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Prélevements ophtalmologiques

Prélevements ophtalmologiques

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Institut Pasteur d' Algerie

Techniques microbiologiques

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ae riologiqu Anti ioth r pie

des Infe Deu ires

Editions Pirates

Insttrut Pasteur dt Algerie

Techniques microbiologiques

1Dlagnostlc 1Bacteriologique et Antfbiocherapie dles Infeorions ooulaires

A.S. M ERAO-H. TALI-MAAMAR-K. RAHAL

Plan

I Introduction
II ~natomie de l'oeil
III Flore normale conjonctivale
IV $ites infectieux oculaires et etiologies bacterlennes
V Materiel de prelevernent
VI Methodes de prelevernent et d'isolement
VII Methode et interpretation des frottis
VIII Methodes et interpretation des cultures
IX $ensibilite aux antlblotlques-antlblotheraple
X Etiologies bacterlennes des infections oculaires en algerie
XI Bibliographie
XII ~nnexes I-INTRODUCTION ·

L'ceil, organe noble, est particulierernent expose aux agressions externes dont celles microbiennes ; mais il en est extrernernent protege par l'equipernent immunologique de la muqueuse conjonctivale et par les decences specitiques apportees par la secretion lacrymale.

Cependant la surface oculaire est souvent victime de I'infection, qui est surtout virale. L'inflammation qui en results est un moyen de defense contre les agents infectieux.

Les infections oculaires superficielles sont tres frequentes et beniqnes, et querissent sans problems sous traitement local. Mais dans certains cas les tissus de l'ceil sont leses et il en results des sequelles dont les consequences ont un retentissement sur la fonction visuelle, par I'opacification des milieux, la rupture des barrieres hernato-oculaires et I'atteinte de la retina. Ainsi l'etude microbiologique des infections oculaires doit etre rapidement entre prise afin d'isoler Ie germe causal et d'instaurer aussitot que possible un traitement antibiotique adequat en plus des autres moyens therapeutiques permettant la regression de I'infection.

Les indications de I'analyse microbiologique et les techniques utilisees dependent du site de I'infection, de la severite du processus et de la connaissance du germe mis en cause.

De plus la collection et Ie traitement de petits volumes de produits pathologiques des ditferents sites de l'ceil infects requierent des methodes speciales,

Enfin, plusieurs facteurs rendent necessaires I'isolement du prelevernent dans la salle d'examen, au bloc operatoire ou au lit du malade, c'est pourquoi ce fascicule s'adresse tant au personnel de laboratoire qu'a I'ophtalmologiste.

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II-FLORE NORMALE CONJONCTIVALE ·

t-Bacterles .

La flore norma Ie conjonctivale est surtout constituee de Staphylococcus epidermidis (75-90%) et de Corynebacterium spp (20-75 %) en particulier C.xerosis et C.acnes (50%), streptococcus spp (2 a 10 %) et streptococcus pneumoniae, les microcoques, les branhamella catarrhalis (5%) les enterobacteries et autres bacilles gram neqatif sont moins frequents.

Staphylococcus aureus (25-45 %) peut transiter sur la surface conjonctivale, sans manifestation clinique.

2-Virus

Les virus peuvent transiter sur la conjonctive mais sont Ie plus souvent a I'origine de manifestations cliniques.

3-Champignons .

Les cham pig nons rnyceliens tels que Aspergillus; Penicillium, Cephalosporium et Cladosporium, ainsi que les levures telles que Candida; Rhodotorula et Geotrichum peuvent coloniser la surface conjonctivale du sujet sain a peau seborrheique.

III-SITES INFECTIEUX OCULAIRES ET ETIOLOGIES BACTERIENNES :

Les infections oculaires peuvent etre localisees dans n'importe quelle partie de l'ceil que ce soit Ie segment anterieur ou posterieur.

1-Cellulite orbitaire .

Les cellulites orbitaires sont dues a une inoculation intra orbitaire par traumatisme ; conduisant a I'extension de I'infection dans une panophtalmie ou a une rnetastase de I'infection du sinus para nasal.

La cellulite orbitaire est une infection grave qui pourrait produire une cecite, une thrombose septique des sinus caverneux et une infection intracranienne.

1.1- Cellulite orbitaire aigue :

Traumatique ou chirurgicale :

./ Staphylococcus aureus est Ie plus frequent.

./ Une infection mixte aero-anaerobie peut avoir lieu.

Secondaire a une panophtalmie :

./ N'importe quelle bacterie peut etre mise en cause .

./ Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae ou Pseudomonas aeruginosa sont Ie plus souvent isoles,

Assocle a une sinusite paranasale :

./ Staphylococcus aureus, Streptococcus du groupe A, Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influanzae sont les principaux germes isoles .

./ Haemophilus influanzae est surtout retrouve chez I'enfant de moins de 5 ans . ./ Les autres BGN sont rarement isoles chez un patient sans antecedents.

./ Les anaerobies non sporules contribuent parfois a la pathoqenese des sinusites aigues et cellulites orbitaires aigues.

1.2- Cellulite orbitaire chronique .

Elle est rare, elle peut se developper apres placement de materiel etranqer au cours d' une chirurgie sur la retina ou apres reparation d'une fracture orbitaire.

Les germes isoles sont : les rnycobacteries, nocardia, Actinomyces et certains cham pig nons filamenteux survenant presque exclusivement chez des patients ages entre 40 a 60 ans vivant dans les regions ternperees et tropicales.

2- Cellulite preseptale .

./ C'est I'inflammation des tissus sous cutanes du septum orbitaire des paupieres, delirnites de l'interieur par un attachement fibreux a la peau des bordures orbitaires superieures et inferieures .

./ L'infection des tissus sous cutanes pre septaux results, en general, d'une blessure par piqure ou d'une laceration .

./ l.'elasticite de la peau des paupieres, la perte de tissus sous cutanes ; I'absence de graisse et Ie site relativement clos predisposent a la formation d'cedernes extensifs et d'abces .

./ Les germes les plus frequernment incrirnines sont :

.:. Staphylococcus aureus, Streptocoques du groupe A et autres streptocoques .

• :. Le streptocoque du groupe A est parfois la cause de necroses qanqrenees severes .

• :. Les bacteries anaerobies non sporulees peuvent etre retrouvees en association avec les bacteries aerobies .

• :. Clostridium perfringens est rarement incrirnine, mais peut engendrer des gangrenes gazeuses ou cellulites a la suite de complications des traumatismes periorbitaires .

• :. Dans les cellulites preseptales post traumatiques ; Haemophilus influanzae peut etre isole chez les patients de tout age .

• :. Chez I'enfant de 36 mois a 6 ans il produit Ie plus souvent des cedernes non suppures des paupieres et des conjonctivites.

.:. Les infections dues a Pseudomonas aeruginosa et autres bacteries a gram neqatifs aerobies sont rares chez un patient sans antecedents.

3-Erysipele oculaire

,/ C'est une forme rare de cellulite aigue du au streptocoque du groupe A.

,/ L'infection est tout d'abord caracterisee par une eruption cutanee bien delirnitee qui tend a devenir rouge vif ou cramoisi, chaude tendue et induree,

,/ La porte d'entree ou la blessure sont en general absentes. L'inflammation peut s'etendre a I'espace orbitaire et produire un ptosis; un cede me conjonctival et une limitation de la rnobilite oculaire.

4-Blepharite .

4.1-Blepharite virale .

Elle est caracterisee par une eruption vesiculaire de la region annexe oculaire et des paupieres sans diffusion exanthernique et est cause par Herpes simplex, Herpes zoster, Poxvirus, et Molluscum contagiosum.

4.2-Blepharite bacterlenne .

Est Ie plus souvent due a Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis.

L'infection aigue staphylococcique est caracterisee par des ulcerations uni ou bilaterales de la peau ou de la marge des paupieres avec une cellulite palpebrale.

L'infection chronique staphylococcique est squameuse.

Une hyperhernie chronique, une desquamation et une ulceration de la region laterals canthale (blepharite angulaire) peut etre due aux moraxella.

5-Conjonctivite .

Les principales voies de contamination de la conjonctive sont les particules aeriennes ; Ie contact main ceil et les metastases a partir des annexes oculaires.

Les conjonctivites hernatoqenes sont rares. l.'etude microbiologique de la conjonctive normale est intluencee par la cornplexite environnementale et par les facteurs de l'hote : aussi l'interpretation de la

culture conjonctivale demande de l'experience sur la frequence relative de la contamination par des germes varies.

Des cultures bilaterales sont obligatoires dans toute suspicion de conjonctivite unilaterale.

5.1-Conjonctivite bacterlennes :

Elles se caracterisent par un cederne des paupieres, une hyperhernie et un cedeme conjonctival avec suppuration de la conjonctive.

Les principaux agents mis en cause sont :

• Staphylococcus aureus
• Streptococcus du groupe A
• Streptococcus pneumoniae
• Haemophilus influanzae
• Et Neisseria gonorrhoeae. Ce dernier doit etre suspects chez tout patient presentant une conjonctivite purulente rapidement progressive.

Neisseria gonorrhoeae est I'un des rares germes capables de penetrer l'epitheliurn corneen et d'y produire des keratites suppuratives.

Pseudomonas et les enterobacteries sont rarement mis en cause, excepte chez Ie sujet imrnunodeprime et en presence de « paroi sclera Ie cosrnetique » (cosmetic scleral shell).

Le role des anaerobies non sporules n'est pas etabli,

5.2- Conjonctivite a Chlamydia :

Le trachome, conjonctivite granuleuse due a Chlamydia trachomatis, est une infection endernique dans de nombreux pays africains et moyen-orientaux et est une cause majeure de cecite.

La transmission se fait par prorniscuite et est liee aux mauvaises conditions d'hyqiene.

Elle se presents par un aspect turgescent des follicules conjonctivaux qui eclatent a la pression; par I'apparition d'un panus corneen superieur et la formation de sequelles cicatricielles palpebroconjonctivales avec trichiasis.

Les serotypes ABBa et C sont mis en cause.

La conjonctivite a inclusions est due aux serotypes : D E F G H I J K.

5.3- Conjonctivite neonatale :

Elle est due a Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Neisseria gonorrhoeae et Chlamydia trachomatis.

5.4- Conjonctivite virales :

Elle est due a Herpes simplex, Herpes Zoster et Adenovirus et est caracterisee par une lyrnphadenopathie pre oculaire, un cedeme des paupieres, une decharqe conjonctivale sereuse, une conjonctivite folliculaire et une keratite. Cytomegalovirus est eqalement incrirnine chez l'imrnunodeprime.

6-Keratite

L'infection de la cornee est une infection grave necessitant des investigations rneticuleuses et rapides au laboratoire. Seules quelques bacteries arrivent a franchir un epithelium corneen intact (Neisseria, Corynebacterium diphteriae), les autres germes ne contaminent la cornee qu'au decours d'une blessure par un materiel etranqer contarnine ou d'une invasion d'une defection epitheliale preexistante. l.'anarnnese n'est pas evocatrice d'un germe particulier.

Les germes les plus frequents sont Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa (infections severes pouvant donner une perforation de cornee en 72H) et diverses enterobacteries,

Les anaerobies sont rares.

Mycobacterium fortuitum et M.chelonei donne des keratites ulceratives avec peu de suppurations stromales.

7 -Endophtalmies :

Ce sont les plus severes des infections oculaires :

7.1-Endophtalmies exoqenes :

Dues a une chirurgie intraoculaire, a une blessure perforante de l'ceil, a une fistule sclerocorneenne ou a une suppuration corneenne avec perforation.

Elles se developpent dans les 72 heures qui suivent I'intervention chirurgicale ou la blessure et sont caracterisees par une baisse de la vision, douleur, cedeme palpebral, hyperhernie conjonctivale, chemosis, cedeme corneen, une severe iridocyclite avec hypopyon et hyalite, des secretions purulentes bordent la racine des cils.

Les germes isoles sont en post operatoire sont Staphylococcus aureus et Staphylococcus epidermidis, Streptococcus pneumoniae et autres especes, Pseudomonas et enterobacteries (proteus).

Les infections fongiques et celles dues aux anaerobies se developpent plus tardivement.

7.2- Endophtalmies endoqenes :

Apparaissent apres complication d'une septicernie.

L'invasion directe du globe oculaire a partir d'une cellulite orbitaire est rare; mais peut avoir lieu dans les cas de mucormycoses.

N'importe quel germe peut etre en cause s'il y trouve les conditions favorables a son developpernent.

Ces infections ont lieu habituellement chez les sujets debilites ou apres traitement.

II Y a baisse de la vision, une douleur leqere ou absente, une iridocyclite et rarement une retinite focale.

Les germes isoles sont Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae ; Haemophilus influanzae, Neisseria meningitidis, Mycobacterium fortuitum, Bacillus spp et Candida Albicans.

8-Retinites

B.t-Retlnlte toxoplasmique :

Elle est due a la multiplication et a I'enkystement intra- retinien de Toxoplasma gondii.

8.2-Retinite a cytomegalovirus CMV :

C'est une des rares complications d'un traitement irnrnunodepresseur chez les transplantes, Avec l'avenernent du SIDA, la retinite a CMV est devenue plus frequents et est la principale cause de cecite au cours de la maladie.

Le virus produit une diminution de la vision, une necrose retinienne diffuse ou focale, une vitrite.

8.3-Retinite et endophtalmie a Toxocara:

La dissemination de larves de Toxocara canis produit une inflammation oculaire chez Ie jeune enfant.

Elle se caracterise par un granulome retinien, un detachernent et une traction retinienne focale et une retinovitrite diffuse.

8.4-Retinite syphilitique

Elle est rare et se manifeste par une page blanche de reticule hemorraqique associee a une inflammation du segment anterieur.

8.5-Autres retlnltes infectieuses .

La retinite a Pneumocystis carinii a ete decrite avec l'avenernent du SIDA.

D'autres agents infectieux ont ete decrits tels que: Mycobacterium avium intracellulare, bacilles a gram positif, Cryptococcus neoformans et Histoplasma capsulatum.

9-Dacryoadenite

C'est une infection aigue, rare des glandes lacrymales.

La voie d'inoculation se fait par les conjonctives a travers les canaux du « fornix» supero-ternporal so it par extension hernatoqene.

L'infection exoqene est caracterisee par une douleur, une secretion sereuse ou mucopurulente conjonctivale, une hyperhernie, un cederne et une suppuration du lobe palpebral.

Les germes les plus frequents sont : Staphylococcus aureus, streptococcus pneumoniae et streptococcus du groupe A.

L'infection par voie hernatoqene est une complication rare due so it a Neisseria gonorrhoeae so it au virus des oreillons, de la grippe ou de la MNI.

La dacryoadenite granulomateuse chronique, est due a Treponema pallidum, Mycobacterium tuberculosis et Mycobacterium leprae, Nocardia et certains champignons filamenteux.

10-Canaliculite

Les formes aigues sont rares et sont dues a I'infection des points et canalicules lacrymaux.

Les canaliculites chroniques sont caracterisees par un cederne et hyperhernie des paupieres, une dilatation, un ecoulernent mucopurulente epais et un epiphora recurrent.

L'infection peut impliquer les canalicules inferieures et superieures

Le germe Ie plus souvent mis en cause est Actinomyces israelii puis Arachnia Proprionica.

Des infections mixtes aero-anaerobies peuvent eqalement avoir lieu, mais sont d'interpretation difficile a cause de la contamination probable par les germes de la peau et des conjonctives.

11-Dacryocystite .

C'est I'infection du sac lacrymal due a une stenose du canallacrymo-nasal.

La forme aigue se caracterise par une douleur une hyperemia, une epiphora, une distension une tendrete des tissus mous dans la region canthale interne.

Les germes les plus souvent en cause sont Staphylococcus aureus, streptococcus pneumoniae, Streptococcus du groupe A et Haemophilus influanzae.

12-Mucormycose

Elle realise une infection rhino-orbito-cerebrale, due a un champignon de la famille des phycomycetes, et touche essentiellement Ie diabetique desequilibre en acidocetose. Mais elle a ete decrite eqalement dans les leucernies, les Iymphomes et lors des traitements corticofdes ou antimitotiques.

V-MATERIELS DE PRELEVEMENTS ·

Le materiel de prelevernent et de transport peut etre qarde dans un easier dans Ie service d'ophtalmologie.

Le prelevernent en particulier dans les cas d'Endophtalmies ou de keratite sera pratique par I'ophtalmologiste.

Une fiche d'instruction plastifiee et collee au easier peut aider pour les differents precedes. Certains milieux tels que bouillon Tryptone soja, gelose au sang, gelose au chocolat ou des milieux de transport pour virus peuvent etre qardes, enveloppes dans un sachet plastique, au refriqerateur entre 2°C et 8°C.

Dans les cas d'infections oculaires graves, telles que Ie keratites et Endophtalmies suppuratives, I'ophtalmologiste doit alerter rapidement Ie laboratoire afin que des milieux adequats puissent etre disponibles des la reception du prelevernent.

1-Systemes de collection du prelevernent :

La spatule de Kimura: est ideale pour obtenir du materiel conjonctival, ou corneen. La pointe de la spatule est sterilises a la flamme puis refroidie rapidement avant de proceder au grattage conjonctival ou corneen.

Plusieurs spatules doivent etre disponibles pour la collection rapide des prelevernents. Plusieurs types d'ecouvillons doivent, eqalement etre disponibles, so it conditionnes dans de simples sachets unitaires sees, soit dans un systerne utilise comme milieu de transport.

Les bouts des ecouvillons peuvent etre en coton, en polyester ou en alginate de calcium qui conviennent a la majorite des bacteries et champignons.

Les ecouvillons sees ne doivent pas etre utilises si Ie prelevernent n'est pas isole aussit6t, car les bouts s'assechent rapidement et les bacteries peuvent etre perdues.

Pour les bacteries anaerobies, Ie liquide ou Ie pus doit etre aspire a I'aide d'une seringue rnontee d'une aiguille sans admission de bulles d'air.

L'aiguille est ensuite bouches et la seringue rnontee de I'aiguille est envoyee au laboratoire.

Des systernes de transport pour bacteries anaerobies existent dans Ie commerce (culturettes anaerobies Biolyon par exemple).

Pour les virus, les bouts des ecouvillons doivent etre en coton ou en polyester.

2-Anesthesiants topiques

Pour obtenir un raclage de la cornee, I'hydrochlorure de proparacaine a 0.5 % est prefers aux autres anesthesiants topiques, car il est moins antiseptique.

3-Lames et fixateurs :

Plusieurs lames de verre doivent etre disponibles pour realiser des frottis. Elles sont a bord depoli et avec un cercle grave, ce qui facilite l'etiquetaqe et la reconnaissance du frottis.

Avant de proceder au frottis, les lames sont deqraissees en les plongeant dans du methanol puis soigneusement essuyees,

Different fixateurs peuvent etre utilises selon I'application des frottis :

Pour I'histologie et la microscopie optique, on utilise Ie formal a 10 %.

Pour I'histologie et la microscopie electronique : Ie glutaraldehyde a 4% ou un melange de 1 % de glutaraldehyde et de 4 % de formal peuvent etre employes.

Pour la coloration de Papanicoulaou : Alcool ethylique a 95%.

Pour la coloration au methenamine d'argent rnodlflee, on utilise des lames de verre recouvertes de gelatine.

Pour la coloration des anticorps fluorescents, l'acetone est utilise entre 0 et 20°C.

4-Milieux utilises:

4.1-Pour les bacteries aerobles ou anaerobles facultatives :

Bouillon BHIB ou BGT pour imbiber les ecouvillons ayant servi aux prelevernents.

Gelose au sang de mouton a 5 %.

Gelose au sang de cheval a 5 % pour les especes autre qu'Haemophilus influanzae.

Gelose au sang cuit addltionne de supplement Fildes ou supplement G et incubee 48 h sous C02 (3 a 10 %) pour Haemophilus influanzae ou Neisseria gonorrhoeae.

4.2-Pour les bacteries anaerobles strictes :

Bouillon TGY ou bouillon au Thioglycolate addltionne de 5 ug d'hemine et de 0.5 ug de Vitamine K.

Les bouillons sont mis en ebullition 20 minutes et refroidis rapidement, puis utilises externporanernent.

Les bouchons sont aussitot visses et Ie milieu est incube en anaerobiose soit en jarre chimique avec Gaz Pack ou anaerocult A, soit en jarre physique avec melange gazeux 5 % H2, 5 % de C02, 90 % N2 a 37 ° ou 35°C durant 48 h a 7 jours.

Deux qeloses Columbia additionnees I'une de 5 % de sang frais et I'autre de sang hernolyse incubees en anaerobiose 48 h a 7 jours.

Des sachets unitaires type anaerocult P (Merck) existent dans Ie commerce.

4.3-Pour les champignons

Gelose Sabauraud addltionnee de Chloramphenicol a 50 ug/ml ou de gentamicine a 50 ug/ml incubee 48 h en aerobiose.

4.4-Pour les rnycobacteries et les Nocardia

Milieu de Lowenstein Jensen incubes en aerobiose, Ie milieu Middle Brook so us 5 a 10 % de C02 pendant 08 semaines.

4.5-Pour les virus

Les milieux de Hanks, de Leibovits-Emory et de Stuart conviennent au transport des prelevernents susceptibles de contenir des virus (Adenovirus, Herpes simplex virus, Virus de la Varicelle et du Zona).

4.6-Pour Chlamydia

Le milieu de transport sucrose phosphate est qarde dans de la glace durant Ie transport vers Ie laboratoire. Si la conservation dure une nuit, Ie milieu est conqele dans de la neige carbonique ou a - 70 "C.

Des milieux de transport pour LCR (Ligase Chain Reaction) existent pour la mise en evidence du DNA des Chlamydiae.

VI-METHODES DE PRELEVEMENT ET D'ISOLEME NT :

1-Cellulite orbitaire

En presence de blessure ouverte ou de site de drainage, Ie prelevernent est obtenu par aspiration a I'aide de seringue rnontee d'une aiguille et isolement irnrnediat sur les milieux adequate.

Si Ie pus doit etre transporte, a la seringue est convenablement rebouchee et son contenu debarasse des bulles d'air.

Un frottis pour une coloration de gram permet une orientation de diagnostic.

Dans Ie cas de cellulite orbitaire chronique des colorations de Ziehl, Giemsa et coloration speciale pour champignons sont eqalement realises et une biopsie du tissu orbitaire peut etre effectuee par I'ophtalmologiste.

2-Cellulite preseptale :

2.1-Absence de blessure auverte au de site de drainage :

Le prelevernent est realise par I'ophtalmologiste.

Pour la paupiere superieure : incision au niveau de la jonction du tiers lateral et des deux tiers median de la paupiere a I'aide d'une lame n011 Baird-Parker et apres avoir nettoye la peau avec de I'alcool et de la teinture d'iode ou un derive lode,

Pour la paupiere inferieure : incision de 1 a 2 cm au dessus de la bordure orbitaire inferieure apres desintection de la peau.

Dans les deux cas, Ie pus est ensuite sterilernent aspire sterilernent a la seringue et envoye aussitot au laboratoire.

2.2-Presence de blessure auverte au de site de drainage:

Nettoyage de la peau adjacente a I'aide de la teinture d'iode ou de derives lodes, Collection du pus a I'aide de seringue sterile rnontee d'une aiguille.

Dans les deux cas, Ie prelevernent est aussitot ensernence dans les milieux adequats et un frottis est realise pour les exam ens microscopiques.

Si Ie prelevernent doit etre transporte et non ensernence aussitot, les seringues doivent etre convenablement rebouchees apres avoir evacue les bulles d'air, puis envoyees aussitot au laboratoire.

3-Erysipele oculaire :

Prelevernent a I'aide d'ecouvillon en coton ou en alginate de Ca au niveau du tarse inferieur conjonctival et du fornix et isolement sur gelose au sang de mouton a 5 %.

L'injection aspiration de solution saline sterile a travers les tissus sous cutanes et I'aspiration par aiguille dans I'espace orbitaire sont contre-lndlquees,

L'injection peut etre confirmee lors de la periode de convalescence par une augmentation des anticorps antistreptolysine 0 (ASLO).

4-Blepharite

Prelevernent a I'aide d'ecouvillon en coton ou alginate de Ca, de la marge anterieure de la paupiere et des surfaces ulcerees de la paupiere inferieure et superieure des yeux.

Les ecouvillons sont ensuite trempes dans du bouillon Trypticase Soja et un isolement est realise sur les milieux adequate.

6-Conjonctivite :

Des prelevernents bilateraux, sont la aussi obligatoires afin de pouvoir com parer la flore normale de l'cell sain avec celie de l'oell infecte.

-Pour les cultures bacteriennes : l'ecouvillon est frotte sur Ie tarse inferieure conjonctival et Ie fornix puis trernpe dans du BTS (Bouillon Trypticase Soja) ou dans du BGT (Bouillon glucose tarnponne).

En presence d'un exsudat, l'ecouvillon n'a pas besoin d'etre trernpe dans du bouillon.

Dans Ie cas de suspicion de conjonctivite a Staphylococcus, la marge anterieure des paupieres est eqalernent ecouvillonnee.

Les prelevernents sont ensuite ensernences dans les milieux adequats, et des frottis sont realises.

Le grattage de la surface conjonctivale a I'aide de la spatule de Kimura et apres instillation d'hydrochlorure de proparacaine (1 a 2 gouttes) permet un meilleur isolement des germes et la realisation de bon frottis pour les differentes colorations.

-Pour les chlamydiae:

Les ecouvillons en alginate de Ca sont recornrnandes, alors que ceux en coton sont toxiques pour les chlamydiae.

Le prelevernent est realise avant administration d'anesthesiants topiques.

Les tarses inferieurs et posterieurs conjonctivaux ainsi que Ie fornix sont ecouvillonnes et les ecouvillons sont ensuite trernpes dans Ie milieu de transport pour Chlamydiae puis transportes rapidement vers Ie laboratoire dans un container a glace ou - 70°C jusqu'a inoculation des cellules.

Les cellules de choix pour la culture sont les cellules Mc Coy.

Le grattage conjonctival (tarses info et sup) permet la realisation des frottis que I'on colorera par la suite au Giemsa dans Ie cas de conjonctivites a inclusions, surtout chez Ie nouveau ne,

L'immunofluorescence sur lame est plus speclfique que Ie Giemsa.

6-Les Keratites .

Les prelevernents sont obtenus par grattage de plusieurs sites ulceres ou suppures de la cornee a I'aide de la spatule de Kimura par I'ophtalmologiste et sous une lampe a fente qui permet de detailler les abces corneens.

7 -Endophtalmie :

Le prelevernent des humeurs intraoculaires par I'ophtalmologiste et en salle d'operation. Dans Ie cas d'endophtalmie post chirurgicale les humeurs sont aspirees des deux chambres anterieures et de la cavite vitreenne.

La culture du vitree est plus appropriee en cas d'endophtalmie bacterienne. L'ophtalmologiste peur soit aspirer a la seringue rnontee d'une aiguille, 1 a 2 ml d'humeur aqueuse so it faire une biopsie du vitree lors de la vitrectornie apres avoir mis une solution saline sterile.

Dans Ie cas d'endophtalmie endogene la meilleure methode de prelevernent de I'humeur intraoculaire est la vitrectornie so us microscope chirurgical.

L'ophtalmologiste doit aussitot avertir Ie laboratoire, pour une mise en culture immediate des humeurs intraoculaires.

Un milieu de Lowenstein Jensen doit etre ensernence dans Ie cas de la suspicion d'endophtalmie a Mycobacteries.

Les prelevernents serviront a ensemencer :

Gelose au sang frais, gelose Sabauraud, Bouillon Thioglycate supplernente, BHIB, Gelose au sang cuit, Columbia au sang. (Anaerobles),

Et a effectuer les frottis suivants :

Frottis pour Giemsa, Frottis pour Gram et un frottis de reserve.

Les ensemencements se font directement en exprimant une a 2 gouttes de I'humeur a partir de la seringue, sur les boites et dans les milieux liquides (Thioglycolate et BHIB).

Les frottis sont effectues en exprimant 1 goutte a la surface des lames, en l'etalant de facon circulaire. Apres sechaqe a I'air la fixation se fait dans I'alcool rnethyllque a 95 0 pendant 5 minutes.

Si Ie prelevernent est tres visqueux, il faudra les diluer dans une goutte de solution saline sterile pour obtenir un frottis mince.

l.'ldeal serait d'ensemencer les prelevernents en salle d'operation afin d'eviter toute contamination, pour cela un technicien de laboratoire ou un microbiologiste devrait etre present au moment du prelevernent.

B-Dacryoaoenlte :

Prelevernent a I'aide d'ecouvillon en coton ou en alginate de ca au niveau du fornix superotemporal et des surfaces du lobe palpebral.

Un ecouvillonnage de la surface conjonctivale de l'cell sain est realise sirnultanernent,

Une ou deux gouttes d'hydrochlorure de proparacaine a 0.5 % sont instlllees dans l'cell avant Ie prelevernent par grattage de la conjonctive au niveau de la partie supero-ternporale du fornix a I'aide de la spatule de Kimura afin d'effectuer un frottis sur lame.

L'aspiration a I'aide d'aiguille des glandes lacrymales est deconseillee.

Chaque prelevernent par grattage ne servira a ensemencer qu'une boite ou a ne faire qu'un frottis. C'est la raison pour laquelle de nombreux prelevernents par grattage corneen (15 a 20) sont necessaires,

En cas de keratite non suppurative, I'ophtalmologiste doit inciser la cornee pour prelever sterilernent un fragment qui sera ensernence dans les milieux solides et liquides adequats,

Un frottis sur lame sera eqalement realise.

En parallele les cultures de grattage de conjonctive de l'oell sain doivent etre realisees sur Ie rnerne type de milieu (GS, GSC et Columbia au sang pour anaerobies), afin de faire une analyse comparative et reconnaitre les germes de la flore norma Ie.

9-Canaliculite

Le pus peut etre obtenu en compressant sterilernent la paupiere et les canalicules et en prelevant a I'aide de la spatule de Kimura ou d'un ecouvillon.

Le pus doit etre ensernence aussitot et un frottis sur lame est realise.

10-Dacryocystite :

L'aspiration transcutanee ou I'incision du sac lacrymal sont centre lndlquees, Si une fistulisation externe spontanee a lieu, I liquide de drainage du sac lacrymal peut etre aspire a I'aide d'une seringue sterile rnontee d'une aiguille. Le pus est ensuite ensernence sur les milieux adequats et un frottis pour coloration est realise.

11-Les autres prelevernents :

a- Culture conjonctivale preoperatolre

La valeur de la culture conjonctivale preoperatoire en chirurgie nitra-oculaire est controversee. Le nombre et Ie type de germes d'une conjonctivite varient quotidiennement et les cultures initiales ne refletent pas la flore presente au moment de l'operation,

Cependant une consideration speciale est attribuee aux patients ayant eu une longue hospitalisation ou portant une prothese oculaire pour lesquelles des cultures conjonctivales bilaterales doivent etre realisees,

b- Culture des corps etrangers corneens et intraoculaires :

Apres ablation des corps etranqers par I'ophtalmologiste, on ensemence des bouillons et des milieux adequats pour la recherche des germes responsables de keratites.

c- Culture de milieu de bain de cornee :

Une culture de fragments des tissus corneo-sclereux des donneurs de keratoplastie doit etre realises apres excision par I'ophtalmologiste.

Le prelevernent de cornee et de la sclere est ensuite qarde a +4 "C, dans un milieu contenant des antibiotiques (Peni-Genta ou autres) dans des banques d'oell. Ce milieu de bain de cornee peut etre mis en culture avant de proceder a la greffe.

d- Materiel d'implant infecte :

L'implant intecte est enleve par I'ophtalmologiste puis ensernence au laboratoire dans des milieux adequats pour aerobies, anaerobies et champignons.

Le drainage purulent et des tissus necroses sont eqalernent ensernences de la rnerne rnaniere que les autres prelevernents de tissus.

e- Blessure perforatrice oculaire :

L'ophtalmologiste preleve I'humeur intraoculaire qui sera ensernencee dans les milieux adequate.

Un frottis est eqalement realise comme dans les cas d'endophtalmie microbienne.

Type d'infection Prelevements Colorations Recherche Recherche de Principaux germes lsoles
de virus Chlamydia
Gram Ziehl MGG Autres
Cellulite Ponction de pus + S.aureus S pyogenes H.influanzae
preseptale d'abces Anaerobies Pseudomonas
enterobacteries
Cellulite orbitaire Ponction de pus + + + (1) S.aureus, S.pneumoniae, S.pyogenes,
d'abces H.influanzae, Pseudomonas et
enterobacteries.(3)
Erysipele oculaire Ecouvillonnage du + + + (1) + + Streptococcus du groupe A
tarse inferieur
conjonctival et du
fornix
Daeryoadenlte Ecouvillonnage du + S.aureus, S.pneumoniae, S.pyogenes,
fornix grattage N.gonorrhoeae, Virus (3)
conjonctival apres
instillation
d'anestheslant
Dacryocystite Drainage du liquide + S.aureus, S.pneumoniae, S.pyogenes,
du sac lacrymal H.influanzae
Canaliculite Prelevement de pus + + Actinomyces, Arachnia Blepharite

+

Virus, S.aureus, S.epidermidis, Moraxella

Ecouvillonnage de la marge anterleure de la paupiere.

Ecouvillonnage du tarse inferieure et fornix

+

Conjonctivite

(2)

+

S.aureus, S.pyogenes, S.pneumoniae, H.influanzae, N.gonorrhoeae, anaerobiesPseudomonas et enterobacteries, Chlamydia, virus.

+

+

+

+

Keratite Grattage corneen + + +
ecouvillonnage
conjonctival
Endophtalmies Humeur acqueuse + + +
Biopsie du vitre
Ecouvillonnage
conjonctival +

S.aureus, S.epidermidis, Pseudomonas, Enterobacteries, S.pneumoniae, H.influanzae, N.meningitidis, Mycobacteries, Bacillus, Mucormycose, Champignons, Anaerobies, Virus.

+

S.aureus, S.pneumoniae, Pseudomonas, anaerobies, Mycobacteries, Virus, Champignons, Acantamoeba.

(1) Coloration pour champignons ; (2) : coloration au fluorochrome; (3) : Si infection chronique.

VII-METHODES ET INTERPRETATION DES FROTTIS:

1-Grattage conjonctival 1.1-Coloration de Gram .

Dans les conjonctivites bacteriennes aigues Ie germe peut etre intra ou extracellulaire (polynuclealres),

Les germes ne sont retrouves que tres rarement a l'interieur des cellules eplthellales,

Le bacterioloqiste doit pouvoir distinguer les germes de la flore normale (cocci a gram + evoquant Staphylococcus et bacteries coryneformes) qui sont retrouvees en petit nombre, des germes pathoqenes,

Des levu res peuvent etre observees occasionnellement.

1.2-Coloratin de May Grunwald Giemsa:

Elle permet de caracteriser Ie type de reponse inflammatoire cellulaire et l'etat des cellules epithellales et de mettre en evidence les inclusions intra cytoplasmiques chlarnydlennes .

../ Les noyaux des polynucleaires sont colores en bleu violace . ../ Le cytoplasme des polynucleaires est en bleu clair .

../ Les granules eoslnophiles et les hernaties ont en rose .

../ Les cellules conjonctivales epithellales sont plus larges que les leucocytes (10 a 15 um de diarnetre) et possedent un noyau granuleux bleu central, parfois des nucleoles saillants, et un cytoplasme bleu pale .

../ Les bacteries sont colorees en bleu fence.

Le MGG doit etre prepare quotidiennement afin d'avoir une bonne coloration des differentes cellules l'intenslte de la reponse cellulaire est estirnee en comptant Ie nombre de cellules inflammatoires par rapport a 100 cellules eplthellales,

Dans une conjonctivite bacterienne aigue on remarque plus de 100 polynucleaires/f Ou cellules eplthellales,

Dans les conjonctivites a Adenovirus et Herpes Simplex Virus il ya moins de 100 lymphocytes / 100 cellules epithellales ou monocytes.

La determination du type inflammatoire cellulaire predominant est realises par un comptage dlfferentiel comme pour Ie frottis sanguin.

1.3-Cytologie MGG des conjonctivites a chlamydia :

Les caracteristiques cytologiques d'une infection a chlamydiae sont :

Reponse cellulaire mixte : Polynucleaires, monocytes et lymphocytes.

Larges macrophages (cellules de leber), cellules plasmatiques, cellules blastoides et cellules souches.

Inclusions intra cytoplasmiques basophiles, les inclusions intra cytoplasmiques sont Ie plus souvent observees dans les champs contenant de nombreux polynucleaires et dans I'interstice de separation des cellules eplthellales,

Le microscopiste doit regarder au grossissement 40 puis au 100 pour bien selectionner les champs.

Les inclusions intra cytoplasmiques sont des particules de petits corps elernentaires de 300 nm colores en rouge violace et de corps initiaux colores en bleu fence.

Les inclusions de corps elernentaires sont en general, plus grandes et contiennent plusieurs particules.

Les inclusions de corps initiaux sont plus petites et ne contiennent que quelques particules.

II faut distinguer les inclusions des granules de rnelanine qui sont colores en gris noir, des emissions nucleaires, des cellules epithellales qui ont la rnerne couleur que Ie noyau , et des bacteries colorees en bleu pale ou bleu fence et localisees a la surface des cellules eplthellales,

1.4-Autres methodes de detection de Chlamydiae :

a-Immunofluorescence: utilisant des anticorps monoclonaux qui reveleront la presence des corps elernentaires.

b-Recherche d'antiqenes de C.trachomatis par technique immunoenzymatique (Chlamydiazyme).

2-Grattage corneen 2.1-Coloration de Gram :

Elle permet de reconnaitre Ie type de bacteries et de champignons qui sont en general observes dans les champs contenant de nombreux polynuclealres et cellules epithellales necrotiques.

Les coccidies, les sporangiospores ou autres elements n'apparaissent que tres rarement dans les grattages corneens et leur identification sur frottis est en general impossible.

La double paroi cystique d'Acanthamoeba peut etre observee au gram et se colore en bleu fence et rouge.

2.2-Coloration au MGG

II permet surtout d'observer les champignons.les hyphes des protoplasmes sont colores en violet ou bleu.

Les Blastocononidies et les pseudohyphes sont colores en bleu fence.

Les bacteries sont colorees en leu fences.

Les parois des cystodes d'Acanthamoeba se colorent en bleu fence et Ie cytoplasme en bleu pale.

2.3-Les autres colorations :

La coloration au methenamine argentique de Gomori modiflee permet d'observer les levures. Dans ce cas, Ie frottis de grattage corneen est realise sur des lames recouvertes de gelatine.

La paroi cellulaire et Ie septum des levures sont colores en noir et sont facilement reconnaissables sur un fond clair.

La coloration de Schiff a I'acide periodique est eqalement utilises en cas de frottis neqatif.

La coloration a la fuschine pheniquee ou au fluorochrome permet d'observer les rnycobacteries, les nocardia, les Actinomyces et Arachnia.

3-Humeurs intraoculaires :

Elles sont examinees de la rnerne rnaniere que pour Ie grattage corneen.

Les bacteries presentes sont aisernent detectees dans les champs contenant de nombreux polynuclealres,

Les granules plqrnentees peuvent etre faussement interpretes comme etant des cocci a gram positif, ils sont differencies par leur forme ovale, leur grande taille et la pigmentation brun pale.

Les endophtalmies non infectieuses peuvent etre differencies grace a la reponse de type cellulaire inflammatoire observes apres coloration au MGG .

../ Dans I'infection a Toxocara on observe de nombreux eoslnophiles .

../ Dans les uveites induites par Ie cristallin on observe de nombreuses cellules macrophagiques et rnononucleaires.

VIII-METHODES ET INTERPRETATION DES

CULTURES

1-Milieux de culture et conditions d'incubation .

Milieux de culture et Indications Stockage Incubations
de transport
Bouillon trypticase Saturation des ecouvillons aprss Ie +4°C
prelevernent (pour eviter leur dessechernent)
Gelose au sang Bacteries aerobie et anaerobies facultatives +4°C • 37"C (3 a 10 % de CO2)
• 24 a 48 h
Gelose au sang cuit Bacteries aero-anaerobies facultatives, +4°C • 37"C (3 a 10 % de CO2)
haemophilus, Neisseria • 24 a 48 h
Bouillon thioglycolate Bacteries anaerobies Preparation • 37" (Anaerobiose)
Bouillon trypticase yeast externporanee • 48 h a 7 j
additionne de 5 ul Iml
hernine + 0.5 ug/ml de Vit K
Milieu Lowenstein Jensen Mycobacteries Nocardia +4°C • 37"C (3 a 10 % de CO2)
• 8 semaines
Sabauraud + Champignons +4C 37"C 48 h a 7 j
chloramphenicol
BHIB + Gentamicine a 50 Champignons +4°C 37"C 48 h (sous agitation)
ug/ml
Columbia + sang a 5 % Anaerobies Preparation 37"C 48h a 7 jours
externporanee
Wilkins Chagren Anaerobies Preparation 37"C 48 h a 7 jours
externporanee
Milieu de transport pour Virus +4°C
virus
Milieu de transport pour Chlamydia +4°C
Chlamydia -70°C Les boites qelosees sont examines quotidiennement ainsi que les milieux liquides afin d detecter toute culture ou trouble des milieux ensernences,

Pour les bacteries anaerobies, la lecture des boites se fait au bout de 48 Heures puis apres 5 a 7 jours.

2-Cultures conjonctivales et palpebrales .

La selection des colonies pour I'identification et I'antibiogramme est basee sur Ie diagnostic clinique, et sur la connaissance des germes de la flore commensale conjonctivale.

La numeration rapportee ci apres permet de classer les cultures en scores (de 0 a +++), ceux-ci n'etant donnes qu'a titre indicatif, afin d'apprecler I'abondance de la culture bacterienne, notamment au cours des infections unilaterales,

Numeration des colonies poussant a partir des prelevernents conjonctivaux et palpebraux

Nombre de colonies

Score

Moins de 50 colonies

Plus de 50 colonies isolees

a

+

Tres nombreuses colonies precocernent coalescente Tapis dense de colonies

++

+++

3-Cultures cornsennes

L'inoculation des grattages corneens se fait en decharqeant la spatule de Kimura sur la sur la surface gelosee, en etalant delicaternent (eviter de dechirer la gelose) Ie prelevement , et en decrivant des stries.

Des scores de numeration bacterienne peuvent etre decrits, afin d'apprecler la richesse de la primo culture.

Numeration

Score

Culture dans moins de la rnoitie des sites ensernences

Culture dans plus de rnoitie des sites ensernences mais pas dans tous les sites Culture dans tous les sites ensernences

1+ 2+ 3+

Les cultures sur milieux anaerobies sont observees au bout de 48 h et jusqu'a 7 jours.

Si les cultures en anaerobioses n'ont ete realisees qu'en bouillon supplernente, des isolements sont alors effectues en aerobiose et anaerobiose des que Ie bouillon est trouble.les colonies sont ensuite ldentiflees selon les methodes usuelles.

Les cultures sur gelose Sabauraud sont incubees et observees [usqu'a 7 jours mais peuvent n'apparaitre qu'au bout de 14 a 19 jours apres isolement (26 % des cas).

Pour detecter Acanthamoeba, les boites sont observees au microscope a dissection en illumination oblique (45°C) qui met en evidence de fines lignes sinueuses a la surface de la gelose.

4-Cultures des humeurs intraoculaires

Des cultures directes de faible volume de I'humeur aqueuse (0.1 a 0.2 ml) ou vitreenne (0.5 a 2 ml) sont realisees de la rnerne rnaniere que pour les cultures corneennes.

Les contaminants sont facilement reconnaissables grace a leur culture en dehors des stries.

Un grand volume des humeurs intraoculaires doit etre filtre (0.45 um). Le filtre est alors enleve a I'aide d'un scalpel et dlvise en 6 parties que I'on ensemence dans les differents milieux (GSF, GSC, Columbia au sang, Gelose Sabauraud, Bouillon thioglycolate et BHIB).

Ces filtres peuvent etre ensernences directement sur milieux qeloses en les appliquant a leur surface.

5-Culture de tissus ou de biopsie :

On broie sterilernent l'echantillon a I'aide d'un mortier et d'un pilon ou d'un broyeur sterile, apres y avoir ajoute 2 ml de bouillon trypicase soja. Des frottis sont prepares pour la coloration de gram et de Giemsa ; 1 a 4 gouttes sont ensernencees ensuite dans les milieux adequate.

6-Culture des milieux de bain de cornee .

Au cours des keratoplasties, les cornees de donneurs sont conservees dans un milieu contenant des antibiotiques (Type: Mac Carey Kaufman medium), permettant un stockage a +4°C dans les banques de cornees.

Le microbiologiste peut etre arnene a contr61er la sterilite de ces milieux.

Ces echantillons sont alors ensernences dans du bouillon thioglycolate supplernente et du BHIB enrichi de 5 % d'extrait de serum de bceut, a des dilutions au 1/10eme et au 1/100eme afin d'elirniner l'activite des antibiotiques contenues dans les milieux de bain de cornee.

Le tissu sclero-corneen inutllise est emulsionne et ensernence de la rnerne rnaniere que les autres tissus.

IX-SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUESANTIBIOTHERAPIE :

1-Tests de sensibilite aux antibiotiques

Apres identification des colonies suspectes par les techniques usuelles (biochimique et immunologique pour la determination des serotypes si necessaire), un antibiogramme est alors realise.

la technique utilises est celie recornrnandee par Ie NCClS et preconisee par I'OMS (Cf. Standardisation de I'antibiogramme a l'echelle nationale selon les recommandations de I'OMS).

l'ophtalmologiste et Ie microbiologiste doivent savoir que les resultats obtenus par I'antibiogramme ne refletent que la concentration de I'antibiotique dans Ie serum mais pas celie obtenu au niveau du film lacrymal et des tissus oculaires lorsque I'antibiotique est donne par les voies d'administration standard.

2-Antibiotiques utlllsees en ophtalmologie

2.1-Les collyres antibiotiques .

Bien que la liste des collyres et pommades utilisees soit longue, Ie nombre de molecules antibiotiques qui les composent est plut6t restreint, Ie tableau suivant en cite les principales :

Families des antibiotiques

Molecules utilisees

Betalactamines Aminoside

Penicilline G - Oxacilline

Streptomycine, Gentamicine, Kanamycine, Neomycine, Frarnycetine

Oxytetracycline

Chloramphenicol

Colistine, Polymyxine B, Bacitracine Virginamycine

Norfloxacine

Sulfacetamide

Rifampicine

Tetracycline Phenicoles Polypeptides Macrolides Fluoroquinolones Sulfamides Rifamycine

Les collyres peuvent contenir jusqu'a trois antibiotiques a la fois, utilisees seuls ou en association avec des anti-inflammatoires eU ou corticofdes, comme indique ci-dessous :

Col lyres

Pommades

Association a un cortico"lde

Bacitracine Norfloxacine

Rifampicine

Penicilline

Rifampicine, Oxytetracycline Gentamycine, Tobramycine Chloramphenicol

Meticilline

Neornycine, Frarnycetine, Oxytetracycline Sulfacetamide de Polymyxine Gentamicine Chloramphenicol

Acide Fusidique Neornycine Frarnycetine Oxytetracycline Sulfacetamide de Polymyxine Gentamicine Tobramycine Chloramphenicol

Polymyxine B + Neornycine ou Frarnycetine

Polymyxine B + Neornycine ou Frarnycetine ou Kanamycine

Polymyxine B + Neornycine ou

Frarnycetine

Colimycine +

Bacitracine Frarnycetine + gramicidine Neornycine +Bacitracine

3-Penetration intraoculaire des antibiotiques :

l.'cell est un milieu ferrne compose de compartiments tres variables dans leur structure: cornee avasculaire, iris et choroide tres vascularises, humeur aqueuse a renouvellement rapide et un epithelium retinien plqrnente.

D'autre part, les voies d'administration des antibiotiques sont multiples: voies generales et locales, injections peri oculaires et intraoculaires.

A chacune de ces voies correspond une cinetique partlcullere, l.'etude de celle-ci se fait par Ie dosage des antibiotiques dans les milieux oculaires et sur des echantillons d'humeur aqueuse, essentiellement.

3.1-Voies de penetration:

Pour parvenir au niveau de l'ceil, et a des concentrations efficaces, I'antibiotique doit franchir les barrieres corneennes (pour les collyres) et hernato-oculaires (pour la voie qenerale), qui s'opposent naturellement a sa penetration.

Pour la barriers corneenne : l'epltheliurn corneen st riche en lipides et ne laisse passer que les substances liposolubles. Cette penetration aug mente en cas d'alteration tissulaire. Le stroma permeable aux substances hydrosolubles, I'est peu pour les autres drogues.

Quant a la barriere hernato-oculaire : elle est constituee du systems d'irrigation de l'cell et du tissu epithelial. Deux systernes s'organisent alors, la barriere hernato-aqueuse anterieure permettant l'acces des molecules a travers la secretion d'humeur acqueuse, et la barriere hernato-retinienne posterieure, plus etanche. A ce niveau les jonctions cellulaires sont tres etroites, les molecules traversent cette barriere par passage trans-cellulaire obligatoire,

pass if (substances de faible PM) ou actif (cas de certains medicaments).

3.2-Facteurs influencant la penetration intraoculaire des antibiotiques :

3.2.1-Facteurs lies a la molecule:

Taille : Ie passage des molecules est inversement proportionnel a leur poids moleculaire.

Liposolubilite : cette propriete permet une meilleure combinaison aux llpoproteines de la membrane cellulaire. Une substance liposoluble rnerne si son PM est eleve, aura une bonne penetration oculaires (ex: chloramphenicol).

Liaison aux proteines plasmatiques : c'est un facteur limitant des mouvements des antibiotiques hors du systems vasculaire, car seule la fraction libre diffuse a travers les barrieres tissulaires.les molecules a faible liaison proteique ont une meilleure penetration oculaire. (ex: Ceftriaxone qui se lie a 58-95 % ne penetre qu'a 1.25 %, alors que la Fosfomycine qui se lie a < 10 % penetration jusqu'a 44 %).

3.2.2-Etat de I'reil :

L'inflammation augmente la diffusion des antibiotiques. Ainsi les concentrations d'antibiotiques sont 4 a 5 fois plus elevees dans l'cell infecte que dans l'cell sain.

On a rnontre que la penetration de la gentamicine passait de 2 % sur un ceil sain a 7 % sur un ceil lnfecte,

l.'alteration de l'epltheliurn, de l'endotheliurn, l'anesthesie de la cornee, sont des facteurs (entre autres) favorisant la penetration intraoculaires des collyres.

3.2.3-Mode d'administration :

Voie locale: c'est I'une des meilleures voies de penetration intraoculaire. Les concentrations sont nettement inferieures a celles obtenues par voie genera Ie.

On ne doit pas neqliqer I'effet diluant des larmes.

On estime que seulement 10 % du produit lnstille penetre dans Ie globe oculaire. Pour pallier a cet inconvenient, on recommande d'augmenter les frequences d'administration.

Voies peri-ocutares : (s/conjonctivale et laterobulbalre).

La penetration intraoculaire est bonne, avec passage important vers la circulation qenerale, Voie intraoculaire : l'inconvenient de cette voie est Ie risque de toxicite retlnienne, cristalline, et endothelia Ie.

De nombreuses etudes ont perm is de definlr les doses maximales non toxiques, ainsi que leur duree d'administration.

Voies systemiques (Peros, Intramusculaire, intraveineuse)

La penetration endoculaire est faible. L'augmentation des doses n'arneliore pas la penetration des antibiotiques.

Finalement mis a part la voie intraoculaire, seule la conjugaison de to utes les autres voies, permet de realiser et d'entretenir une concentration d'antibiotique intraoculaire, capable d'agir au niveau du site infectieux.

3.2.4-Nombre de prises de doses :

La penetration des antibiotiques dans l'oell augmente avec Ie nombre de prises.

3.2.5-Action de certains medicaments:

Prescrites sirnultanernent ou en association avec les antibiotiques, certaines substances modifient leur penetration au niveau de l'cell. (ex: Probenecide retarde l'excretion de la penicllllne favorisant sa penetration tissulaire).

4-Penetration selon la molecule:

4.1-Betalactamines :

Penlcitllnes : Leur penetration est mediocre, elle est meilleure par voie so us conjonctivale. Ampicilline : adrninistree par voie so us conjonctivale, elle a une bonne penetration dans I'humeur acqueuse.

Carboxypenicillines : Les concentrations obtenues dans I'humeur acqueuse sont superieures par injection so us conjonctivale, que par voie intraveineuse.

Ureidopenicillines: La piperacilline a une tres bonne penetration, l'Azlociliine et la Mezlocilline ont une diffusion similaire, mais on recommande de les administrer par voie so us conjonctivale.

Cephalosporlnes 1 ere generation :

Cefalotine, en injection s/conjonctivale, elle a une bonne penetration oculaire, mais c'est une voie douloureuse.

Cefalorldlne, a une excellente penetration quelque so it son mode d'administration, mais son emploi est exceptionnel car Ie risque toxique est important (pseudo retinite pigmentaire toxique avec cecite lors de I'injection so us conjonctivale).

Cefazotlne, cette molecule a une tres bonne penetration, on I'utilise en injection sous conjonctivale et intraoculaire lors du traitement des endophtalmies.

Cephalosporlnes 2eme generation :

Cefamandole, sa concentration est importante au niveau de la cornee, la sclere et la chrioretinite.

L'administration de la cefoxitine par voie intraveineuse, permet d'avoir des concentrations en humeur acqueuse efficaces centre les gram(+).

Cephalosporlnes 3eme generation :

Cefotaxme, adminlstre par voie systernlque, il permet d'atteindre des pics dans I'humeur acqueuse, rapidement, et a des taux efficaces sur de nombreux germes responsables d'endophtalmies.

La voie so us conjonctivale arneliore ces taux.

Cefsulodine, realise des taux intraoculaires efficaces sur les germes sensibles.

Ceftriaxone, a une penetration modeste, sa longue demi-vie permet de maintenir dans I'humeur acqueuse des taux efficaces.

L'administration sirnultanee d'indometacine favorise la persistance de la Ceftriaxone dans ce compartiment.

Ceftazidime, sa faible liaison protelque lui confers une tres bonne penetration intraoculaire, sinon Ie meilleur de to utes les cephalosporines.

lrnlpeneme :

Son injection parenterale donne des concentrations superieures au CMI 90 de la plupart des germes responsables d'endophtalmies.

Aztreonarn :

II a une assez bonne penetration, son usage est limite par son spectre d'action etroit,

O'une facon qenerale Ie passage des Beta-lactamlnes au niveau de l'cell est faible. Mais des concentrations efficaces, peuvent etre atteintes, en particuliers pour les molecules ayant des CMI basses, comme c'est Ie cas des C3G.

L'excellente diffusion de l'irnlpenern en fait un candidat tout a fait lndique dans Ie traitement des infections profondes graves de l'ceil, mais son utilisation doit rester lirnitee aux cas graves afin d'eviter l'ernerqence de resistances aux antibiotiques.

4.2-Aminosides :

La gentamicine est I'aminoside Ie plus etudie, ceci est du a son usage tres repandu,

Adrnlnlstree par voie qenerale, la penetration de la gentamicine est llrnitee en raison de sa faibe l.iposolubilite, son PM, sa liaison protelque (20-30 %), et sa biodisponibilite dirninuee par sa fixation sur les tissus pig mentes.

En cas d'inflammation oculaire, la penetration de la gentamicine augmente de 30 a 100 %.

La voie so us conjonctivale semble etre meilleure, pour les aminosides.

4.2-Cyclines :

Leur penetration dans l'cell est variable, sinon faible. Leur utilisation therapeutique est llrnitee au traitement des infections de surface de l'cell.

• Oxytetracycline: a une tres mauvaise penetration intraoculaire, surtout si la cornee est intacte.

• Doxycycline: bonne penetration, apres administration per os.

4.4-Phenicoles :

Leurs proprietes chimiques en font des molecules a tres bonne penetration oculaire.

Ces antibiotiques sont d'un grand interet en ophtalmologie.

4.5-Polypeptides :

Colistine, ne penetre dans l'oell que lorsqu'elle est adminlstree par voie locale ou so us conjonctivale.

Polymyxine B ou Bacitracine, n'agissent qu'en surface sans aucune penetration intraoculaire.

4.6-Fluoroquinolones :

Leurs parametres pharmacoclnetlques en font des molecules a tres bonne penetration oculaire.

Pefloxacine et Ofloxacine, donnent des concentrations intraoculaires elevees,

Les nouvelles quinolones, sont des molecules de choix dans Ie traitement des infections endoculaires. Mais leur utilisation doit se faire en association avec d'autres antibiotiques, car il ya risque de selection de mutants resistants.

4.7 -Acide Fusidique :

C'est un anti staphylococcique a bonne penetration intraoculaire, par administration locale et qenerale,

4.B-Fosfomycine :

C'est une molecule de faible toxicite, a faible liaison proteique, et de faible taille.

Sa penetration intraoculaire est tres bonne. De ce fait c'est I'un des antibiotiques lndiques en premiere intention dans Ie traitement des infections endoculaires.

On retiendra de facon qenerale que:

La forme collyre est surtout destines au traitement des infections superficielles de l'ceil, type: conjonctivite, blepharite ...

Pour les atteinte profondes telle que: ulceres de cornee, endophtalmies, on aura recours aux voies generales, peri oculaire, intraoculaire et locales.

La voie so us conjonctivale permet la meilleure penetration oculaire.

Les taux d'antibiotiques au niveau de I'humeur aqueuse sont plus eleves qu'au niveau du vitre.

L'inflammation favorise la penetration.

La mise en route de traitement approprie d'une infection de l'oell , passera necessairernent par une bonne connaissance de la prevalence des germes qui en sont responsables, et par la maitrise de la capacite de diffusion des antibiotiques dans Ie globe oculaire, ceci afin de rendre ce traitement mieux cible et plus efficace.

ETIOLOGIES BACTERIENNES DES INFECTIONS OCULAIRES EN ALGERIE

RESULTAT D'UNE ETUDE REALISEE A L'INSTITUT PASTEUR D'ALGERIE A.S. MERAD, A.LAZIZI, S.MOKRANI, F.DERRAR ET RYEDDOU.

I-INTRODUCTION :

l.'etioloqie bacterienne des infections oculaires est bien etablie dans les autres parties du rnonde, cependant en Algerie aucun travail effectif n'a encore jamais ete realise.

Les ophtalmologistes traitent I'infection sans jamais faire un prelevernent adequat permettant au laboratoire de bacterioloqie de mettre en evidence les bacteries causales.

l.'etude que nous presentons rapporte les resultats obtenus a partir de 76 prelevernents conjonctivaux provenant d'infections oculaires diverses effectues entre fevrier et septembre 2002 dans Ie service de bacterioloqie rnedlcale de I'IPA.

II-MATERIEL:

t-Prelsvernents .

76 prelevernents conjonctivaux ont ete effectues au niveau des annexes oculaires ainsi qu'au niveau du segment anterieur de l'cell droit et gauche, a I'aide d'ecouvlllons steriles , par raclage de la conjonctive tarsale, en allant du coin externe de l'cell jusqu'au coin interne.

Pour chaque patient un deuxierne prelevernent a servi aux examens microscopiques.

55 prelevernents proviennent du service d'ophtalmologie du CHU Mustapha et 21 des CHU de Beni -Messous et Parnet.

2-0rigine des patients

Nombre

Pourcentage

Consultants externes

34 42 76

45%

Patients hospitalises Total

55%

100%

3-Repartition des patients selon Ie sexe :

Nombre

Pourcentage

Patientes

29 47 76

38%

Patients

62%

Total

100%

4-Repartition des patients selon I'age :

Age

Nombre

Pourcentage

21 % 50 % 29 % 100 %

Oa16ans

17 a 49 ans Plus de 50 ans Total

16 38 22 76

5-Types d'infections oculaires etudiees :

Types d'infection Nombre Pourcentage
Conjonctivite 40 53%
Keratite 23 30 %
Oacryocystite 05 07 %
Endophtalmie 04 05 %
Cellulite orbitaire 03 04 %
Uvelte 01 01 % 6-Antibiotiques prescrits :

Les patients hospitallses sont traites so it avec une association Cefazollne-qentarnycine so it Ofloxacine-gentamycine par voie genera Ie.

La rnajorite des patients externes et hospitallses ont recu un traitement local de Rifampicine et de Neomycine.

III-METHODES

1-Milieux de transport :

Apres realisation du prelevement les ecouvillons sont introduit dans un milieu de transport prepare dans Ie service anaerobies de I'IPA.

2-Examen direct:

Des frottis sur lame ont ete fixes et colores au bleu de methylene.

Pour 04 patients presentant des signes cliniques de trachome , des frottis sur des lames, provenant des kits « chlamydia trachomatis specimen direct antigen detection» (Biorad), ont ete fixes, colores et Ius au microscope a fluorescence.

3-lsolement :

Les milieux suivants ont ete utilises:

../ Gelose Columbia + 5 % de sang pour les bacteries anaerobies .

../ Gelose au sang cuit + supplement G pour Haemophilus influanzae et Neisseria gonorrhoeae .

../ Gelose au sang frais .

../ Gelose Sabauraud + chloramphenicol pour les champignons.

Ces milieux ont ete incubes :

../ 48 heures a 05 jours en anaerobiose (Anaerobles) . ../ 48 heures so us C02 (Haemophilus et Neisseria) ;

../ 24 heures en anaerobiose pour les germes banals . ../ 48 heures a 15 jours pour les champignons.

4-ldentification :

Elle est realises grace aux galeries API (Biornerieux) ou galeries classiques.

Pour streptococcus pneumoniae, un diarnetre superieur a 19 mm auteur du disque d'optochine et un test au desoxycholate positif ont permis d'etablir son identification.

5-tests de sensibilite aux antibiotiques.

lis ont ete effectues selon les normes preconisees par Ie NCClS.

Des tests cornplernentalres ont ete realises:

../ Detection de la rnethicillino-resistance (screening) . ../ Test du trefle .

../ Test de confirmation de betalactarnase a spectre elarqie .

../ Determination de la concentration minimale inhibitrice pour streptococcus pneumoniae resistant a l'Oxaciliine.

IV-RESUL TAT ET DISCUSSION ·

1-Etiologie bacterlenne selon Ie type d'infection oculaire:

1.1-Conjonctivites :

53 % des patients presentaient des conjonctivites uni ou bllaterales,

Tableau 1 : germes lsoles dans les conjonctivites

Staphylococcus epidermidis (12 fois)

Staphylococcus epidermidis + Staphylococcus aureus (2 fois)

Staphylococcus epidermidis + serratia liqufaciens Staphylococcus epidermidis + Staphylococcus lugdunensis Staphylococcus hominis

Staphylococcus aureus

Streptococcus hominis (03 fois)

Corynebacterium spp (04 fois)

Haemophilus influanzae (02 fois)

Chlamydia trachomatis (02 fois)

Staphylococcus epldermldis + Streptococcus viridans (02 fois) Stenotrophomonas maltophilia

31 prelevernents etaient positifs, cependant no us n'avons pas prise en consideration ceux ou il n'a ete isole que des staphylocoques a coagulase negative ou que des Corynebacterium spp, car ces memes germes ont ete eqalement retrouves au niveau de l'cell sain et font partie de la flore conjonctivale normale.

Ainsi 13 prelevernents seulement sont reellernent consideres comme positifs dans cette etude, so it 32.5 %.

Tableau 2 : pourcentage des germes pathoqenes isoles dans les conjonctivites :

Germes

Pourcentage

23 % 23 % 15 % 15 %

7.6 % 7.6 % 7.6%

Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Streptococcus viridans Chlamydia trachomatis

Haemophilus influanzae Enterobacteries

Bacilles a gram neqatif oxydatifs

Stenotrophomonas maltophilia ainsi que serratia liquefasciens ont ete isoles respectivement chez deux patients hospitalises, I'un pour cataracte traumatique, I'autre pour tumeur conjonctivale.

Streptococcus pneumoniae a ete isole chez 02 enfants ages de 02 a 07 ans et chez un adulte de 30 ans.

Haemophilus influanzae a ete mis en evidence a partir du prelevernent conjonctival d'un enfant de 10 ans.

1.2-Keratites

30 % des patients presentaient une keratite (abces ou ulcere) et tous sont hospitallses, aussi avons-nous tenu compte des staphylocoques a coagulase negative qui ont ete isoles soit seuls so it associes a des bacilles a gram neqatifs.

Tableau 3 : germes isoles dans les keratites :

-Staphylocoques a coagulase negative (6 fois)

-Staphylococcus epldermldis + Pseudomonas stuttzeri

-Staphylococcus hominis + Serratia marcescens.

-Staphylococcus haemolyticus + Enterobacter aeroqenes

-Staphylococcus aureus + Pseudomonas cepaciae

-Staphylococcus aureus

-Klebsiella oxytoca + Stenotrophomonas maltophilia

-Pseudomonas aeruginosa

14 prelevernents etaient positifs (60.7 %) et dans 37.7 % d'entre eux, il a ete isoles deux types de germes.

On remarque I'augmentation des bacilles a gram negatif qui signe I'infection nosocomiale.

Tableau 4: Pourcentage des germes lsoles dans les keratites :

Germes

Pourcentage

-Staphylocoques coagulase negative

-Bacilles a gram neqatif oxydatifs

-Enterobacteries

-Staphylococcus aureus

-Streptococcus pneumoniae

64.2 % 28.5 %

21.4 % 14.2 % 07.1 %

Pseudomonas aeruginosa a ete isole aussi bien chez Ie patient hospitallse qu'a partir du serum physiologique qui servait aux instillations quotidiennes de celui-ci.

Cette constatation nous alerte Quant a la sterilite des produits utilises d'autant que ce germe est repute pour etre a I'origine d'infections severes pouvant donner une perforation de la cornee en 72 heures.

1. 3-Cell u lite orbitai re :

-02 sur 03 sont positives.

-Streptococcus pneumoniae a ete isole chez une etudiante en rnedecine qui I'aurait peut etre contracte lors des contacts avec les patients.

-Une association de 03 bacilles a gram neqatif (Enterobacter arnnlqenus, Enterobacter aqqlornerans et Aerornonas caviae) a ete isolee chez un patient hospltalise suite a une cellulite cornpliquee de panophtalmie.

1.4-Dacryocystite :

-Chez deux patients, il a ete isole des staphylocoques a coagulase negative qui font probablement partie de la flore normale de leurs conjonctives.

-Chez un autre patient, Streptococcus pneumoniae a ete lsole,

2-Sensibilite aux antibiotiques des germes lsoles :

2.1-Staphylocoques a coagulase negative (31 souches)

Antibiotique Nombre %
MRCNS 17 54.8 %
KTG 10 32.2 %
MLSB inductible 07 22.5 %
Phenotype M efflux actif 01 3.2 %
Senslblllte dirninuee aux 01 3.2 %
glycopeptides - MRCNS : Staphylocoque Coagulase Negative Methlcllllno-Resistant.

- KTG : Kanamycine, Tobramycine, Gentamicine, Amikacine Resistant.

- MLSB : Macrolides-Lincosamides-Streptogramine B.

Les staphylocoques a coagulase negative isoles des patients hospitallses presentent des multi resistances aux antibiotiques.

2.2-Les autres germes :

-1 souche de Staphylococcus aureus etait MRSA positive. Elle a ete isolee d'une conjonctivite et etait associee a un Staphylococcus coagulase negative eqalement resistant a l'Oxaciliine.

-Aucune des souches de streptococcus pneumoniae isolees n'a presents de sensibilite dirninuee aux beta-lactarnines.

-Haemophilus influanzae ne possedait pas de penicillinase et etait sensible a tous les antibiotiques testes.

-Les bacilles a gram neqatif (Enterobacteries et germes oxydatifs) presentaient I'antibiotype normal des souches sauvages.

V-CONCLUSION

l.'etioloqie bacterienne des infections oculaires en Algerie ne semble pas etre differente de celie decrite dans les autres pays.

Lorsque les prelevernents sont issus de patients hospitallses, les germes des infections nosocomiales predornlnent et masquent probablement Ie germe causant initialement I'infection.

Dans Ie cas des conjonctivites, la bacterioloqie doit pouvoir distinguer les germes de la flore normale (Staphylocoque coagulase negative, Corynebacteries spp), des germes pathoqenes en comparant systernatlquement Ie resultat des cultures de l'cell sain avec celui de l'cell atteint.

XI-REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

1-Laboratory Diagnosis of Ocular infections CUMITECH 13-May 1981. 2-Laboratory Diagnosis Of Ocular Infection CUMITECH 13 A, American Society For Microbiology 1994.

3-lnfections de l'cell et prevention A.EYQUEM, C.AZNAR Association des anciens eleves de I'institut pasteur W 153-Novembre-Decembre 1997.

4-Role du laboratoire de Biologie dans les infections Oculaires-Y.SSCAT Association des anciens eleves de I'institut pasteur W153-Novembre-Decembre 1997.

5-Entretiens annuels d'ophtalmologie-1999.

6-Diagnostic biologique des conjonctivites S.LlOLET et Coll.Feuiliets de Biologie,1991-Vol XXX-W180.

7 -I nfections oculaires-Monographie-Revue du praticien-1992.

8-lnfection et inflammations du segment anterieur de I'ceil-JP.ADENIS -F.DENIS-A.BRONJ.COLlN-J.L.FRANCO-M.MOUNIER 1989 Edition MSD.

9-lnfections nosocomiales en ophtalmologie F.Denis,J.P.Adenis,M.Mounier in :infections nosocomiales J.L.AvriI1999.Editions Ellipses.

1 O-Endophtalmies bacteriennes resultat ophtalmologiques d'une enquete prospective multicentrique nationale in Journal Francais d'Ophtalmologie.

t t-Penetration intraoculaire des antibiotiques in « EMC.Ophtalmologie 2000, 21-235-C-20.

12-Prelevements endo-oculaires et endophtalmies : etude des germes isoles au CHNO des quinze-vingts » Medecine et maladies infectleuses 1996,no26.

13-Les conjonctivites Biologiste et Praticien 1993/3.

14-lnfections oculaires bacteriennes : methodes de diagnostic actuelles et prospectives Annales de biologie clinique 1999 vol 57.

XII-ANNEXES ·

Coloration de May Grunwald Giemsa

../ Solution May-Grunwald 5 min
../ Laver a I'eau 1 min
../ Solution de Giemsa 15 min
../ Laver a I'eau
../ Secher
../ Examiner a I'immersion. Coloration de Gomori Modifiee :

Materiel et solutions:

../ Lames recouvertes de gelatine (stockage entre + et -20°C) ../ Acide chromique a 5 % .

../ Nitrate d'argent methenamine (100 ml methenamine 3% + 7 ml AgN03 a 10%) . ../ Chlorure d'or a 0.1 % .

../ Thiosulfate de Sodium a 2 % .

../ Solution stock de vert brillant (0.2 9 + 100 ml E.D +0.2 ml acide acetique glacial) . ../ Alcool absolu rnethyllque .

../ Eau distillee.(E.D).

Procede :

../ Fixer la lame a I'alcool rnethylique absolu . ../ Oxyder avec acide chromique a 5 % .

../ Immerger dans la solution de nitrate d'argent methenamine prechauffee pendant 20 min .

../ Laver 6 fois la lame a I'eau distlllee .

../ «tone» pendant 2 a 4 minutes Ie chlorure d'or a 0.1 %.

../ Rineer deux fois a I'eau dlstillee .

../ Immerger dans la solution de thiosulfate de sodium a 2 % pendant 2 minutes . ../ Laver .

../ Contre colorer pendant 1 minute avec la solution stock de vert briliant fraichement diluee au 1/5eme dans I'eau dlstillee. Laver puis secher .

../ Observer a I'immersion.

Milieu de Hanks:

Solution A:

../ NaCI80 gr
../ KCI 4 gr
../ CaC121.4g
../ MgS04 0.6g
../ Glucose pur 10 ml.
../ Eau bl-dlstillee 1000 ml ../ Dissoudre les ingredients dans I'eau, filtrer, repartir en ampoules de 50 ml et steriliser a I'autoclave, 30 min a 110°C.

Solution B :

../ Na2HP04 1.2 gr ../ NaC03H 3.5 gr

../ Rouge de phenol 0.2 gr ../ Eau bi dlstillee 1000 ml.

../ Sterillser par filtration sur bougie L3 et repartir en ampoules de 10 ml.

Milieu definitif

../ Solution A 50 ml ../ Solution B 10 ml

../ Eau distlllee sterile 440 ml

Melanqer sterilernent,

On obtient 500 ml de liquide de Hanks pret a I'emploi que I'on complete par addition de 1 ml de la solution usuelle d'antibiotique.

PH de ce milieu =7.2

Conservation lndeflnie des ampoules a temperature du laboratoire.

Le milieu deflnltif se conserve deux a trois mois dans la qlaciere a I'abri des contaminations

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