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LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA

PRÁCTICA NÚMERO 3

Facultad de Ciencias Médicas


Cátedra de Microbiología
Tercer Semestre

TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA

LA COLORACIÓN DE GRAM

REALIZADO POR: Sthefani Gualpa S.


REVISADO POR: Dr. Roberto Aguirre.
Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador

UNIDAD DE COMPETENCIA:
Identifica prácticamente los microorganismos patógenos con los
alteraciones orgánicas por ellos producidas: con responsabilidad y
orden.

ELEMENTO DE COMPETENCIA:
Comprende los pasos necesarios para realizar la tinción de Gram
además de reconocer los microorganismos Gram positivos y
negativos, al igual de la aplicabilidad clínica de la tinción con orden e
iniciativa.

NÚCLEOS DE CONOCIMIENTO:
Técnica de tinción – La Coloración Gram. Realización de tinción
por el método de Gram a partir de colonias. Visualizar al microscopio
de gérmenes Gram positivos y Gram negativos. Ver la utilidad clínica
de la coloración por el método de Gram.

ACTIVIDADES TRABAJO AUTÓNOMO:


Guía de prácticas descriptiva. Realización de una coloración Gram
individual y visualización en el microscopio.

CRITERIOS DE EVALUACIÓN:
Comprender la aplicabilidad clínica de la tinción Gram y la morfología
bacteriana en cuestión de distinción entre Gram positivas y Gram
negativas.

“Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja,


se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.
Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador

COLORACIÓN DE GRAM.

OBJETIVO:
✔ Comprender los pasos necesarios para realizar la tinción de
Gram
✔ Reconocer los microorganismos Gram positivos y negativos, al
igual de la aplicabilidad clínica de la tinción.

FUNDAMENTOS DE LA PRÁCTICA:

La tinción de Gram fue creada por Hans Christian Gram a fines del
siglo XIX y puede utilizarse para separar la mayoría de las especies
bacterianas en dos grandes grupos, a saber, las que captan el
colorante básico, cristal violeta (es decir las bacterias gran positivas),
y las que pierden ese colorante por el lavado con el decolorante
alcohol o acetona (es decir las bacterias gram negativas).

TECNICAS DE TINCION PARA LA MICROSCOPIA OPTICA.

Preparación del extendido:


Los métodos de tinción se utilizan en forma directa con las muestras
del paciente o se aplican a los preparados obtenidos a partir del
desarrollo de los microorganismos en cultivos.

Por lo general las muestras se colocan sobre el portaobjeto con un


hisopo que contiene el material del paciente o con una pipeta dentro
de la cual se encuentra la muestra de líquido aspirado (Fig 1). El
material que se va a teñir se coloca en forma de una gota (si la
muestra es liquida) o se rota (si la esta e un hisopo) sobre la
superficie de un portaobjeto limpio y seco.

“Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja,


se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.
Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador

Fig 1.- frotis obtenidos por rotación de un hisopo (A) y


Es deposito conlapipeta
importante evitar (B) de la muestra
contaminación del medios
de los paciente de
sobre un
cultivo;
por lo
tanto, una vez que el hisopo toco la superficie de un portaobjetos no
estéril no debe utilizarse para la inoculación posterior de medios de
cultivo.

Para la tinción de los microorganismos que crecen en cultivos puede


utilizarse una aguja estéril para transferir una pequeña cantidad del
cultivo desarrollado en un medio solido a la superficie del
portaobjetos. Este material se emulsiona en una gota de agua o
solución salina 0.9% estéril sobre el portaobjeto. En caso de
cantidades pequeñas que puedan perderse incluso en una gota de
solución fisiológica se puede utilizar n aplicador de madera estéril
para obtener el material; luego este material se frota directamente
sobre el portaobjetos que se va a teñir se deja secar y se fija al
portaobjeto mediante su colocación sobre una platina caliente (a
60⁰C) durante por lo menos 10 minutos o cubriéndolo con metanol al
95% durante 1 minuto.

Para examinar los microorganismos que crecen en medio líquido se


aplica una muestra aspirada del caldo de cultivo sobre el
portaobjetos, se seca y se fija antes de la tinción.

La preparación de los frotis varía de acuerdo con el tipo de muestra


que se va a procesar y con los métodos de tinción que se van a
utilizar. No obstante la regla general para la preparación de frotis es
que debe aplicarse una cantidad de material suficiente sobre el
portaobjeto para maximizar las posibilidades de detectar y diferenciar
los microorganismos. Por último, el método de tinción que se debe
utilizar esta determinado por el tipo de microorganismo buscado.

TINCION DE GRAM

“Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja,


se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.
Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador
La tinción de gram es la técnica principal utilizada para el examen
microscópico de las bacterias. Casi todas las bacterias de importancia
clínica pueden detectarse con este método.

Las únicas excepciones son:


Los microorganismos que se hallan casi con exclusividad dentro
de las células huésped (p. ej., clamidias).

Los que carecen de pared celular (p. ej., micoplasmas y


ureoplasmas).

Los que tienen un tamaño insuficiente para ser observados por


el microscopio óptico (p. ej., espiroquetas).

Los que tienen una diferente composición en su pared y no


captan los colorantes (p. ej., mycobacterias).

MATERIALES:
✔ Portaobjetos
✔ Cubreobjetos
✔ Asas de inoculación
✔ Mechero Bunsen
✔ Pipetas
✔ Hisopos
✔ Colorantes

PROCEDIMIENTO:
El procedimiento clásico de la tinción de Gram consiste en fijar el
material orgánico a la superficie del portaobjetos del microscopio ya
por calor o con metanol.

Después de la fijación el primer paso en la tinción de Gram es la


aplicación del colorante principal cristal violeta (metil rosanilina o
violeta de genciana). Luego se aplica un mordiente, el yodo de Gram
(lugol), para que el colorante alcalino se una a la pared celular a
través de enlaces químicos. La decoloración distingue las bacterias
grampositivas de las gramnegativas. Después de la decoloración los
microorganismos aparecen como grampositivos retienen el cristal
violeta y los gramnegativos lo pierden. El agregado colorante de
contraste safranina (Contratinción) teñirá de color rosa o rojo las
bacterias gramnegativas claras.

“Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja,


se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.
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PRINCIPIO:
Las diferencias de composición de las paredes de las bacterias
grampositivas, que contienen una gruesa capa de peptidoglucano con
numerosos enlaces cruzados de acido teicoico, y las paredes de las
células gramnegativas, en las que la capa de peptidoglucano es más
delgada, explican las diferencias de la tinción de Gram entre estos
dos grupos principales de bacterias es probable que la gran cantidad
de enlaces cruzados de acido teicoico de los microorganismos gram
positivos contribuya a su capacidad de resistir la decoloración con
alcohol.(Fig. 2) Si bien el colorante de contraste puede ser captado
por los microorganismos gram positivos, su color violeta no se altera.

Fig. 2.- Estructura de paredes bacterianas GRAM(+) y

*Los microorganismos gram positivos que perdieron la integridad de


la pared celular debido al tratamiento antibiótico, al envejecimiento o
a la acción de enzimas autolíticas permiten que el violeta se elimine
durante la decoloración y pueden aparecer como gram variables, con
algunas células coloreadas de rosa y otras de violeta.

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se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.
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Sin embargo, con propósitos de identificación, estos microorganismos


se consideran gram positivos verdaderos.
Por otro lado, las bacterias gram negativas raras veces (o nunca)
retienen el cristal violeta si el procedimiento de tinción se ha
realizado de manera apropiada.

Las células huésped, como los eritrocitos y los leucocitos (fagocitos),


pierden el cristal violeta con la decoloración y aparecen de color rosa
en los frotis preparados y teñidos de manera correcta.

OBSERVACION DE LA TINCION DE GRAM.

Una vez teñido el frotis se observa con el objetivo de inmersión


(1.000x). Cuando el material orgánico se tiñe con Gram (p. ej., frotis
directo) el portaobjetos se evalúa en busca de la presencia de células
bacterianas así como de las reacciones Gram, (Fig. 3) las morfologías
(p. ej., cocos y bacilos) y la disposición (p. ej., cadenas pares,
racimos) de células observadas (Fig.4). Esta información a menudo
proporciona un diagnostico preliminar con respecto a los agentes
infecciosos y con frecuencia se utiliza para el tratamiento directo
inicial del paciente.

Fig.3.- Reacciones Gram.

“Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja,


se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.
Cátedra de Microbiología – Universidad Central del Ecuador

Fig 4. Clasificación de las bacterias de acuerdo a su morfología

Si bien la evaluación de la tinción de Gram del frotis directo se utiliza


de rutina como una ayuda en el diagnostico de las infecciones
bacterianas, es posible que se detecten –y no deben ignorarse-
hallazgos inesperados pero importantes de otras etiologías
infecciosas. Por ejemplo, las células y los elementos micóticos por lo
general se tiñen como grampositivos pero pueden captar el cristal
violeta de manera deficiente y aparecer como gram variables (p. ej.,
rosa y violeta) o gram negativos. Dado que con la tinción de Gram
pueden detectarse otros agentes infecciosos además de las bacterias,
todas las células o las estructuras inusuales observadas en el frotis
deben evaluarse de nuevo antes de descartarse como no
importantes.

TINCIÓN DE GRAM DE LAS BACTERIAS QUE CRECEN EN


CULTIVOS. (Frotis indirectos).

La tinción de Gram también desempeña un papel clave en la


identificación de las bacterias en crecimiento en cultivos. De manera
similar a los frotis directos, en los preparados a partir del crecimiento
bacteriano se evalúan las reacciones de Gram, las morfologías y las

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se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.
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disposiciones de las células bacterianas. Si se va a teñir más de una
muestra en el mismo portaobjeto, puede utilizarse un lápiz de cera
para crear divisiones.es útil dibujar una especie de “mapa” de ese
portaobjetos de modo que los resultados de las diferentes tinciones
de Gram puedan registrarse de manera organizada. Los resultados
del examen del frotis se utilizaran para determinar comprobaciones
ulteriores para la identificación y la caracterización de los
microorganismos aislados a partir de la muestra del paciente.
.

BIBLIOGRAFÍA
1.Koneman, E. Diagnostico microbiológico, Editorial médico
panamericana,
2.Jawetz Ernest, Microbiología médica, 17ª edición en español, Manual
moderno, México, México 2002.
3.Bailey & Scott, Diagnóstico microbiológico, 11ª edición, Editorial
Panamericana, Buenos Aires – Argentina, 2 004.
4. Salazar Wilson, Guías de práctica de Laboratorio de Microbiología,
Depart. de publicaciones de la Facultad de Ciencias Médicas, Quito –
Ecuador, 2007.

“Aprender es como remar contra corriente: en cuanto se deja,


se retrocede”. Edward Benjamin Britten (1913-1976) Compositor británico.