CURSO DE IMUNOHEMATOLOGIA - 2009

Parte II: Reação Antígeno-Anticorpo e o Complemento em Imunohematologia

(Compreendendo a sorologia de grupos sanguíneos)

1- Estrutura e origem dos anticorpos:

A estrutura dos anticorpos humanos está, aqui, representada por moléculas de

imunoglobulinas de classe IgG (monômero = 1 unidade básica) e de classe IgM
(pentâmero = 5 unidades básicas). Cada unidade básica é constituída por 2
seqüências longas de aminoácidos (480 a.a.) que denominamos cadeias pesadas e
2 seqüências curtas (212 a.a.) denominadas cadeias leves. Pontes de bissulfeto
ao longo das cadeias peptídicas mantêm a estrutura espacial da imunoglobulina e
promovem a união entre estas cadeias, criando regiões de “dobradiças” que
permitem uma certa mobilidade ao anticorpo.

As seqüências peptídicas das regiões constantes das cadeias leves e pesadas (CL,
CP1-CP2-CP3) constituem a fração “Fc”, comum em todos os anticorpos humanos
e que pode ser reconhecida por macrófagos com receptores de “Fc”.
As seqüências peptídicas das regiões variáveis das cadeias leves e pesadas (VL,
VP) formam os sítios de ligação aos antígenos e são, portanto, responsáveis pela
especificidade do anticorpo.

A diversidade de anticorpos com diferentes especificidades, que constitui o

repertório de respostas imunológicas de um indivíduo, é herdada geneticamente.
Os genes que produzem as regiões variáveis (VL,VP) dos anticorpos, são
codificados em segmentos que se rearranjam no DNA de precursores dos
linfócitos para formar um gene completo.
Este processo possibilita 4.000 combinações somente para produção das cadeias
pesadas das IgGs humanas. Além disso, adições e deleções randômicas de bases
nas regiões de ligação dos segmentos, criam uma diversidade adicional.

Após a expressão dos receptores “sIg” (imunoglobulina de superfície) nos

linfócitos maduros, o sistema imunitário começa a expurgar os clones “auto-
reativos” (produtores de auto-anticorpos), por um mecanismo chamado “auto-
tolerância”.
A maior parte destes clones são deletados na medula óssea. Outros são inativados,
mas não eliminados e, portanto, linfócitos auto-reativos podem permanecer na
circulação linfóide periférica, mas com uma vida-média mais curta, com menor
quantidade expressa de “sIg” e com menor capacidade de perceber o auto-
antígeno quando a sua “sIg” é estimulada.

Se por um lado, os mecanismos de eliminação ou inativação de linfócitos auto-

reativos são críticos para a viabilidade de um animal, por outro lado, existem
razões para acreditar que a “auto-tolerância” não pode e não deve ser
perfeitamente eficiente. A capacidade de tolerância aos auto-antígenos deve
estar balanceada com a capacidade de responder aos antígenos estranhos. Cada
célula eliminada em benefício da “auto-tolerância” é uma que não poderá
responder a um antígeno estranho potencial.

Considerando que certos linfócitos auto-reativos permanecem na circulação

linfóide periférica, muitas respostas imunes (proteínas estranhas, vírus) são
acompanhadas de respostas auto-imunes transitórias.

2- Especificidade da reação Antígeno-Anticorpo:

A característica básica da reação antígeno-anticorpo é a “especificidade”, que é
representada por uma estreita relação de complementaridade entre as estruturas
tridimensionais das duas moléculas.
Esta complementaridade permite a aproximação máxima entre os sítios de ligação
das moléculas de antígeno (Ag) e anticorpo (Ac). As forças de interação moleculares
no complexo “Ag-Ac” não são covalentes e, embora sejam individualmente fracas,
a multiplicidade das uniões leva a uma considerável energia de coesão.

Forças de interação “Ag-Ac”:

• Pontes de hidrogênio: existentes entre átomos eletropositivos (hidrogênio) e

átomos eletronegativos (oxigênio ou nitrogênio).

• Forças eletrostáticas: representadas pela atração exercida entre dois

grupamentos de cargas opostas, por exemplo, os grupos NH3+ e COOH- nas
estruturas do anticorpo e do antígeno.

• Forças de Van der Waals: ligadas ao movimento dos elétrons. Com a

aproximação máxima, as nuvens eletrônicas de antígeno e anticorpo interagem
formando uma nuvem única em torno do complexo “Ag-Ac”, estabilizando-o.

• Ligações hidrofóbicas: associação de grupos hidrofóbicos não polares, de modo

que o contato com moléculas de água é minimizado.

3- Reversibilidade da reação Antígeno-Anticorpo:

As ligações não covalentes entre o anticorpo e o antígeno são dissociáveis,

fornecendo-se a energia necessária ao sistema, caracterizando a reversibilidade da
reação “Ag-Ac”. Essa dissociação (eluição) pode ser feita por diversos processos:
calor, modificação do pH, da força iônica, solventes orgânicos, etc.
Como se trata de uma reação bimolecular reversível, podemos aplicar a lei de ação
das massas e determinarmos a constante de equilíbrio ou de afinidade na reação.

Ag + Ac AgAc

Se (Ag) representa a concentração antigênica (mol/l), (Ac) a concentração de

anticorpos (mol/l), k e k' as constantes de associação e dissociação do complexo
Ag-Ac, a aplicação da lei de ação das massas, em equilíbrio, nos permite considerar:

(Ag)(Ac)k' = (AgAc)k ou (AgAc) = k = K

(Ag)(Ac) k'

K representa a "constante de equilíbrio de associação" do sistema e mede a

estabilidade do complexo Ag-Ac ou, mais precisamente, a afinidade intrínseca do
anticorpo pelo antígeno correspondente. Quanto mais elevada for a constante K,
maior será a afinidade do anticorpo.

4- Termodinâmica da reação “Ag-Ac” – liberação de energia:

É importante a correta compreensão da termodinâmica das reações “Ag-Ac”, pois

isto facilitará muito o entendimento do conceito de anticorpos «frios e quentes»
em imunohematologia.
A reação antígeno-anticorpo é exotérmica, ou seja, sempre provoca uma liberação
de calor, cuja variação ou entalpia (∆Hº) é mais negativa quanto mais exotérmica
for a reação (quanto mais calor liberar). Usa-se o sinal negativo para simbolizar a
liberação da energia. Assim um ∆Hº = -20 Kcal/mol é maior que um ∆Hº de -10
Kcal/mol, isto é, está liberando mais calor.

Podemos então compreender os anticorpos "frios" e "quentes" em imunohematologia.

Uma variação da entalpia, fortemente negativa, indica uma reação muito
exotérmica. Em outras palavras, a combinação mol a mol do anticorpo com seu
antígeno libera uma grande quantidade de calor. Nesse caso, a fixação do anticorpo
sobre o antígeno é máxima em baixa temperatura (4ºC), mais fraca à 25ºC e
freqüentemente nula à 37ºC (range térmico curto) e, esses anticorpos são
chamados "frios".

A combinação do anti-I (tipicamente frio) com seu antígeno específico, libera de

-30 a -40 Kcal/mol. As aglutininas naturais do sistema ABO são, igualmente,
exotérmicas e dão valores de ∆Hº variando de -2 Kcal/mol para o anti-B dos
indivíduos "O" até -20 Kcal/mol para o anti-A dos indivíduos "B". São, então,
anticorpos "frios".

Inversamente, os anticorpos anti-RhD (tipicamente quentes) tem calor de reação

(∆Hº) muito fracos e são chamados anticorpos "quentes". A variação da constante
de equilíbrio de associação do sistema (K) é muito baixa em reações de 4ºC à 37ºC
(range térmico amplo), sendo que a aglutinação é melhor visível à 37ºC.
Um método de estudo da termodinâmica da combinação das hemaglutininas com
seus antígenos correspondentes, foi introduzido em Imunogenética por Wurmser e
colaboradores e é baseado na lei clássica de ação das massas. Por este método
pode-se medir a concentração de anticorpos com maior precisão do que nas
titulações clássicas por diluição.

Conhecendo-se o número aproximado de hemácias presentes em suspensões de

diversas concentrações, pode-se estimar o número de determinados antígenos de
grupos sanguíneos (Ag).
A partir da relação entre a concentração total dos anticorpos (T) que introduzimos
na reação e a concentração dos anticorpos livres (L) e, contando-se o número
máximo de hemácias aglutinadas pelo soro, pode-se determinar a concentração dos
anticorpos fixados (Ac) pela relação (T/L). Em condições estandardizadas,
demonstra-se que esse número é proporcional à concentração de anticorpos.

A representação gráfica de Ac (T/L) x Ag é uma linha reta, cuja inclinação é

proporcional a constante de equilíbrio de associação (K) do sistema que, como já
vimos, define a afinidade do anticorpo por seu antígeno correspondente.

O método pode ser utilizado para caracterizar um determinado anticorpo se

utilizarmos sempre o mesmo antígeno, ou para caracterizar um antígeno se
utilizarmos o mesmo anticorpo.

5- A aglutinação de eritrócitos:
Se produzirmos certas modificações físico-químicas em suspensões de partículas de
colóides ou células como eritrócitos e bactérias, estas suspensões perdem a
estabilidade e os colóides ou células se aglutinam, formando grumos que chamamos
“aglutinatos”.

Em imunohematologia eritrocitária, o fenômeno de aglutinação das hemácias

produzido pela reação de anticorpos contra antígenos de grupos sanguíneos,
constitui a base de quase todas as técnicas aplicadas na “sorologia dos grupos
sanguíneos”. Eventualmente, o fenômeno de hemólise pode ser a base de outras
técnicas utilizadas.

A aglutinação de hemácias em suspensões fisiológicas pode ocorrer por dois

mecanismos básicos: específico e inespecífico.

• Aglutinação específica:

Sabemos que uma suspensão de hemácias em salina fisiológica (NaCl 0,85%)

constitui um sistema estável, ou seja, as hemácias se mantêm a uma certa
distância umas das outras. Essa estabilidade pode ser alterada pela introdução, de
anticorpos específicos que se fixarão em antígenos da membrana eritrocitária,
provocando a aglutinação das hemácias.

De acordo com a "teoria das pontes", as moléculas de anticorpos são capazes de se

fixarem sobre sítios antigênicos de células adjacentes formando pontes entre elas.
A aglutinação seria observável, tão logo a rede, assim constituída, possua um
tamanho importante. Veremos que esta concepção é falha e que resulta de uma
simples analogia com o fenômeno de precipitação.
A "teoria das pontes" é um modelo simplista do fenômeno de aglutinação de
hemácias em suspensão e não permite compreender os exemplos de aglutinações
inespecíficas, ou seja, na ausência de anticorpos.

• Aglutinação inespecífica:

Este fenômeno, chamado de “panaglutinação”, corresponde à aglutinação de

hemácias normais (não sensibilizadas por anticorpos) por substâncias presentes no
meio de suspensão, como: detergentes, sílica coloidal, ions metálicos, e
macromoléculas (albumina, polibreno, ficol, dextran).
Algumas fito-aglutininas (anti-A1, anti-H) são capazes de reagir com receptores
presentes nas hemácias humanas, produzindo um fenômeno que se aproxima muito
da aglutinação por anticorpos.

6- Processos físico-químicos da aglutinação (Potencial Zeta):

Para compreendermos os fenômenos de hemaglutinação específica e não específica,

precisamos de um modelo mais complexo, com base em processos físico-químicos,
onde o fator mais importante a ser considerado é a distância média que separa as
hemácias em suspensão. Esta distância pode ser diminuída, pela adição de
anticorpos ou outras substâncias ao meio, até um ponto crítico em que a
aglutinação ocorre.

As hemácias comportam-se como partículas eletronegativas em estudos de

migração eletroforética. Os grupos carboxílicos das sialoglicoproteinas da
membrana eritrocitária são os maiores responsáveis por essa eletronegatividade.

Em meio salino (NaCl 0,85%), íons positivos de sódio (Na+) são atraídos para junto
das hemácias, criando uma camada dupla de cargas positivas, que gera uma forte
repulsão interglobular.
A nuvem de íons positivos que envolve cada hemácia, torna-se menos densa à
medida que se distancia da hemácia. A diferença de potencial elétrico criada entre
a camada dupla de íons positivos (Na+) próxima da hemácia e o meio com íons de
sódio e cloro em equilíbrio (neutro), é chamada “Potencial Zeta”. A força de
repulsão entre as hemácias, em meio salino, depende do valor do potencial zeta.

Considerando a carga elétrica da hemácia (γ), a força iônica do meio de suspensão

(µ) e a constante dielétrica do meio (D), Pollack desenvolveu a seguinte expressão
do potencial zeta (Z): Z = f {γ, 1/D, 1/√µ}, ou seja, a diferença de potencial zeta
é uma função que varia diretamente com eletronegatividade da membrana
eritrocitária (γ) e, inversamente com a constante dielétrica do meio de suspensão
(D) e com a raiz quadrada da sua força iônica (√µ).
Do ponto de vista físico-químico, a aglutinação ocorre pela agregação das hemácias
(aglutinatos), quando a distância média entre elas se reduz a um valor mínimo.
Esta distancia depende dos valores de duas forças antagônicas: a “tensão
interfacial” (força de coesão), que tende a agregar as hemácias e a “força de
repulsão”, devida aos escudos de cargas positivas criados ao redor das hemácias
(cargas iguais repelem-se). Na ausência de agentes aglutinantes, a força de
repulsão predomina e mantém a suspensão globular estável em meio salino.

A noção de "Potencial Zeta Crítico (Zc)" definida por Abramson, mostra que para
valores elevados do potencial Zeta (em valores absolutos), as hemácias não se
aglutinam, mesmo na presença de anticorpos específicos. Diminuindo-se,
lentamente, o potencial Zeta do sistema, constata-se que a aglutinação ocorre em
um determinado valor, que chamamos "Potencial Zeta Crítico".

O potencial Zeta de um sistema pode ser modificado de duas maneiras:

• Pela redução da carga elétrica da hemácia:

Incluímos nesta categoria, os efeitos devidos ao tratamento das hemácias por

enzimas proteolíticas, que removem fragmentos de proteínas da membrana,
reduzindo sua eletronegatividade e ao efeito da fixação de anticorpos sobre a
membrana eritrocitária.

• Variação da composição do meio:

São os efeitos devidos às modificações da força iônica e da constante dielétrica do

sistema.

A aglutinabilidade de um sistema é maior quanto mais baixo for o valor do

potencial Zeta. Pollack relacionou os termos da sua expressão, de acordo com a
seguinte equação:

Esta equação nos mostra que as reduções do potencial Zeta aumentam a

aglutinabilidade do sistema, ou até mesmo promovem a aglutinação das hemácias
em suspensão se o potencial zeta crítico (Zc) é atingido. Os valores do potencial
Zeta podem baixar em três condições:

• se a carga elétrica da hemácia (γ) diminui.

• se a constante dielétrica (D) do sistema aumenta.
• se a força iônica do meio (µ) aumenta.

Tais condições são os principais parâmetros utilizados para se compreender as

reações de aglutinação e os métodos de produção de aglutinações artificiais
utilizados na rotina dos laboratórios de Imunohematologia, como abordaremos mais
adiante.

7- O potencial zeta crítico (Zc) e as classes de anticorpos:

Pollack explicou, em bases físico-químicas, as diferenças de comportamento dos
anticorpos de classe IgG e de classe IgM na aglutinação de hemácias, quando
reagem com antígenos de grupos sanguíneos.
Estima-se em -15 mV, o potencial zeta de uma suspensão de hemácias RhD positivas
em NaCl 0,85%.
Pelo ajuste da força iônica (µ) e/ou da constante dielétrica (D) do meio de
suspensão, pode-se fazer variar o valor do potencial Zeta do sistema e, mesmo na
ausência de anticorpos anti-RhD, observa-se que as hemácias tendem a se aglutinar,
espontaneamente, ao se atingir o potencial Zeta crítico (Zc) da ordem de -7 mV.
Este valor obtido para o zeta crítico, onde uma aglutinação inespecífica das
hemácias ocorre, não varia com diferentes suspensões celulares e, por isso,
permite avaliar o valor da “tensão interfacial” (força de coesão) entre hemácias
em suspensão salina (NaCl 0,85%).

Podemos refazer os mesmos ajustes anteriores, na presença de anticorpos anti-RhD

das classes IgG e IgM.
Suspensões de hemácias RhD positivas foram tratadas com anticorpos anti-RhD das
classes IgG e IgM e, em seguida, os valores do potencial zeta de cada suspensão
foram modificados, para se determinar o potencial Zeta crítico (Zc) de cada
sistema. O valor do zeta crítico (Zc) para as suspensões tratadas com anti-RhD de
classe IgM, é da ordem de -18 a -23 mV, enquanto aquelas tratadas com anti-RhD
de classe IgG, é da ordem de -8 a -10 mV.

Como o potencial Zeta crítico (Zc) da suspensão de hemácias sensibilizadas por

anticorpos anti-RhD (IgM) é superior, em valor absoluto, ao da própria suspensão
em NaCl 0,85%, estes anticorpos são ditos “aglutinantes”.
Ao contrário, o potencial Zeta crítico (Zc) na presença de anticorpos anti-RhD de
classe IgG, sendo inferior ao da suspensão em NaCl 0,85%, não ocorre aglutinação
das hemácias e estes anticorpos são ditos “não aglutinantes”.

A vantagem das moléculas de IgM sobre as de IgG está ligada ao seu peso molecular
e à sua estrutura pentamérica, melhor adaptada à função aglutinante.

8- Influência dos antígenos na aglutinação das hemácias:

A aglutinação das hemácias, em uma suspensão, não está relacionada apenas com
as classes dos anticorpos, mas também, com o número e localização dos sítios
antigênicos.

Anticorpos anti-A de classe IgM, por exemplo, aglutinam hemácias A1 ou A2 em

suspensão de NaCl à 0,85%, mas não aglutinam hemácias Am. Da mesma maneira,
anticorpos anti-RhD, de classe IgG, não aglutinam hemácias RhD positivas em
suspensão de NaCl à 0,85%, mas aglutinam hemácias do fenótipo D--/D-- (variante
rara do sistema Rh).

O número de sítios antigênicos é responsável pelas diferenças de comportamentos

dos anticorpos anti-A e anti-RhD em presença de hemácias Am e D--/D--,
respectivamente. As hemácias Am possuem um número de sítios antigênicos "A" da
ordem de 1.000 receptores por membrana, enquanto que as hemácias A1 possuem
cerca de 1.000.000. Os fenótipos RhD mais comuns possuem entre 10.000 a 30.000
sítios por membrana, enquanto o fenótipo D--/D-- possui cerca de 100.000.

Existe uma relação clara entre aglutinabilidade das hemácias e o número de sítios
antigênicos presentes na membrana. Existe um número crítico de antígenos para se
produzir a aglutinação, cujo valor depende do sistema de grupos sanguíneos em
questão e das condições experimentais.
No sistema ABO, o número crítico de antígenos "A" é da ordem de 2 a 3.000
receptores por célula, o que explica o fato de não observarmos aglutinações
diretas com as hemácias "Am".

A localização dos antígenos na membrana eritrocitária é outro fator importante na

reação de aglutinação. Os antígenos podem estar total ou parcialmente encobertos
(cripto-antígenos) e inacessíveis aos anticorpos. O exemplo mais conhecido é do
antígeno "T" que, normalmente, não é reativo em hemácias íntegras, mas que após
ação de enzimas proteolíticas bacterianas (pacientes com septicemia), tornam-se
acessíveis e poliaglutináveis, uma vez que os soros humanos contêm auto-anti-T.

9- Técnicas de produção artificial de aglutinação de hemácias:

Anticorpos “não aglutinantes” se fixam sobre as membranas das hemácias sem

aglutiná-las. Por isso, a visualização das reações destes anticorpos com seus
respectivos antígenos, depende de artifícios técnicos para produção da aglutinação.

Em imunohematologia, essas técnicas são essenciais na detecção e identificação de

alo-anticorpos anti-eritrocitários, nas fenotipagens sanguíneas, no diagnóstico das
anemias hemolíticas auto-imunes (AHAI) e no diagnóstico das doenças hemolíticas
do recém-nascido (DHRN).

Discutiremos as técnicas mais importantes à luz da equação de Pollack para o

potencial zeta:
• Tratamento das hemácias por enzimas proteolíticas:

A tripsina, a papaína, a bromelina e a ficina são as principais enzimas proteolíticas

utilizadas nas técnicas enzimáticas de aglutinação artificial.
Estas enzimas são capazes de retirar da membrana eritrocitária, fragmentos
peptídicos de glicoproteínas membranárias contendo moléculas de ácido siálico
(eletronegativas), diminuindo a carga negativa das hemácias.
Como conseqüência da diminuição da eletronegatividade das hemácias, os escudos
de íons positivos (Na+), atraídos para próximo das membranas eritrocitárias,
diminuem e o valor da diferença de potencial elétrico (potencial zeta) entre estes
escudos e o meio de suspensão em equilíbrio (neutro), também diminui. Para
valores mais baixos do potencial zeta, as suspensões de hemácias tornam-se mais
aglutináveis. Isto está de acordo com o modelo eletrostático de Pollack, onde o
potencial Zeta (Z) é diretamente proporcional à eletronegatividade da hemácia (γ).

Como exemplo, hemácias RhD positivas tratadas pelas enzimas proteolíticas citadas,
podem ser aglutinadas, em meio salino, por anticorpos anti-RhD de classe IgG (não
aglutinantes).

O tabela acima, mostra os efeitos de redução do potencial zeta, produzidos pelas

enzimas proteolíticas mais utilizadas nos laboratórios de imunohematologia.

• Adição de substâncias macro-moleculares:

Pollack foi o primeiro a oferecer um modelo físico-químico da aglutinação em meio

macromolecular, ou seja, do papel da constante dielétrica (D) do meio de
suspensão.
Macromoléculas hidrossolúveis como albumina, PVP, dextran, ficol, PEG, etc,
quando adicionadas ao meio de suspensão das hemácias, aumenta sua constante
dielétrica (D). Estas moléculas possuem uma extremidade positiva (amínica) e outra
negativa (carboxílica) e se polarizam no campo elétrico das hemácias em suspensão.
Como são pesadas, são atraídas para próximo das hemácias neutralizando cargas
negativas das membranas eritrocitárias e promovendo a dispersão de íons positivos
(Na+) próximos a elas. A diminuição deste escudo de cargas positivas, baixa o valor
do potencial zeta e diminui força de repulsão interglobular. Isto está de acordo
com a equação de Pollack, onde o potencial Zeta (Z) é inversamente proporcional à
constante dielétrica (D) do meio de suspensão.

A albumina (20 – 30%) e o polietilenoglicol (PEG) são os meios macromoleculares

mais utilizados e a eficácia depende do conteúdo de polímeros.

Falsas reações positivas podem ser provocadas pelo próprio meio macromolecular,
quando um excesso de polímeros aumenta a constante dielétrica (D) a um ponto
que o potencial Zeta crítico (Zc) é atingido e o fenômeno da aglutinação ocorre
espontaneamente, mesmo na ausência de anticorpos (panaglutinação).
As falsas reações podem ser evidenciadas pela utilização de soros-controle
produzidos pelo mesmo fabricante e contendo o mesmo meio macromolecular dos
soros de classificação sanguínea. O uso de tais controles é obrigatório pelas normas
técnicas vigentes.

• Alteração da força iônica do meio:

Sabe-se que uma concentração muito elevada de certos cátions (Cr3+, Al3+, Fe3+)
pode provocar uma “panaglutinação” de uma suspensão de hemácias não
sensibilizadas por anticorpos.
Os cátions introduzidos no meio modificam pouco a atmosfera iônica em volta dos
glóbulos, uma vez que sua densidade depende da carga negativa das hemácias.
A diferença de potencial (potencial zeta) diminui entre os escudos de cargas
positivas ao redor das hemácias, que não aumentam com a adição de cátions e o
meio de suspensão que se torna mais iônico pelo excesso de cátions, resultando
numa diminuição da força de repulsão interglobular.
Isto está de acordo com a equação de Pollack, onde um aumento da força iônica (µ)
conduz a uma diminuição do potencial Zeta da suspensão de hemácias em NaCl
0,85%, o que favorece o aparecimento do fenômeno de aglutinação.

A força iônica desempenha um papel importante no equilíbrio primário da reação

antígeno-anticorpo, sendo seu efeito manifestado sob dois aspectos antagônicos. Se
um aumento de "µ" conduz a um aumento da aglutinabilidade, na prática,
concentrações iônicas elevadas competem com os anticorpos e inibem sua fixação
inicial sobre os antígenos, conduzindo a um fenômeno inverso ao desejado.

Tecnicamente, em reações de dois tempos (LISS/Coombs), a etapa de

sensibilização é realizada em meio isotônico de baixa força iônica (LISS),
aumentando a fixação inicial dos anticorpos sobre os antígenos membranários
correspondentes (maior sensibilidade da reação), além de reduzir o tempo de
incubação. A etapa de revelação dos anticorpos fixados sobre a membrana
eritrocitária, pela adição da antiglobulina humana (soro de Coombs), é executada
após uma série de lavagens das hemácias com salina (NaCl 0,85%) que é um meio
de força iônica normal.
Na técnica de “Gel-centrifugação ID-Gel teste”, as reações de LISS/Coombs não
apresentam a etapa de lavagens das hemácias após a etapa de incubação. Nestes
casos, a solução de baixa força iônica é modificada (LISS mod.) por um pequeno
aumento de sua constante dielétrica (D), para compensar o efeito da diminuição da
força iônica do meio de suspensão (µ) sobre o potencial zeta (Z).
Observem que podemos trabalhar, simultaneamente, em mais de uma variável da
equação de Pollack para o potencial zeta (Z).

• Teste da antiglobulina humana ou reação de Coombs:

O teste da antiglobulina humana ou teste de Coombs representa a forma mais

importante de aglutinação artificial em imunohematologia.
Por um procedimento imunológico, essa reação nos permite revelar a presença de
anticorpos "não aglutinantes" na membrana eritrocitária. Dizemos "procedimento
imunológico", porque os soros de Coombs são compostos de anticorpos contra
anticorpos humanos. São produzidos pela injeção de cadeias leves e pesadas de
IgGs humanas em animais (coelhos ou cabras), que formam anticorpos contra as
frações "Fc" destas imunoglobulinas humanas.
Estes anticorpos podem reconhecer qualquer imunoglobulina humana, por isso na
execução do teste de Coombs é necessário lavar as hemácias, após a etapa de
sensibilização (incubação) e antes de se acrescentar o soro de Coombs, a fim de se
remover os anticorpos livres, deixando as hemácias recobertas com os anticorpos
que se ligaram especificamente em antígenos membranários.
Na técnica do “ID-Gel teste”, a separação de anticorpos livres dos fixados sobre
antígenos membranários, se dá por um gradiente de centrifugação.

Quando adicionamos o soro de Coombs, os anticorpos antiglobulinas humanas (AGH),

se ligam nas frações “Fc” dos anticorpos anti-eritrocitários fixados na membrana
eritrocitária. Considerando sua estrutura tridimensional, observamos que cada
fração “FC” de um anticorpo fixado na membrana eritrocitária pode receber
diversas moléculas de antiglobulinas humanas (AGH), tornado sua estrutura maior e
mais pesada.

Como podemos observar no gráfico do experimento acima, a capacidade de

aglutinação de anticorpos da classe IgG + AGH é similar aos da classe IgM, que são
“aglutinantes”.

Os soros de Coombs podem ser “poliespecíficos ou monoespecíficos”. Os

poliespecíficos contem, além de anticorpos contra frações “Fc” das
imunoglobulinas humanas, anticorpos contra a fração C3d do Complemento que
pode estar presente sensibilizando a membrana eritrocitária, na presença ou
ausência de anticorpos fixados. Os soros monoespecíficos contem anticorpos contra
apenas um tipo de imunoglobulina (IgG, IgM ou IgA) ou contra frações do
Complemento (C3c, C3d). Os anticorpos contra a fração C4 não devem estar
presentes nos soros poliespecíficos, para se evitar reações cruzadas com antígenos
do grupo sanguíneo Chido/Rodgers (ISBT= 017- CH/RG).

O teste de Coombs pode ser realizado de duas formas: Coombs Direto e Indireto.

Pelo Teste de Coombs Direto (TCD), demonstramos hemácias sensibilizadas in vivo

por anticorpos e/ou frações do complemento. É utilizado no diagnóstico da Doença
Hemolítica do Recém-Nascido (DHRN), da Anemia Hemolítica Auto-Imune (AHAI), da
hemólise induzida por drogas e ainda no diagnóstico das reações hemolíticas pós
transfusionais.
O Teste de Coombs Indireto (TCI) representa a reação chave e de maiores
possibilidades em imunohematologia e nos permite executar uma série de testes
como: pesquisa e identificação de anticorpos anti-eritrocitários, testes de
compatibilidade pré-transfusionais e determinação de antígenos eritrocitários que
não são evidenciados por aglutinação direta (exs: variáveis fracas de RhD, antígenos
Duffy, Kidd, Kell, etc).

A sensibilidade do Teste de Coombs Indireto (TCI) pode ser aumentada por

procedimentos que modificam a primeira etapa da reação, ou seja, da fixação dos
anticorpos durante a incubação. Os mais utilizados são: adição de albumina 22%
(BSA) ou polietilenoglicol (PEG) ao meio, uso de meios de baixa força iônica (LISS)
ou, ainda, utilização de hemácias já tratadas por enzimas proteolíticas.

A adição de albumina ou polietilenoglicol aumenta a constante dielétrica (D) do

meio de suspensão e baixa o valor do potencial zeta (Z), favorecendo a aglutinação
das hemácias. Favorece, também, a fixação inicial dos anticorpos à membrana
eritrocitária pela dissipação de íons positivos próximos à membrana, embora este
procedimento seja menos eficaz do que a diminuição da força iônica do meio.

O uso de um meio isotônico de baixa força iônica (LISS), na etapa de sensibilização

das hemácias, aumenta consideravelmente a velocidade de fixação e a quantidade
de anticorpos fixados sobre a membrana eritrocitária. Este fato nos permite
aumentar a sensibilidade e diminuir o tempo de incubação do teste.

O uso de hemácias pré-tratadas por enzimas proteolíticas (tripsina ou papaína) no

Teste de Coombs Indireto (TCI), é um procedimento indicado para melhorar a
detecção de anticorpos anti-Kidd.

10- Outros fatores que influenciam a reação de aglutinação das hemácias:

A temperatura da reação e o pH do meio de suspensão, influem no fenômeno de

fixação primária dos anticorpos sobre seus antígenos e sobre o fenômeno de
aglutinação, já que os dois aspectos da reação não são dissociáveis.
Como já tratado anteriormente, distinguimos dois tipos de temperaturas de reação:
um primeiro grupo das reações ótimas em baixas temperaturas e um outro grupo
das reações ótimas em temperaturas mais elevadas.

Os anticorpos ativos em temperaturas baixas (4oC), também chamados "anticorpos

frios" correspondem, principalmente, às especificidades anti-I, -H, -A, -B, -AB, -Le,
-M, -N e –P1. Trata-se, normalmente, de anticorpos naturais regulares ou irregulares.
Os anticorpos ditos "imunes" reagem melhor à 37oC e são, também, chamados
"anticorpos quentes". É o caso, por exemplo, dos anticorpos dos sistemas Rh, Kell,
Duffy, Kidd, MNS, Diego, etc.

As modificações de pH compreendidas entre 6,0 e 8,0 têm pouca ou nenhuma

influência sobre a reatividade dos anticorpos. Fora destes limites pode-se observar
hemólise das hemácias para valores extremos de pH, ou uma inibição da
aglutinação devida a uma diminuição importante da constante de associação dos
anticorpos.

11- O Complemento:

O sistema de “Complemento” é constituído por uma série complexa de cerca de 20

proteínas plasmáticas, que funcionam como enzimas ou proteínas de ligação e que
desempenham papel essencial na defesa do organismo contra agentes infecciosos e
nos processos inflamatórios.
Além das proteínas plasmáticas, o sistema de complemento inclui diversos
receptores membranários em células do sistema imunitário, que reconhecem
frações específicas do complemento. Outras proteínas membranárias com funções
reguladoras (DAF, MIRL) previnem o ataque do complemento contra células
autólogas.
As três principais atividades biológicas do complemento são:

− opsonização pela adesão de frações do complemento às células, facilitando a

fagocitose do antígeno.
− ativação do sistema imunológico (ex: macrófagos) por substâncias com atividade
inflamatória como C3a e C5a (anafilotoxinas) liberadas na circulação.
− lise de células alvo.

Existem 2 vias de ativação do complemento: clássica e alternativa. Pela via clássica,

a ativação se dá por complexos “antígeno-anticorpo”, sendo os anticorpos de classe
IgM ou das subclasses IgG1, IgG3 e, em menor grau, IgG2.
A via alternativa de ativação do complemento não é anticorpo-dependente e
ativada, principalmente, por microorganismos invasores, constituindo uma defesa
inata contra infecções bacterianas.

Temos, então, duas vias de clivagem da proteína C3, que representa o

acontecimento central no processo de ativação do sistema de complemento. Ambas
as vias geram uma enzima "C3 convertase”, que converte C3 em C3b, que por sua
vez ativa a seqüência terminal C5..C9 do complemento capaz de provocar a lise
celular (citólise).

Faremos uma breve descrição das vias clássica e alternativa de ativação do sistema
de complemento:

• Via clássica (na presença de anticorpos)

Nesta via, o primeiro estágio de ativação do complemento é representado pela
fixação do complexo protéico C1 (C1qrs) pelas imunoglobulinas (IgM, IgG1, IgG3 e
IgG2 no homem) ligadas aos seus antígenos específicos. O subcomponente C1q do
complexo C1 une-se diretamente a imunoglobulina, por dois carboidratos presentes
na fração “Fc”. São necessárias, pelo menos, duas moléculas de IgG ou apenas
uma de IgM para a fixação de C1.

Em seguida o complexo ativado C1qrs cliva a proteína C4 no plasma próximo do

local catalítico C1s, liberando o fragmento C4a. O fragmento principal C4b une-se a
C2, que por sua vez é, também, clivado por C1s, liberando o fragmento C2b. O
fragmento principal C2a permanece ligado ao C4b para formar a "C3 convertase”
(C4b2a).
A C3-convertase é a enzima central no processo de ativação do complemento,
uma vez que cliva a proteína mais abundante do sistema de complemento,
chamada C3. Como resultado desta clivagem temos as frações C3a (anafilotoxina)
e C3b que é capaz de opsonizar membranas celulares e imunocomplexos para
serem reconhecidos por macrófagos com receptores de C3b. Além disto, é a C3-
convertase que se liga, aleatoriamente, a uma molécula de C3b para formar a
C5-convertase, que iniciará a formação do complexo de ataque à membrana (C5b,
C6, C7, C8 e múltiplos C9).

A “C5 convertase” (C4b2a3b) atua sobre C5 clivando essa proteína em C5a

(anafilotoxina) e C5b que se fixa à membrana celular, criando a base para a
construção do complexo de ataque à membrana.
Na etapa de formação do complexo de ataque à membrana, a ligação seqüencial
de C6, C7 e C8 sobre C5b, forma o complexo estável C5b678 que rompe a
membrana celular. A última fração inserida no complexo é C9. Múltiplas
moléculas de C9 se fixam sobre fração C8, que já atravessou a matriz
fosfolipídica da membrana e se polimerizam aumentando o diâmetro do poro
criado por C8. Estes orifícios criados na membrana permitem as trocas de
conteúdos extra e intracelulares, provocando a lise da célula (hemólise no caso
das hemácias).

• Via alternativa (na ausência do complexo Ag-Ac)

O complemento pode também ser ativado na ausência de um complexo antígeno-

anticorpo. A ativação pela via alternativa é iniciada por substâncias como
lipopolissacarídios em membranas de microorganismos (LPS), polissacarídios
(zimosan, inulina), agregados de imunoglobulinas, endotoxinas de bactérias gram-
negativas, veneno de cobra, entre outras, que são reconhecidas por moléculas
circulantes de C3 ativadas fisiologicamente por hidrólise (C3+H2O).

O C3 hidrolisado tem atividade similar ao C3b (C3b-like) e combina com uma

glicoproteína rica em glicina chamada “fator B”, para formar uma proenzima de
fase fluida (C3bB). Quando uma protease chamada “fator D” cliva a proteína B da
proenzima C3bB, libera um pequeno fragmento “Ba” e gera uma C3 convertase
(C3bBb) de fase fluida
A presença de substancias ativadoras, como por exemplo microorganismos
invasores, estimula todo o processo. Uma maior produção de C3 hidrolisado (C3b-
like) com uma conseqüente maior produção da proenzima C3bB, aumenta a
quantidade de substrato para o fator D, levando a um aumento da concentração
de C3 convertase (C3bBb) fluida. Esta enzima produz mais C3b, pela clivagem de
moléculas de C3. Cada C3b formado pode, potencialmente, formar mais C3
convertase e, portanto, mais C3b.
Como C3b reconhece lipopolissacarídios (LPS) membranários, moléculas de C3b e
de C3 convertase (C3bBb) se fixam sobre os microorganismos invasores. As
moléculas de C3b fixadas já permitem o reconhecimento dos microorganismos por
células fagocitárias com receptores para C3b. Além disto, as C3 convertases (C3bBb)
sobre as membranas dos microorganismos iniciam um processo de clivagem de C3
ao seu redor, aumentando a cobertura opsônica de C3b e propiciando a formação
de uma C5 convertase pela combinação da C3-convertase com mais uma molécula
de C3b (C3bBbC3b).
Uma vez formada a C5 convertase, a formação do complexo de ataque (C5b6789)
às membranas dos microorganismos com a conseqüente lise celular, ocorre como
na via clássica, descrita anteriormente.

11- Controle da Atividade do Complemento:

A atividade do complemento precisa ser controlada para evitar uma produção

excessiva de mediadores inflamatórios e de danos celulares. Proteínas
plasmáticas e membranárias participam deste controle, interagindo em alguma
etapa do processo de ativação do complemento.
A figura acima representa a atividade reguladora de proteínas plasmáticas como
as serino-proteases “fator H” e “fator I” que são capazes de clivar uma das
cadeias do C3b fixado sobre uma membrana celular, alterando sua estrutura.
Este C3b alterado passa a ser reconhecido por “enzimas trípticas” que sacam do
C3b um fragmento maior que chamamos C3c. O fragmento menor C3d continua
ligado à membrana celular (ligação covalente), mas não é mais reconhecido pelos
macrófagos com receptores de C3b.

Proteínas membranárias reguladoras do complemento (CR1, DAF e MIRL) foram

apresentadas na parte I deste curso, quando estudamos os sistemas de grupos
sanguíneos, por se tratar de proteínas que carreiam antígenos de grupos
sanguíneos.