Croissance industrielle des microorganismes

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Raisons : Obtention d·une biomasse servant
- soit d·aliment (levures comme complément nutritionnel) - soit à la fabrication d·aliment (levures pour la fabrication de pain, de bière, de brioches, de vin«, moisissures pour fabrication de fromages, saké«, bactéries pour fabrication de yaourt, de choucroute«.)

Synthèse de molécules d·intérêt alimentaire, médical ou industriel
acide citrique, pénicilline, cyclosporine«..

Plan 1- Les diverses techniques de culture 2- Caractéristiques des souches utilisées 3- Des exemples de cultures industrielles

3

Les diverses techniques de culture 4 .1.

Culture en continu = culture en milieu renouvelé Remarque : existence d·un autre type de culture avec immobilisation des microorganismes 5 .Deux grandes techniques de culture : .Culture en discontinu = culture en batch .

Culture en discontinu = culture en batch = culture en milieu non renouvelé .1-1.

Matériel de culture : bioréacteur (fermenteur) 7 .1-1-1.

Matériel de culture : bioréacteur ‡ 1.manomètre (pour vérifier la pression interne) ‡ 6.entrée d·eau de refroidissement ‡ 4.pales pour agitation ‡ 8 ² tuyau de vidange 8 .sortie de l·eau de refroidissement ‡ 7.moteur pour agitation ‡ 5.entrée d·air muni d·un filtre (ou tuyau d·échantillonnage) ‡ 2.enveloppe de refroidissement ‡ 3.1-1-1.

1-1-1.Matériel de culture : bioréacteur 9 .

Un bioréacteur de production industrielle est un cuve accueillant de quelques centaines de L à plusieurs m3 10 .Un bioréacteur de laboratoire est une cuve accueillant de 1 à 5 L en général.

remplie d·un milieu de culture stérile .Principe de la culture en batch Culture en milieu clos dans une cuve de taille variable .permettant la croissance du microorganisme jusqu·à épuisement des substances nutritives 11 .stérilisée .ensemencée avec le microorganisme voulu .1-1-2.

de carbone. d·ions minéraux . en peptones. lipides). soja : riche en protéines). de viande (protéines. ‡ Eléments divers pouvant être utilisés en industrie. seuls ou associés (voir cours sur la nutrition): ² des mélasses. ‡ Est souvent riche en glucose. 12 . phosphore). en magnésium. riches en glucides.1-1-3. d'azote. en vitamines. ² des liquides biologiques : du plasma. de poisson (méthionine. résidus visqueux du raffinage de la betterave ou de la canne à sucre.Caractéristiques du milieu de culture ‡ Doit apporter au minimum une source d'énergie. en phosphates. et en oligoéléments. en sulfates. du lactosérum (protéines) ² des farines : végétales (maïs riche en amidon . riz riche en amidon et en protéines .

Conditions d¶une bonne culture en bioréacteur Nécessité .d·une bonne agitation de la culture .d· une régulation du pH car les réactions métaboliques microbiennes peuvent acidifier ou alcaliniser le milieu .1-1-3.d· une régulation de la température par refroidissement car les réactions métaboliques lors de la croissance sont généralement exothermiques .d·une régulation de la pression partielle en O2 par insufflation d·air stérile 13 .

y compris durant la phase d e déclin .Pas de perte de microorganismes durant la culture .Avantages et inconvénients de la culture en batch Inconvénients Avantages .Pas de maintien de la phase exponentielle : donc biomasse et produits recueillis en quantités faibles : rendement limité .Possibilité de recueil des produits synthétisés à tout moment.1-1-4.Difficulté de stériliser de grands volumes de milieu .Préparation longue 14 .Peu de risques de contamination de la culture .Existence d·une phase de latence impropre à la production .

1-2.Culture en discontinu = culture en milieu renouvelé .

une addition régulière de milieu neuf stérile pour réapprovisionner en nutriments et maintenir le pH .1-2-1.Principe de la culture en milieu renouvelé Culture du microorganisme en vase non clos de façon à maintenir en permanence en phase exponentielle grâce à .un soutirage d·une quantité équivalente de milieu de culture permettant ainsi l·élimination régulière des déchets. 16 .

Matériels de culture ‡ Turbidostat ‡ Chemostat ou bactogène 17 .1-2-2.

Le turbidostat 18 .1-2-2-1.

19 . ‡ 5.Réservoir de milieu stérile 2 Valve de contrôle du flux de milieu neuf 3.Schéma d·un turbidostat.1-2-2-1.Le turbidostat ‡ ‡ ‡ ‡ 1.Source lumineuse ‡ 6.sortie de milieu de culture 4 ² cellule photoélectrique reliée à la vanne d·entrée de milieu neuf ce qui permet via un système électronique une autorégulation du débit en fonction de la concentration de la biomasse mesurée en sortie.

‡ Si le trouble tend à trop augmenter il y a une augmentation d·apport de milieu neuf qui dilue et ramène le trouble à sa valeur initiale. La concentration du milieu de culture est maintenue constante par un contrôle turbidimétrique.1-2-2.Principe de fonctionnement du turbidostat ‡ Un turbidostat est un dispositif de culture en continu.1. ‡ Si le trouble tend à trop diminuer il y a diminution d·apport de milieu neuf jusqu·à ce que la croissance ait permis de retrouver la valeur initiale 20 .

Le chémostat 21 .1-2-2-2.

1-2-2-2- Le chémostat

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1-2-2- 2- Principe de fonctionnement du chemostat ‡ Introduction de milieu neuf stérile dans la chambre de culture à la même vitesse que le milieu contenant les micro-organismes est éliminé (c·est le volume de milieu frais qui chasse par trop plein le volume de culture microbienne). ‡ Conséquences : ² stabilité de concentration en substances nutritives limitantes ² microorganismes soumis à une bonne aération, à une vigoureuse agitation et ayant toujours à leur disposition les éléments nutritifs dont ils ont besoin

Multiplication maintenue exponentielle à une vitesse spécifique de croissance rigoureusement contrôlée par l·apport de milieu neuf.

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Avantages - Difficulté du contrôle du - Maintien de la phase système de régulation exponentielle : - Difficulté du maintien rendement optimal d·une culture pure - Stérilisation facile du - Pas de possibilité de milieu fabrication de produits - Récupération des libérés uniquement durant produits au fur et à la phase de déclin. mesure de leur production

1-2-3- Avantages et inconvénients de la culture en continu Inconvénients

24

Caractéristiques des souches utilisées 25 .2.

Démarche historique .2-1.

Découverte de la pénicilline Découverte« Staphylococcus aureus Penicillium 27 .

Il en déduit que le champignon produit une molécule inhibant (à distance) le Staphylocoque. Quelques jours plus tard. aureus et oublie la boite sur la paillasse. il constate l·apparition d·un champignon (Penicillium notatum). Un jour il ensemence une boîte avec du S. Il remarque une zone d·inhibition autour du Staphylococcus.Découverte de la pénicilline Staphylococcus aureus Fleming recherchait des molécules inhibant les contaminants des cultures. Penicillium 28 .

Une souche de Penicillium chrysogenum fut isolé en 1943 et utilisée à la place car davantage productrice novembre 2006 Cellule procaryote 29 .Penicillium notatum espèce historique de la découverte de la pénicilline produisait de faible quantité de pénicilline.

suite à diverses mutations des clones ayant e meilleur rendement sans perte de leurs qualités .Amélioration des souches grâce au progrès de la biologie moléculaire .Sélection..Recherche de la meilleure souche productrice à partir de constituants naturels (aliments.Fusion de cellules . sols««) .Introduction d·un DNA extérieur (ADN recombinant) 30 .

Caractéristiques des souches utilisées en production industrielle .2-2.

dans le but d'améliorer ou de d'adapter la production) 32 .Bonne productivité (fort rendement = capacité à synthétiser des quantités appréciables de produit attendu) .Améliorabilité (idéalement la souche doit pouvoir être capable d'évoluer sous la pression de l'industriel.Stabilité génétique (ne perdant pas ses caractéristiques après de nombreuses multiplications en bioréacteur et lors de sa conservation) .Innocuité (non pathogène) .Croissance rapide (de façon à donner très vite beaucoup de produit ou une biomasse importante) .Production industrielle nécessite une souche ayant les caractéristiques suivantes : .

Exemples de cultures et productions industrielles 33 .3.

Intérêt des cultures industrielles .3-1.

Intérêt dans le domaine ‡ agroalimentaire ‡ industriel autre 35 .

3-1-1.Cultures industrielles en agroalimentaire ‡ Obtention de levains servant à la fabrication d·aliments ‡ Obtention de levains servant d·aliments ‡ Obtention de molécules participant à la fabrication d·aliments 36 .

1.3-1-1.) ‡ Bacillus natto pour le natto ‡ Penicillium roquefortii.Obtention de levains servant à la fabrication d¶aliments ‡ Saccharomyces cerevisiae pour la panification et l·oenologie ‡ Saccharomyces cerevisiae et carlbergensis pour la fabrication de la bière ‡ Lactobacillus pour les produits laitiers (yaourts«) carnés (saucissons) ou végétaux (choucroute«. Penicillium camembertii« pour la fromagerie ‡ Aspergillus flavus pour certains produits asiatiques (saké) 37 .

oviformis. S.Evolution de la flore au cours de la vinification : S. ellipsoideus. ellipsoideus et S. oviformis sont les espèces les plus alcoologènes 38 .Cas du vin : Levures oenologiques . S.Peuvent également être ajoutées au moût Saccharomyces : S.Présence naturelle sur la peau des raisins avec des espèces variant selon l·environnement et les cépages . cerevisiae Torulospora rosei Kloeckera apiculata .

autres alcools.Principale réaction de fermentation : Fructose et glucose éthanol + CO2 100 à 250 g/L 60 à 170 g/L (6 à 17%) Réactions additionnelles donnent des produits composants essentiels du bouquet » du vin . aldéhydes Puis combinaison de ces produits esters novembre 2006 Cellule procaryote 39 . succinique). acides organiques dont acide malique glycérol.Sucres. acides organiques (lactique.

Lactobacillus .Leuconostoc 40 .Intérêt de la fermentation malolactique : réduire l·acidité du vin Acide malique acide lactique 2 à 5g/L < 1g/L COOH-CHOH-CH2-COOH COOH-CHOH-CH3 Réaction assurée par des bactéries après la fermentation alcoolique: .

41 .

ellipsoideus ‡ fermentation malolactique ‡ Lactobacillus de diverses espèces 42 .Principaux micro-organismes ‡ fermentation alcoolique ‡ Kloeckera de diverses espèces ‡ Saccharomyces uvarum et S.Jus de pomme cidre .Degré d·alcool plus faible : 2 à 5% .Cas du cidre .Mêmes types de réactions que pour le vin .

Production très importante de CO2 : mousse abondante ‡ Processus comparable pour l·obtention du saké : alcool de riz 43 .Aromatisation par le houblon .Cas de la bière .2 différences avec le vin et le cidre ² amidon (sucre complexe) au lieu de sucres simples dans la matière première ² 2 étapes ‡ ‡ ‡ ‡ ‡ hydrolyse enzymatique de l·amidon jus sucré : le brassage fermentation alcoolique du jus sucré Ajout nécessaire des micro-organismes après le brassage Saccharomyces cerevisiae : levure de bière Saccharomyces carlsbergensis .Grain d·orge germés bière .

Saccharomyces cerevisiae ² d·autres levures ou des bactéries peuvent être ajoutées (pains ‡ ‡ ‡ ‡ spéciaux) Amidon sucres simples alcool + CO2 Levée de la pâte grâce au CO2 Modification également du gluten et ainsi de latexture de la pâte Cuisson : ² l·alcool s·évapore ² les bulles de CO2 persistent 44 .Cas du pain ‡ Fermentation alcoolique également ‡ Levain ajouté à la pâte pendant le pétrissage : .

Cas du yaourt Les réactions chimiques : la fermentation homolactique lactique Lactose du lait acide lactique Aliment sucré » aliment acide De plus modification des protéines (caséine) par les mêmes microorganismes Aliment liquide aliment solide ‡ ‡ ‡ ‡ 45 .

de chèvre.Cas des fromages Transformations complexes du lait de vache. de brebis par les microorganismes 46 .

Accéléré par pression pâtes pressées (ex: St Nectaire) . diminution de l·acidité« 47 . Munster.Accéléré par pression + cuisson pâtes fermes cuites (ex: gruyère. roquefort) . d·alcools.blanc) fromages à pâte molle (ex: camembert. Développement de la flore.Transformations microbiennes : Protéolyse.6 : caséine gel + liquide (lactosérum = petit lait) ‡ Egouttage du caillé .Les 3 étapes de la fabrication des fromages ‡ Production du caillé ² Fermentation lactique par les bactéries lactiques(cf yaourts) + présure d·origine animale ou fungique Le lait coagule à pH < 4. lipolyse. de gaz. des composés soufrés«production d·arômes. d·ammoniac. fr à pâte ferme (ex: Cantal) . Comté) ‡ Salage et affinage (durée 1 à 8 mois) ² Ajout d·une flore spécifique à chaque fromage. . d·aldéhydes. métabolisme des acides aminés.Lent : fromages frais (ex: fr.

bleus« Geotrichum : camembert 48 .Exemples de micro-organismes participant à la formation des fromages 1. Lactobacillus Leuconostoc.Des bactéries Bactéries lactiques : groupe prédominant: Streptococcus.Des moisissures Penicillium : brie. Lactococcus Propionibacterium (gruyères beaucoup de gaz) 2. camembert roquefort.Des levures Saccharomyces lactis 3.

pickles (concombres.Fabrication de choucroute ‡ + NaCl 2 à 3% pour freiner le développement des Gram ² ‡ Fermentation lactique du chou par Leuconostoc et Lactobacillus (flore naturelle du chou) ‡ pH<2 Fabrication d·olives. cornichons) ‡ Augmentation progressive du salage jusqu·à 16% (saumure) ‡ Fermentation lactique par Lactobacillus plantarum principalement Fabrication de sauce soja ‡ Fermentation d·un mélange salé de graines de soja et de blé par Aspergillus oryzae 49 Cas des produits végétaux .

Fabrication de la choucroute Incision dans la fabrique Choucroute après le processus de fermentation Contrôle qualité après le conditionnement 50 .

café (grains). cacao (fèves). Gluconobacter Fabrication de divers végétaux fermentés ‡ Thé noir (feuilles fermentées). igname. maïs. soja 51 . manioc.Cas des produits végétaux (suite) Fabrication de vinaigre Fermentation acétique par Jus de raisin vin vinaigre Sucres éthanol acide acétique Bactéries responsablers Acetobacter.

Lactobacillus plantarum Fabrication de préparations asiatiques de poisson Fermentations lactiques ou fermentations complexes par bactéries et moisissures 52 .Cas des produits animaux Fabrication de saucissons. jambons fumés Fermentation lactique par Pediococcus cerevisiae .

Conclusion : intérêt des fermentations lors de la fabrication d·un aliment Fermentation lactique : acidification du milieu empêchant ainsi la multiplication d·autres microorganismes (conservateur). Autres fermentations : responsables des arômes et des goûts propres à chaque aliment 53 .

3-1-1.Obtention de levains servant d¶aliments ‡ Levures 54 .2.

Xanthomonas par exemple cultivés sur amidons. 55 .de dextrane. xanthane ou alginate. amylases.3-1-1.d·enzymes (ex : chymosine (présure).3. utilisés comme gélifiants alimentaires produits à partir de Leuconostoc.Obtention de molécules utiles à la fabrication d¶aliments : quelques exemples Production . pectinase«) par des moisissures ou des bactéries .d·acides organiques * acide citrique (conservateur) * acide lactique (conservateur) abondamment utilisé en industrie alimentaire (laitière notamment) produit par Lactobacillus delbrueckii à partir de lactosérum (plusieurs dizaines de milliers de tonnes par an) * acide glutamine (exhausteur de goût) . invertase.

Cultures industrielles utiles pour un domaine autre qu¶agroalimentaire Production ² de bioéthanol par des levures (Saccharomyces et / ou des bactéries) à partir de mélasses de canne ou de betterave à sucre ou de lactosérum utilisé dans l·industrie chimique ou pour les voitures ² de lipides utiles dans le domaine de la cosmétologie 56 .3-1-2.

) ² de molécules immunosuppressives 57 . enzymes«) ² d·antibiotiques ‡ Soit par des moisissures (pénicilline par Penicillium.. anticorps. céphalosporines par Cephalosporium) ‡ Soit par des bactéries (streptomycine par Streptomyces«.Cultures industrielles utiles pour un domaine autre qu¶agroalimentaire ‡ Production ² de protéines d·importance médicale (hormones.3-1-2. molécules antitumorales.

Origine des molécules produites .3-2.

Molécules produites pouvant être ‡ Des métabolites primaires ‡ Des métabolites secondaires ‡ Des métabolites issus d·une bioconversion 59 .

Molécules produites : métabolites primaires ‡ Définition : molécules fabriquées par le microorganisme pour ses besoins nutritifs et la croissance cellulaire. ‡ Moment du recueil : période de production = de la phase exponentielle de croissance. acides aminés« ² Alcools. acides organiques«. ‡ Exemples : ² enzymes.3-2-1. 60 .

3-2-2.Molécules produites : métabolites secondaires ‡ Définition : molécules fabriquées après la phase de multiplication active. protéines«. 61 . ‡ Exemples : antibiotiques. sans doute suite à un stress microbien lors de la phase stationnaire. ‡ Moment du recueil : fin de la croissance : phases exponentielle et de déclin.

3-2-3.Molécules issus d¶une bioconversion d¶un substrat ‡ Définition d·une bioconversion : transformation spécifique mineure d·un composé mis dans le milieu de culture . non utilisé normalement par le microorganisme ‡ Exemples : hydroxylation de progestérone par diverses moisissures 62 .