FACULTAD DE MEDICINA Y BIOCIENCIAS

CARRERA DE QUIMICA Y FARMACIA

ACTIVIDAD PRACTICA N°3

AGENTES EXTERNOS SOBRE LAS BACTERIAS

ESTERILIZACION

Objetivos
• Conocer los principales elementos que afectan la viabilidad y el desarrollo
bacteriano
• Demostrar la utilidad de la esterilización (calor seco y calor húmedo) en la
práctica clínica

CONCEPTOS BÁSICOS INVOLUCRADOS EN ESTA CLASE PRÁCTICA

El crecimiento óptimo de los microorganismos está condicionado a factores

nutricionales y condiciones físicas y químicas del ambiente. Estas condiciones han
permitido diseñar métodos para controlar y/o eliminar microorganismos que son
perjudiciales para el ser humano porque causan enfermedades, alteran alimentos y
producen otros efectos indeseables en el medio donde se encuentran. Estos métodos
permiten realizar los procesos de Esterilización y/o Desinfección.
La esterilización comprende las metodologías empleados con el fin de destruir
toda forma de vida (virus, bacterias, hongos, parásitos, forma vegetativa, esporas y
quistes) existentes en instrumentos, sustancias u otro tipo de material.
La desinfección comprende los procesos destinados a disminuir la carga
microbiana, llevando el número de microorganismos a niveles inocuos para el ser
humano.
El empleo de técnicas correctas de esterilización y desinfección es
fundamental, tanto en los laboratorios de microbiología como en clínica médica y
hospitalaria, ya que permiten el control de posibles fuentes de infección para el
hombre.

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Clasificación de los métodos de control del crecimiento microbiano.

A. Métodos Físicos
1. Calor:
1.a. Llameado: Exposición directa a la llama para la eliminación de
biocontaminantes, destruyendo así toda la materia orgánica.
1.b. Calor seco: Este procedimiento se realiza, principalmente en Hornos Pasteur,
a través de la circulación de aire caliente. La esterilización se produce en todo
material vivo debido al aumento exagerado de los procesos oxidativos.
Para esta práctica hay que tener presente los tiempos y temperaturas de
esterilización:
a) Temperatura de 250ºC en tiempo de 30 a 60 minutos
b) Temperatura de 180ºC por 60 minutos

1.c. Calor Húmedo: Existen diversos procedimientos que involucran la utilización

de calor húmedo. Ejemplo: Pasteurización, Ebullición, Tindalización, etc. Sin
embargo, no todos conducen a la esterilización, con excepción cuando este
calor se obtiene en forma de vapor saturado, a alta presión, que es la forma
más ventajosa y económica para el transporte de la energía y el calor.
La utilización de calor húmedo se considera más efectiva que el calor seco por
su mayor poder de penetración y de mayor rapidez porque la muerte de los
microorganismos se debe a la coagulación de las proteínas del protoplasma
(un aumento del contenido de agua en protoplasma hace que las proteínas
coagulen a más baja temperatura).
La esterilización con vapor a presión se realiza en autoclave, equipo que
esteriliza a diferentes temperaturas y tiempos según la naturaleza del producto.

2. Radiaciones:
La esterilización por radiación se emplea para equipos de material plástico y cualquier
otro material que no sea factible de esterilizar por sistemas con calor y/o materiales
químicos. La muerte bacteriana se produce por alteración de ácidos nucleicos.

a) Radiación ultravioleta:
Esta radiación tiene una aplicación muy limitada por su penetración limitada. Se utiliza
prácticamente para esterilización de aire y/o equipos.

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b) Radiación ionizante (radiación gamma):
Esta radiación es muy letal por su acción sobre la molécula de ADN. Sus principales
aplicaciones son la esterilización sellada de material farmacéutico, material médico-
quirúrgico (guantes, jeringas desechables, agujas, catéteres, apósitos, etc.)

B. Métodos Mecánicos:

Las sustancias que no pueden esterilizarse por métodos químicos o físicos se pueden
esterilizar por métodos mecánicos, tales como filtración, centrifugación, ultrasonido,
etc. donde fundamentalmente se separan los microorganismos de las soluciones.
La filtración, sistema más usado en la práctica, utiliza filtros especiales (de porcelana,
membrana nitrocelulosa, etc.), que aseguren la retención de todos los
microorganismos y sus formas resistentes. Todos estos filtros deben tener un diámetro
de poro inferior al largo y/o el diámetro de los microorganismos (bacterias, virus,
protozoos).

AGENTES EXTERNOS SOBRE LAS BACTERIAS

ANTISEPTICOS Y DESINFECTANTES

Objetivos
• Conocer los principales elementos que afectan la viabilidad y el desarrollo
bacteriano
• Demostrar la utilidad de antisépticos y desinfectantes en la práctica clínica

C. Métodos químicos

Métodos que buscan alterar el metabolismo bacteriano a través de sustancias

químicas, por ejemplo, óxido de etileno, formaldehído, fenol, halógenos, etc. Es la
llamada "esterilización fría" pues es la alternativa para aquellos materiales termolábiles
aún cuando no siempre se obtiene esterilización.
Las sustancias químicas empleadas en el control de microorganismos se pueden
clasificar en:

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A. Desinfectantes: Son sustancias químicas de acción inespecífica sobre distintos
materiales y sobre células animales y de microorganismos, por lo que se aplica sólo
sobre materiales inanimados para evitar su acción tóxica.
Estas sustancias actúan generalmente sobre microorganismos que se encuentran en
estado vegetativo, sin producir necesariamente, esterilización.
Ejemplo: formaldehído, glutaraldehído, cloro, alcohol puro.

B. Antisépticos: Son sustancias químicas que manifiestan su acción selectivamente

sobre microorganismos y no sobre células y tejidos animales, por lo tanto, pueden ser
utilizados en forma tópica en el organismo para controlar la presencia de
microorganismos.
Estas sustancias también actúan sobre microorganismos en estado vegetativo, por lo
tanto, no producen esterilización
Ejemplo: Povidona yodada, H2O2, mercurio cromo, alcohol diluido.

TRABAJO PRÁCTICO

a) Calor Seco

En el laboratorio encontrará tórulas, las que deben contaminar con un cultivo

bacteriano líquido (Escherichia coli y Bacillus subtilis). Estas tórulas serán sometidas a
la acción del calor seco (Horno Pasteur) bajo las siguientes condiciones de tiempo y
temperatura:

100°C 10 min 180°C 10 min

100°C 60 min 180°C 60 min
100°C 90 min 180°C 90 min

Luego del tratamiento respectivo, siembre cada una de las tórulas en un tubo con
medio de cultivo líquido (caldo tripticasa) siguiendo las instrucciones de la profesora e
incube a 37°C por 24 horas.

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b) Calor Húmedo

En el laboratorio encontrará hilos de algodón, previamente esterilizados, los cuales

deberán ser contaminados con un inóculo bacteriano (Escherichia coli y/o Bacillus
subtilis). Encontrará también tubos con medio de cultivo líquido y siga las siguientes
instrucciones:
- Tome cuatro muestras de hilo contaminado y colóquelo en cuatro tubos que
contienen el medio de cultivo líquido.
- Coloque tres de los tubos en un Baño María con agua en ebullición (100°C)
- Saque un tubo a los 10 minutos, otro a los 20 minutos y el tercer tubo a los 30
minutos; inmediatamente después de sacar los tubos del agua hirviendo enfríelos bajo
agua de la llave.
- Entregue un cuarto tubo a su Profesora para ser sometido al calor del autoclave a
121°C durante 20 minutos.
- Incube a 37°C por 24 h.

C. Desinfectantes y su acción sobre material de uso habitual en clínica.

En el laboratorio encontrará varillas de vidrio que simularán termómetros clínicos.

a) Tome una varilla de vidrio y colóquela bajo la lengua durante 3 minutos. Proceda a
sembrar esta varilla en la mitad de una placa de agar sangre.

b) Proceda de la misma manera con una segunda varilla, pero antes de sembrar,
lávela con agua jabonosa y enjuáguela con agua estéril.

c) Proceda de la misma forma con una tercera varilla, pero antes de sembrar sumerja
la varilla en etanol 70% por 15 minutos. Deje evaporar el alcohol y siembre.

d) Proceda de la forma anterior con una cuarta varilla, pero antes de sembrar sumerja
la varilla en hipoclorito / solución de cloro por 15 minutos. Deje secar por unos
minutos y siembre.
Incube las placas sembradas a 37°C durante 24 hora s.

Posterior a las 24 h de incubación observe, anote y discuta sus resultados

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D. Importancia de las medidas de asepsia en la práctica clínica

D.1

En el laboratorio Ud. encontrará a su disposición una mascarilla preformada para

realizar las siguientes actividades:

a) Colóquese la mascarilla y proceda a toser sobre una placa de cultivo de Agar

sangre a una distancia, que separe la boca del medio, de 5 cm y 60 cm
respectivamente. Luego incube cada placa en la estufa a 37°C por 24 h.
b) Realice el mismo procedimiento pero sin la presencia de mascarilla y luego incube
en las mismas condiciones.
c) Posterior a las 24 h de incubación observe, anote y discuta sus resultados.

D.2

En el laboratorio encontrará una placa de cultivo y dos tórulas de algodón estéril, con
ellas realice la siguiente actividad:

a) Con una tórula estéril seca proceda a tomar una muestra de piel de mano sin
previo aseo de ésta y proceda a sembrar sobre la mitad de una placa de agar
sangre. En la otra mitad de la placa siembre la muestra obtenida también de la
mano pero tomada posterior al lavado de ésta.
b) Incube la placa a 37°C por 24 h
c) Posterior a la incubación observe su placa, anote y discuta sus resultados.

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FACULTAD DE MEDICINA Y BIOCIENCIAS
CARRERA DE QUIMICA Y FARMACIA

ACTIVIDAD PRACTICA N°4

ANTIBIOGRAMA Y EXAMENES MICROBIOLOGICOS

Objetivos

• Conocer los principales elementos que afectan la realización de un

antibiograma y exámenes microbiológicos relacionados.
• Demostrar la utilidad del proceso de laboratorio en la práctica clínica y el
tratamiento farmacológico del paciente.

CONCEPTOS BÁSICOS INVOLUCRADOS EN ESTA CLASE PRÁCTICA

La selección de antimicrobianos en el estudio de susceptibilidad in vitro tiene

como objetivo disponer de un adecuado apoyo en la elección de las terapias
antimicrobianas, al igual que promover su uso racional. En la selección de
antimicrobianos para el estudio de susceptibilidad in vitro debemos reconocer
los siguientes fundamentos:

Microbiológicos: donde priman las características estructurales y genéticas de

cada microorganismo determinando así patrones de resistencia, tanto natural
como adquirida, frente a algunos antimicrobianos.

Farmacológicos: características de los antimicrobianos que determinan su

mecanismo de acción y espectro antibacteriano. También contempla
propiedades farmacológicas tales como vía de administración, características
farmacocinéticas y de biodisponibilidad.

Técnicos: condiciones necesarias para obtener datos confiables y extrapolar

los resultados obtenidos en el estudio de susceptibilidad in vitro hacia la
respuesta clínica.

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Para lo anterior se requiere:
• Contar con una técnica estandarizada
• Reconocer las limitaciones de la técnica de difusión en agar
• Adecuar el estudio de acuerdo al agente causal y al sitio de infección.

De acuerdo a las condiciones necesarias para estudiar la susceptibilidad in

vitro se han diferenciado dos grupos de microorganismos:

Microorganismos no fastidiosos. Los que requieren condiciones estándares

para su estudio de susceptibilidad por difusión. Este grupo incluye:
Staphylococcus spp, Enterococcus spp, Enterobacteriaceas, Pseudomonas spp
y otros bacilos no fermentadores.

Microorganismos fastidiosos. Aquellos que requieren de una modificación en

la técnica de difusión con el fin de lograr resultados válidos y confiables. En
esta categoría se encuentran: Streptococcus pneumoniae, otros Streptococcus,
Haemophilus spp, Neisseria gonorrhoeae y Vibrio cholerae,entre otros.

ANTIBIOGRAMA: Consiste en el estudio de la sensibilidad o resistencia de

determinado microorganismo (o grupo de ellos) a varios antibióticos. Se puede
utilizar para tratar un patógeno, añadir a alimentos, en definitiva para saber
como se comporta un germen frente a determinado antibiótico.
Los antibióticos en general pueden ser de amplio espectro o de espectro
reducido, estos últimos van a matar gérmenes más específicamente.
Dependiendo del origen o localización de la infección, se va a utilizar uno u
otro. Por ejemplo en una infección de garganta no se debería utilizar uno de
amplio espectro ya que mataría también a la microbiota tan importante para
nosotros.
El antibiograma se puede hacer tanto en medio líquido como en medio sólido.
En nuestro caso vamos a utilizar un agar ordinario pero modificado de manera
que gérmenes y antibióticos puedan difundir correctamente: agar de Muëller-
Hinton.

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Se utilizan para poner los antibióticos, unos discos impregnados que llevan
unas letras que nos indican el antibiótico del que se trata y un número que
indica la concentración en mg/ml que tenía la disolución en la que se
impregnaron.

Agar Mueller Hinton

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de

sensibilidad a los antimicrobianos. Además es útil con el agregado de sangre
para el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.
El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), ex National Committee for
Clinical Laboratory Standards (NCCLS), recomendó su uso en forma rutinaria
para la realización del antibiograma en medio sólido, debido a una serie de
factores que se detallan a continuación:
• Presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de
sensibilidad
• Su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina
es bajo
• La mayoría de los patógenos crece satisfactoriamente
• Una gran cantidad de datos han sido evaluados y avalados usando este
medio de cultivo.

TRABAJO PRÁCTICO

c) Cada grupo tendrá 1 placa de Agar Muller, la cual deberán sembrar con
ayuda de las placas obtenidas en el trabajo práctico anterior.

d) La placa se sembrará en forma ordenada y uniforme y posteriormente se

pondrán los sensidicos correspondientes a 6 representantes de antibióticos,
cada placa se incubará a 37ºC por 24 horas y se anotarán los resultados,
para el informe de los alumnos.

e) Las placas sembradas en el práctico anterior además se someterán a

Tinción de Gram, con el fin que el alumno pueda evaluar la presencia de
flora normal y flora saprofita en los compañeros.

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