LES TECHNIQUES EN IMMUNOLOGIE

FICHE TECHNIQUE N°1 PLAN

I/ Les Anticorps monoclonaux et anticorps polyclonaux A. Les anticorps polyclonaux B. Les anticorps monoclonaux
Rappel Principe

II/ Les réactions antigènes / anticorps A. Généralités B. La réaction de précipitation
En milieu liquide : En milieu gélifié : Exemple du « ring test » Immunodiffusion double (Ouchterlony) Immunodiffusion radiale (Mancini) Electro-immnunodiffusion (Laurell) Immuno-électrophorèse

C. La réaction d’agglutination
Principe : potentiel ζ Paramètres internes et externes Agglutination active : ex système ABO Agglutination indirecte Agglutination passive

Hugo MOUQUET, INSERM U519
hugo.mouquet@etu.univ-rouen.fr

I/ Les anticorps polyclonaux et monoclonaux A. Anticorps polyclonaux (sérum polyclonal, immunosérum) Un immunosérum renferme des Acp de classes et de sous-classes différentes, d’affinités diverses et reconnaissent plusieurs déterminants antigéniques. Ag : de différente nature, pour les haptènes (< 3 kDa) ou les peptides synthétiques (10-15 AA), ces Ag sont couplés à une protéine porteuse de haut PM (« carrier ») ex : BSA, thyroglobuline, hémocyanine… par l’action d’agents de couplage ex : glutaraldéhyde (NH2, SH), carbodiimides (NH2, COOH). Voies d’administration : sous-cutanée, intradermique, intramusculaire et intraveineuse. Animaux : souris, lapin, mouton, chèvre Protocoles d’immunisation : Les animaux sont immunisés avec l’Ag en présence d’adjuvant de Freund ; complet pour la première immunisation et incomplet pour les rappels. Les durées entre les rappels varient. Les animaux sont prélevés et la réactivité des sérums est testée (ELISA, IFI, WB…). B. Anticorps monoclonaux (Milstein, 1974-1975) 1. Rappel Un clone lymphocytaire B possède un programme génétique unique qui par les mécanismes de réarrangement code pour une IgG de surface (BCR) spécifique du clone B. Le BCR qui se lie aux épitopes antigéniques est identique au niveau structural à l’immunoglobuline sécrétée par le plasmocyte dérivant du clone B. 2. Principe La production d’Acm chez la souris ou le rat se fait par la technique d’hybridation cellulaire. Elle consiste à fusionner des cellules productrices d’Ac et des cellules d’une lignée myélomateuse. Cette fusion conduit à la production de cellules hybrides ou hybridomes.

Sécréteur HGPRT+ Mortel

PEG

LB

M

Myélome (immortel) Non sécréteur HGPRT-

Hétéromyélome Sécréteur HGPRT+ immortel

HM Culture sur milieu HAT (Hypoxanthine, aminoptérine, thymidine)

Aminoptérine Voie de synthèse des nucléotides « de novo » Bases azotées Nucléotides

HGPRT
Voie de « sauvetage » HX Thymidine

Thymidine Kinase

Ac
II/ Les réactions antigènes / anticorps A. Généralités
Paratope 2

La réaction Ag/Ac est due à l’interaction 1 entre l’épitope et le paratope. Le complexe (immun) Ag/Ac fait intervenir des liaisons Epitope Ag 3 faibles ; hydrogène, électrostatiques, les forces de Van der Waals et interactions Ag + Ac ⇄ Ag-Ac apolaires. La constante d’association K varie K = k1 / k2 4 12 K = [Ag Ac] / [Ag].[Ac] entre 10 et 10 L/M. Epitope séquentiel (linéaire) / épitope conformationnel

Ac monoclonal

Sérum polyclonal (Ac polyclonaux)

Si l’antigène est moléculaire et soluble; les complexes Ag/Ac forment un précipité, si l’antigène est particulaire ou cellulaire (bactéries, hématies, billes de latex …); les complexes immuns forment un agglutinat. B. La réaction de précipitation 1 : En milieu liquide : le test de l’anneau (« Ring Test »)
[Ac] croissantes

[Ag] constante

ZONE D’EQUIVALENCE

Paramètres physico-chimiques de la réaction : La température ; à θ=37°C, la précipitation est accélérée et à θ=0°C, la quantité de précipité est augmentée La force ionique ; chez les mammifères, la quantité maximale de précipité est obtenue pour [NaCl] < 0,15 M. Le pH ; la réaction est inhibée aux pH extrêmes (en dessous de 6 et au-dessus de 8,5). Effet dissociant des pH acides (élution). Les adjuvants de précipitation ; accélère la réaction ( ex : PEG).

2 : En milieu gélifié Gel (agar de 5 à 20 g/l en tampon PBS pH 7,2 ou d’agarose) de 3-4 mm.

Immunodiffusion double (Ouchterlony)
Cette technique est basée sur la double diffusion Ag et Ac dans un gel en fonction de leur PM. Elle permet l’analyse qualitative d’un mélange d’Ag en solution.

IDENTITE

OUI
Ag B

NON
Ag B

PARTIELLE
Ag B

Antigènes Ag

Ag A

Ag A

Ag A

Ac Anticorps Ac anti-A Ac anti-A Ac anti-B Les Ag A et B n’ont aucun déterminant antigènique commun Ac anti-B

Les Ag A et B possèdent des épitopes communs

Immunodiffusion radiale (Mancini)
Cette technique quantitative permet le dosage d’un antigène (protéine).
Protéine 1 2 3

Gel

Anticorps

Diffusion selon un gradient de concentration décroissant

Formation d’un anneau de précipitation ; réseau Ag/Ac

5 mg/l diamétre2 Etalon 2 . ? mg/l Etalon 3 . Le pH du gel est choisi de façon que les Ac soient immobiles (pI des Ig) et que l’Ag chargé négativement migre (blocage des NH2 . « Rockets » 14 12 hauteur (h) 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 h 1 2 3 Etalons 4 ? [Protéine] (mg/l) La hauteur des «fusées» (lignes de précipitation) est proportionnelle à la [Ag]. formylation). dans un gel contenant l’Ac. carbamylation. . 6 mg/l d2 = a. 1.[Ag] + b Etalon 1 . 3 mg/l [Protéine] (mg/l) dosage des IgG sériques Electro-immunodiffusion (Laurell) Cette technique permet d’accélérer le temps de diffusion en obligeant l’Ag à migrer sous l’effet d’un champ électrique.[Ag] 14 12 10 8 6 4 2 0 0 2 4 6 8 [Ag] inconnue .

un immunosérum polyspécifique diffuse dans un sens perpendiculaire à celui de la piste électrophorètique dont les fractions diffusent en sens inverse. . C. micro-organismes.Immuno-électrophorèse (Grabar et Williams) Cette technique renforce le pouvoir analytique des doubles diffusions en identifiant les constituants d’un mélange par 2 propriétés indépendantes. La réaction d’agglutination 1 : Principe Les réactions d’agglutination mettent en jeu un Ag situé à la surface d’une particule de taille comprise entre le dixième et la dizaine de micron (globules rouges. (Tampon Véronal-Tris) 2e tps . plaquettes. globules blancs. L’exploitation des résultats est basée sur celle de la technique d’Ouchterlony. un mélange d’Ag est soumis à un champ électrique (de 5 à 8 V) le long duquel les constituants se répartissent en fonction de leur mobilité électrophorètique. billes de latex ou de sépharose). 1er tps . spermatozoïdes. leur mobilité électrophorètique et leur spécificité antigènique. C’est un phénomène complexe au cours duquel les Ac s’unissent aux Ag portés par la particule formant ainsi des ponts spécifiques entre ces particules permettant leur réunion en amas.

2 : Le potentiel Zêta Deux forces antagonistes jouent un rôle dans l’interaction des particules entre elles : . .leur localisation . Lorsque les Ac recouvrent les GR. dits agglutinants (IgM en majorité) sont capables de produire une agglutination des particules en suspension dans un milieu salin de [NaCl] = 0.la tension interfaciale. l’état électrique est modifié.15 M). à effet opposé. qui tend à agréger les particules entre elles.le nombre de sites antigéniques . Les Ag . il existe une relation entre l’agglutinabilité et : . elle provient des charges électriques identiques des particules. 3 : Les paramètres de réaction Les Ac .la force de répulsion (prédominante). _ _ _ + + + + + + + + _ _ ζ CH2OH HO C H HOOC H OH OH H H HO C H O H NH2 + + + + + + + GR + + + NANA (acide sialique) H _ + _ Pollack : + _ ζ = σ / (D x √µ) + _ σ : charge électrique D : constante diélectrique du milieu µ : force ionique du milieu La force de répulsion est fonction du potentiel ζ (-16 mV pour [NaCl] = 0.15 M. en cela les IgM s’avèrent plus efficaces. dits non-agglutinants sont incapables de provoquer une agglutination dans ces conditions.

Les facteurs expérimentaux . . .Le pH. On distingue des Ac « chauds » et des Ac « froids ». 4 : Les réactions Agglutination active Elle résulte d’une union spécifique entre un Ac agglutinant et un Ag appartenant en propre à la particule. L’agglutination est plus rapide à 37°C. plus elle est élevée plus l’agitation moléculaire est importante (augmentation de p (rencontre)). entérophathogènes…) Groupage sanguin ABO . Sérogroupages bactériens (Salmonella. coli. optimum entre 6 et 8 . Elle peut se faire en tubes. E.La température. Shigella. elle contrarie l’union Ag-Ac mais favorise la formation du réseau (par la diminution du potentiel ζ).La force ionique (effet quasi nul). en microplaques ou sur lame et peuvent être qualitatives ou quantitatives (la dernière dilution du sérum où l’on observe encore une agglutination). cependant la quantité finale d’Ac fixés est plus élevée à basse température (après 24 h).

on peut obtenir une agglutination avec des Ac non agglutinants en diminuant le potentiel ζ (↘σ ou ↘D ou↘ ). ex la BSA. Les hématies . l’Ag est fixé par simple contact (pH 8. mais rendu particulaire par fixation sur un support : 1. De façon générale. la trypsine…). di-nitro chloro-benzéne…) ou par fixation immunologique (cas des Ac dirigés contre des épitopes du GR). par fixation chimique (glutaraldéhyde. 3. la fucine.2) 2. par traitement à l’acide tannique. Les techniques : 1. en faisant appel à un artifice. Hydrolyse des glycoprotéines présentes à la surface des cellules par protéases (la papaïne. Leur action permet la diminution de σ (libération de NANA). l’Ag est fixé par simple contact.Agglutination indirecte Elle se produit entre un Ac non agglutinant et un Ag faisant normalement partie intégrante de la particule. la broméline. le Ficoll… 2. une meilleure accessibilité des Ag (mise en place de liaison hydrophobe) et une redistribution des récepteurs aux Ag. le Dextran. Ajout au MR des macromolécules qui pontent les Ac unis à des cellules voisines (par րD). Les billes de latex . . Utilisation Ac anti-Ac GR Ac anti-isotype GR Phénotypage Rhésus Agglutination passive Elle est réalisée entre un Ac et un Ag normalement soluble.

Agglutination HGC dans l’urine Réaction Oui Non Equilibre Non Oui Excès d’Ag ♀ non enceinte ♀ enceinte . IgG lapin anti-GR de mouton + GR mouton test de grossesse. Les [GR-HGC] et [Ac anti-HGC] sont optimums pour l’agglutination. stables plusieurs mois à 4°C) .Inconvénients : . elles s’hémolysent en 3 semaines (utilisation d’hématies formolées. détection de l’hormone gonadotrophine chorionique (HGC) dans l’urine .elles portent une mosaïque d’Ag recherche du facteur rhumatoïde (réaction de Waaler Rose .fragiles. GR recouverte d’hormone mise en contact des Ac anti-HGC et l’urine de la femme suspectée d’être enceinte.

Le transfert des protéines sur membrane C. Applications II/ L’immuno-empreinte A. La révélation immunologique III/ L’immunofluorescence A. Différentes méthodes Dosage d’Ag Dosage d’Ac C. physiques Purification d’Ac spécifiques . Principe B. Directe (IFD) IV/ La purification d’immunoglobulines Méthodes chimiques.FICHE TECHNIQUE N°2 PLAN Les techniques immuno-enzymatiques I/ Les techniques ELISA A. Indirecte (IFI) Principe Rappel sur la fluorescence Organigramme expérimental Applications B. chromatographiques. Séparation des Ag par SDS-PAGE B.

En phase hétérogène : Activité enzymatique inchangée après la fixation (besoin d’une étape de séparation entre les complexes marqués et l’Ag ou Ac marqués). des Ig purifiées ou des Acm (évite les réactions croisées). de microplaques… Par liaison covalente entre l’Ag ou l’Ac à la phase solide appropriée (cellulose activée. une préparation brute ou purifiée de l’Ag ou de l’haptène. agarose ou acrylamide par le glutaraldéhyde). de tubes. des haptènes) analyse médicale. enzymes et substrats en phase hétérogène L’agent chimique utilisé pour coupler une enzyme à un Ag ou à un Ac ne doit pas altérer l’activité enzymatique ni celle du réactif immunologique. Systèmes biologiques Ag : liquide biologique. pour le dosage de nombreuses substances (Ag. Conjugués. Ac. On utilise : le glutaraldéhyde. du bromure de .I/ Techniques immuno-enzymatiques : les tests ELISA (enzyme linked immunosorbent assay) A. Phase solide et « fixation » Par adsorption passive sur du verre. Ac : immunosérum total. Principe Elles reposent sur l’utilisation d’une enzyme pour déceler les complexes immuns. Les techniques ELISA sont très utilisées en : recherche fondamentale et appliquée (reconnaissance des épitopes protéiques. de plaques. marqueurs tumoraux. du plastique. latex… sous forme de billes. du polystyrène. hormones. médicaments…) Méthodes En phase homogène : La fixation de l’enzyme au complexe immun modifie son activité (révélation directe).

Différentes méthodes d’ELISA en phase hétérogène 1 : Dosage des antigènes Par compétition : Vis à vis d’Ac présents en quantité limitée. H2O2 Tétraaminobenzidine.cyanogène. et fixés sur un support. coli ou muqueuse 4-nitro-phényl-phosphate intestinale de veau ß-D galactosidase (3) E. le produit de la réaction est mesuré par spectrophotométrie. Besoin de séparation de l’enzyme en excès par chromatographie d’exclusion moléculaire. le carbodiimide… . ENZYME Peroxydase (1) ORIGINE Raifort (radis noir) SUBSTRAT Diaminobenzidine. H2O2 Phosphatase (2) alcaline E. il y a compétition entre l’Ag à doser et l’Ag marqué (de même spécificité) ajouté en quantité définie dans le même temps. . colorimétrie (examen visuel) ou par fluorométrie. coli 2-nitro-phényl-ß-Dgalactopyrannoside (ONPG) Glucose oxydase Aspergillus niger Chromogène + H2O2 Glucose NAD+ 6 phosphate + Glucose 6 phosphate Leuconostoc déshydrogénase (1) (2) mesenteroïdes : pour les dosages rapides et (3): pour un grand nombre d’échantillon En fonction du substrat. B.

de la streptavidine conjuguée à une enzyme se lie à la biotine (complexe ternaire). Avidine Biotine . L’Ac biotynilé se lie sur l’Ag fixé à la phase solide puis. [Ag x] [Ag x] Directe : Dosage immuno-enzymométrique ou IEMA Amplification par le système avidine-biotine (ABC) La biotine (coenzyme facile à lier aux Ig) a une très forte affinité pour l’avidine (blanc d’œuf) et la streptavidine (Streptomyces avidinii).Méthode en « sandwich » S’applique aux Ag possédant au moins 2 épitopes (identiques ou non) Réaction Ag à doser Addition du second Ac marqué Révélation de la réaction S P Ac en excès Ag à doser Ac marqué en excès Activité enzymatique liée au support (DO) Activité (DO) = k .

[Ac] [Ac x] Indirecte avec Ac secondaire marqué Puits négatif Puits positif .2 : Dosage des anticorps Indirecte avec Ag marqué Réaction Ag / Ac Addition de l’Ag marqué Révélation de la réaction S P Ag en excès Ac à doser Activité enzymatique liée au support (DO) Ag marqué en excès Activité (DO) = k .

[Ac] [Ac]  Protocole expérimental en TP Un seuil de positivité est déterminé par un index calculé à partir des DO de témoins connus (moyenne DO sujets sains + 2-3 σ pour ex). anti-histones. les facteurs rhumatoïdes. glucacon…). enzymes (énolase. rubéole. lipase…). Applications Dosage des protéines : la ß2m. herpés. Treponema…). varicelle. drogues. médicaments. C. vitamines. hormones (insuline. bactériologique par titrage d’anticorps (Brucella. anti-Dsg1/3… .Activité enzymatique liée au support (DO) Activité (DO) = k . IgE… Diagnostic sérologique : parasitaire. des Ac anti-ADN. virologique (HIV. grippe…) Maladies auto-immunes : recherche et dosage des FR. hépatite A-B. Salmonelle.

Elles sont séparées en fonction de leur PM.II/ L’immuno-empreinte (immunotransfert ou « western blot ») Cette technique combine le pouvoir de séparation de l’électrophorèse et la grande sensibilité de l’immunodétection. 3 minutes Fragments polypeptidiques B CH2 SH HC OH HC OH CH2 SH DTT CH3 (CH2)11 SO3.009%.05 g de protéine / piste)… ⊕ . Séparation des Ag par SDS-PAGE Les protéines d’un extrait tissulaire ou cellulaire ou des protéines recombinantes dénaturées et chargées négativement.5 g de protéine / piste). migrent dans un gel d’acrylamide / bis-acrylamide (de teneur x %) sous l’action d’un champ électrique. nitrate d’argent (0. SDS 40%.5 M pH 6. Bleu de bromophénol 0. le gel peut être colorée s’il ne constitue pas SDS-PAGE la première étape du WB : Bleu de Coomassie (0. DTT 10%) Protéine native A S S A B SDS Dithiotreïtol 100°C. ce qui en fait un outil performant pour l’identification d’un Ag ou d’un Ac.8.2 à 0. glycérol 20%. A. Solution de dépôt des échantillons : Solution de Laëmmli (Tris 0.Na+ SDS B ⊝ A 120 V t=2h La migration achevée.01 à 0.

ANODE Temps de transfert : 2 h (à 18 h). voltage 30 V (à 60 V) Coussins absorbants Papiers buvards Membrane de nitrocellulose Gel de polyacrylamide Papiers buvards Coussins absorbants Le tampon de transfert contient du méthanol qui augmente la capacité de la NC à absorber les protéines.8-kDa .2-kDa ⇐ 20.3-kDa ⇐ 28. et empêche le gel de gonfler CATHODE A la suite du transfert. Le transfert des protéines sur membrane Les protéines contenues dans le gel sont transférées sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF sous l’action d’un champ électrique. Marqueur ⇐ 35. la membrane qui contient les protéines peut être colorée à l’aide de rouge Ponceau puis est décolorée avec de l’acide acétique 5% et enfin séchée.B.

5% lait Lavages dans du tampon TBST Incubation avec le(s) sérum(s) ou les Ac dilués dans du tampon TBS. Les protéines ayant formé des complexes Ag /Ac réagissent ensuite avec des Ac (de chèvre) dirigés contre les IgG de l’espèce d’origine du sérum testé. Principe de la révélation immunologique par ECL Les protéines transférées sur membrane de NC sont incubées avec des immunosérums ou des Ac.C. 5% lait Lavages dans du tampon TBST . Tween 0. 2/ Organigramme du protocole expérimental (TP) Découpage de la membrane en bandelettes Saturation dans du tampon TBS. La révélation immunologique 1/ Principe H2O2 Peroxydase Protéine Premier Ac (Sérum) Forme oxydée de l'enzyme LUMIERE Luminol oxydé Second Ac + Luminol + Activateur Membrane NC Film photographique Figure. La peroxydase oxyde le luminol qui va émettre de la lumière permettant la révélation autoradiographique des complexes. Tween 0.05%.05%. Ces Ac secondaires sont couplés à la peroxydase (ou à la phosphatase alcaline).

Ex : révélation colorimétrique SDS-PAGE 4% Extrait de peau 160 kDa .05%. celle-ci provoque l’excitation du luminol qui va retourner à son état fondamental en émettant de la lumière. Principe de la chimioluminescence.Incubation avec les Ac secondaires (conjugués à une enzyme . Tween 0. La chimioluminescence est basée sur une émission de lumière provoquée par la dissipation de l'énergie d'une molécule qui se trouve dans un état excité par une réaction chimique. 5% lait Lavages dans du tampon TBST Révélation ECL ou colorimétrique Analyse des résultats O NH NH NH2 O H2O2 Peroxydase O O O NH2 O - + N2 + Lumière Figure. L’oxydation du luminol est catalysée par le système HRP (horseradish peroxydase) / peroxyde d'hydrogène en conditions alcalines. peroxydase ou phosphatase alcaline) dilués dans du tampon TBS.

Fluorochromes : FITC : dérivé de la fluorescéine (λémission = 520 nm. des frottis cellulaires.III/ L’immunofluorescence L’immunofluorescence classique permet de déceler une réaction Ag / Ac sur des cellules en suspension. A. couleur verte). des microorganismes ou des coupes d’organe. I λexcitation < λémission Eémission < Eexcitation Spectre d’absorption = ensemble des e. Le spectre d’émission des fluoλ (nm) rochromes est dans le visible. Rhodamine et ses dérivés. Indirecte (IFI) 1/ Principe Second Ac . utilisé en général pour le double marquage. donne une fluorescence rouge-orangée.FITC Premier Ac (Sérum) FLUORESCENCE Microscope à fluorescence Coupe tissulaire 2/ Rappel sur la fluorescence Luminescence : phénomène défini comme une radiation émise par un atome ou une molécule après l’absorption d’énergie qui l’a conduit dans un état excité.dans leur état excité. Absorption Emission .

caméra… 3/ Organigramme du protocole expérimental Incubation des coupes (3-4 m) fixées sur lame avec le sérum ou l’Ac dilué dans du tampon PBS (1 h) Lavages dans du tampon PBS Incubation des complexes avec les Ac secondaires dilués dans du tampon PBS (30 min) Lavages dans du tampon PBS Montage entre lame et lamelle puis observation au microscope 4/ Applications Auto-immunité : détection des Ac anti-nucléaire. Epiderme humain HepG2 Anti-ADN natif. dénaturé. anti-organites ou Ac spécifiques d’organe. anti-histones. Anti-Dsg1 .Rq :Système amplificateur avidine / biotine Microscope à fluorescence : A lumière réfléchie A lumière transmise Lampes à vapeur d’halogène ou de mercure Système d’acquisition : appareil photos. etc.

présence des Ig dans le 1er pic d’élution à 99.Microbiologie : bactériologie. par ex fractionnement sur résine basique type diéthylaminoéthyl (DEAE cellulose). sur colonne de protéine A (protéine de paroi de 90% des S. aureus. détection de virus responsable d’infection respiratoire)… B. IV/ La purification d’Immunoglobulines 1. sur Sépharose 4B (limite d’exclusion 4000 kDa) pour fractionner IgM (970 kDa)… HPLC.5 % de pureté. les Ig précipitent entre 12 et 20% d’EthOH. virologie (cinétique de multiplication de virus. Par précipitation à l’éthanol. Recherche des dépôts d’Ig ou de complément dans les tissus. . Exclusion moléculaire (gel filtration. capable de fixer le fragment Fc des Ig) ou de protéine G (Steptococcus). fractionnement d’un sérum en 30 min 3. Ultracentrifugation Centrifugation du sérum à 100 000 g pendant 18 h sur gradient de saccharose. Méthodes chromatographiques Echangeuse d’ions. Affinité. Directe (IFD) Méthode en « un temps ». tamis moléculaire). l’Ag est recherché directement par l’Ac spécifique marqué. sur Séphadex 150 (limite d’exclusion 200 kDa) pour fractionner les Ig (150 kDa). Méthodes chimiques Par relargage des sels par précipitation au sulfate d’ammonium en concentration quasi saturante. 2. IgM dans les premières fractions (19 S) puis les Ig (8 S à 6.6 S).

utilisant des billes de sépharose ou d’agarose (activées par le bromure de cyanogène) couplées à l’Ag ou à haptène.4. Purification d’Ac spécifiques On récupère l’Ac spécifique lié à l’Ag fixé sur un support par : Fixation-élution sur l’Ag immobilisé sur membrane de nitrocellulose Chromatographie d’affinité. .5). il est donc nécessaire de neutraliser le pH du milieu rapidement. Cette méthode peut être appliquée à l’isolement d’un Ag (résine couplée à l’Ac spécifique). Rq : les solutions d’élution sont acides (pH proche de 2.

FICHE TECHNIQUE N°3 PLAN I/ Immunocriblage de banque d’expression d’ADNc A. Protocole expérimental de criblage C. Application à la recherche de nouveaux auto-antigènes II/ Analyses protéomiques A. Méthodologie 1 : L’électrophorèse bidimensionnelle 2 : La révélation et l’analyse d’image 3 : Limites des 2 premières étapes 4 : Identification et caractérisation des protéines La spectrométrie de masse C. Le protéome B. Principe B. Application de l’analyse protéomique (“ciblée”) .

EMBL. DDBJ…) et identification de la protéine immunoréactive . Principe Extraction des ARNm (à partir de tissus ou de culture cellulaire spécifique) BANQUE CRIBLAGE IDENTIFICATION Réverse transcription en ADNc Clonage dans un vecteur (phage ou phagémide) Transfection dans E.I/ Immunocriblage de banque d’expression d’ADNc A. Coli Expression des protéines à la surface des phages Immunocriblage avec des immunosérums / Ac Isolement du clone bactérien exprimant la protéine immunoréactive Amplification et conservation du clone d’intérêts PCR sur colonie Purification et séquençage de l’ADNc Comparaison aux banques de données (Genebank.

Protocole expérimental du criblage Bactéries + phages Incubation 4 h à 37°C Incubation 4 h à 42°C Boîte de Pétri Filtre de nitrocellulose imprégné d’IPTG (expression de l’ADNc de chaque phage) Révélation des filtres en immuno-empreinte 1 tache positive Prélèvement du spot correspondant sur la boîte de Pétri (IPTG: isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside) Immunocriblage d’une banque d’expression d’ADNc de kératinocytes avec le surnageant contenant l’acm F12 (Pemphigus vulgaire). 7 colonies d’un clone positif / 50 plages de lyse .B.

une autre cible des auto-Ac présents chez 57% des malades est la calpastatine (Mimori et al) Au cours du Lupus érythémateux disséminé. Application à la recherche de nouveaux auto-antigènes Dans la Polyarthrite rumatoïde (PR). auto-Ag chez 44% des patients (Tanaka et al) De même dans la PR. DEK et ALY. identification d’une protéine proche de la follistatine.C. à l’heure actuelle un véritable marqueur diagnostic de la maladie (Amagaï et al) Récemment. la pemphaxine a été cité comme un nouvel auto-Ag au cours du PV. 2 nouvelles protéines de la régulation transcriptionnelle. ont étés mises en évidence Le criblage d’une banque de kératinocyte avec des Ac purifiés à partir de sérum de patients atteints de Pemphigus vulgaire (PV). . a permis d’identifier la Desmogléine 3.

détergents (CHAPS. A. physiologique. ou un organisme donnée (dans une situation donnée . M/S mai 2001. 1: L’électrophorèse bidimensionnelle Elle combine 2 séparations des protéines selon 2 critéres indépendants le pI et la masse (pouvoir de résolution très élevé de E2D). Le protéome Il est défini (1995) comme la totalité de la partie protéique exprimée dans une cellule. S. un tissu. Elle est trés reproductible.réducteurs (DTT) . C’est un moyen de “décodage” de l’expression protéique des génes et des mécanismes contrôlant cette expression.II/ L’analyse protéomique “Objet et évolution méthodologique de l’analyse protéomique”.la caractérisation des protéines par spectrométrie de masse. Pourquoi ? Les niveaux d’expression protéique ne sont pas le reflet des niveaux d’expression des ARNm.et post-traductionnelle) et le protéome est dynamique ! B. a un haut pouvoir de résolution et posséde un caractère préparatif. Thébault. . les protéines peuvent être modifier (maturation co. thiourée) . Méthodologie 3 étapes : . pathologique…). (17).chaotropes (urée. sulfobétaïne) . .séparation des protéines de l’échantillon biologique par électrophorèse bidimensionnelle (E-2D). La solubilisation des protéines: Action synergique d’agents : .le traitement et la mise en image pour établir une carte protéique.

. 1 h 30 à 1000 V et 6 h à 8000 V). le gel est placé dans la cuve de 2nd dimension et est soumis à un ampérage max de 40 mA et un voltage max de 500 V duant 5 h à T < 10°C. marquage radioisotopique .La première dimension. Une fois l’agarose gélifier. Equilibrage des bandelettes GPIS. La migration est réalisée dans un gel de poly-acrylamide à gradient de pH préformé (pH 3-10) sur un support plastique qui constitue une bandelette GPIS. Les bandelettes sont insérés dans de l’agarose liquide (+ SDS) coulé au-dessus du gel de 2nd dimension.. l’électrophorèse SDS-PAGE Elle permet la séparation des protéines selon leur masse. argent . Sypro rubis…) par chimioluminescence. 2: La révélation et l’analyse d’image Á Méthodes de mise en image : coloration spécifique des protéines (bleu de Coomassie colloïdal. tmin = 10 h Séparation des protéines selon leur pI : appareillage de migration pour l’IEF (les conditions électrophorètiques comportent 3 phases : 1 h 30 à 500 V. Des gels de poly-acrylamide de grande taille et de porosité en gradient (8%16% par ex) sont utilisés. La deuxième dimension. révélation immunochimique (Western Blot). la focalisation isoélectrique (IEF) Elle permet la séparation des protéines selon leur pI.) détection par fluorescence (Sypro orange. cette étape fondamentale permet aux protéines de sortir du gel de 1er dimension et de s’insérer dans le gel de la 2nd dimension. Réhydratation des bandelettes GPIS en contact avec la solution de lyse-solubilisation contenant l’échantillon protéique à étudier (dans un sarcophage de réhydratation).

Plasma SWISS 2D-PAGE Á Technologies de détection et de digitalisation: impression de plaques photographiques imager caméra CCD densitomètre Laser 3 : Limites des 2 premières étapes le caractére hydrophobe et insoluble de certaines protéines la variabilité d’expression des protéines les PM > 200 000 Da ou les PM < 7000 Da ainsi que certains pI difficultés dans l’analyse et le traitement informatisés des cartes protéiques. .

est bombardée avec un rayon laser . sulfatation…) et mutations ponctuelles (due au polymorphisme protéique) sont décelées sur les cartes (car elles modifient la charge ou la masse de la protéine considérée). Application de la spectrométrie de masse (SM) à l’identification des protéines 2 grandes avancés à la base de l’identification : .le séquençage du génome (bio-informatique. ou trappe à ions).adaptation de la SM à l’analyse de polyméres biologiques (capable de détecter des différences de masse de 0. La spectrométrie de masse en tandem SM/SM (Q-ToF) 2 analyseurs séparés par une chambre de fragmentation (CID. collision-induced dissociation). Il sépare les ions sur la base de leur rapport m / z. hydroxylation. méthylation. formation de ponts di-sulfures. quadrupôle. Système Protéine ions monochargés (M + H)+ ou (M + H)- L’analyseur est responsable de la séparation des ions gazeux formés dans la source ionisation (type ToF. phosphorylation.1 Da) d’ionisation MALDI (matrix assisted-laser desorption/ionization) : La protéine co-cristallisée avec une matrice absorbant les photons. secteurmagnétique. banques…) . la matrice transmet l’énergie transportée par le laser en énergie d’éxitation pour l’échantillon et ce mécanisme s’accompagne de transfert de protons.4 : Identification et caractérisation des protéines L’analyse protéomique peut présenter des études de caractérisation structurale des protéines . . certaines modifications post-traductionnelles (glycosylation.

à analyser par SM les fragments peptidiques obtenus après excision et digestion (par la trypsine le plus souvent) d’une tâche protéique. La stratégie d’identification des tâches protéiques consiste. . Le spectre de masse (“empreinte digitale” de la protéine) obtenu par MALDI-ToF est comparé (outil informatique MS-FIT) aux spectres de masse virtuels de protéine dont le géne est caractérisé et qui sont disponibles dans les banques de données spécialisées sur internet (SWISS-PROT par ex).Source d’ionisation ESI Chambre de collision 1 analyseur 2ème analyseur Quadrupole ToF er détecteur accélérateur Aiguille de l ’électrospray réflecteur Les appareils les plus souvent utilisés sont : Le MALDI-ToF pour l’identification des protéines Les tandem SM/SM avec notamment le quadrupole-orthogonal time of flight (Q-ToF) et la trappe à ion pour le séquençage des peptides et leur caractérisation structurale.

C. Application de l’analyse protéomique (“ciblée”) Données comparatives sur les variations induitent par la différenciation cellulaire. AP utilisant l’immunodétection l’identication de nouveaux couples auto-Ag / Auto-Ac permet COMPRENDRE LES MECANISMES PHYSIOPATHOLOGIQUES REPERER DES MARQUEURS SPECIFIQUES DE LA PATHOLOGIE (A forte valeur diagnostique er pronostic) . l’AP permet d’étudier l’action de certains médicaments En immunologie. d’identifier les protéines et de quantifier leur expression différencielle (mais ne permet pas de caractériser les modifications post-traductionnelles). études de nombreux tissus et fluides biologiques sains ou malades (tumeurs diverses par ex…). études sur le protéome de lignées tumorales… En pharmacologie.L’analyse protéomique quantitative (QPA) permet à la fois. l’action de cytokines. de molécules utilisées en chimiothérapie… En biomédecine.

Tri cellulaire par cytométrie de flux E. Destruction d’une population cellulaire II/ La technique ELISPOT III/ La technique de l’Immunoscope . Les prélèvements B. Les techniques de séparation par densité C. Les techniques de séparation par phase solide D.FICHE TECHNIQUE N°4 PLAN I/ Les techniques de séparation cellulaire A.

ainsi que leurs réponses en culture à différents facteurs stimulants. qui peuvent être décelés avec des Acm ou polyclonaux spécifiques. héparine… Dans le cas où une culture serait envisagée. Les techniques de séparation par densité La densité de chaque population cellulaire est différente . on recueille le prélèvement dans un milieu de culture cellulaire (RPMI par ex). DMSO B. ainsi. à –80°C ou en azote liquide (besoin d’agents cryoprotecteurs . moelle osseuse. EDTA.Physiques (taille. rapport nucléocytoplasmique…) . en étudier les fonctions. 1.Chimiques (propriétés d’adhérence.I/ Les techniques de séparation cellulaire But : obtenir des populations cellulaires quasiment pures et. A. séparation sur gradient de densité continu ou discontinu. Les prélèvements Origine : sang périphérique. capacité enzymatique particulière…) . densité. les caractéristiques. rate. ganglions. La conservation peut être réalisée à 4°C (conservation des cellules dans un milieu supplémenté par 20% de sérum). Centrifugation simple 200 g pendant 10 min Plasma (riche en plaquettes) Leucocytes Globules rouges .Immunologiques (liés à la présence d’Ag intracytoplasmiques ou de surface. biopsie pathologique Les prélèvements sont généralement recueillit sur anticoagulants : citrate. Les cellules peuvent être distinguées par des critères : .

20-40 min Ficoll Plasma Cellules mononuclées (L + Mo) Ficoll GR Méthode le plus fréquemment utilisée 3. . 10 min à 20°C Plaquettes Polynucléaires 4. Les cellules mononuclées se trouvent dans l’anneau d’interphase. Utilisation du Percoll Percoll : milieu de microbilles de silice enrobées séparation en gradient continu ou discontinu Les cellules sont déposées sur le gradient de Percoll et centrifugées 30 min à 400 g.077) Prélèvement sanguin 400-650 g Ta. Utilisation du Dextran Permet de séparer les polynucléaires Prélèvement sanguin 45 min Plaquettes + polynucléaires Dextran 100 g. Utilisation du Ficoll Ficoll : glucide ramifié artificiel (d20°C = 1.2.

2. 1. soit par l’intermédiaire d’Ac ou de lectine. L’élutriation Basée sur gradient de densité Prélèvement à l’interphase Appareillage : automate Séparation de grandes quantités de cellules Préparation de poche de cytaphérèse. Rosettes Principe : entourer les cellules concernées par de GR = « rosettes » . Adhérence aux fibres de Nylon Les Mo et les Ly adhérent spontanément aux fibres de Nylon (préalablement activées à pH acide). « sélection positive » : population retenue par la phase solide « sélection négative » : population non retenue Phases solides : fond en plastique des boîtes de Pétri ou de culture cellulaire. Ma. Adhérence immune Les cellules sont retenues par des Ac ou des lectines fixés au fond d’une boîte de Pétri 3. incubation 2 h à 37°C. C. 4. polystyrène. certains Ly). billes de taille et de nature diverse (polyacrylamide.5. Adhérence simple Adhérence spontanée au plastique de certaines populations cellulaires (Mo. agarose. silice…) ou encore des hématies. Les techniques de séparation par phase solide But : retenir les cellules soit par adhérence spontanée.

# Le tri est simple.un Ac (dirigé contre un Ag cellulaire) . polystyrène.d’Ac secondaires (les cellules sont préalablement incubées avec des Acm) . latex. 5. Nylon) Deux systèmes principaux : . sélection jusqu’à 109 cellules et compatible avec la cytométrie de flux.les billes magnétiques Technique MACS (« Magnetic activated cell sorting ») : # les cellules sont marquées spécifiquement avec des anticorps couplés à des microbilles magnétiques. silice.Après séparation par un Ficoll. Elles sont couplées à : . rendement > 90%. puis séparées en utilisant une colonne de séparation magnétique placée dans un aimant de très forte puissance.les billes de densité inférieure à celle de l’eau (récupérées par flottaison) . les rosettes se trouvent dans le culot et les GR sont ensuite éliminées. # Les billes ont un diamètre de 50 nm environ et sont composées d’oxyde de fer et de polysaccharide. pureté > 95%. rapide. Billes Variables par leur taille et leur nature (par ex : agarose. chlorure de polyvinyle.

6. Principe technique de la CMF Les cellules sont canalisées par « centrage hydrodynamique » ( passage une à une) dans « une veine liquide » traversée par un faisceau laser Les cellules émettent des signaux lumineux. CD5) D. reflets de propriétés optiques intrinsèques ou induites des cellules . élimination des cellules T dans le cadre des allogreffes de moelle (sur colonne couplée à un Acm pan T. couplées à un Ac dirigé spécifiquement contre un Ag donné. Permet une caractérisation qualitative et quantitative des cellules 1. Tri cellulaire par cytométrie de flux (CMF) 1934 Définition de la CMF : étude précise de cellules isolées entraînées par un flux liquide. Utilisation de la chromatographie d’affinité sur colonne Colonne de billes de Sepharose ou d’acrylamide-agarose.

La gouttelette (contenant la cellule) est déviée par un champ électrique et collectée. rapidité. Jusqu’à 3. 103 cellules analysées / s (1. Le flux peut être fractionné par : . Avantages et limites Analyse quantitative. permet de séparer physiquement les éléments d’une ou deux populations cellulaires définies par leurs propriétés optiques. préalablement chargée électriquement.103 – 5. tri Possible de trier des populations sur une base multiparamétrique (2 morphologies et jusqu’à 5 fluorescences) Les cellules isolées sont parfaitement viables (peuvent être remises en culture) Besoin de standards calibrés pour permettre l’étalonnage de l’appareil Choix contradictoire . est fractionnée en gouttelettes par vibration (US). traitement et stockage informatique des données représentées sous forme d’histogrammes (1 paramètre) ou de cytogrammes (2 paramètres) 2.une séparation mécanique (300 cellules déviées / s) vibration associée à la déviation dans un champ électrique . Le tri cellulaire Cette fonction de la CMF.104 – 2. 104) 3. sensibilité de détection.Les signaux sont séparés (par des filtres optiques). collectés (par des photomultiplicateurs) puis amplifiés Numérisation des signaux. analyse multiparamétrique cellule par cellule. la veine liquide. rendement / pureté (inversement proportionnelle à la vitesse du tri) Besoin de cycles d’enrichissement pour les populations minoritaires (< 5%) .

de lymphocytes T CD4+. Destruction d’une population cellulaire 1. Tri cellulaire révélé par immunofluorescence Technique FACS (« Fluorescence activated cell sorting ») Association de la fluorescence et de la CMF On utilise des anticorps (monoclonaux) dirigés contre des marqueurs de la surface cellulaire par exemple (anti-CD4+ par ex) et qui sont couplés à un fluorochrome La population cellulaire recherchée marquée est ensuite triée par le cytométre et peut être utilisée pour d’autres applications 5. Par choc osmotique Adapté à l’élimination des GR.4. 2. Cytotoxicité par Ac Principe : tuer une population cellulaire par des Ac fixant le complément ou des Ac couplés à des toxines (la ricine par ex). . par choc hypotonique à l’eau distillée ou par choc au chlorure d’ammonium. Applications de la CMF Purification des cellules CD34 pour la greffe de cellules souches hématopoïétiques Tri de cellules transfectées (utilisation conjointe du tri cellulaire et de gène rapporteur) Tri de spermatozoïdes (sélection du sexe d’un embryon) Tri de chromosome (création de banques) Tri des microorganismes de l’environnement (obtenir des souches pures d’algues unicellulaires par ex) Dénombrement de lymphocytes B. CD8+… réalisée en diagnostic médical E.

en détectant la sécrétion de cytokines (l’INFγ notamment).II/ La technique ELISPOT (« Enzyme-linked immunospot ») 1983 1. Principe Détecter et dénombrer les cellules T activés chez un patient. A l’origine. adaptée pour l’analyse de l’activation des lymphocytes T 2. La coopération cellulaire : cellule présentatrice d’Ag (CPA) / LT Activation Différenciation CPA LT LT Premier signal : CMH/peptide/TCR Second signaux : cosignaux CD28/B7. c’est cette variabilité qui est étudiée par la technique de l’immunoscope Sécrétion de cytokines 50 (24 familles) 2 6-7 .1-2. CD154/CD40… III/ La technique de l’Immunoscope C. Pannetier & M. Cochet (1992) « microscope du système immunitaire » Détecter sélectivement l’amplification d’un clone T (en réponse à la présentation d’un Ag) et identifier ce clone Cette technique s’appuie sur l’analyse du répertoire de cellules T d’un échantillon. utilisée pour l’activation des cellules B En 1996. plus précisément sur l’analyse d’une région hypervariable du TCR La taille de la région CDR3 (entre les segments V et C) est caractéristique d’un nombre restreint de clones de cellules T.

permettant de visualiser pour chaque couple BV-amorce fluorescente. la distribution des fragments obtenus et de les quantifier . Pannetier).Principe technique de l’immunoscope Réverse transcription des ARNm extraits des cellules T Division en 24 fractions des ADNc amplifiés par PCR jusqu’à saturation (40 cycles) (une amorce spécifique du segment C et la seconde sur l’un des 24 V) Amplification des ampliméres par PCR (1 à 5 cycles) avec une seule amorce spécifique de la région C ou d’un des segments J marqués en C-ter par un composé fluorescent (un seul brin copié) Séparation des amplimères marqués par une électrophorèse sur un gel de polyacrylamide placé dans un séquenceur automatique Traitement des données par le logiciel Immunoscope (C.

CDR3 (5-15 AA) V D J C Echantillon sanguin Les 4 segments recombinés formant la chaîne β du TCR Lymphocytes T ARN V D J C Amplification par PCR Population cellulaire hétérogène Population cellulaire comprenant un clone lymphocytaire majoritaire Analyse par électrophorèse Distribution .

extraordinaire sensibilité .Traitement des résultats Profils d’une distribution gaussienne (8 pics en moyenne) population cellulaire hétérogène. correspondant à autant de lignées de cellules T activées Un ou plusieurs clones T sont devenus majoritaires.de 20) L’inconvénient majeur est que cette technique ne permet pas de distinguer les clones T présentant des régions CDR3 distinctes mais de même taille .travailler avec un très petit nombre de cellules (. suite à une vaccination ou à une infection. Avantages : . absence d’expansion clonale Apparition d’un (ou plusieurs) pic(s) avec un écart de la distribution gaussienne.

Distribution tissulaire 2. Les molécules de classes II 1. Propriétés du système HLA C. 6. Distribution tissulaire 2.FICHE TECHNIQUE N°5 PLAN I/ Rappels sur le CMH / HLA A. Fonctions des molécules HLA II/ Les 1. SSP. techniques d’analyse du CMH Méthode sérologique (lymphocytotoxicité) Méthode cellulaire : la Culture mixte lymphocytaire (MLR) Méthode biochimique Méthodes de BM : PCR-SSO. RFLP Séquençage direct Nomenclature -1- . Structure biochimique E. 3. Organisation du CMH B. 4. Structure biochimique D. 5. 2. Les molécules de classe I 1.

Présentation au lymphocyte T CD4+ Les locus de classe III . Gènes A. Rôle dans l’apprêtement : molécules chaperons (HSP-70) . B et C . fonction réelle : présentation Notion d’épitope T Définition fonctionnelle : ensemble de gènes impliqués dans les processus d’apprêtement de l’antigène et de présentation au lymphocyte T. H2 (George SNELL) Historiquement : le rejet de greffe . C4b. Présentation au lymphocyte T CD8+ Les locus de classe II . Aucun rôle dans l’immunité : 21 hydroxylase. Gènes D : DP. HLA (Jean DAUSSET) en 1958. cytokine :TNF) .I/ Rappels sur le CMH / HLA CMH. Rôle dans l’immunité : complément (C2.3 4000 kb. Organisation du CMH Chr 6p21. Bf). hémochromatose -2- . C4a. Définition génétique : région chromosomique où se trouvent les gènes controllant la structure et l’expression des molécules de présentation antigénique. A. 1/1000e du génome humain environ Système multigènique (>200 gènes) Organisé en 3 sous-régions • Dont les produits des gènes se distinguent par : leur structure leur fonction leur localisation cellulaire • On distingue : Les locus de classe I . DQ et DR .

peu de recombinaison. Les molécules de classe I 1. TAP2. Classes II (rôle d’apprêtement) : DM. MIC . notion d’haplotype) conséquences : • Diversité des molécules HLA chez un individu : hétérozygotie. TAP1. glandes salivaires. G. DO. F. codominance • Diversité entre individus : nombre élevé d’haplotypes différents • Transmission en bloc d’un haplotype C. Propriétés du système HLA Système multigénique (>200 locus) Multiallélique (Polymorphisme : plusieurs allèles) Codominance Liaison (les gènes ségrègent en bloc. LMP7 B.Autres locus de classes I et II . LMP2. Distribution tissulaire Ubiquitaires Expression forte : • Lymphocytes • Cellules dendritiques • Macrophages Expression faible ou nulle : • Hématies • SNC • Cellules trophoblastiques et cellules embryonnaires en débuts de développement • Certains endothéliums (pancréas. Classes I non classiques ou Ib : gène E. cornée) -3- .

B et C) . • Lymphocyte B. • Epithélium digestif et respiratoire. 3 domaines extracellulaires • D’une chaîne légère β : β2 microglobuline . tissus conjonctifs). Les molécules de classes II 1. • Macrophages. Codée par les gènes de classe I (A. Monomorphe .Expression diminuée par : • Infection virale • Cellules tumorales Expression augmentée par : • INF α. D. Distribution tissulaire Cellules présentatrices d’antigènes (CPA) au LT CD4+ : • Cellule dendritique (épithélium. • Cellule interdigitée (ganglion). Non HLA (Chr 15) . β et γ 2. -4- . Autres cellules : • Epithélium thymique. 1987) : Sillon de présentation • Formée par α 1 et α 2 • Fond : 8 feuillets β plissés antiparallèles • Bords : 2 hélices α Toujours occupée par un peptide Peptides présentés : nonamères (8-10 aa). Polymorphe . Rôle important (conformation) Structure tridimensionnelle (Bjorman. Structure biochimique Glycoprotéines transmembranaires exprimées à la surface des cellules Association non covalente : • D’une chaîne lourde α : .

• Sillon : α1 et β1 . Constituants cellulaires (normaux. Structure biochimique Glycoprotéines transmembranaires exprimées à la surface des cellules Association non covalente : • D’une chaîne α et d’une chaîne β . • Endothélium vasculaire activé. E.• Progéniteur hématopoïétique. Ag tumoraux) . Lymphocyte T activé. mais c’est la séquence centrale de 8-10 aa qui interagit avec le sillon. Codé chacune par un gène HLA par ex : DQA1 pour la chaîne α de la molécule DQ DQB1 pour la chaîne β de la molécule DQ . Polymorphes . IL-4. Fonctions des molécules HLA Présentation Apprêtement ("processing") Pas le même type d'Ag Pas au même lymphocyte Pour les classes I et les classes II Classes I : • Ag : protéines intracellulaires . Les extrémités N et C-ter débordent du sillon. IL-13. 2 domaines extracellulaires Structure tridimensionnelle : • Sillon plus ouvert à ses extrémités. TNFα et β 2. Virus.Taille des peptides présentés : plus variable (13 à 34 aa). Expression augmentée par : INFγ. bactéries intracellulaires -5- .

Lymphocytes à typer + Ac monospécifique + complément -> lyse ? Simple. B. Méthode cellulaire : la Culture mixte lymphocytaire (MLR) Histoire : découverte des classes II (Benaceraf et Mac Devitt) Population stimulante irradiée (LT homozygote pour classe II) + LT à tester -> prolifération ? -6- . quantité molécules de classe II exprimées) 2. classes II (isoler les cellules exprimant les cl II : LB. Surveillance du contenu protéique de la cellule . fiable uniquement pour les classes I Limites : qualité des sérums utilisés (polyspécificité). C et DR obtenus à partir de polytransfusés. Défense anti-infectieuse vis à vis des germes intracellulaires En accord avec l'expression ubiquitaire des classes I Classes II : • Ag : protéines extracellulaires et membranaires (Bactéries) • LT : CD4+ auxiliaire • Mécanisme effecteur : Ac • Fonction : . Défense antibactérienne En accord avec l'expression des classes II sur les APC II/ Les techniques d’analyse du CMH 1.• LT : CD8+ cytotoxique • Mécanisme effecteur : cytotoxicité • Fonction : . de femme multipare (10% des femmes durant leur grossesse développent des Ac anti-HLA) ou de rejet de greffe. rapide. Méthode sérologique (lymphocytotoxicité) Histoire : Ac lymphocytotoxiques (jean Dausset) : Ac anti classes I Ac monospécifiques anti A.

B. fastidieux => n'est plus utilisé 3. Méthode biochimique Isoélectrofocalisation Electrophorèse bidimensionnelle (précipitation à l’aide d’Acm. SSP. Nomenclature Classes I : A. DR 5. Séquençage direct En recherche Description de nouveau allèles 6. élimination des NANA et E2-D) Détermination de variants non détectés en sérologie 4. C + N° d'allèle Classes II : f(technique utilisée) • Sérologie : (DP-DQ-DR) + N° d'allèle • MLC : DW + N° • PCR-SSO : (DP-DQ-DR) + Chaîne + * + N° d'allèle Ex : DRB1*0402 (DR4 en sérologie) -7- . DQ. RFLP Amplification d'un exon du locus à étudier (PCR) Hybridation avec sonde oligonucléotodique spécifique (+/-) R* ou froide (SSO) Utilisation d’amorces spécifiques d’allèles (SSP) Digestion par des enzymes de restriction (RFLP) Technique de référence pour DP. Méthodes de BM : PCR-SSO.Long.

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