LES TECHNIQUES EN IMMUNOLOGIE

FICHE TECHNIQUE N°1 PLAN

I/ Les Anticorps monoclonaux et anticorps polyclonaux A. Les anticorps polyclonaux B. Les anticorps monoclonaux
Rappel Principe

II/ Les réactions antigènes / anticorps A. Généralités B. La réaction de précipitation
En milieu liquide : En milieu gélifié : Exemple du « ring test » Immunodiffusion double (Ouchterlony) Immunodiffusion radiale (Mancini) Electro-immnunodiffusion (Laurell) Immuno-électrophorèse

C. La réaction d’agglutination
Principe : potentiel ζ Paramètres internes et externes Agglutination active : ex système ABO Agglutination indirecte Agglutination passive

Hugo MOUQUET, INSERM U519
hugo.mouquet@etu.univ-rouen.fr

I/ Les anticorps polyclonaux et monoclonaux A. Anticorps polyclonaux (sérum polyclonal, immunosérum) Un immunosérum renferme des Acp de classes et de sous-classes différentes, d’affinités diverses et reconnaissent plusieurs déterminants antigéniques. Ag : de différente nature, pour les haptènes (< 3 kDa) ou les peptides synthétiques (10-15 AA), ces Ag sont couplés à une protéine porteuse de haut PM (« carrier ») ex : BSA, thyroglobuline, hémocyanine… par l’action d’agents de couplage ex : glutaraldéhyde (NH2, SH), carbodiimides (NH2, COOH). Voies d’administration : sous-cutanée, intradermique, intramusculaire et intraveineuse. Animaux : souris, lapin, mouton, chèvre Protocoles d’immunisation : Les animaux sont immunisés avec l’Ag en présence d’adjuvant de Freund ; complet pour la première immunisation et incomplet pour les rappels. Les durées entre les rappels varient. Les animaux sont prélevés et la réactivité des sérums est testée (ELISA, IFI, WB…). B. Anticorps monoclonaux (Milstein, 1974-1975) 1. Rappel Un clone lymphocytaire B possède un programme génétique unique qui par les mécanismes de réarrangement code pour une IgG de surface (BCR) spécifique du clone B. Le BCR qui se lie aux épitopes antigéniques est identique au niveau structural à l’immunoglobuline sécrétée par le plasmocyte dérivant du clone B. 2. Principe La production d’Acm chez la souris ou le rat se fait par la technique d’hybridation cellulaire. Elle consiste à fusionner des cellules productrices d’Ac et des cellules d’une lignée myélomateuse. Cette fusion conduit à la production de cellules hybrides ou hybridomes.

Sécréteur HGPRT+ Mortel

PEG

LB

M

Myélome (immortel) Non sécréteur HGPRT-

Hétéromyélome Sécréteur HGPRT+ immortel

HM Culture sur milieu HAT (Hypoxanthine, aminoptérine, thymidine)

Aminoptérine Voie de synthèse des nucléotides « de novo » Bases azotées Nucléotides

HGPRT
Voie de « sauvetage » HX Thymidine

Thymidine Kinase

Ac
II/ Les réactions antigènes / anticorps A. Généralités
Paratope 2

La réaction Ag/Ac est due à l’interaction 1 entre l’épitope et le paratope. Le complexe (immun) Ag/Ac fait intervenir des liaisons Epitope Ag 3 faibles ; hydrogène, électrostatiques, les forces de Van der Waals et interactions Ag + Ac ⇄ Ag-Ac apolaires. La constante d’association K varie K = k1 / k2 4 12 K = [Ag Ac] / [Ag].[Ac] entre 10 et 10 L/M. Epitope séquentiel (linéaire) / épitope conformationnel

Ac monoclonal

Sérum polyclonal (Ac polyclonaux)

Si l’antigène est moléculaire et soluble; les complexes Ag/Ac forment un précipité, si l’antigène est particulaire ou cellulaire (bactéries, hématies, billes de latex …); les complexes immuns forment un agglutinat. B. La réaction de précipitation 1 : En milieu liquide : le test de l’anneau (« Ring Test »)
[Ac] croissantes

[Ag] constante

ZONE D’EQUIVALENCE

Paramètres physico-chimiques de la réaction : La température ; à θ=37°C, la précipitation est accélérée et à θ=0°C, la quantité de précipité est augmentée La force ionique ; chez les mammifères, la quantité maximale de précipité est obtenue pour [NaCl] < 0,15 M. Le pH ; la réaction est inhibée aux pH extrêmes (en dessous de 6 et au-dessus de 8,5). Effet dissociant des pH acides (élution). Les adjuvants de précipitation ; accélère la réaction ( ex : PEG).

2 : En milieu gélifié Gel (agar de 5 à 20 g/l en tampon PBS pH 7,2 ou d’agarose) de 3-4 mm.

Immunodiffusion double (Ouchterlony)
Cette technique est basée sur la double diffusion Ag et Ac dans un gel en fonction de leur PM. Elle permet l’analyse qualitative d’un mélange d’Ag en solution.

IDENTITE

OUI
Ag B

NON
Ag B

PARTIELLE
Ag B

Antigènes Ag

Ag A

Ag A

Ag A

Ac Anticorps Ac anti-A Ac anti-A Ac anti-B Les Ag A et B n’ont aucun déterminant antigènique commun Ac anti-B

Les Ag A et B possèdent des épitopes communs

Immunodiffusion radiale (Mancini)
Cette technique quantitative permet le dosage d’un antigène (protéine).
Protéine 1 2 3

Gel

Anticorps

Diffusion selon un gradient de concentration décroissant

Formation d’un anneau de précipitation ; réseau Ag/Ac

3 mg/l [Protéine] (mg/l) dosage des IgG sériques Electro-immunodiffusion (Laurell) Cette technique permet d’accélérer le temps de diffusion en obligeant l’Ag à migrer sous l’effet d’un champ électrique. formylation). carbamylation.[Ag] 14 12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 [Ag] inconnue . « Rockets » 14 12 hauteur (h) 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 h 1 2 3 Etalons 4 ? [Protéine] (mg/l) La hauteur des «fusées» (lignes de précipitation) est proportionnelle à la [Ag]. 6 mg/l d2 = a. Le pH du gel est choisi de façon que les Ac soient immobiles (pI des Ig) et que l’Ag chargé négativement migre (blocage des NH2 .[Ag] + b Etalon 1 . . ? mg/l Etalon 3 . 1. dans un gel contenant l’Ac.5 mg/l diamétre2 Etalon 2 .

. (Tampon Véronal-Tris) 2e tps . plaquettes. 1er tps . billes de latex ou de sépharose). C’est un phénomène complexe au cours duquel les Ac s’unissent aux Ag portés par la particule formant ainsi des ponts spécifiques entre ces particules permettant leur réunion en amas. L’exploitation des résultats est basée sur celle de la technique d’Ouchterlony.Immuno-électrophorèse (Grabar et Williams) Cette technique renforce le pouvoir analytique des doubles diffusions en identifiant les constituants d’un mélange par 2 propriétés indépendantes. C. globules blancs. micro-organismes. un mélange d’Ag est soumis à un champ électrique (de 5 à 8 V) le long duquel les constituants se répartissent en fonction de leur mobilité électrophorètique. La réaction d’agglutination 1 : Principe Les réactions d’agglutination mettent en jeu un Ag situé à la surface d’une particule de taille comprise entre le dixième et la dizaine de micron (globules rouges. leur mobilité électrophorètique et leur spécificité antigènique. spermatozoïdes. un immunosérum polyspécifique diffuse dans un sens perpendiculaire à celui de la piste électrophorètique dont les fractions diffusent en sens inverse.

qui tend à agréger les particules entre elles. l’état électrique est modifié. il existe une relation entre l’agglutinabilité et : .15 M). dits non-agglutinants sont incapables de provoquer une agglutination dans ces conditions. dits agglutinants (IgM en majorité) sont capables de produire une agglutination des particules en suspension dans un milieu salin de [NaCl] = 0. _ _ _ + + + + + + + + _ _ ζ CH2OH HO C H HOOC H OH OH H H HO C H O H NH2 + + + + + + + GR + + + NANA (acide sialique) H _ + _ Pollack : + _ ζ = σ / (D x √µ) + _ σ : charge électrique D : constante diélectrique du milieu µ : force ionique du milieu La force de répulsion est fonction du potentiel ζ (-16 mV pour [NaCl] = 0. en cela les IgM s’avèrent plus efficaces.15 M.la force de répulsion (prédominante).le nombre de sites antigéniques . Lorsque les Ac recouvrent les GR.la tension interfaciale.leur localisation . . à effet opposé. Les Ag .2 : Le potentiel Zêta Deux forces antagonistes jouent un rôle dans l’interaction des particules entre elles : . elle provient des charges électriques identiques des particules. 3 : Les paramètres de réaction Les Ac .

Le pH. Shigella. . cependant la quantité finale d’Ac fixés est plus élevée à basse température (après 24 h). entérophathogènes…) Groupage sanguin ABO . plus elle est élevée plus l’agitation moléculaire est importante (augmentation de p (rencontre)).Les facteurs expérimentaux . L’agglutination est plus rapide à 37°C. . Elle peut se faire en tubes. coli. 4 : Les réactions Agglutination active Elle résulte d’une union spécifique entre un Ac agglutinant et un Ag appartenant en propre à la particule. On distingue des Ac « chauds » et des Ac « froids ». en microplaques ou sur lame et peuvent être qualitatives ou quantitatives (la dernière dilution du sérum où l’on observe encore une agglutination).La température.La force ionique (effet quasi nul). Sérogroupages bactériens (Salmonella. elle contrarie l’union Ag-Ac mais favorise la formation du réseau (par la diminution du potentiel ζ). E. optimum entre 6 et 8 .

la broméline. Utilisation Ac anti-Ac GR Ac anti-isotype GR Phénotypage Rhésus Agglutination passive Elle est réalisée entre un Ac et un Ag normalement soluble. mais rendu particulaire par fixation sur un support : 1. 3. le Ficoll… 2.2) 2. Les hématies . la fucine. di-nitro chloro-benzéne…) ou par fixation immunologique (cas des Ac dirigés contre des épitopes du GR). en faisant appel à un artifice. la trypsine…). l’Ag est fixé par simple contact. on peut obtenir une agglutination avec des Ac non agglutinants en diminuant le potentiel ζ (↘σ ou ↘D ou↘ ). par fixation chimique (glutaraldéhyde. Hydrolyse des glycoprotéines présentes à la surface des cellules par protéases (la papaïne.Agglutination indirecte Elle se produit entre un Ac non agglutinant et un Ag faisant normalement partie intégrante de la particule. l’Ag est fixé par simple contact (pH 8. . Les billes de latex . le Dextran. Ajout au MR des macromolécules qui pontent les Ac unis à des cellules voisines (par րD). une meilleure accessibilité des Ag (mise en place de liaison hydrophobe) et une redistribution des récepteurs aux Ag. Leur action permet la diminution de σ (libération de NANA). par traitement à l’acide tannique. De façon générale. Les techniques : 1. ex la BSA.

détection de l’hormone gonadotrophine chorionique (HGC) dans l’urine . IgG lapin anti-GR de mouton + GR mouton test de grossesse.Inconvénients : . Agglutination HGC dans l’urine Réaction Oui Non Equilibre Non Oui Excès d’Ag ♀ non enceinte ♀ enceinte . elles s’hémolysent en 3 semaines (utilisation d’hématies formolées. Les [GR-HGC] et [Ac anti-HGC] sont optimums pour l’agglutination.elles portent une mosaïque d’Ag recherche du facteur rhumatoïde (réaction de Waaler Rose . GR recouverte d’hormone mise en contact des Ac anti-HGC et l’urine de la femme suspectée d’être enceinte. stables plusieurs mois à 4°C) .fragiles.

Différentes méthodes Dosage d’Ag Dosage d’Ac C. chromatographiques. Directe (IFD) IV/ La purification d’immunoglobulines Méthodes chimiques.FICHE TECHNIQUE N°2 PLAN Les techniques immuno-enzymatiques I/ Les techniques ELISA A. Principe B. Applications II/ L’immuno-empreinte A. physiques Purification d’Ac spécifiques . Le transfert des protéines sur membrane C. Séparation des Ag par SDS-PAGE B. Indirecte (IFI) Principe Rappel sur la fluorescence Organigramme expérimental Applications B. La révélation immunologique III/ L’immunofluorescence A.

du plastique. enzymes et substrats en phase hétérogène L’agent chimique utilisé pour coupler une enzyme à un Ag ou à un Ac ne doit pas altérer l’activité enzymatique ni celle du réactif immunologique. Systèmes biologiques Ag : liquide biologique. On utilise : le glutaraldéhyde. hormones. Conjugués.I/ Techniques immuno-enzymatiques : les tests ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) A. Phase solide et « fixation » Par adsorption passive sur du verre. Principe Elles reposent sur l’utilisation d’une enzyme pour déceler les complexes immuns. agarose ou acrylamide par le glutaraldéhyde). Ac : immunosérum total. de microplaques… Par liaison covalente entre l’Ag ou l’Ac à la phase solide appropriée (cellulose activée. du polystyrène. de tubes. médicaments…) Méthodes En phase homogène : La fixation de l’enzyme au complexe immun modifie son activité (révélation directe). des haptènes) analyse médicale. Les techniques ELISA sont très utilisées en : recherche fondamentale et appliquée (reconnaissance des épitopes protéiques. Ac. du bromure de . pour le dosage de nombreuses substances (Ag. marqueurs tumoraux. des Ig purifiées ou des Acm (évite les réactions croisées). En phase hétérogène : Activité enzymatique inchangée après la fixation (besoin d’une étape de séparation entre les complexes marqués et l’Ag ou Ac marqués). de plaques. latex… sous forme de billes. une préparation brute ou purifiée de l’Ag ou de l’haptène.

. le carbodiimide… . il y a compétition entre l’Ag à doser et l’Ag marqué (de même spécificité) ajouté en quantité définie dans le même temps. H2O2 Tétraaminobenzidine. B. Différentes méthodes d’ELISA en phase hétérogène 1 : Dosage des antigènes Par compétition : Vis à vis d’Ac présents en quantité limitée. coli 2-nitro-phényl-ß-Dgalactopyrannoside (ONPG) Glucose oxydase Aspergillus niger Chromogène + H2O2 Glucose NAD+ 6 phosphate + Glucose 6 phosphate Leuconostoc déshydrogénase (1) (2) mesenteroïdes : pour les dosages rapides et (3): pour un grand nombre d’échantillon En fonction du substrat. le produit de la réaction est mesuré par spectrophotométrie. colorimétrie (examen visuel) ou par fluorométrie. H2O2 Phosphatase (2) alcaline E. et fixés sur un support. coli ou muqueuse 4-nitro-phényl-phosphate intestinale de veau ß-D galactosidase (3) E.cyanogène. Besoin de séparation de l’enzyme en excès par chromatographie d’exclusion moléculaire. ENZYME Peroxydase (1) ORIGINE Raifort (radis noir) SUBSTRAT Diaminobenzidine.

Méthode en « sandwich » S’applique aux Ag possédant au moins 2 épitopes (identiques ou non) Réaction Ag à doser Addition du second Ac marqué Révélation de la réaction S P Ac en excès Ag à doser Ac marqué en excès Activité enzymatique liée au support (DO) Activité (DO) = k . L’Ac biotynilé se lie sur l’Ag fixé à la phase solide puis. de la streptavidine conjuguée à une enzyme se lie à la biotine (complexe ternaire). Avidine Biotine . [Ag x] [Ag x] Directe : Dosage immuno-enzymométrique ou IEMA Amplification par le système avidine-biotine (ABC) La biotine (coenzyme facile à lier aux Ig) a une très forte affinité pour l’avidine (blanc d’œuf) et la streptavidine (Streptomyces avidinii).

[Ac] [Ac x] Indirecte avec Ac secondaire marqué Puits négatif Puits positif .2 : Dosage des anticorps Indirecte avec Ag marqué Réaction Ag / Ac Addition de l’Ag marqué Révélation de la réaction S P Ag en excès Ac à doser Activité enzymatique liée au support (DO) Ag marqué en excès Activité (DO) = k .

Activité enzymatique liée au support (DO) Activité (DO) = k . virologique (HIV. enzymes (énolase. hépatite A-B. bactériologique par titrage d’anticorps (Brucella. hormones (insuline. des Ac anti-ADN. médicaments. rubéole. Applications Dosage des protéines : la ß2m. les facteurs rhumatoïdes. grippe…) Maladies auto-immunes : recherche et dosage des FR. C. Treponema…). vitamines. anti-histones. Salmonelle. [Ac] [Ac]  Protocole expérimental en TP Un seuil de positivité est déterminé par un index calculé à partir des DO de témoins connus (moyenne DO sujets sains + 2-3 σ pour ex). glucacon…). anti-Dsg1/3… . drogues. herpés. IgE… Diagnostic sérologique : parasitaire. lipase…). varicelle.

DTT 10%) Protéine native A S S A B SDS Dithiotreïtol 100°C. Solution de dépôt des échantillons : Solution de Laëmmli (Tris 0.05 g de protéine / piste)… ⊕ . Séparation des Ag par SDS-PAGE Les protéines d’un extrait tissulaire ou cellulaire ou des protéines recombinantes dénaturées et chargées négativement. migrent dans un gel d’acrylamide / bis-acrylamide (de teneur x %) sous l’action d’un champ électrique. A. SDS 40%.5 M pH 6.8. Bleu de bromophénol 0. nitrate d’argent (0.2 à 0.Na+ SDS B ⊝ A 120 V t=2h La migration achevée.5 g de protéine / piste).009%.II/ L’immuno-empreinte (immunotransfert ou « western blot ») Cette technique combine le pouvoir de séparation de l’électrophorèse et la grande sensibilité de l’immunodétection. Elles sont séparées en fonction de leur PM. le gel peut être colorée s’il ne constitue pas SDS-PAGE la première étape du WB : Bleu de Coomassie (0. 3 minutes Fragments polypeptidiques B CH2 SH HC OH HC OH CH2 SH DTT CH3 (CH2)11 SO3.01 à 0. ce qui en fait un outil performant pour l’identification d’un Ag ou d’un Ac. glycérol 20%.

3-kDa ⇐ 28. Le transfert des protéines sur membrane Les protéines contenues dans le gel sont transférées sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF sous l’action d’un champ électrique. ANODE Temps de transfert : 2 h (à 18 h).8-kDa . Marqueur ⇐ 35.B. voltage 30 V (à 60 V) Coussins absorbants Papiers buvards Membrane de nitrocellulose Gel de polyacrylamide Papiers buvards Coussins absorbants Le tampon de transfert contient du méthanol qui augmente la capacité de la NC à absorber les protéines. et empêche le gel de gonfler CATHODE A la suite du transfert.2-kDa ⇐ 20. la membrane qui contient les protéines peut être colorée à l’aide de rouge Ponceau puis est décolorée avec de l’acide acétique 5% et enfin séchée.

Tween 0. 2/ Organigramme du protocole expérimental (TP) Découpage de la membrane en bandelettes Saturation dans du tampon TBS. Principe de la révélation immunologique par ECL Les protéines transférées sur membrane de NC sont incubées avec des immunosérums ou des Ac. Les protéines ayant formé des complexes Ag /Ac réagissent ensuite avec des Ac (de chèvre) dirigés contre les IgG de l’espèce d’origine du sérum testé. Tween 0. 5% lait Lavages dans du tampon TBST . Ces Ac secondaires sont couplés à la peroxydase (ou à la phosphatase alcaline). La peroxydase oxyde le luminol qui va émettre de la lumière permettant la révélation autoradiographique des complexes.05%. La révélation immunologique 1/ Principe H2O2 Peroxydase Protéine Premier Ac (Sérum) Forme oxydée de l'enzyme LUMIERE Luminol oxydé Second Ac + Luminol + Activateur Membrane NC Film photographique Figure.C. 5% lait Lavages dans du tampon TBST Incubation avec le(s) sérum(s) ou les Ac dilués dans du tampon TBS.05%.

L’oxydation du luminol est catalysée par le système HRP (horseradish peroxydase) / peroxyde d'hydrogène en conditions alcalines. peroxydase ou phosphatase alcaline) dilués dans du tampon TBS. Principe de la chimioluminescence. Tween 0. celle-ci provoque l’excitation du luminol qui va retourner à son état fondamental en émettant de la lumière.05%. La chimioluminescence est basée sur une émission de lumière provoquée par la dissipation de l'énergie d'une molécule qui se trouve dans un état excité par une réaction chimique.Incubation avec les Ac secondaires (conjugués à une enzyme . Ex : révélation colorimétrique SDS-PAGE 4% Extrait de peau 160 kDa . 5% lait Lavages dans du tampon TBST Révélation ECL ou colorimétrique Analyse des résultats O NH NH NH2 O H2O2 Peroxydase O O O NH2 O - + N2 + Lumière Figure.

Rhodamine et ses dérivés. Indirecte (IFI) 1/ Principe Second Ac . des frottis cellulaires.dans leur état excité. A. des microorganismes ou des coupes d’organe. utilisé en général pour le double marquage.FITC Premier Ac (Sérum) FLUORESCENCE Microscope à fluorescence Coupe tissulaire 2/ Rappel sur la fluorescence Luminescence : phénomène défini comme une radiation émise par un atome ou une molécule après l’absorption d’énergie qui l’a conduit dans un état excité. I λexcitation < λémission Eémission < Eexcitation Spectre d’absorption = ensemble des e. donne une fluorescence rouge-orangée.III/ L’immunofluorescence L’immunofluorescence classique permet de déceler une réaction Ag / Ac sur des cellules en suspension. Fluorochromes : FITC : dérivé de la fluorescéine (λémission = 520 nm. Le spectre d’émission des fluoλ (nm) rochromes est dans le visible. Absorption Emission . couleur verte).

Epiderme humain HepG2 Anti-ADN natif. Anti-Dsg1 . anti-histones.Rq :Système amplificateur avidine / biotine Microscope à fluorescence : A lumière réfléchie A lumière transmise Lampes à vapeur d’halogène ou de mercure Système d’acquisition : appareil photos. etc. caméra… 3/ Organigramme du protocole expérimental Incubation des coupes (3-4 m) fixées sur lame avec le sérum ou l’Ac dilué dans du tampon PBS (1 h) Lavages dans du tampon PBS Incubation des complexes avec les Ac secondaires dilués dans du tampon PBS (30 min) Lavages dans du tampon PBS Montage entre lame et lamelle puis observation au microscope 4/ Applications Auto-immunité : détection des Ac anti-nucléaire. dénaturé. anti-organites ou Ac spécifiques d’organe.

aureus. Méthodes chromatographiques Echangeuse d’ions. Exclusion moléculaire (gel filtration. Affinité.Microbiologie : bactériologie. 2. les Ig précipitent entre 12 et 20% d’EthOH. fractionnement d’un sérum en 30 min 3. détection de virus responsable d’infection respiratoire)… B.6 S). l’Ag est recherché directement par l’Ac spécifique marqué. IgM dans les premières fractions (19 S) puis les Ig (8 S à 6. Recherche des dépôts d’Ig ou de complément dans les tissus. .5 % de pureté. IV/ La purification d’Immunoglobulines 1. Ultracentrifugation Centrifugation du sérum à 100 000 g pendant 18 h sur gradient de saccharose. Méthodes chimiques Par relargage des sels par précipitation au sulfate d’ammonium en concentration quasi saturante. sur colonne de protéine A (protéine de paroi de 90% des S. Directe (IFD) Méthode en « un temps ». Par précipitation à l’éthanol. présence des Ig dans le 1er pic d’élution à 99. sur Séphadex 150 (limite d’exclusion 200 kDa) pour fractionner les Ig (150 kDa). par ex fractionnement sur résine basique type diéthylaminoéthyl (DEAE cellulose). tamis moléculaire). capable de fixer le fragment Fc des Ig) ou de protéine G (Steptococcus). virologie (cinétique de multiplication de virus. sur Sépharose 4B (limite d’exclusion 4000 kDa) pour fractionner IgM (970 kDa)… HPLC.

Rq : les solutions d’élution sont acides (pH proche de 2. . il est donc nécessaire de neutraliser le pH du milieu rapidement. Cette méthode peut être appliquée à l’isolement d’un Ag (résine couplée à l’Ac spécifique).5).4. utilisant des billes de sépharose ou d’agarose (activées par le bromure de cyanogène) couplées à l’Ag ou à haptène. Purification d’Ac spécifiques On récupère l’Ac spécifique lié à l’Ag fixé sur un support par : Fixation-élution sur l’Ag immobilisé sur membrane de nitrocellulose Chromatographie d’affinité.

Le protéome B. Application à la recherche de nouveaux auto-antigènes II/ Analyses protéomiques A. Application de l’analyse protéomique (“ciblée”) . Principe B. Méthodologie 1 : L’électrophorèse bidimensionnelle 2 : La révélation et l’analyse d’image 3 : Limites des 2 premières étapes 4 : Identification et caractérisation des protéines La spectrométrie de masse C.FICHE TECHNIQUE N°3 PLAN I/ Immunocriblage de banque d’expression d’ADNc A. Protocole expérimental de criblage C.

Principe Extraction des ARNm (à partir de tissus ou de culture cellulaire spécifique) BANQUE CRIBLAGE IDENTIFICATION Réverse transcription en ADNc Clonage dans un vecteur (phage ou phagémide) Transfection dans E. DDBJ…) et identification de la protéine immunoréactive . Coli Expression des protéines à la surface des phages Immunocriblage avec des immunosérums / Ac Isolement du clone bactérien exprimant la protéine immunoréactive Amplification et conservation du clone d’intérêts PCR sur colonie Purification et séquençage de l’ADNc Comparaison aux banques de données (Genebank. EMBL.I/ Immunocriblage de banque d’expression d’ADNc A.

Protocole expérimental du criblage Bactéries + phages Incubation 4 h à 37°C Incubation 4 h à 42°C Boîte de Pétri Filtre de nitrocellulose imprégné d’IPTG (expression de l’ADNc de chaque phage) Révélation des filtres en immuno-empreinte 1 tache positive Prélèvement du spot correspondant sur la boîte de Pétri (IPTG: isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) Immunocriblage d’une banque d’expression d’ADNc de kératinocytes avec le surnageant contenant l’acm F12 (Pemphigus vulgaire). 7 colonies d’un clone positif / 50 plages de lyse .B.

la pemphaxine a été cité comme un nouvel auto-Ag au cours du PV. à l’heure actuelle un véritable marqueur diagnostic de la maladie (Amagaï et al) Récemment. une autre cible des auto-Ac présents chez 57% des malades est la calpastatine (Mimori et al) Au cours du Lupus érythémateux disséminé. identification d’une protéine proche de la follistatine.C. Application à la recherche de nouveaux auto-antigènes Dans la Polyarthrite rumatoïde (PR). DEK et ALY. 2 nouvelles protéines de la régulation transcriptionnelle. a permis d’identifier la Desmogléine 3. ont étés mises en évidence Le criblage d’une banque de kératinocyte avec des Ac purifiés à partir de sérum de patients atteints de Pemphigus vulgaire (PV). . auto-Ag chez 44% des patients (Tanaka et al) De même dans la PR.

physiologique. Le protéome Il est défini (1995) comme la totalité de la partie protéique exprimée dans une cellule. M/S mai 2001. un tissu. . pathologique…). les protéines peuvent être modifier (maturation co. 1: L’électrophorèse bidimensionnelle Elle combine 2 séparations des protéines selon 2 critéres indépendants le pI et la masse (pouvoir de résolution très élevé de E2D). sulfobétaïne) . A.séparation des protéines de l’échantillon biologique par électrophorèse bidimensionnelle (E-2D).réducteurs (DTT) . Elle est trés reproductible. thiourée) .le traitement et la mise en image pour établir une carte protéique. Méthodologie 3 étapes : . La solubilisation des protéines: Action synergique d’agents : .et post-traductionnelle) et le protéome est dynamique ! B. a un haut pouvoir de résolution et posséde un caractère préparatif. . S.la caractérisation des protéines par spectrométrie de masse. ou un organisme donnée (dans une situation donnée . (17). Thébault.II/ L’analyse protéomique “Objet et évolution méthodologique de l’analyse protéomique”.détergents (CHAPS. Pourquoi ? Les niveaux d’expression protéique ne sont pas le reflet des niveaux d’expression des ARNm.chaotropes (urée. C’est un moyen de “décodage” de l’expression protéique des génes et des mécanismes contrôlant cette expression.

cette étape fondamentale permet aux protéines de sortir du gel de 1er dimension et de s’insérer dans le gel de la 2nd dimension.. La deuxième dimension. révélation immunochimique (Western Blot). l’électrophorèse SDS-PAGE Elle permet la séparation des protéines selon leur masse. Equilibrage des bandelettes GPIS. argent . Des gels de poly-acrylamide de grande taille et de porosité en gradient (8%16% par ex) sont utilisés. Une fois l’agarose gélifier. la focalisation isoélectrique (IEF) Elle permet la séparation des protéines selon leur pI. 2: La révélation et l’analyse d’image Á Méthodes de mise en image : coloration spécifique des protéines (bleu de Coomassie colloïdal. marquage radioisotopique . La migration est réalisée dans un gel de poly-acrylamide à gradient de pH préformé (pH 3-10) sur un support plastique qui constitue une bandelette GPIS.La première dimension. tmin = 10 h Séparation des protéines selon leur pI : appareillage de migration pour l’IEF (les conditions électrophorètiques comportent 3 phases : 1 h 30 à 500 V.. Sypro rubis…) par chimioluminescence. le gel est placé dans la cuve de 2nd dimension et est soumis à un ampérage max de 40 mA et un voltage max de 500 V duant 5 h à T < 10°C. Réhydratation des bandelettes GPIS en contact avec la solution de lyse-solubilisation contenant l’échantillon protéique à étudier (dans un sarcophage de réhydratation). Les bandelettes sont insérés dans de l’agarose liquide (+ SDS) coulé au-dessus du gel de 2nd dimension.) détection par fluorescence (Sypro orange. 1 h 30 à 1000 V et 6 h à 8000 V).

.Plasma SWISS 2D-PAGE Á Technologies de détection et de digitalisation: impression de plaques photographiques imager caméra CCD densitomètre Laser 3 : Limites des 2 premières étapes le caractére hydrophobe et insoluble de certaines protéines la variabilité d’expression des protéines les PM > 200 000 Da ou les PM < 7000 Da ainsi que certains pI difficultés dans l’analyse et le traitement informatisés des cartes protéiques.

secteurmagnétique. Il sépare les ions sur la base de leur rapport m / z.le séquençage du génome (bio-informatique. . hydroxylation. quadrupôle. banques…) . Système Protéine ions monochargés (M + H)+ ou (M + H)- L’analyseur est responsable de la séparation des ions gazeux formés dans la source ionisation (type ToF. formation de ponts di-sulfures. est bombardée avec un rayon laser . Application de la spectrométrie de masse (SM) à l’identification des protéines 2 grandes avancés à la base de l’identification : .1 Da) d’ionisation MALDI (matrix assisted-laser desorption/ionization) : La protéine co-cristallisée avec une matrice absorbant les photons. La spectrométrie de masse en tandem SM/SM (Q-ToF) 2 analyseurs séparés par une chambre de fragmentation (CID.4 : Identification et caractérisation des protéines L’analyse protéomique peut présenter des études de caractérisation structurale des protéines . certaines modifications post-traductionnelles (glycosylation. collision-induced dissociation). phosphorylation. ou trappe à ions). méthylation. la matrice transmet l’énergie transportée par le laser en énergie d’éxitation pour l’échantillon et ce mécanisme s’accompagne de transfert de protons.adaptation de la SM à l’analyse de polyméres biologiques (capable de détecter des différences de masse de 0. sulfatation…) et mutations ponctuelles (due au polymorphisme protéique) sont décelées sur les cartes (car elles modifient la charge ou la masse de la protéine considérée).

.Source d’ionisation ESI Chambre de collision 1 analyseur 2ème analyseur Quadrupole ToF er détecteur accélérateur Aiguille de l ’électrospray réflecteur Les appareils les plus souvent utilisés sont : Le MALDI-ToF pour l’identification des protéines Les tandem SM/SM avec notamment le quadrupole-orthogonal time of flight (Q-ToF) et la trappe à ion pour le séquençage des peptides et leur caractérisation structurale. à analyser par SM les fragments peptidiques obtenus après excision et digestion (par la trypsine le plus souvent) d’une tâche protéique. Le spectre de masse (“empreinte digitale” de la protéine) obtenu par MALDI-ToF est comparé (outil informatique MS-FIT) aux spectres de masse virtuels de protéine dont le géne est caractérisé et qui sont disponibles dans les banques de données spécialisées sur internet (SWISS-PROT par ex). La stratégie d’identification des tâches protéiques consiste.

Application de l’analyse protéomique (“ciblée”) Données comparatives sur les variations induitent par la différenciation cellulaire. d’identifier les protéines et de quantifier leur expression différencielle (mais ne permet pas de caractériser les modifications post-traductionnelles). C. l’AP permet d’étudier l’action de certains médicaments En immunologie. études de nombreux tissus et fluides biologiques sains ou malades (tumeurs diverses par ex…). de molécules utilisées en chimiothérapie… En biomédecine.L’analyse protéomique quantitative (QPA) permet à la fois. AP utilisant l’immunodétection l’identication de nouveaux couples auto-Ag / Auto-Ac permet COMPRENDRE LES MECANISMES PHYSIOPATHOLOGIQUES REPERER DES MARQUEURS SPECIFIQUES DE LA PATHOLOGIE (A forte valeur diagnostique er pronostic) . études sur le protéome de lignées tumorales… En pharmacologie. l’action de cytokines.

Destruction d’une population cellulaire II/ La technique ELISPOT III/ La technique de l’Immunoscope .FICHE TECHNIQUE N°4 PLAN I/ Les techniques de séparation cellulaire A. Les techniques de séparation par densité C. Les prélèvements B. Tri cellulaire par cytométrie de flux E. Les techniques de séparation par phase solide D.

Physiques (taille. Les prélèvements Origine : sang périphérique. on recueille le prélèvement dans un milieu de culture cellulaire (RPMI par ex). qui peuvent être décelés avec des Acm ou polyclonaux spécifiques. en étudier les fonctions. séparation sur gradient de densité continu ou discontinu. ganglions. Les cellules peuvent être distinguées par des critères : . DMSO B. les caractéristiques. rate. A. densité.I/ Les techniques de séparation cellulaire But : obtenir des populations cellulaires quasiment pures et. biopsie pathologique Les prélèvements sont généralement recueillit sur anticoagulants : citrate. 1. ainsi. ainsi que leurs réponses en culture à différents facteurs stimulants. moelle osseuse. à –80°C ou en azote liquide (besoin d’agents cryoprotecteurs . rapport nucléocytoplasmique…) .Chimiques (propriétés d’adhérence.Immunologiques (liés à la présence d’Ag intracytoplasmiques ou de surface. EDTA. La conservation peut être réalisée à 4°C (conservation des cellules dans un milieu supplémenté par 20% de sérum). héparine… Dans le cas où une culture serait envisagée. capacité enzymatique particulière…) . Centrifugation simple 200 g pendant 10 min Plasma (riche en plaquettes) Leucocytes Globules rouges . Les techniques de séparation par densité La densité de chaque population cellulaire est différente .

10 min à 20°C Plaquettes Polynucléaires 4. 20-40 min Ficoll Plasma Cellules mononuclées (L + Mo) Ficoll GR Méthode le plus fréquemment utilisée 3. Les cellules mononuclées se trouvent dans l’anneau d’interphase. . Utilisation du Ficoll Ficoll : glucide ramifié artificiel (d20°C = 1. Utilisation du Percoll Percoll : milieu de microbilles de silice enrobées séparation en gradient continu ou discontinu Les cellules sont déposées sur le gradient de Percoll et centrifugées 30 min à 400 g.2.077) Prélèvement sanguin 400-650 g Ta. Utilisation du Dextran Permet de séparer les polynucléaires Prélèvement sanguin 45 min Plaquettes + polynucléaires Dextran 100 g.

billes de taille et de nature diverse (polyacrylamide. 2.5. incubation 2 h à 37°C. 4. silice…) ou encore des hématies. agarose. Rosettes Principe : entourer les cellules concernées par de GR = « rosettes » . L’élutriation Basée sur gradient de densité Prélèvement à l’interphase Appareillage : automate Séparation de grandes quantités de cellules Préparation de poche de cytaphérèse. Adhérence simple Adhérence spontanée au plastique de certaines populations cellulaires (Mo. Ma. Adhérence immune Les cellules sont retenues par des Ac ou des lectines fixés au fond d’une boîte de Pétri 3. C. Adhérence aux fibres de Nylon Les Mo et les Ly adhérent spontanément aux fibres de Nylon (préalablement activées à pH acide). 1. « sélection positive » : population retenue par la phase solide « sélection négative » : population non retenue Phases solides : fond en plastique des boîtes de Pétri ou de culture cellulaire. soit par l’intermédiaire d’Ac ou de lectine. polystyrène. certains Ly). Les techniques de séparation par phase solide But : retenir les cellules soit par adhérence spontanée.

Après séparation par un Ficoll. puis séparées en utilisant une colonne de séparation magnétique placée dans un aimant de très forte puissance. latex. rapide.les billes magnétiques Technique MACS (« Magnetic activated cell sorting ») : # les cellules sont marquées spécifiquement avec des anticorps couplés à des microbilles magnétiques. polystyrène. # Les billes ont un diamètre de 50 nm environ et sont composées d’oxyde de fer et de polysaccharide.d’Ac secondaires (les cellules sont préalablement incubées avec des Acm) . pureté > 95%. rendement > 90%. sélection jusqu’à 109 cellules et compatible avec la cytométrie de flux. les rosettes se trouvent dans le culot et les GR sont ensuite éliminées. # Le tri est simple. silice.les billes de densité inférieure à celle de l’eau (récupérées par flottaison) . Nylon) Deux systèmes principaux : . Elles sont couplées à : . chlorure de polyvinyle. Billes Variables par leur taille et leur nature (par ex : agarose.un Ac (dirigé contre un Ag cellulaire) . 5.

élimination des cellules T dans le cadre des allogreffes de moelle (sur colonne couplée à un Acm pan T. reflets de propriétés optiques intrinsèques ou induites des cellules . Tri cellulaire par cytométrie de flux (CMF) 1934 Définition de la CMF : étude précise de cellules isolées entraînées par un flux liquide. couplées à un Ac dirigé spécifiquement contre un Ag donné. Principe technique de la CMF Les cellules sont canalisées par « centrage hydrodynamique » ( passage une à une) dans « une veine liquide » traversée par un faisceau laser Les cellules émettent des signaux lumineux. Utilisation de la chromatographie d’affinité sur colonne Colonne de billes de Sepharose ou d’acrylamide-agarose. CD5) D. Permet une caractérisation qualitative et quantitative des cellules 1.6.

sensibilité de détection. 103 cellules analysées / s (1. Le tri cellulaire Cette fonction de la CMF.une séparation mécanique (300 cellules déviées / s) vibration associée à la déviation dans un champ électrique . tri Possible de trier des populations sur une base multiparamétrique (2 morphologies et jusqu’à 5 fluorescences) Les cellules isolées sont parfaitement viables (peuvent être remises en culture) Besoin de standards calibrés pour permettre l’étalonnage de l’appareil Choix contradictoire . 104) 3. La gouttelette (contenant la cellule) est déviée par un champ électrique et collectée. traitement et stockage informatique des données représentées sous forme d’histogrammes (1 paramètre) ou de cytogrammes (2 paramètres) 2. la veine liquide. préalablement chargée électriquement.Les signaux sont séparés (par des filtres optiques). est fractionnée en gouttelettes par vibration (US). permet de séparer physiquement les éléments d’une ou deux populations cellulaires définies par leurs propriétés optiques.103 – 5. rendement / pureté (inversement proportionnelle à la vitesse du tri) Besoin de cycles d’enrichissement pour les populations minoritaires (< 5%) . collectés (par des photomultiplicateurs) puis amplifiés Numérisation des signaux. analyse multiparamétrique cellule par cellule. Jusqu’à 3. Le flux peut être fractionné par : .104 – 2. Avantages et limites Analyse quantitative. rapidité.

Par choc osmotique Adapté à l’élimination des GR. Destruction d’une population cellulaire 1. de lymphocytes T CD4+. Cytotoxicité par Ac Principe : tuer une population cellulaire par des Ac fixant le complément ou des Ac couplés à des toxines (la ricine par ex). Tri cellulaire révélé par immunofluorescence Technique FACS (« Fluorescence activated cell sorting ») Association de la fluorescence et de la CMF On utilise des anticorps (monoclonaux) dirigés contre des marqueurs de la surface cellulaire par exemple (anti-CD4+ par ex) et qui sont couplés à un fluorochrome La population cellulaire recherchée marquée est ensuite triée par le cytométre et peut être utilisée pour d’autres applications 5. 2.4. par choc hypotonique à l’eau distillée ou par choc au chlorure d’ammonium. CD8+… réalisée en diagnostic médical E. Applications de la CMF Purification des cellules CD34 pour la greffe de cellules souches hématopoïétiques Tri de cellules transfectées (utilisation conjointe du tri cellulaire et de gène rapporteur) Tri de spermatozoïdes (sélection du sexe d’un embryon) Tri de chromosome (création de banques) Tri des microorganismes de l’environnement (obtenir des souches pures d’algues unicellulaires par ex) Dénombrement de lymphocytes B. .

1-2. CD154/CD40… III/ La technique de l’Immunoscope C. Principe Détecter et dénombrer les cellules T activés chez un patient.II/ La technique ELISPOT (« Enzyme-linked immunospot ») 1983 1. Cochet (1992) « microscope du système immunitaire » Détecter sélectivement l’amplification d’un clone T (en réponse à la présentation d’un Ag) et identifier ce clone Cette technique s’appuie sur l’analyse du répertoire de cellules T d’un échantillon. utilisée pour l’activation des cellules B En 1996. La coopération cellulaire : cellule présentatrice d’Ag (CPA) / LT Activation Différenciation CPA LT LT Premier signal : CMH/peptide/TCR Second signaux : cosignaux CD28/B7. c’est cette variabilité qui est étudiée par la technique de l’immunoscope Sécrétion de cytokines 50 (24 familles) 2 6-7 . A l’origine. plus précisément sur l’analyse d’une région hypervariable du TCR La taille de la région CDR3 (entre les segments V et C) est caractéristique d’un nombre restreint de clones de cellules T. Pannetier & M. en détectant la sécrétion de cytokines (l’INFγ notamment). adaptée pour l’analyse de l’activation des lymphocytes T 2.

permettant de visualiser pour chaque couple BV-amorce fluorescente.Principe technique de l’immunoscope Réverse transcription des ARNm extraits des cellules T Division en 24 fractions des ADNc amplifiés par PCR jusqu’à saturation (40 cycles) (une amorce spécifique du segment C et la seconde sur l’un des 24 V) Amplification des ampliméres par PCR (1 à 5 cycles) avec une seule amorce spécifique de la région C ou d’un des segments J marqués en C-ter par un composé fluorescent (un seul brin copié) Séparation des amplimères marqués par une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide placé dans un séquenceur automatique Traitement des données par le logiciel Immunoscope (C. Pannetier). la distribution des fragments obtenus et de les quantifier .

CDR3 (5-15 AA) V D J C Echantillon sanguin Les 4 segments recombinés formant la chaîne β du TCR Lymphocytes T ARN V D J C Amplification par PCR Population cellulaire hétérogène Population cellulaire comprenant un clone lymphocytaire majoritaire Analyse par électrophorèse Distribution .

travailler avec un très petit nombre de cellules (. correspondant à autant de lignées de cellules T activées Un ou plusieurs clones T sont devenus majoritaires. absence d’expansion clonale Apparition d’un (ou plusieurs) pic(s) avec un écart de la distribution gaussienne.extraordinaire sensibilité . Avantages : . suite à une vaccination ou à une infection.de 20) L’inconvénient majeur est que cette technique ne permet pas de distinguer les clones T présentant des régions CDR3 distinctes mais de même taille .Traitement des résultats Profils d’une distribution gaussienne (8 pics en moyenne) population cellulaire hétérogène.

Les molécules de classes II 1. RFLP Séquençage direct Nomenclature -1- . Les molécules de classe I 1. Distribution tissulaire 2. Distribution tissulaire 2. Structure biochimique D. Structure biochimique E. Propriétés du système HLA C. 3.FICHE TECHNIQUE N°5 PLAN I/ Rappels sur le CMH / HLA A. 4. Fonctions des molécules HLA II/ Les 1. 6. 5. SSP. Organisation du CMH B. techniques d’analyse du CMH Méthode sérologique (lymphocytotoxicité) Méthode cellulaire : la Culture mixte lymphocytaire (MLR) Méthode biochimique Méthodes de BM : PCR-SSO. 2.

B et C . hémochromatose -2- . Bf). C4b. H2 (George SNELL) Historiquement : le rejet de greffe . fonction réelle : présentation Notion d’épitope T Définition fonctionnelle : ensemble de gènes impliqués dans les processus d’apprêtement de l’antigène et de présentation au lymphocyte T. Présentation au lymphocyte T CD4+ Les locus de classe III .3 4000 kb. Aucun rôle dans l’immunité : 21 hydroxylase. Rôle dans l’immunité : complément (C2. A.I/ Rappels sur le CMH / HLA CMH. HLA (Jean DAUSSET) en 1958. Rôle dans l’apprêtement : molécules chaperons (HSP-70) . Organisation du CMH Chr 6p21. Gènes D : DP. Présentation au lymphocyte T CD8+ Les locus de classe II . C4a. cytokine :TNF) . Gènes A. Définition génétique : région chromosomique où se trouvent les gènes controllant la structure et l’expression des molécules de présentation antigénique. DQ et DR . 1/1000e du génome humain environ Système multigènique (>200 gènes) Organisé en 3 sous-régions • Dont les produits des gènes se distinguent par : leur structure leur fonction leur localisation cellulaire • On distingue : Les locus de classe I .

Distribution tissulaire Ubiquitaires Expression forte : • Lymphocytes • Cellules dendritiques • Macrophages Expression faible ou nulle : • Hématies • SNC • Cellules trophoblastiques et cellules embryonnaires en débuts de développement • Certains endothéliums (pancréas. TAP1. codominance • Diversité entre individus : nombre élevé d’haplotypes différents • Transmission en bloc d’un haplotype C. glandes salivaires. F. Classes II (rôle d’apprêtement) : DM. DO. notion d’haplotype) conséquences : • Diversité des molécules HLA chez un individu : hétérozygotie. G. MIC . Les molécules de classe I 1. Classes I non classiques ou Ib : gène E. cornée) -3- . Propriétés du système HLA Système multigénique (>200 locus) Multiallélique (Polymorphisme : plusieurs allèles) Codominance Liaison (les gènes ségrègent en bloc. peu de recombinaison. LMP7 B. LMP2. TAP2.Autres locus de classes I et II .

1987) : Sillon de présentation • Formée par α 1 et α 2 • Fond : 8 feuillets β plissés antiparallèles • Bords : 2 hélices α Toujours occupée par un peptide Peptides présentés : nonamères (8-10 aa). Rôle important (conformation) Structure tridimensionnelle (Bjorman. -4- .Expression diminuée par : • Infection virale • Cellules tumorales Expression augmentée par : • INF α. • Cellule interdigitée (ganglion). Monomorphe . • Macrophages. 3 domaines extracellulaires • D’une chaîne légère β : β2 microglobuline . Les molécules de classes II 1. Distribution tissulaire Cellules présentatrices d’antigènes (CPA) au LT CD4+ : • Cellule dendritique (épithélium. B et C) . Structure biochimique Glycoprotéines transmembranaires exprimées à la surface des cellules Association non covalente : • D’une chaîne lourde α : . D. • Lymphocyte B. • Epithélium digestif et respiratoire. β et γ 2. Codée par les gènes de classe I (A. Polymorphe . Non HLA (Chr 15) . Autres cellules : • Epithélium thymique. tissus conjonctifs).

E. • Sillon : α1 et β1 . Constituants cellulaires (normaux. • Endothélium vasculaire activé. mais c’est la séquence centrale de 8-10 aa qui interagit avec le sillon.• Progéniteur hématopoïétique.Taille des peptides présentés : plus variable (13 à 34 aa). 2 domaines extracellulaires Structure tridimensionnelle : • Sillon plus ouvert à ses extrémités. bactéries intracellulaires -5- . Virus. TNFα et β 2. Lymphocyte T activé. Ag tumoraux) . Fonctions des molécules HLA Présentation Apprêtement ("processing") Pas le même type d'Ag Pas au même lymphocyte Pour les classes I et les classes II Classes I : • Ag : protéines intracellulaires . Polymorphes . IL-4. Codé chacune par un gène HLA par ex : DQA1 pour la chaîne α de la molécule DQ DQB1 pour la chaîne β de la molécule DQ . Structure biochimique Glycoprotéines transmembranaires exprimées à la surface des cellules Association non covalente : • D’une chaîne α et d’une chaîne β . Les extrémités N et C-ter débordent du sillon. Expression augmentée par : INFγ. IL-13.

• LT : CD8+ cytotoxique • Mécanisme effecteur : cytotoxicité • Fonction : . B. Surveillance du contenu protéique de la cellule . Lymphocytes à typer + Ac monospécifique + complément -> lyse ? Simple. classes II (isoler les cellules exprimant les cl II : LB. Méthode cellulaire : la Culture mixte lymphocytaire (MLR) Histoire : découverte des classes II (Benaceraf et Mac Devitt) Population stimulante irradiée (LT homozygote pour classe II) + LT à tester -> prolifération ? -6- . C et DR obtenus à partir de polytransfusés. rapide. quantité molécules de classe II exprimées) 2. Méthode sérologique (lymphocytotoxicité) Histoire : Ac lymphocytotoxiques (jean Dausset) : Ac anti classes I Ac monospécifiques anti A. Défense antibactérienne En accord avec l'expression des classes II sur les APC II/ Les techniques d’analyse du CMH 1. Défense anti-infectieuse vis à vis des germes intracellulaires En accord avec l'expression ubiquitaire des classes I Classes II : • Ag : protéines extracellulaires et membranaires (Bactéries) • LT : CD4+ auxiliaire • Mécanisme effecteur : Ac • Fonction : . fiable uniquement pour les classes I Limites : qualité des sérums utilisés (polyspécificité). de femme multipare (10% des femmes durant leur grossesse développent des Ac anti-HLA) ou de rejet de greffe.

Long. B. RFLP Amplification d'un exon du locus à étudier (PCR) Hybridation avec sonde oligonucléotodique spécifique (+/-) R* ou froide (SSO) Utilisation d’amorces spécifiques d’allèles (SSP) Digestion par des enzymes de restriction (RFLP) Technique de référence pour DP. DR 5. DQ. C + N° d'allèle Classes II : f(technique utilisée) • Sérologie : (DP-DQ-DR) + N° d'allèle • MLC : DW + N° • PCR-SSO : (DP-DQ-DR) + Chaîne + * + N° d'allèle Ex : DRB1*0402 (DR4 en sérologie) -7- . Méthodes de BM : PCR-SSO. Nomenclature Classes I : A. Méthode biochimique Isoélectrofocalisation Electrophorèse bidimensionnelle (précipitation à l’aide d’Acm. SSP. élimination des NANA et E2-D) Détermination de variants non détectés en sérologie 4. Séquençage direct En recherche Description de nouveau allèles 6. fastidieux => n'est plus utilisé 3.