Croissance industrielle des microorganismes

1

Raisons : Obtention d·une biomasse servant
- soit d·aliment (levures comme complément nutritionnel) - soit à la fabrication d·aliment (levures pour la fabrication de pain, de bière, de brioches, de vin«, moisissures pour fabrication de fromages, saké«, bactéries pour fabrication de yaourt, de choucroute«.)

Synthèse de molécules d·intérêt alimentaire, médical ou industriel
acide citrique, pénicilline, cyclosporine«..

Plan 1- Les diverses techniques de culture 2- Caractéristiques des souches utilisées 3- Des exemples de cultures industrielles

3

Les diverses techniques de culture 4 .1.

Culture en continu = culture en milieu renouvelé Remarque : existence d·un autre type de culture avec immobilisation des microorganismes 5 .Culture en discontinu = culture en batch .Deux grandes techniques de culture : .

Culture en discontinu = culture en batch = culture en milieu non renouvelé .1-1.

Matériel de culture : bioréacteur (fermenteur) 7 .1-1-1.

entrée d·air muni d·un filtre (ou tuyau d·échantillonnage) ‡ 2.pales pour agitation ‡ 8 ² tuyau de vidange 8 .manomètre (pour vérifier la pression interne) ‡ 6.enveloppe de refroidissement ‡ 3.1-1-1.Matériel de culture : bioréacteur ‡ 1.entrée d·eau de refroidissement ‡ 4.sortie de l·eau de refroidissement ‡ 7.moteur pour agitation ‡ 5.

Matériel de culture : bioréacteur 9 .1-1-1.

Un bioréacteur de production industrielle est un cuve accueillant de quelques centaines de L à plusieurs m3 10 .Un bioréacteur de laboratoire est une cuve accueillant de 1 à 5 L en général.

Principe de la culture en batch Culture en milieu clos dans une cuve de taille variable .ensemencée avec le microorganisme voulu .permettant la croissance du microorganisme jusqu·à épuisement des substances nutritives 11 .1-1-2.stérilisée .remplie d·un milieu de culture stérile .

de viande (protéines. d·ions minéraux . d'azote. ‡ Est souvent riche en glucose. en vitamines. 12 . ‡ Eléments divers pouvant être utilisés en industrie. résidus visqueux du raffinage de la betterave ou de la canne à sucre. de poisson (méthionine.1-1-3. en sulfates. en phosphates. et en oligoéléments. du lactosérum (protéines) ² des farines : végétales (maïs riche en amidon . en magnésium.Caractéristiques du milieu de culture ‡ Doit apporter au minimum une source d'énergie. riches en glucides. riz riche en amidon et en protéines . soja : riche en protéines). seuls ou associés (voir cours sur la nutrition): ² des mélasses. de carbone. lipides). phosphore). ² des liquides biologiques : du plasma. en peptones.

d· une régulation du pH car les réactions métaboliques microbiennes peuvent acidifier ou alcaliniser le milieu .d·une régulation de la pression partielle en O2 par insufflation d·air stérile 13 .Conditions d¶une bonne culture en bioréacteur Nécessité .1-1-3.d·une bonne agitation de la culture .d· une régulation de la température par refroidissement car les réactions métaboliques lors de la croissance sont généralement exothermiques .

Possibilité de recueil des produits synthétisés à tout moment.Pas de maintien de la phase exponentielle : donc biomasse et produits recueillis en quantités faibles : rendement limité .Existence d·une phase de latence impropre à la production .Préparation longue 14 .Avantages et inconvénients de la culture en batch Inconvénients Avantages .Difficulté de stériliser de grands volumes de milieu .Pas de perte de microorganismes durant la culture .Peu de risques de contamination de la culture . y compris durant la phase d e déclin .1-1-4.

1-2.Culture en discontinu = culture en milieu renouvelé .

16 .1-2-1.un soutirage d·une quantité équivalente de milieu de culture permettant ainsi l·élimination régulière des déchets.une addition régulière de milieu neuf stérile pour réapprovisionner en nutriments et maintenir le pH .Principe de la culture en milieu renouvelé Culture du microorganisme en vase non clos de façon à maintenir en permanence en phase exponentielle grâce à .

1-2-2.Matériels de culture ‡ Turbidostat ‡ Chemostat ou bactogène 17 .

Le turbidostat 18 .1-2-2-1.

Source lumineuse ‡ 6.1-2-2-1. ‡ 5.Schéma d·un turbidostat.Réservoir de milieu stérile 2 Valve de contrôle du flux de milieu neuf 3. 19 .sortie de milieu de culture 4 ² cellule photoélectrique reliée à la vanne d·entrée de milieu neuf ce qui permet via un système électronique une autorégulation du débit en fonction de la concentration de la biomasse mesurée en sortie.Le turbidostat ‡ ‡ ‡ ‡ 1.

‡ Si le trouble tend à trop diminuer il y a diminution d·apport de milieu neuf jusqu·à ce que la croissance ait permis de retrouver la valeur initiale 20 . La concentration du milieu de culture est maintenue constante par un contrôle turbidimétrique.Principe de fonctionnement du turbidostat ‡ Un turbidostat est un dispositif de culture en continu.1. ‡ Si le trouble tend à trop augmenter il y a une augmentation d·apport de milieu neuf qui dilue et ramène le trouble à sa valeur initiale.1-2-2.

1-2-2-2.Le chémostat 21 .

1-2-2-2- Le chémostat

22

1-2-2- 2- Principe de fonctionnement du chemostat ‡ Introduction de milieu neuf stérile dans la chambre de culture à la même vitesse que le milieu contenant les micro-organismes est éliminé (c·est le volume de milieu frais qui chasse par trop plein le volume de culture microbienne). ‡ Conséquences : ² stabilité de concentration en substances nutritives limitantes ² microorganismes soumis à une bonne aération, à une vigoureuse agitation et ayant toujours à leur disposition les éléments nutritifs dont ils ont besoin

Multiplication maintenue exponentielle à une vitesse spécifique de croissance rigoureusement contrôlée par l·apport de milieu neuf.

23

Avantages - Difficulté du contrôle du - Maintien de la phase système de régulation exponentielle : - Difficulté du maintien rendement optimal d·une culture pure - Stérilisation facile du - Pas de possibilité de milieu fabrication de produits - Récupération des libérés uniquement durant produits au fur et à la phase de déclin. mesure de leur production

1-2-3- Avantages et inconvénients de la culture en continu Inconvénients

24

Caractéristiques des souches utilisées 25 .2.

Démarche historique .2-1.

Découverte de la pénicilline Découverte« Staphylococcus aureus Penicillium 27 .

Il en déduit que le champignon produit une molécule inhibant (à distance) le Staphylocoque. Un jour il ensemence une boîte avec du S. il constate l·apparition d·un champignon (Penicillium notatum). Il remarque une zone d·inhibition autour du Staphylococcus. Penicillium 28 . Quelques jours plus tard. aureus et oublie la boite sur la paillasse.Découverte de la pénicilline Staphylococcus aureus Fleming recherchait des molécules inhibant les contaminants des cultures.

Une souche de Penicillium chrysogenum fut isolé en 1943 et utilisée à la place car davantage productrice novembre 2006 Cellule procaryote 29 .Penicillium notatum espèce historique de la découverte de la pénicilline produisait de faible quantité de pénicilline.

Introduction d·un DNA extérieur (ADN recombinant) 30 . sols««) .Fusion de cellules . suite à diverses mutations des clones ayant e meilleur rendement sans perte de leurs qualités .Amélioration des souches grâce au progrès de la biologie moléculaire .Recherche de la meilleure souche productrice à partir de constituants naturels (aliments..Sélection.

2-2.Caractéristiques des souches utilisées en production industrielle .

Bonne productivité (fort rendement = capacité à synthétiser des quantités appréciables de produit attendu) .Croissance rapide (de façon à donner très vite beaucoup de produit ou une biomasse importante) . dans le but d'améliorer ou de d'adapter la production) 32 .Innocuité (non pathogène) .Stabilité génétique (ne perdant pas ses caractéristiques après de nombreuses multiplications en bioréacteur et lors de sa conservation) .Améliorabilité (idéalement la souche doit pouvoir être capable d'évoluer sous la pression de l'industriel.Production industrielle nécessite une souche ayant les caractéristiques suivantes : .

3.Exemples de cultures et productions industrielles 33 .

3-1.Intérêt des cultures industrielles .

Intérêt dans le domaine ‡ agroalimentaire ‡ industriel autre 35 .

3-1-1.Cultures industrielles en agroalimentaire ‡ Obtention de levains servant à la fabrication d·aliments ‡ Obtention de levains servant d·aliments ‡ Obtention de molécules participant à la fabrication d·aliments 36 .

Obtention de levains servant à la fabrication d¶aliments ‡ Saccharomyces cerevisiae pour la panification et l·oenologie ‡ Saccharomyces cerevisiae et carlbergensis pour la fabrication de la bière ‡ Lactobacillus pour les produits laitiers (yaourts«) carnés (saucissons) ou végétaux (choucroute«. Penicillium camembertii« pour la fromagerie ‡ Aspergillus flavus pour certains produits asiatiques (saké) 37 .3-1-1.) ‡ Bacillus natto pour le natto ‡ Penicillium roquefortii.1.

Peuvent également être ajoutées au moût Saccharomyces : S.Evolution de la flore au cours de la vinification : S. cerevisiae Torulospora rosei Kloeckera apiculata . oviformis sont les espèces les plus alcoologènes 38 . S.Présence naturelle sur la peau des raisins avec des espèces variant selon l·environnement et les cépages . S.Cas du vin : Levures oenologiques . oviformis. ellipsoideus et S. ellipsoideus.

aldéhydes Puis combinaison de ces produits esters novembre 2006 Cellule procaryote 39 .Principale réaction de fermentation : Fructose et glucose éthanol + CO2 100 à 250 g/L 60 à 170 g/L (6 à 17%) Réactions additionnelles donnent des produits composants essentiels du bouquet » du vin . acides organiques dont acide malique glycérol. autres alcools.Sucres. succinique). acides organiques (lactique.

Lactobacillus .Leuconostoc 40 .Intérêt de la fermentation malolactique : réduire l·acidité du vin Acide malique acide lactique 2 à 5g/L < 1g/L COOH-CHOH-CH2-COOH COOH-CHOH-CH3 Réaction assurée par des bactéries après la fermentation alcoolique: .

41 .

Principaux micro-organismes ‡ fermentation alcoolique ‡ Kloeckera de diverses espèces ‡ Saccharomyces uvarum et S.Mêmes types de réactions que pour le vin .Degré d·alcool plus faible : 2 à 5% .Jus de pomme cidre .Cas du cidre . ellipsoideus ‡ fermentation malolactique ‡ Lactobacillus de diverses espèces 42 .

Cas de la bière .Aromatisation par le houblon .Grain d·orge germés bière .Production très importante de CO2 : mousse abondante ‡ Processus comparable pour l·obtention du saké : alcool de riz 43 .2 différences avec le vin et le cidre ² amidon (sucre complexe) au lieu de sucres simples dans la matière première ² 2 étapes ‡ ‡ ‡ ‡ ‡ hydrolyse enzymatique de l·amidon jus sucré : le brassage fermentation alcoolique du jus sucré Ajout nécessaire des micro-organismes après le brassage Saccharomyces cerevisiae : levure de bière Saccharomyces carlsbergensis .

Saccharomyces cerevisiae ² d·autres levures ou des bactéries peuvent être ajoutées (pains ‡ ‡ ‡ ‡ spéciaux) Amidon sucres simples alcool + CO2 Levée de la pâte grâce au CO2 Modification également du gluten et ainsi de latexture de la pâte Cuisson : ² l·alcool s·évapore ² les bulles de CO2 persistent 44 .Cas du pain ‡ Fermentation alcoolique également ‡ Levain ajouté à la pâte pendant le pétrissage : .

Cas du yaourt Les réactions chimiques : la fermentation homolactique lactique Lactose du lait acide lactique Aliment sucré » aliment acide De plus modification des protéines (caséine) par les mêmes microorganismes Aliment liquide aliment solide ‡ ‡ ‡ ‡ 45 .

de chèvre. de brebis par les microorganismes 46 .Cas des fromages Transformations complexes du lait de vache.

d·aldéhydes. diminution de l·acidité« 47 . lipolyse.Accéléré par pression + cuisson pâtes fermes cuites (ex: gruyère.6 : caséine gel + liquide (lactosérum = petit lait) ‡ Egouttage du caillé .Accéléré par pression pâtes pressées (ex: St Nectaire) . métabolisme des acides aminés. Comté) ‡ Salage et affinage (durée 1 à 8 mois) ² Ajout d·une flore spécifique à chaque fromage. Développement de la flore.Transformations microbiennes : Protéolyse.Lent : fromages frais (ex: fr. roquefort) . fr à pâte ferme (ex: Cantal) .Les 3 étapes de la fabrication des fromages ‡ Production du caillé ² Fermentation lactique par les bactéries lactiques(cf yaourts) + présure d·origine animale ou fungique Le lait coagule à pH < 4. .blanc) fromages à pâte molle (ex: camembert. de gaz. Munster. d·ammoniac. d·alcools. des composés soufrés«production d·arômes.

Exemples de micro-organismes participant à la formation des fromages 1. bleus« Geotrichum : camembert 48 .Des bactéries Bactéries lactiques : groupe prédominant: Streptococcus. camembert roquefort.Des levures Saccharomyces lactis 3.Des moisissures Penicillium : brie. Lactococcus Propionibacterium (gruyères beaucoup de gaz) 2. Lactobacillus Leuconostoc.

cornichons) ‡ Augmentation progressive du salage jusqu·à 16% (saumure) ‡ Fermentation lactique par Lactobacillus plantarum principalement Fabrication de sauce soja ‡ Fermentation d·un mélange salé de graines de soja et de blé par Aspergillus oryzae 49 Cas des produits végétaux . pickles (concombres.Fabrication de choucroute ‡ + NaCl 2 à 3% pour freiner le développement des Gram ² ‡ Fermentation lactique du chou par Leuconostoc et Lactobacillus (flore naturelle du chou) ‡ pH<2 Fabrication d·olives.

Fabrication de la choucroute Incision dans la fabrique Choucroute après le processus de fermentation Contrôle qualité après le conditionnement 50 .

soja 51 . cacao (fèves). manioc. café (grains). maïs.Cas des produits végétaux (suite) Fabrication de vinaigre Fermentation acétique par Jus de raisin vin vinaigre Sucres éthanol acide acétique Bactéries responsablers Acetobacter. Gluconobacter Fabrication de divers végétaux fermentés ‡ Thé noir (feuilles fermentées). igname.

Lactobacillus plantarum Fabrication de préparations asiatiques de poisson Fermentations lactiques ou fermentations complexes par bactéries et moisissures 52 . jambons fumés Fermentation lactique par Pediococcus cerevisiae .Cas des produits animaux Fabrication de saucissons.

Conclusion : intérêt des fermentations lors de la fabrication d·un aliment Fermentation lactique : acidification du milieu empêchant ainsi la multiplication d·autres microorganismes (conservateur). Autres fermentations : responsables des arômes et des goûts propres à chaque aliment 53 .

Obtention de levains servant d¶aliments ‡ Levures 54 .3-1-1.2.

d·acides organiques * acide citrique (conservateur) * acide lactique (conservateur) abondamment utilisé en industrie alimentaire (laitière notamment) produit par Lactobacillus delbrueckii à partir de lactosérum (plusieurs dizaines de milliers de tonnes par an) * acide glutamine (exhausteur de goût) . utilisés comme gélifiants alimentaires produits à partir de Leuconostoc. Xanthomonas par exemple cultivés sur amidons.3. 55 .Obtention de molécules utiles à la fabrication d¶aliments : quelques exemples Production .d·enzymes (ex : chymosine (présure). pectinase«) par des moisissures ou des bactéries .de dextrane. invertase.3-1-1. amylases. xanthane ou alginate.

Cultures industrielles utiles pour un domaine autre qu¶agroalimentaire Production ² de bioéthanol par des levures (Saccharomyces et / ou des bactéries) à partir de mélasses de canne ou de betterave à sucre ou de lactosérum utilisé dans l·industrie chimique ou pour les voitures ² de lipides utiles dans le domaine de la cosmétologie 56 .3-1-2.

molécules antitumorales. anticorps. enzymes«) ² d·antibiotiques ‡ Soit par des moisissures (pénicilline par Penicillium.Cultures industrielles utiles pour un domaine autre qu¶agroalimentaire ‡ Production ² de protéines d·importance médicale (hormones.) ² de molécules immunosuppressives 57 . céphalosporines par Cephalosporium) ‡ Soit par des bactéries (streptomycine par Streptomyces«.3-1-2..

Origine des molécules produites .3-2.

Molécules produites pouvant être ‡ Des métabolites primaires ‡ Des métabolites secondaires ‡ Des métabolites issus d·une bioconversion 59 .

60 .Molécules produites : métabolites primaires ‡ Définition : molécules fabriquées par le microorganisme pour ses besoins nutritifs et la croissance cellulaire.3-2-1. ‡ Exemples : ² enzymes. ‡ Moment du recueil : période de production = de la phase exponentielle de croissance. acides aminés« ² Alcools. acides organiques«.

protéines«. 61 .3-2-2.Molécules produites : métabolites secondaires ‡ Définition : molécules fabriquées après la phase de multiplication active. ‡ Exemples : antibiotiques. ‡ Moment du recueil : fin de la croissance : phases exponentielle et de déclin. sans doute suite à un stress microbien lors de la phase stationnaire.

3-2-3. non utilisé normalement par le microorganisme ‡ Exemples : hydroxylation de progestérone par diverses moisissures 62 .Molécules issus d¶une bioconversion d¶un substrat ‡ Définition d·une bioconversion : transformation spécifique mineure d·un composé mis dans le milieu de culture .

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