Vous êtes sur la page 1sur 54

LES TECHNIQUES EN IMMUNOLOGIE

FICHE TECHNIQUE N°1

PLAN

I/ Les Anticorps monoclonaux et anticorps polyclonaux


A. Les anticorps polyclonaux
B. Les anticorps monoclonaux
 Rappel
 Principe
II/ Les réactions antigènes / anticorps
A. Généralités
B. La réaction de précipitation
 En milieu liquide : - Exemple du « ring test »
 En milieu gélifié : - Immunodiffusion double (Ouchterlony)
- Immunodiffusion radiale (Mancini)
- Electro-immnunodiffusion (Laurell)
- Immuno-électrophorèse

C. La réaction d’agglutination
 Principe : potentiel ζ
 Paramètres internes et externes
 Agglutination active : ex système ABO
 Agglutination indirecte
 Agglutination passive

Hugo MOUQUET, INSERM U519


hugo.mouquet@etu.univ-rouen.fr
I/ Les anticorps polyclonaux et monoclonaux
A. Anticorps polyclonaux (sérum polyclonal, immunosérum)
Un immunosérum renferme des Acp de classes et de sous-classes
différentes, d’affinités diverses et reconnaissent plusieurs
déterminants antigéniques.
Ag : de différente nature, pour les haptènes (< 3 kDa) ou les peptides
synthétiques (10-15 AA), ces Ag sont couplés à une protéine porteuse
de haut PM (« carrier ») ex : BSA, thyroglobuline, hémocyanine… par
l’action d’agents de couplage ex : glutaraldéhyde (NH2, SH),
carbodiimides (NH2, COOH).
Voies d’administration : sous-cutanée, intradermique, intramusculaire
et intraveineuse.
Animaux : souris, lapin, mouton, chèvre
Protocoles d’immunisation : Les animaux sont immunisés avec l’Ag en
présence d’adjuvant de Freund ; complet pour la première immunisation
et incomplet pour les rappels. Les durées entre les rappels varient.
Les animaux sont prélevés et la réactivité des sérums est testée
(ELISA, IFI, WB…).

B. Anticorps monoclonaux (Milstein, 1974-1975)


1. Rappel
Un clone lymphocytaire B possède un programme génétique unique qui
par les mécanismes de réarrangement code pour une IgG de surface
(BCR) spécifique du clone B. Le BCR qui se lie aux épitopes antigéniques
est identique au niveau structural à l’immunoglobuline sécrétée par le
plasmocyte dérivant du clone B.

2. Principe
La production d’Acm chez la souris ou le rat se fait par la technique
d’hybridation cellulaire. Elle consiste à fusionner des cellules
productrices d’Ac et des cellules d’une lignée myélomateuse. Cette
fusion conduit à la production de cellules hybrides ou hybridomes.
Sécréteur PEG
Myélome (immortel)
HGPRT+ LB M Non sécréteur
Mortel HGPRT-

Hétéromyélome
Sécréteur HM
HGPRT+
immortel Culture sur milieu HAT (Hypoxanthine,
aminoptérine, thymidine)

Aminoptérine

Voie de synthèse des Bases azotées Nucléotides


nucléotides « de novo »

HGPRT Thymidine Kinase


Voie de « sauvetage » HX
Thymidine

Ac
II/ Les réactions antigènes / anticorps
A. Généralités
Paratope
2
La réaction Ag/Ac est due à l’interaction
1
entre l’épitope et le paratope. Le complexe
(immun) Ag/Ac fait intervenir des liaisons Epitope Ag
faibles ; hydrogène, électrostatiques, les 3
forces de Van der Waals et interactions Ag + Ac ⇄ Ag-Ac
apolaires. La constante d’association K varie K = k1 / k2
4 12 K = [Ag Ac] / [Ag].[Ac]
entre 10 et 10 L/M.
Epitope séquentiel (linéaire) / épitope conformationnel
Ac monoclonal Sérum polyclonal (Ac polyclonaux)

Si l’antigène est moléculaire et soluble; les complexes Ag/Ac forment


un précipité, si l’antigène est particulaire ou cellulaire (bactéries,
hématies, billes de latex …); les complexes immuns forment un
agglutinat.

B. La réaction de précipitation
1 : En milieu liquide : le test de l’anneau (« Ring Test »)

[Ac] croissantes

[Ag]
constante

ZONE
D’EQUIVALENCE

 Paramètres physico-chimiques de la réaction :


 La température ; à θ=37°C, la précipitation est accélérée et à
θ=0°C, la quantité de précipité est augmentée
 La force ionique µ ; chez les mammifères, la quantité maximale
de précipité est obtenue pour [NaCl] < 0,15 M.
 Le pH ; la réaction est inhibée aux pH extrêmes (en dessous de
6 et au-dessus de 8,5). Effet dissociant des pH acides (élution).
 Les adjuvants de précipitation ; accélère la réaction ( ex : PEG).
2 : En milieu gélifié
Gel (agar de 5 à 20 g/l en tampon PBS pH 7,2 ou d’agarose) de 3-4 mm.

 Immunodiffusion double (Ouchterlony)


Cette technique est basée sur la double diffusion Ag et Ac dans un gel
en fonction de leur PM. Elle permet l’analyse qualitative d’un mélange
d’Ag en solution.

IDENTITE OUI NON PARTIELLE

Ag B Ag B Ag B
Antigènes Ag A Ag A Ag A

Ag

Ac

Anticorps Ac anti-A Ac anti-A Ac anti-B


Ac anti-B

Les Ag A et B n’ont
Les Ag A et B possèdent
aucun déterminant
des épitopes communs
antigènique commun

 Immunodiffusion radiale (Mancini)


Cette technique quantitative permet le dosage d’un antigène (protéine).
Protéine

1 2 3

Gel

Diffusion selon un gradient Formation d’un anneau de


Anticorps
de concentration décroissant précipitation ; réseau Ag/Ac
[Ag]

14
d2 = a.[Ag] + b Etalon 1 ; 1,5 mg/l
12
10
diamétre2

Etalon 2 ; 3 mg/l
8
6
4
Etalon 3 ; 6 mg/l
2
0
0 2 4 6 8 [Ag] inconnue ; ? mg/l

[Protéine] (mg/l)

dosage des IgG sériques

 Electro-immunodiffusion (Laurell)

Cette technique permet d’accélérer le temps de diffusion en obligeant


l’Ag à migrer sous l’effet d’un champ électrique, dans un gel contenant
l’Ac. Le pH du gel est choisi de façon que les Ac soient immobiles (pI
des Ig) et que l’Ag chargé négativement migre (blocage des NH2 ;
carbamylation, formylation).

« Rockets » 14
12
hauteur (h)

10
8
h
6
4
2
0
0 2 4 6 8
1 2 3 4 ?
Etalons [Protéine] (mg/l)

La hauteur des «fusées» (lignes de précipitation) est proportionnelle à


la [Ag].
 Immuno-électrophorèse (Grabar et Williams)

Cette technique renforce le pouvoir


analytique des doubles diffusions en
identifiant les constituants d’un mélange par 2
propriétés indépendantes, leur mobilité
électrophorètique et leur spécificité
antigènique.

 1er tps ; un mélange d’Ag est soumis à un


champ électrique (de 5 à 8 V) le long duquel
les constituants se répartissent en fonction
de leur mobilité électrophorètique.
(Tampon Véronal-Tris)
2e tps ; un immunosérum polyspécifique
diffuse dans un sens perpendiculaire à celui
de la piste électrophorètique dont les
fractions diffusent en sens inverse.
L’exploitation des résultats est basée
sur celle de la technique d’Ouchterlony.

C. La réaction d’agglutination
1 : Principe
Les réactions d’agglutination mettent en jeu un Ag situé à la
surface d’une particule de taille comprise entre le dixième et la dizaine
de micron (globules rouges, globules blancs, plaquettes, spermatozoïdes,
micro-organismes, billes de latex ou de sépharose). C’est un phénomène
complexe au cours duquel les Ac s’unissent aux Ag portés par la
particule formant ainsi des ponts spécifiques entre ces particules
permettant leur réunion en amas.
2 : Le potentiel Zêta
Deux forces antagonistes jouent un rôle dans l’interaction des
particules entre elles : - la tension interfaciale, qui tend à agréger les
particules entre elles.
- la force de répulsion (prédominante), à effet
opposé, elle provient des charges électriques identiques des particules.

_ + + + _
+ + + CH2OH
HO C H
_ + +
+ + _ HOOC HO C H
GR O
+
+
ζ H
OH
_ NANA (acide sialique)
+ + OH H
+ H H
+ +
+ + H NH2
_ _
+ +
_ _ La force de répulsion est fonction du
potentiel ζ (-16 mV pour [NaCl] = 0,15
Pollack : ζ = σ / (D x √µ) M). Lorsque les Ac recouvrent les GR,
l’état électrique est modifié, en cela les
IgM s’avèrent plus efficaces.
σ : charge électrique
D : constante diélectrique du milieu
µ : force ionique du milieu

3 : Les paramètres de réaction


 Les Ac ; dits agglutinants (IgM en majorité) sont capables de
produire une agglutination des particules en suspension dans un milieu
salin de [NaCl] = 0,15 M.
dits non-agglutinants sont incapables de provoquer une
agglutination dans ces conditions.

 Les Ag ; il existe une relation entre l’agglutinabilité et :


- le nombre de sites antigéniques
- leur localisation
Les facteurs expérimentaux ;
- La température, plus elle est élevée plus l’agitation moléculaire
est importante (augmentation de p (rencontre)).

L’agglutination est plus


rapide à 37°C, cependant
la quantité finale d’Ac
fixés est plus élevée à
basse température (après
24 h). On distingue des
Ac « chauds » et des Ac
« froids ».

- Le pH, optimum entre 6 et 8

- La force ionique (effet quasi nul), elle contrarie l’union Ag-Ac


mais favorise la formation du réseau (par la diminution du
potentiel ζ).

4 : Les réactions
 Agglutination active
Elle résulte d’une union spécifique entre un Ac agglutinant et un Ag
appartenant en propre à la particule. Elle peut se faire en tubes, en
microplaques ou sur lame et peuvent être qualitatives ou quantitatives
(la dernière dilution du sérum où l’on observe encore une agglutination).

 Sérogroupages bactériens (Salmonella, Shigella, E. coli,


entérophathogènes…)

 Groupage sanguin ABO


 Agglutination indirecte
Elle se produit entre un Ac non agglutinant et un Ag faisant
normalement partie intégrante de la particule, en faisant appel à un
artifice. De façon générale, on peut obtenir une agglutination avec des
Ac non agglutinants en diminuant le potentiel ζ (↘σ ou ↘D ou↘µ).

Les techniques :
1. Ajout au MR des macromolécules qui pontent les Ac unis à des
cellules voisines (par րD). ex la BSA, le Dextran, le Ficoll…

2. Hydrolyse des glycoprotéines présentes à la surface des cellules par


protéases (la papaïne, la fucine, la broméline, la trypsine…). Leur
action permet la diminution de σ (libération de NANA), une meilleure
accessibilité des Ag (mise en place de liaison hydrophobe) et une
redistribution des récepteurs aux Ag.

3. Utilisation Ac anti-Ac
GR GR

Ac anti-isotype

 Phénotypage Rhésus

 Agglutination passive
Elle est réalisée entre un Ac et un Ag normalement soluble, mais rendu
particulaire par fixation sur un support :

1. Les billes de latex ; l’Ag est fixé par simple contact (pH 8,2)

2. Les hématies ; l’Ag est fixé par simple contact, par traitement à
l’acide tannique, par fixation chimique (glutaraldéhyde, di-nitro
chloro-benzéne…) ou par fixation immunologique (cas des Ac dirigés
contre des épitopes du GR).
Inconvénients : - fragiles, elles s’hémolysent en 3 semaines (utilisation
d’hématies formolées, stables plusieurs mois à 4°C)
- elles portent une mosaïque d’Ag

 recherche du facteur rhumatoïde (réaction de Waaler Rose ; IgG


lapin anti-GR de mouton + GR mouton
 test de grossesse, détection de l’hormone gonadotrophine
chorionique (HGC) dans l’urine ; GR recouverte d’hormone mise en
contact des Ac anti-HGC et l’urine de la femme suspectée d’être
enceinte. Les [GR-HGC] et [Ac anti-HGC] sont optimums pour
l’agglutination.

Agglutination Oui Non

HGC dans l’urine Non Oui

Réaction Equilibre Excès d’Ag

♀ non enceinte ♀ enceinte


FICHE TECHNIQUE N°2

PLAN

Les techniques immuno-enzymatiques


I/ Les techniques ELISA
A. Principe
B. Différentes méthodes
 Dosage d’Ag
 Dosage d’Ac
C. Applications

II/ L’immuno-empreinte
A. Séparation des Ag par SDS-PAGE
B. Le transfert des protéines sur membrane
C. La révélation immunologique

III/ L’immunofluorescence
A. Indirecte (IFI)
 Principe
 Rappel sur la fluorescence
 Organigramme expérimental
 Applications
B. Directe (IFD)

IV/ La purification d’immunoglobulines


 Méthodes chimiques, chromatographiques, physiques
 Purification d’Ac spécifiques
I/ Techniques immuno-enzymatiques : les tests ELISA (enzyme
linked immunosorbent assay)
A. Principe
Elles reposent sur l’utilisation d’une enzyme pour déceler les
complexes immuns. Les techniques ELISA sont très utilisées en :
 recherche fondamentale et appliquée (reconnaissance
des épitopes protéiques, des haptènes)
 analyse médicale, pour le dosage de nombreuses
substances (Ag, Ac, hormones, marqueurs tumoraux,
médicaments…)

Méthodes
 En phase homogène : La fixation de l’enzyme au complexe immun
modifie son activité (révélation directe).
 En phase hétérogène : Activité enzymatique inchangée après la
fixation (besoin d’une étape de séparation entre les complexes
marqués et l’Ag ou Ac marqués).

Systèmes biologiques
 Ag : liquide biologique, une préparation brute ou purifiée de l’Ag
ou de l’haptène.
 Ac : immunosérum total, des Ig purifiées ou des Acm (évite les
réactions croisées).

Phase solide et « fixation »


 Par adsorption passive sur du verre, du plastique, du polystyrène,
latex… sous forme de billes, de plaques, de tubes, de
microplaques…
 Par liaison covalente entre l’Ag ou l’Ac à la phase solide appropriée
(cellulose activée, agarose ou acrylamide par le glutaraldéhyde).

Conjugués, enzymes et substrats en phase hétérogène


L’agent chimique utilisé pour coupler une enzyme à un Ag ou à un Ac
ne doit pas altérer l’activité enzymatique ni celle du réactif
immunologique. On utilise : le glutaraldéhyde, du bromure de
cyanogène, le carbodiimide… . Besoin de séparation de l’enzyme en
excès par chromatographie d’exclusion moléculaire.

ENZYME ORIGINE SUBSTRAT

Peroxydase (1) Raifort (radis noir) Diaminobenzidine, H2O2

Tétraaminobenzidine, H2O2

Phosphatase alcaline E. coli ou muqueuse 4-nitro-phényl-phosphate

(2) intestinale de veau

ß-D galactosidase (3) E. coli 2-nitro-phényl-ß-D-

galactopyrannoside

(ONPG)

Glucose oxydase Aspergillus niger Chromogène + H2O2

Glucose 6 phosphate Leuconostoc Glucose 6 phosphate +

déshydrogénase mesenteroïdes NAD+

(1) : pour les dosages rapides


(2) et (3): pour un grand nombre d’échantillon

En fonction du substrat, le produit de la réaction est mesuré par


spectrophotométrie, colorimétrie (examen visuel) ou par
fluorométrie.

B. Différentes méthodes d’ELISA en phase hétérogène


1 : Dosage des antigènes
 Par compétition : Vis à vis d’Ac présents en quantité limitée, et
fixés sur un support, il y a compétition entre l’Ag à doser et l’Ag
marqué (de même spécificité) ajouté en quantité définie dans le
même temps.
 Méthode en « sandwich »
S’applique aux Ag possédant au moins 2 épitopes (identiques ou non)

Réaction Ag à doser Addition du second Ac marqué Révélation de la réaction

Ac en excès Ag à doser Ac marqué en excès

Activité enzymatique
liée au support (DO)

Activité (DO) = k . [Ag x]

[Ag x]

 Directe : Dosage immuno-enzymométrique ou IEMA

 Amplification par le système avidine-biotine (ABC)


La biotine (coenzyme facile à lier aux Ig) a une très
forte affinité pour l’avidine (blanc d’œuf) et la
Avidine
streptavidine (Streptomyces avidinii). L’Ac biotynilé se
lie sur l’Ag fixé à la phase solide puis, de la
streptavidine conjuguée à une enzyme se lie à la biotine
Biotine
(complexe ternaire).
2 : Dosage des anticorps
 Indirecte avec Ag marqué

Réaction Ag / Ac Addition de l’Ag marqué Révélation de la réaction

Ag en excès Ac à doser Ag marqué en excès

Activité enzymatique
liée au support (DO)

Activité (DO) = k . [Ac]

[Ac x]

 Indirecte avec Ac secondaire marqué

Puits négatif Puits positif


Activité enzymatique
liée au support (DO)

Activité (DO) = k . [Ac]

[Ac]

✑ Protocole expérimental en TP

Un seuil de positivité est déterminé par un index calculé à partir des


DO de témoins connus (moyenne DO sujets sains + 2-3 σ pour ex).

C. Applications

 Dosage des protéines : la ß2m, drogues, hormones (insuline,


glucacon…), médicaments, enzymes (énolase, lipase…), les facteurs
rhumatoïdes, vitamines, IgE…

 Diagnostic sérologique : parasitaire, bactériologique par titrage


d’anticorps (Brucella, Salmonelle, Treponema…), virologique (HIV,
rubéole, hépatite A-B, varicelle, herpés, grippe…)

 Maladies auto-immunes : recherche et dosage des FR, des Ac


anti-ADN, anti-histones, anti-Dsg1/3…
II/ L’immuno-empreinte (immunotransfert ou « western blot »)
Cette technique combine le pouvoir de séparation de
l’électrophorèse et la grande sensibilité de l’immunodétection, ce qui
en fait un outil performant pour l’identification d’un Ag ou d’un Ac.

A. Séparation des Ag par SDS-PAGE


Les protéines d’un extrait tissulaire ou cellulaire ou des
protéines recombinantes dénaturées et chargées négativement,
migrent dans un gel d’acrylamide / bis-acrylamide (de teneur x %)
sous l’action d’un champ électrique. Elles sont séparées en fonction
de leur PM.

Solution de dépôt des échantillons : Solution de Laëmmli (Tris 0,5 M


pH 6,8, glycérol 20%, SDS 40%, Bleu de bromophénol 0,009%, DTT
10%)

Protéine native A
SDS
Dithiotreïtol
A S S B Fragments polypeptidiques
100°C, 3 minutes

CH2 SH
HC OH CH3 (CH2)11 SO3- Na+
HC OH ⊝
CH2 SH SDS

DTT B

120 V
A t=2h

La migration achevée, le gel peut


être colorée s’il ne constitue pas
la première étape du WB :
SDS-PAGE ⊕
Bleu de Coomassie (0,2 à 0,5 µg de protéine / piste), nitrate d’argent
(0,01 à 0,05 µg de protéine / piste)…
B. Le transfert des protéines sur membrane

Les protéines contenues dans le gel sont transférées sur une


membrane de nitrocellulose ou de PVDF sous l’action d’un champ
électrique.

Temps de transfert : 2 h (à 18 h), voltage


ANODE 30 V (à 60 V)

Coussins absorbants

Papiers buvards
Le tampon de transfert contient
Membrane de nitrocellulose
du méthanol qui augmente la
Gel de polyacrylamide capacité de la NC à absorber les
protéines, et empêche le gel de
Papiers buvards
gonfler
Coussins absorbants

CATHODE

A la suite du transfert, la membrane qui contient les protéines peut


être colorée à l’aide de rouge Ponceau puis est décolorée avec de
l’acide acétique 5% et enfin séchée.
Marqueur

⇐ 35,3-kDa
⇐ 28,2-kDa
⇐ 20,8-kDa
C. La révélation immunologique
1/ Principe

H2O2
Second Ac
Luminol
Peroxydase oxydé
Forme oxydée
Protéine de l'enzyme LUMIERE
+
Premier Ac Luminol
(Sérum) +
Activateur

Membrane NC Film photographique

Figure. Principe de la révélation immunologique par ECL


Les protéines transférées sur membrane de NC sont incubées avec
des immunosérums ou des Ac. Les protéines ayant formé des
complexes Ag /Ac réagissent ensuite avec des Ac (de chèvre) dirigés
contre les IgG de l’espèce d’origine du sérum testé. Ces Ac
secondaires sont couplés à la peroxydase (ou à la phosphatase
alcaline). La peroxydase oxyde le luminol qui va émettre de la lumière
permettant la révélation autoradiographique des complexes.

2/ Organigramme du protocole expérimental (TP)

Découpage de la membrane en bandelettes

Saturation dans du tampon TBS, Tween 0,05%, 5% lait

Lavages dans du tampon TBST

Incubation avec le(s) sérum(s) ou les Ac dilués


dans du tampon TBS, Tween 0,05%, 5% lait

Lavages dans du tampon TBST


Incubation avec les Ac secondaires (conjugués à une enzyme ;
peroxydase ou phosphatase alcaline) dilués dans du tampon TBS,
Tween 0,05%, 5% lait

Lavages dans du tampon TBST

Révélation ECL ou colorimétrique

Analyse des résultats

O O
-
NH H2O2 O
- + N2 + Lumière
NH Peroxydase O

NH2 O NH2 O

Figure. Principe de la chimioluminescence. La chimioluminescence


est basée sur une émission de lumière provoquée par la dissipation de
l'énergie d'une molécule qui se trouve dans un état excité par une
réaction chimique. L’oxydation du luminol est catalysée par le
système HRP (horseradish peroxydase) / peroxyde d'hydrogène en
conditions alcalines, celle-ci provoque l’excitation du luminol qui va
retourner à son état fondamental en émettant de la lumière.

Ex : révélation colorimétrique

SDS-PAGE 4%
Extrait de peau

160 kDa
III/ L’immunofluorescence

L’immunofluorescence classique permet de déceler une réaction Ag /


Ac sur des cellules en suspension, des frottis cellulaires, des
microorganismes ou des coupes d’organe.

A. Indirecte (IFI)

1/ Principe

Second Ac - FITC

Premier Ac
FLUORESCENCE
(Sérum)

Microscope à
Coupe tissulaire fluorescence

2/ Rappel sur la fluorescence

Luminescence : phénomène défini comme une radiation émise par un


atome ou une molécule après l’absorption d’énergie qui l’a conduit
dans un état excité.
λexcitation < λémission I
Eémission < Eexcitation
Absorption

Emission

Spectre d’absorption = ensemble


des e- dans leur état excité.
Le spectre d’émission des fluo- λ (nm)
rochromes est dans le visible.
Fluorochromes :
 FITC : dérivé de la fluorescéine (λémission = 520 nm, couleur
verte).
 Rhodamine et ses dérivés, utilisé en général pour le double
marquage, donne une fluorescence rouge-orangée.
Rq :Système amplificateur avidine / biotine

Microscope à fluorescence :
 A lumière réfléchie
 A lumière transmise
Lampes à vapeur d’halogène ou de mercure
Système d’acquisition : appareil photos, caméra…

3/ Organigramme du protocole expérimental

Incubation des coupes (3-4 µm) fixées sur lame avec le sérum ou l’Ac
dilué dans du tampon PBS (1 h)

Lavages dans du tampon PBS

Incubation des complexes avec les Ac secondaires dilués dans du


tampon PBS (30 min)

Lavages dans du tampon PBS

Montage entre lame et lamelle puis observation au microscope

4/ Applications
 Auto-immunité : détection des Ac anti-nucléaire, anti-organites ou
Ac spécifiques d’organe.
humain
Epiderme

HepG2
Anti-ADN natif, dénaturé, Anti-Dsg1
anti-histones, etc.
 Microbiologie : bactériologie, virologie (cinétique de multiplication
de virus, détection de virus responsable d’infection respiratoire)…

B. Directe (IFD)
Méthode en « un temps », l’Ag est recherché directement par l’Ac
spécifique marqué.

 Recherche des dépôts d’Ig ou de complément dans les tissus.

IV/ La purification d’Immunoglobulines


1. Méthodes chimiques
 Par relargage des sels par précipitation au sulfate d’ammonium en
concentration quasi saturante.
 Par précipitation à l’éthanol, les Ig précipitent entre 12 et 20%
d’EthOH.

2. Méthodes chromatographiques
 Echangeuse d’ions, par ex fractionnement sur résine basique type
diéthylaminoéthyl (DEAE cellulose), présence des Ig dans le 1er
pic d’élution à 99,5 % de pureté.
 Affinité, sur colonne de protéine A (protéine de paroi de 90% des
S. aureus, capable de fixer le fragment Fc des Ig) ou de protéine
G (Steptococcus).
 Exclusion moléculaire (gel filtration, tamis moléculaire), sur
Séphadex 150 (limite d’exclusion 200 kDa) pour fractionner les Ig
(150 kDa), sur Sépharose 4B (limite d’exclusion 4000 kDa) pour
fractionner IgM (970 kDa)…
 HPLC, fractionnement d’un sérum en 30 min

3. Ultracentrifugation
Centrifugation du sérum à 100 000 g pendant 18 h sur gradient de
saccharose, IgM dans les premières fractions (19 S) puis les Ig (8 S
à 6,6 S).
4. Purification d’Ac spécifiques

On récupère l’Ac spécifique lié à l’Ag fixé sur un support par :


 Fixation-élution sur l’Ag immobilisé sur membrane de
nitrocellulose
 Chromatographie d’affinité, utilisant des billes de sépharose ou
d’agarose (activées par le bromure de cyanogène) couplées à l’Ag
ou à haptène. Cette méthode peut être appliquée à l’isolement d’un
Ag (résine couplée à l’Ac spécifique).

Rq : les solutions d’élution sont acides (pH proche de 2,5), il est donc
nécessaire de neutraliser le pH du milieu rapidement.
FICHE TECHNIQUE N°3

PLAN

I/ Immunocriblage de banque d’expression d’ADNc


A. Principe
B. Protocole expérimental de criblage
C. Application à la recherche de nouveaux auto-antigènes
II/ Analyses protéomiques
A. Le protéome
B. Méthodologie
1 : L’électrophorèse bidimensionnelle
2 : La révélation et l’analyse d’image
3 : Limites des 2 premières étapes
4 : Identification et caractérisation des protéines
La spectrométrie de masse

C. Application de l’analyse protéomique (“ciblée”)


I/ Immunocriblage de banque d’expression d’ADNc

A. Principe

Extraction des ARNm


(à partir de tissus ou de culture cellulaire spécifique)
BANQUE

Réverse transcription en ADNc

Clonage dans un vecteur (phage ou phagémide)

Transfection dans E. Coli

Expression des protéines à la surface des phages


CRIBLAGE

Immunocriblage avec des immunosérums / Ac

Isolement du clone bactérien exprimant


la protéine immunoréactive

Amplification et conservation du clone d’intérêts


IDENTIFICATION

PCR sur colonie

Purification et séquençage de l’ADNc

Comparaison aux banques de données


(Genebank, EMBL, DDBJ…) et identification
de la protéine immunoréactive
B. Protocole expérimental du criblage

Bactéries + phages

Incubation 4 h à 37°C
Incubation 4 h à 42°C

Boîte de Pétri
Révélation des filtres en
Filtre de nitrocellulose imprégné
immuno-empreinte
d’IPTG (expression de l’ADNc de
chaque phage)

1 tache positive
Prélèvement du spot correspondant
sur la boîte de Pétri

(IPTG: isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)

Immunocriblage d’une banque d’expression


d’ADNc de kératinocytes avec le surnageant
contenant l’acm F12 (Pemphigus vulgaire).

 7 colonies d’un clone positif


/ 50 plages de lyse
C. Application à la recherche de nouveaux auto-antigènes

 Dans la Polyarthrite rumatoïde (PR), identification d’une protéine


proche de la follistatine, auto-Ag chez 44% des patients (Tanaka
et al)

 De même dans la PR, une autre cible des auto-Ac présents chez
57% des malades est la calpastatine (Mimori et al)

 Au cours du Lupus érythémateux disséminé, 2 nouvelles protéines


de la régulation transcriptionnelle, DEK et ALY, ont étés mises en
évidence

 Le criblage d’une banque de kératinocyte avec des Ac purifiés à


partir de sérum de patients atteints de Pemphigus vulgaire (PV), a
permis d’identifier la Desmogléine 3, à l’heure actuelle un véritable
marqueur diagnostic de la maladie (Amagaï et al)

 Récemment, la pemphaxine a été cité comme un nouvel auto-Ag au


cours du PV.
II/ L’analyse protéomique
“Objet et évolution méthodologique de l’analyse protéomique”, S.
Thébault. M/S mai 2001, (17).

A. Le protéome
Il est défini (1995) comme la totalité de la partie protéique exprimée
dans une cellule, un tissu, ou un organisme donnée (dans une situation
donnée ; physiologique, pathologique…). C’est un moyen de “décodage”
de l’expression protéique des génes et des mécanismes contrôlant
cette expression.
 Pourquoi ?
Les niveaux d’expression protéique ne sont pas le reflet des niveaux
d’expression des ARNm, les protéines peuvent être modifier
(maturation co- et post-traductionnelle) et le protéome est
dynamique !

B. Méthodologie
3 étapes : - séparation des protéines de l’échantillon biologique par
électrophorèse bidimensionnelle (E-2D).
- le traitement et la mise en image pour établir une carte
protéique.
- la caractérisation des protéines par spectrométrie de
masse.

1: L’électrophorèse bidimensionnelle
Elle combine 2 séparations des protéines selon 2 critéres
indépendants le pI et la masse (pouvoir de résolution très élevé de E-
2D). Elle est trés reproductible, a un haut pouvoir de résolution et
posséde un caractère préparatif.

 La solubilisation des protéines:


Action synergique d’agents : - chaotropes (urée, thiourée)
- détergents (CHAPS, sulfobétaïne)
- réducteurs (DTT)
 La première dimension, la focalisation isoélectrique (IEF)
Elle permet la séparation des protéines selon leur pI. La migration
est réalisée dans un gel de poly-acrylamide à gradient de pH
préformé (pH 3-10) sur un support plastique qui constitue une
bandelette GPIS.

Réhydratation des bandelettes GPIS en contact avec la solution de


lyse-solubilisation contenant l’échantillon protéique à étudier (dans un
sarcophage de réhydratation). tmin = 10 h

Séparation des protéines selon leur pI : appareillage de migration


pour l’IEF (les conditions électrophorètiques comportent 3 phases :
1 h 30 à 500 V, 1 h 30 à 1000 V et 6 h à 8000 V).

Equilibrage des bandelettes GPIS, cette étape fondamentale


permet aux protéines de sortir du gel de 1er dimension et de s’insérer
dans le gel de la 2nd dimension.

 La deuxième dimension, l’électrophorèse SDS-PAGE


Elle permet la séparation des protéines selon leur masse. Des gels
de poly-acrylamide de grande taille et de porosité en gradient (8%-
16% par ex) sont utilisés. Les bandelettes sont insérés dans de
l’agarose liquide (+ SDS) coulé au-dessus du gel de 2nd dimension. Une
fois l’agarose gélifier, le gel est placé dans la cuve de 2nd dimension
et est soumis à un ampérage max de 40 mA et un voltage max de 500
V duant 5 h à T < 10°C.

2: La révélation et l’analyse d’image

➪ Méthodes de mise en image :


 coloration spécifique des protéines (bleu de Coomassie colloïdal,
argent ...)
 détection par fluorescence (Sypro orange, Sypro rubis…) par
chimioluminescence, révélation immunochimique (Western Blot),
marquage radioisotopique
Plasma SWISS 2D-PAGE

➪ Technologies de détection et de digitalisation:


 impression de plaques photographiques
 imager
 caméra CCD
 densitomètre Laser

3 : Limites des 2 premières étapes


 le caractére hydrophobe et insoluble de certaines protéines
 la variabilité d’expression des protéines
 les PM > 200 000 Da ou les PM < 7000 Da ainsi que certains pI
 difficultés dans l’analyse et le traitement informatisés des cartes
protéiques.
4 : Identification et caractérisation des protéines
L’analyse protéomique peut présenter des études de
caractérisation structurale des protéines ; certaines modifications
post-traductionnelles (glycosylation, phosphorylation, méthylation,
hydroxylation, formation de ponts di-sulfures, sulfatation…) et
mutations ponctuelles (due au polymorphisme protéique) sont
décelées sur les cartes (car elles modifient la charge ou la masse de
la protéine considérée).

Application de la spectrométrie de masse (SM) à l’identification


des protéines

2 grandes avancés à la base de l’identification :


- le séquençage du génome (bio-informatique, banques…)
- adaptation de la SM à l’analyse de polyméres biologiques
(capable de détecter des différences de masse de 0,1 Da)

 Système d’ionisation MALDI (matrix assisted-laser


desorption/ionization) :
La protéine co-cristallisée avec une matrice absorbant les photons,
est bombardée avec un rayon laser ; la matrice transmet l’énergie
transportée par le laser en énergie d’éxitation pour l’échantillon et ce
mécanisme s’accompagne de transfert de protons.

Protéine ions monochargés (M + H)+ ou (M + H)-

 L’analyseur est responsable de la séparation des ions gazeux


formés dans la source ionisation (type ToF, quadrupôle, secteur-
magnétique, ou trappe à ions). Il sépare les ions sur la base de leur
rapport m / z.

 La spectrométrie de masse en tandem SM/SM (Q-ToF)


2 analyseurs séparés par une chambre de fragmentation (CID,
collision-induced dissociation).
Chambre de collision
Source d’ionisation er
1 analyseur
ESI 2ème analyseur
Quadrupole
ToF
détecteur

accélérateur

Aiguille de
l ’électrospray

réflecteur

Les appareils les plus souvent utilisés sont :


 Le MALDI-ToF pour l’identification des protéines
 Les tandem SM/SM avec notamment le quadrupole-orthogonal
time of flight (Q-ToF) et la trappe à ion pour le séquençage des
peptides et leur caractérisation structurale.

La stratégie d’identification des tâches protéiques consiste, à


analyser par SM les fragments peptidiques obtenus après excision et
digestion (par la trypsine le plus souvent) d’une tâche protéique. Le
spectre de masse (“empreinte digitale” de la protéine) obtenu par
MALDI-ToF est comparé (outil informatique MS-FIT) aux spectres
de masse virtuels de protéine dont le géne est caractérisé et qui
sont disponibles dans les banques de données spécialisées sur
internet (SWISS-PROT par ex).
L’analyse protéomique quantitative (QPA) permet à la fois,
d’identifier les protéines et de quantifier leur expression
différencielle (mais ne permet pas de caractériser les modifications
post-traductionnelles).

C. Application de l’analyse protéomique (“ciblée”)

 Données comparatives sur les variations induitent par la


différenciation cellulaire, l’action de cytokines, de molécules
utilisées en chimiothérapie…

 En biomédecine, études de nombreux tissus et fluides biologiques


sains ou malades (tumeurs diverses par ex…), études sur le
protéome de lignées tumorales…

 En pharmacologie, l’AP permet d’étudier l’action de certains


médicaments

 En immunologie, AP utilisant l’immunodétection permet


l’identication de nouveaux couples auto-Ag / Auto-Ac

COMPRENDRE LES MECANISMES PHYSIOPATHOLOGIQUES

REPERER DES MARQUEURS SPECIFIQUES DE LA PATHOLOGIE


(A forte valeur diagnostique er pronostic)
FICHE TECHNIQUE N°4

PLAN

I/ Les techniques de séparation cellulaire


A. Les prélèvements
B. Les techniques de séparation par densité
C. Les techniques de séparation par phase solide
D. Tri cellulaire par cytométrie de flux
E. Destruction d’une population cellulaire

II/ La technique ELISPOT

III/ La technique de l’Immunoscope


I/ Les techniques de séparation cellulaire
But : obtenir des populations cellulaires quasiment pures et, ainsi, en
étudier les fonctions, les caractéristiques, ainsi que leurs réponses
en culture à différents facteurs stimulants.

Les cellules peuvent être distinguées par des critères :


- Physiques (taille, densité, rapport nucléocytoplasmique…)
- Chimiques (propriétés d’adhérence, capacité enzymatique
particulière…)
- Immunologiques (liés à la présence d’Ag intracytoplasmiques
ou de surface, qui peuvent être décelés avec des Acm ou
polyclonaux spécifiques.

A. Les prélèvements
Origine : sang périphérique, moelle osseuse, ganglions, rate, biopsie
pathologique

 Les prélèvements sont généralement recueillit sur anticoagulants :


citrate, EDTA, héparine…

 Dans le cas où une culture serait envisagée, on recueille le


prélèvement dans un milieu de culture cellulaire (RPMI par ex).

 La conservation peut être réalisée à 4°C (conservation des cellules


dans un milieu supplémenté par 20% de sérum), à –80°C ou en
azote liquide (besoin d’agents cryoprotecteurs ; DMSO

B. Les techniques de séparation par densité

 La densité de chaque population cellulaire est différente ;


séparation sur gradient de densité continu ou discontinu.

1. Centrifugation simple
Plasma (riche en
200 g pendant 10 min plaquettes)
Leucocytes

Globules rouges
2. Utilisation du Ficoll
Ficoll : glucide ramifié artificiel (d20°C = 1,077)

Prélèvement
sanguin

400-650 g
Plasma

Ta, 20-40 min Cellules mononuclées (L + Mo)


Ficoll Ficoll
GR

Méthode le plus fréquemment utilisée

3. Utilisation du Dextran
Permet de séparer les polynucléaires

Prélèvement
sanguin

45 min Plaquettes + polynucléaires

Dextran
100 g, 10 min à 20°C

Plaquettes

Polynucléaires

4. Utilisation du Percoll
Percoll : milieu de microbilles de silice enrobées
 séparation en gradient continu ou discontinu
Les cellules sont déposées sur le gradient de Percoll et centrifugées
30 min à 400 g. Les cellules mononuclées se trouvent dans l’anneau
d’interphase.
5. L’élutriation
 Basée sur gradient de densité
 Prélèvement à l’interphase
 Appareillage : automate
 Séparation de grandes quantités de cellules

 Préparation de poche de cytaphérèse.

C. Les techniques de séparation par phase solide

But : retenir les cellules soit par adhérence spontanée, soit par
l’intermédiaire d’Ac ou de lectine.

 « sélection positive » : population retenue par la phase solide


 « sélection négative » : population non retenue

Phases solides : fond en plastique des boîtes de Pétri ou de culture


cellulaire, billes de taille et de nature diverse (polyacrylamide,
agarose, polystyrène, silice…) ou encore des hématies.

1. Adhérence simple
 Adhérence spontanée au plastique de certaines populations
cellulaires (Mo, Ma, certains Ly), incubation 2 h à 37°C.

2. Adhérence immune
 Les cellules sont retenues par des Ac ou des lectines fixés au fond
d’une boîte de Pétri

3. Adhérence aux fibres de Nylon


 Les Mo et les Ly adhérent spontanément aux fibres de Nylon
(préalablement activées à pH acide).

4. Rosettes
Principe : entourer les cellules concernées par de GR = « rosettes »
Après séparation par un Ficoll, les rosettes se trouvent dans le culot
et les GR sont ensuite éliminées.

5. Billes
 Variables par leur taille et leur nature (par ex : agarose,
polystyrène, chlorure de polyvinyle, silice, latex, Nylon)

 Deux systèmes principaux : - les billes de densité inférieure à


celle de l’eau (récupérées par flottaison)
- les billes magnétiques

Technique MACS (« Magnetic activated


cell sorting ») :

✗ les cellules sont marquées spécifiquement


avec des anticorps couplés à des
microbilles magnétiques, puis séparées en
utilisant une colonne de séparation
magnétique placée dans un aimant de très
forte puissance.

✗ Les billes ont un diamètre de 50 nm


environ et sont composées d’oxyde de fer
et de polysaccharide.

✗ Le tri est simple, rapide, pureté > 95%,


rendement > 90%, sélection jusqu’à 109
cellules et compatible avec la cytométrie
de flux.

 Elles sont couplées à :


- un Ac (dirigé contre un Ag cellulaire)
- d’Ac secondaires (les cellules sont préalablement
incubées avec des Acm)
6. Utilisation de la chromatographie d’affinité sur colonne
 Colonne de billes de Sepharose ou d’acrylamide-agarose, couplées
à un Ac dirigé spécifiquement contre un Ag donné.

élimination des cellules T dans le cadre des allogreffes de moelle


(sur colonne couplée à un Acm pan T, CD5)

D. Tri cellulaire par cytométrie de flux (CMF)


 1934
Définition de la CMF : étude précise de cellules isolées entraînées
par un flux liquide.

 Permet une caractérisation qualitative et quantitative des cellules

1. Principe technique de la CMF

Les cellules sont canalisées par « centrage hydrodynamique » (


passage une à une) dans « une veine liquide » traversée par un
faisceau laser

Les cellules émettent des signaux lumineux, reflets de propriétés


optiques intrinsèques ou induites des cellules
Les signaux sont séparés (par des filtres optiques), collectés (par des
photomultiplicateurs) puis amplifiés

Numérisation des signaux, traitement et stockage informatique des


données représentées sous forme d’histogrammes (1 paramètre) ou
de cytogrammes (2 paramètres)

2. Le tri cellulaire
Cette fonction de la CMF, permet de séparer physiquement les
éléments d’une ou deux populations cellulaires définies par leurs
propriétés optiques.
Le flux peut être fractionné par :
- une séparation mécanique (300 cellules déviées / s)
- vibration associée à la déviation dans un champ
électrique ; la veine liquide, préalablement chargée électriquement,
est fractionnée en gouttelettes par vibration (US). La gouttelette
(contenant la cellule) est déviée par un champ électrique et collectée.
Jusqu’à 3.103 – 5. 103 cellules analysées / s (1.104 – 2. 104)

3. Avantages et limites
 Analyse quantitative, sensibilité de détection, rapidité, analyse
multiparamétrique cellule par cellule, tri

 Possible de trier des populations sur une base multiparamétrique


(2 morphologies et jusqu’à 5 fluorescences)

 Les cellules isolées sont parfaitement viables (peuvent être


remises en culture)

 Besoin de standards calibrés pour permettre l’étalonnage de


l’appareil

 Choix contradictoire ; rendement / pureté (inversement


proportionnelle à la vitesse du tri)
 Besoin de cycles d’enrichissement pour les populations minoritaires
(< 5%)
4. Tri cellulaire révélé par immunofluorescence
Technique FACS (« Fluorescence activated cell sorting »)

 Association de la fluorescence et de la CMF

 On utilise des anticorps (monoclonaux) dirigés contre des


marqueurs de la surface cellulaire par exemple (anti-CD4+ par ex)
et qui sont couplés à un fluorochrome

 La population cellulaire recherchée marquée est ensuite triée par


le cytométre et peut être utilisée pour d’autres applications

5. Applications de la CMF

 Purification des cellules CD34 pour la greffe de cellules souches


hématopoïétiques
 Tri de cellules transfectées (utilisation conjointe du tri cellulaire
et de gène rapporteur)
 Tri de spermatozoïdes (sélection du sexe d’un embryon)
 Tri de chromosome (création de banques)
 Tri des microorganismes de l’environnement (obtenir des souches
pures d’algues unicellulaires par ex)
 Dénombrement de lymphocytes B, de lymphocytes T CD4+, CD8+…
réalisée en diagnostic médical

E. Destruction d’une population cellulaire

1. Par choc osmotique


Adapté à l’élimination des GR, par choc hypotonique à l’eau distillée ou
par choc au chlorure d’ammonium.

2. Cytotoxicité par Ac
Principe : tuer une population cellulaire par des Ac fixant le
complément ou des Ac couplés à des toxines (la ricine par ex).
II/ La technique ELISPOT (« Enzyme-linked immunospot »)
1983
1. Principe
Détecter et dénombrer les cellules T activés chez un patient, en
détectant la sécrétion de cytokines (l’INFγ notamment).
 A l’origine, utilisée pour l’activation des cellules B
 En 1996, adaptée pour l’analyse de l’activation des lymphocytes T

2. La coopération cellulaire : cellule présentatrice d’Ag (CPA) / LT

Activation
CPA LT LT
Différenciation

Sécrétion de cytokines
Premier signal : CMH/peptide/TCR
Second signaux : cosignaux CD28/B7.1-2, CD154/CD40…

III/ La technique de l’Immunoscope


C. Pannetier & M. Cochet (1992) 50 (24 familles)
 « microscope du système immunitaire »

 Détecter sélectivement l’amplification


2
d’un clone T (en réponse à la présentation
d’un Ag) et identifier ce clone

 Cette technique s’appuie sur l’analyse du


répertoire de cellules T d’un échantillon, 6-7
plus précisément sur l’analyse d’une région
hypervariable du TCR

 La taille de la région CDR3 (entre les


segments V et C) est caractéristique d’un
nombre restreint de clones de cellules T,
c’est cette variabilité qui est étudiée par
la technique de l’immunoscope
Principe technique de l’immunoscope

Réverse transcription des ARNm extraits des cellules T

Division en 24 fractions des ADNc amplifiés par PCR jusqu’à


saturation (40 cycles) (une amorce spécifique du segment C et la
seconde sur l’un des 24 V)

Amplification des ampliméres par PCR (1 à 5 cycles) avec une seule


amorce spécifique de la région C ou d’un des segments J marqués en
C-ter par un composé fluorescent (un seul brin copié)

Séparation des amplimères marqués par une électrophorèse sur un


gel de polyacrylamide placé dans un séquenceur automatique

Traitement des données par le logiciel Immunoscope (C. Pannetier),


permettant de visualiser pour chaque couple BV-amorce fluorescente,
la distribution des fragments obtenus et de les quantifier
CDR3 (5-15 AA)

V D J C
Echantillon
Les 4 segments sanguin
recombinés formant
la chaîne β du TCR

Lymphocytes T

ARN

V D J C
Amplification par PCR

Population cellulaire Population cellulaire comprenant un


hétérogène clone lymphocytaire majoritaire

Analyse par
électrophorèse

Distribution
Traitement des résultats

 Profils d’une distribution gaussienne (8 pics en moyenne) 


population cellulaire hétérogène, absence d’expansion clonale

 Apparition d’un (ou plusieurs) pic(s) avec un écart de la


distribution gaussienne, correspondant à autant de lignées de
cellules T activées  Un ou plusieurs clones T sont devenus
majoritaires, suite à une vaccination ou à une infection.

Avantages :
- extraordinaire sensibilité
- travailler avec un très petit nombre de cellules (- de
20)

L’inconvénient majeur est que cette technique ne permet pas de


distinguer les clones T présentant des régions CDR3 distinctes mais
de même taille
FICHE TECHNIQUE N°5

PLAN

I/ Rappels sur le CMH / HLA


A. Organisation du CMH
B. Propriétés du système HLA
C. Les molécules de classe I
1. Distribution tissulaire
2. Structure biochimique
D. Les molécules de classes II
1. Distribution tissulaire
2. Structure biochimique
E. Fonctions des molécules HLA

II/ Les techniques d’analyse du CMH


1. Méthode sérologique (lymphocytotoxicité)
2. Méthode cellulaire : la Culture mixte lymphocytaire (MLR)
3. Méthode biochimique
4. Méthodes de BM : PCR-SSO, SSP, RFLP
5. Séquençage direct
6. Nomenclature

-1-
I/ Rappels sur le CMH / HLA

 CMH, HLA (Jean DAUSSET) en 1958, H2 (George SNELL)

 Historiquement : le rejet de greffe ; fonction réelle : présentation

 Notion d’épitope T

 Définition fonctionnelle : ensemble de gènes impliqués dans les processus


d’apprêtement de l’antigène et de présentation au lymphocyte T.

 Définition génétique : région chromosomique où se trouvent les gènes


controllant la structure et l’expression des molécules de présentation
antigénique.

A. Organisation du CMH
 Chr 6p21.3
 4000 kb, 1/1000e du génome humain environ
 Système multigènique (>200 gènes)
 Organisé en 3 sous-régions
• Dont les produits des gènes se distinguent par :
 leur structure
 leur fonction
 leur localisation cellulaire
• On distingue :
 Les locus de classe I
. Gènes A, B et C
. Présentation au lymphocyte T CD8+

 Les locus de classe II


. Gènes D : DP, DQ et DR
. Présentation au lymphocyte T CD4+

 Les locus de classe III


. Rôle dans l’apprêtement : molécules chaperons (HSP-70)
. Rôle dans l’immunité : complément (C2, C4a, C4b, Bf), cytokine :TNF)
. Aucun rôle dans l’immunité : 21 hydroxylase, hémochromatose

-2-
 Autres locus de classes I et II
. Classes I non classiques ou Ib : gène E, F, G, MIC
. Classes II (rôle d’apprêtement) : DM, DO, TAP1, TAP2, LMP2, LMP7

B. Propriétés du système HLA


 Système multigénique (>200 locus)

 Multiallélique (Polymorphisme : plusieurs allèles)

 Codominance

 Liaison (les gènes ségrègent en bloc, peu de recombinaison, notion


d’haplotype)

 conséquences :
• Diversité des molécules HLA chez un individu : hétérozygotie,
codominance
• Diversité entre individus : nombre élevé d’haplotypes différents
• Transmission en bloc d’un haplotype

C. Les molécules de classe I


1. Distribution tissulaire
 Ubiquitaires

 Expression forte :
• Lymphocytes
• Cellules dendritiques
• Macrophages

 Expression faible ou nulle :


• Hématies
• SNC
• Cellules trophoblastiques et cellules embryonnaires en débuts de
développement
• Certains endothéliums (pancréas, glandes salivaires, cornée)

-3-
 Expression diminuée par :
• Infection virale
• Cellules tumorales

 Expression augmentée par :


• INF α, β et γ

2. Structure biochimique
 Glycoprotéines transmembranaires exprimées à la surface des cellules
 Association non covalente :
• D’une chaîne lourde α :
. Codée par les gènes de classe I (A, B et C)
. Polymorphe
. 3 domaines extracellulaires
• D’une chaîne légère β : β2 microglobuline
. Non HLA (Chr 15)
. Monomorphe
. Rôle important (conformation)
 Structure tridimensionnelle (Bjorman, 1987) : Sillon de présentation
• Formée par α 1 et α 2
• Fond : 8 feuillets β plissés antiparallèles
• Bords : 2 hélices α
 Toujours occupée par un peptide

 Peptides présentés : nonamères (8-10 aa).

D. Les molécules de classes II


1. Distribution tissulaire
 Cellules présentatrices d’antigènes (CPA) au LT CD4+ :
• Cellule dendritique (épithélium, tissus conjonctifs).
• Cellule interdigitée (ganglion).
• Macrophages.
• Lymphocyte B.

 Autres cellules :
• Epithélium thymique.
• Epithélium digestif et respiratoire.

-4-
• Progéniteur hématopoïétique.
• Endothélium vasculaire activé.

 Lymphocyte T activé.

 Expression augmentée par : INFγ, IL-4, IL-13, TNFα et β

2. Structure biochimique
 Glycoprotéines transmembranaires exprimées à la surface des cellules

 Association non covalente :


• D’une chaîne α et d’une chaîne β
. Polymorphes
. Codé chacune par un gène HLA
 par ex : DQA1 pour la chaîne α de la molécule DQ
DQB1 pour la chaîne β de la molécule DQ
. 2 domaines extracellulaires

 Structure tridimensionnelle :
• Sillon plus ouvert à ses extrémités.
• Sillon : α1 et β1

- Taille des peptides présentés : plus variable (13 à 34 aa), mais c’est la
séquence centrale de 8-10 aa qui interagit avec le sillon. Les extrémités N
et C-ter débordent du sillon.

E. Fonctions des molécules HLA


 Présentation

 Apprêtement ("processing")
 Pas le même type d'Ag
Pour les classes I et les classes II
 Pas au même lymphocyte

 Classes I :
• Ag : protéines intracellulaires
. Constituants cellulaires (normaux, Ag tumoraux)
. Virus, bactéries intracellulaires

-5-
• LT : CD8+ cytotoxique
• Mécanisme effecteur : cytotoxicité
• Fonction :
. Surveillance du contenu protéique de la cellule
. Défense anti-infectieuse vis à vis des germes intracellulaires
 En accord avec l'expression ubiquitaire des classes I

 Classes II :
• Ag : protéines extracellulaires et membranaires (Bactéries)
• LT : CD4+ auxiliaire
• Mécanisme effecteur : Ac
• Fonction :
. Défense antibactérienne
 En accord avec l'expression des classes II sur les APC

II/ Les techniques d’analyse du CMH

1. Méthode sérologique (lymphocytotoxicité)


 Histoire : Ac lymphocytotoxiques (jean Dausset) : Ac anti classes I

 Ac monospécifiques anti A, B, C et DR obtenus à partir de polytransfusés,


de femme multipare (10% des femmes durant leur grossesse développent
des Ac anti-HLA) ou de rejet de greffe.

 Lymphocytes à typer + Ac monospécifique + complément -> lyse ?

 Simple, rapide, fiable uniquement pour les classes I

 Limites : qualité des sérums utilisés (polyspécificité), classes II (isoler les


cellules exprimant les cl II : LB, quantité molécules de classe II
exprimées)

2. Méthode cellulaire : la Culture mixte lymphocytaire (MLR)


 Histoire : découverte des classes II (Benaceraf et Mac Devitt)

 Population stimulante irradiée (LT homozygote pour classe II) + LT à


tester -> prolifération ?

-6-
 Long, fastidieux => n'est plus utilisé

3. Méthode biochimique
 Isoélectrofocalisation

 Electrophorèse bidimensionnelle (précipitation à l’aide d’Acm, élimination


des NANA et E2-D)

 Détermination de variants non détectés en sérologie

4. Méthodes de BM : PCR-SSO, SSP, RFLP


 Amplification d'un exon du locus à étudier (PCR)

 Hybridation avec sonde oligonucléotodique spécifique (+/-) R* ou froide


(SSO)

 Utilisation d’amorces spécifiques d’allèles (SSP)

 Digestion par des enzymes de restriction (RFLP)

 Technique de référence pour DP, DQ, DR

5. Séquençage direct
 En recherche

 Description de nouveau allèles

6. Nomenclature
 Classes I : A, B, C + N° d'allèle

 Classes II : f(technique utilisée)


• Sérologie : (DP-DQ-DR) + N° d'allèle
• MLC : DW + N°
• PCR-SSO : (DP-DQ-DR) + Chaîne + * + N° d'allèle
Ex : DRB1*0402 (DR4 en sérologie)

-7-