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UNFV/FIIS ANÁLISIS MICROBIOLOGICO DE MARISCOS

PRACTICA N° 9

ANALISIS MICROBIOLOGICO DE MARISCOS

I.INTRODUCCIÓN

Alteraciones en la manipulación almacenamiento de mariscos

1.1 Cambios bioquímicas

Las modificaciones sufridas por el marisco desde su captura hasta que


llega al consumidor tienen aspectos similares a las del pescado, pero
difieren notablemente en otras. El envejecimiento y el deterioro de los
tejidos ocurren de modo parecido al del pescado, y se ve influido por
idénticos factores. La escasa cantidad de glúcidos en los crustáceos y la
riqueza en enzimas proteoliicos determinan una leve caída del pH y una
rápida alterabilidad, con liberación de compuestos nitrogena dos
volátiles. Algunos enzimas oxidan pigmentos, que dan lugar a un
ennegrecimiento de la cabeza conocido como melanosis. En los
moluscos, la cifra de glúcidos permite un mantenimiento mas prolongado
de su buen estado.

1.2 Derivados de los mariscos

Los productos derivados de los mariscos que recoge el Código


Alimentario Español son: semiconservas, conservas, sopas de mariscos
y bullabesas y platos cocinados.

Tienen características parecidas a las de los derivados del pescado,


pero lógicamente la base la constituyen los crustáceos y los moluscos.

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• Semiconservas.-Son productos a base de crustáceos y de


moluscos sometidos a un tratamiento apropiado y mantenidos en
recipientes impermeables al agua a presión normal. Las
semiconservas deben almacenarse en frigorífico y su conservación
es limitada en el tiempo. Pueden darse como mariscos enteros o
troceados y suelen llevar un líquido de cobertura, que puede ser
aceite vegetal, vinagre o la mezcla de ambos en diferentes
proporciones y con distintos condimentos.

• Conservas.- Son aquellos productos hechos (OR moluscos o


crustáceos, con o sin adición de sustancias autorizadas, contenidos
en envases herméticamente cerrados y tratados exclusivamente por
el vapor, para asegurar su conservación.

1.3 Alteraciones en e almacenamiento

El marisco congelado almacenado sufre, al igual que el pescado,


procesos que cambian su composición lipidia. Las grasas modificadas
con las proteínas, dando lugar a complejos lipoproteicos y a compuestos
de molécula pequeña. Aparecen pigmentos castaño-rojizos, equivalentes
a la lipofucsina, que se utilizan para determinar la edad de los
crustáceos marinos. La interacción lipídico-proteica retarda la oxidación
de las grasas durante e almacenamiento.

En los mariscos enlatados y sometidos a la acción del calor se precisa


realizar una serie de tareas. Las gambas y otros crustáceos, después
de descongeladas, se lavan, separado los ejemplares rotos, decolorados
o alterados y los residuos extraños. Más tarde, se les quita la cabeza y
se pelan; posteriormente, se escaldan en salmuera hirviente. Estas
gambas precocidas se lavan de nuevo, se revisan, se categorizan y se
envasan a mano o a máquina.
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Por último, se añade salmuera, aceite o salsa y se cierran los envases.

En cuanto a las almejas y otros moluscos, en primer lugar se lavan para


que desaparezca la arena y el barro; luego, se precuecen al vapor. Mas
tarde, se extraen de las conchas a mano o a maquina y se cortan por un
lado para eliminar completamente la arena o el barro que pudiera
quedar. Tras un nuevo lavado se extirpan el sifón, las paredes laterales
del cuerpo y el estómago, procediendo, por último, al envasado y a la
adición de agua, salmuera, aceite, jugo o salsa.

Como ocurre en el pescado, tras someter a gambas, langostas y


cangrejos a la acción del calor, pueden aparecer manchas negras en la
superficie por el depósito de sulfuro de hierro.

2. Microbiología de los mariscos

2.1 Características microbiológicas

La presente de bacterias en la superficie de los crustáceos es similar a la


del pescado. En el caso (de los moluscos, la contaminación se reduce
ostensiblemente cuando se someten a depuración en tanques con agua
marina limpia circulante. La posible existencia de gérmenes patógenos
se corresponde con el lugar donde viven y con la forma de alimentarse,
caracterizada, en los moluscos bivalvos, por la filtración de muchos litros
de agua cada día. Los microorganismos más ubicuos son Salmonella,
Shigella, Vibrio cholerae, Escherichia coli, Clostridium perfringens y
virus.

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2.2 Cambios microbiológicos

Las alteraciones microbiológicas que sufren los mariscos constituyen,


en muchos casos, graves problemas de salud pública. Los crustáceos se
suelen capturar en regiones alejadas de la costa, por lo que no suelen
portar gérmenes patógenos. No obstante, se ha extendido su cultivo en
viveros de regiones costeras, en las que el peligro de contaminación se
multiplica; de hecho, se han descrito importantes brotes de intoxicación
por Vibrio parahaemolyticus, procedente de residuos terrestres, en
mariscos cocidos y recontaminados con posterioridad.

En los moluscos con alteraciones de detecta un crecimiento de bacterias


Gram negativas proteolíticas: Pseudomonas y Vibrio, y sacarolíticas:
Lactobacillus. Las primeras generan aminas y amoniaco; las segundas
reducen el pH. Tomar ciertos moluscos bivalvos crudos puede ocasionar
toxiinfecciones graves por Salmonella, Shigella, Vibrio cholerae,
Escherichia coli, Clostridium botulinum, Clostridium perfringens,
Staphylococcus aureus enterotoxigénico, Vibrio parahaemolyticus y
virus. El consumo de otras alteradas puede acarrear cuadros de fiebres
tíficas, paratíficas, hepatitis víricas. Los mejillones crudos, mal cocinados
o recontaminados, pueden ser origen de fiebres tíficas y de
salmonelosis.

Mención aparte merece la contaminación por biotoxinas marinas


fabricadas por los dinoflagelados presentes en el plancton. Algunos
biotoxinas afectan al sistema nervioso las neurotoxinas – y otras, al tubo
digestivo – enterotoxinas -. En determinadas circunstancias favorables,
los dinoflagelados ascienden hacia la superficie marina y se reproducen
rápidamente, dando lugar a coloraciones extrañas, entre las que
predomina el rojo; este fenómeno se conoce como marca roja o purga
de mar. Los moluscos, en especial, los mejillones y las almejas, filtran
cada día grandes cantidades de agua y se alimentan de estos
organismos, y las toxinas se fijan al hepatopáncreas o al sifón. Al ser
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consumidos por el ser humano, sobreviene la intoxicación que, en el


caso de la neurotoxina, puede ocasionar la muerte y en el de la
enterotoxina, provocar trastornos gastrointestinales.

2.3 Control microbiológico de los mariscos

Las muestras de crustáceos con caparazón se consiguen


desinfectando, su superficie con alcohol de 70°C y, luego, se retiran
asépticamente con material estéril. Si carecen de caparazón, la carne se
debe manipular también (le modo aséptico con material estéril).

Si se trata de moluscos se debe tomar un número suficiente (los


individuos para que el volumen de carne y de líquido intervalvar no sea
inferior a 0 ml.

Se deben limpiar concienzudamente a chorro y mediante un cepillo para


retirar todo tipo de sustancias extrañas adheridas a las conchas como
algas, tierra, etc.
Tras un ligero flameado, las valvas se abren y recogen los cuerpos y el
líquido intervalvar sobre pro beta estéril. Se añade diluyente hasta
obtener un dilución 1:10 0; se puede utilizar como diluyente solución
Ringer a 1/4 agua de triptona. Finalmente, la mezcla se tritura y
homogeneiza y se usa como solución madre.

El protocolo de estudio microbiológico en los mariscos es el siguiente:

• Recuento de colonias aerobias revivificables.


• Investigación y recuento de Escherichia coli.
• Investigación y recuento de Enterobacteriaceae totales.
• Investigación de Salmonella y Shigella.

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• Investigación y recuento de Streptococcus aureus


enterotoxigénico.
• Investigación y cuento de Streptococcus D. de Lancefield.
• Investigación de Vibrio paraharahaemolyticus
• Investigación de biotoxinas marinas hidrosolubles (PSP).
• Investigación de biotoxinas marinas liposolubles (DSP).
• Investigación de toxinas botulínicas.

Para la investigación de toxinas marinas se puede recurrir a métodos


biológicos, inmunológicos y químicos. El bioensayo en ratón es el
Procedimiento oficial para determinar biotoxinas PSP, y es el mejor
método de que se dispone. Se valora la posibilidad de sustituirlo por
algún otro método, especialmente, fluorométrico o HPLC. Para las
biotoxinas DSP se puede utilizar el bioensayo en ratón o HPLC.

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Preparación de la muestra

Mariscos con valvas:

1. Recipiente con boca ancha con capacidad de 20 unidades de mariscos


con valvas aprox. 10 gr.
2. Recipiente con escurridero de agua.
3. Vaso de precipitación con 500 ml. de capacidad.
4. Vaso de licuadora estéril.
5. Escobilla dura.
6. Cuchillo estéril
7. Cuchara estéril
8. Servilleta estéril.

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9. Balanza de capacidad no inferior a 2500 gr. y una sensibilidad de 0.1 gr.

10. Licuadora de 2 velocidades.


11. Alcohol etílico de 70%.
12. Solución buffer de fosfato o agua de peptona el 01%.
13. Mechero.
14. Asa de siembra.
15. Tubo con cultivo puro.
16. Tubo con TSI.
17. Tubo con SIM.
18. Tubo con LIA.
19. Tubo con citrato.

PROCEDIMIENTO

1. Colocar 20 unidades de mariscos valvados en un recipiente de boca


ancha. Cepillar cada uno de ellos bajo el chorro de agua potable, con
especial atención a las grietas y uniones de las valvas.

2. Colocar las muestras limpias en un recipiente con calador y dejar


escurrir el agua.

3. Lavar y desinfectar las manos con alcohol de 70%.

4. Colocar la muestra en la mano sobre una servilleta de papel limpia, de


tal forma que una de las partes convexos, descanse sobre la palma de la
mano.

5. Insertar el cuchillo en el punto de unión de las valvas. Cortar el músculo


de la valva superior, palanquear las valvas y dejar que el líquido caiga

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sobre el vaso de precipitados previamente tapados. Retirar la bañada


superior y transferir la carne al vaso contenido el líquido valvar.

6. Pesar el vaso con la muestra extraída.

7. Transferir la muestra al vaso de la licuadora.

8. Adicionar una cantidad igual al peso de la muestra de solución buffer de


fosfato o agua peptonada al 0.1%.

9. Homogenizar tomando las precauciones indicadas en preparación y


dilución de las muestras de alientos ( 2 ml de este, homogenizado
contienen 1 gr. de mariscos).

En caso de que el homogenizado resulte de consistencia pesada y difícil de


pipetear, adicionar 3 partes de diluyentes en peso de la muestra (4 ml., de
esta muestra contiene 1 gr de las muestras en examen). Corregir las
proporciones a ser tomadas para la siembra.

MEDIOS UTILIZADOS

CALDO AZIDA – GLUCOSA

Art. Num 1590


Para ensayo previo orientativo de enterecocos y para enriquecimiento selectivo
de los mismos.

Este medio de cultivo corresponde a las recomendaciones de los


Estándar Methods for the Examination of Water and Wastewater (1975).

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Forma de preparación

La sodio-asida presenta en una concentración que respeta al máximo a


los enterococos e inhibe notablemente a la flora gram-negativa que les puede
acompañar.

La utilización de sodio-azida como sustancia inhibidora selectiva de


bacterias gramnegativas se remonta a los trabajos de EDWARS (1933 – 1938)
y HARTMANN (1936) sobre el aislamiento del Str. Agalactiae, Ulteriormente,
MALLMANN (1940) y SNYDER aislamiento de enterococos a partir de aguas.

La demostración de enterococos (Streptococcus faecalis, S. bovis y S.


Equinus) sirve como un indicador de contaminantes fecales, especialmente de
corrientes de agua, aguas residuales que contengan cloro y baños Yodo, en
todos los cuales pueden estar ya extinguidas en el momento de la
investigación las bacterias coliformes menos resistentes, inclusive E. Coli.

Composición (g/litro)

Peptona de caseína 15.0; extracto de carne 4.8; D (+)-Glucosa 7.5;


Sodio cloruro 7.5; Sodio azida 0.2.

Preparación

Disolver 35 g o 70 g por litro, distribuir y esterilizar autoclave. No recalentar.

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Empleo e interpretación

Si la cantidad de producto a ensayar es pequeña (hasta 1 ml, se incorpora en


el caldo de concentración sencilla (35 g/litro) que queda así diluido a la
concentración habitual.

Incubación : desde 254 hasta 48 horas, a 37°C.

La producción de enturbamiento durante la incubación (crecimiento)


permite sospechar la presencia de enterecocos. En este caso, y para su
confirmación, se resiembra en Calco-purpura de bromocresol – axida (MERCK,
Art. Num 30332). Si no se presenta turbidez alguna, puede desecharse con
seguridad la presencia de enterococos.

Agar ENDO-C

(Agar-fucsina-lactosa seg. ENDO, tipo)


ENDO-C Agar
Art. Num 4044

Medio de cultivo selectivo, para demostración y aislamiento de E. Coli fecal y


coliformes en los más diversos materiales.

Este medio de cultivo corresponde a lo prescrito en los Estándar


Methods for the Examination of Dairy Products (1967) y en los Estándar
Methods for the Examination odf Water and Wastewater (1975).

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Forma de actuación

El sodio sulfito y la fucsina inhiben a las bacterias gram positivas E. Coli


y coliformes utilizan lactosa con formación de aldehído y ácido. Por otra parte,
el aldehído libera fucsina a partir de la combinación fucsina-sulfito, lo cual da
lugar a la coloración roja de las colonias. En el caso de E. Coli, esta reacción
es tan intensa que la fucsina llega a cristalizar y por este motivo, confiere a
dichas colonias un brillo metálico estable, de reflejo verde (típico de la fucsina
cristalizada).

Composición (g/litro)

Peptona de carne 10.0; di-Potadio hidrogenofosfato 3.5; Lactosa 10.0


Sodio sulfito, anhidro 2.5; Fucsina 0.4; Agar – agar 12.5.

Preparación

Disolver 39 g/litro, esterilizar al autoclave y verter en placas. Si el medio


de cultivo muestra, tras la solidificación, un tono rojo demasiado intenso puede
eliminarse dicho exceso de color añadiendo algunas gotas (hasta 1 ml/litro,
como máximo) de una solución, anhídrido, MERCK, Art. Num 6657, e hirviendo
el conjunto a continuación.
Ph 7.4 ≠ 0.2

Por efecto del oxigeno atmosférico y debido a la consiguiente oxidación


del sulfito, el medio de cultivo vertido en placas se vuelve paulatinamente rojo y

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por lo tanto, inservible. Incluso conservado en la oscuridad y a la temperatura


de nevera, solo es utilizable durante pocos días.

Empleo e interpretación

Sembrar las placas en estría por agotamiento


Incubación: 24 horas, a 37°C.

Colonias Microorganismos
Rojas Lactosa – positivos
Rojas con brillo metálico
Estable E. coli
Rojas hasta rojizas, semi-esféricas Enterobacter aerogenes,
mucosas Klesbsiella y tros.
Incoloras, claras Lactosa – (-)

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ANÁLISIS DE LA MUESTRA:

1. Preparar las diluciones decimales, siguiendo una de las técnicas


descritas en preparación y dilución de las muestras de alimentos, hasta la
dilución 10-4 o 10-5 si es necesario.

2. Efectuar las determinaciones microbiológicas de acuerdo al esquema de


trabajo y a la metodología descrita.

3. Reportar los resultados por gramo de muestra.

Pruebas Bioquímicas

La lectura en placa no es suficiente para poder identificar al (los)


microorganismos (s) en estudio, para ello emplearemos las pruebas
bioquímicas con las cuales podemos llegar a identificar el nombre del
espécimen cultivado.
Los medios de diferenciación más empleados en el laboratorio de
microbiología para la identificación de bacterias son: el agar citrato de
Simmons, el medio de SIM, el agar hierro tres azucares (TSI) y el medio de
LIA.

Luego se procederá de la siguiente manera:

1. Flamear el asa de siembra

2. Tomar una muestra del cultivo puro y sembrar en estría y por picadura en
los tubos con medios TSI, LIA y citrato. En el medio de SIM sembrar
únicamente por picadura.
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3. Incubar los tubos y hacer la lectura de los mismos a las 24 horas después
de la siembra.

4. Realizar la prueba de indol añadiendo unas gotas de


dimetilaminobenzaldehido.

5. Realizar la prueba de la catalasa para lo cual añadir unas gotas de peróxido


de hidrógeno sobre las colonias.

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CUESTIONARIO

1. Explique la importancia de evitar contaminación por Vibrio vulnigicus y


Salmonella en mariscos y pescados.

2. Parásitos que puedan ser transmitidos por alimentos marinos.

3. Explique como se realiza el recuento de mohos y levaduras en muestras de


alimentos marinos.

4. Explique la toma de muestras, preparación de muestras y análisis


microbiológicos de los alimentos marinos.

5. Que microorganismos se pueden encontrar en el agua de mar, en las


lagunas y ríos.

6. Busque en alguno recuento o Internet algún proyecto o trabajo de


investigación relacionable a productos hidrobiologicos.

7. Cual es la finalidad del uso del medio TSI, que tipos de azucares participan
en este medio y a que microorganismos permite reconocer.

8. Cual es la finalidad del uso del medio de LIA, que reacciones nos permite
evaluar y que microorganismos nos permite identificar.

9. Que pruebas se pueden realizar en el medio citrato y que microorganismos


se pueden diferenciar con este medio.

10. Para que se emplea el medio de SIM, que microorganismos se pueden


reconocer con éste y como.

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11. Con que finalidad se realiza la prueba de la catalasa y la prueba del indol.

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