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3B-2

GUÍA DE PRÁCTICAS

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MEDICA

ESPECIALIDAD: LABORATORIO CLINICO Y ANATOMIA PATOLOGICA

INMUNOLOGIA I

Autor: Lic. CARLOS ALBERTO BALTODANO HONORES

AGRADECIMIENTOS: William Cornejo Medina

Pilar Alva Betalleluz

Víctor Raúl Arrunátegui Correa

F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

INTRODUCCIÓN

Los animales superiores son atacados por microorganismos y partículas extrañas. Pero poseen
sistemas defensivos frente a tales patógenos; dichos mecanismos tienden a distinguir lo propio de lo
extraño

La inmunidad es un conjunto de mecanismos de defensa de los animales frente a estos agentes

externos extraños. Se adquiere al nacer, y va madurando y consolidándose durante los primeros años
de vida.

La Inmunología es la ciencia biológica que estudia todos los mecanismos fisiológicos de defensa de la
integridad biológica del organismo. Dichos mecanismos consisten esencialmente en la identificación
de lo extraño y su destrucción. La inmunología también estudia los factores inespecíficos que
coadyuvan a los anteriores en sus efectos finales.

La respuesta inmune frente a los agentes extraños es la actuación integrada de un gran número de
mecanismos heterogéneos de defensa contra sustancias y agentes extraños. En general, a las
sustancias extrañas se las denomina como antígenos, y son ellos los que desencadenan en el
organismo una serie de eventos celulares que provocan la producción\n de los mecanismos de
defensa. Como veremos, los mecanismos de respuesta tienen una componente celular y otra
molecular.

Por lo mencionado, un alumno debe de ser capaz al finalizar la asignatura de comprender el

significado de las defensas orgánicas del ser humano, en especial del sistema inmune, su
organización, la dualidad de su respuesta y sus mecanismos celulares y moleculares.

Otro objetivo fundamental es que los alumnos, en el desarrollo de su ejercicio profesional futuro,
puedan aplicar estos conceptos generales al diagnóstico inmunológico de las enfermedades
infecciosas y parasitarias de los seres humanos, y que cuenten con los conocimientos suficientes para
permitir su solución.
La parte práctica del curso se desarrolla en dos grupos de práctica (aproximadamente 10 estudiantes)
en el laboratorio de Inmunología de la facultad de Ciencias de la Salud
Hay un total de 14 prácticas a desarrollar a lo largo del semestre y se cuenta esta una guía de
laboratorio que los estudiantes deben manejar de forma individual para orientar cada práctica.
Las prácticas de laboratorio buscan establecer una relación entre los conceptos teóricos y las
herramientas diagnósticas en inmunología, disponibles en el laboratorio con el fin de correlacionar la
teoría con la interpretación clínica del laboratorio.

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I. PRÁCTICA No. 1 Construcción y Elaboración de grupos de prácticas. Generalidades técnicas en
inmunología

1.1 Marco teórico

La inmunología es una rama amplia de las ciencias biomédicas que se ocupa del estudio
del sistema inmunitario en todos los organismos, entendiendo como tal al conjunto de
órganos, tejidos y células que en los vertebrados tienen como función biológica el
reconocer elementos extraños o ajenos dando una respuesta (respuesta inmunológica).
La ciencia trata, entre otras cosas, el funcionamiento fisiológico del sistema
inmunitario tanto en estadios de salud como de enfermedad; las alteraciones en las
funciones del sistema inmunitario en los desórdenes inmunológicos (enfermedades auto
inmunológicos, hipersensibilidades, deficiencia inmunológica, rechazo a transplante); las
características físicas, químicas y fisiológicas de los componentes del sistema
inmunológico in vitro, in situ, e in vivo. La inmunología tiene varias aplicaciones en
numerosas disciplinas científicas.

1.2 Competencias

Conocimiento de Normas, organización y manejo de aparatos en el laboratorio de

Inmunología. Conocimientos previos indispensables en Inmunología.

1.3 Materiales y equipos

Pizarra

Material impreso

1.4 Procedimiento

Breve explicación del curso a desarrollar, brindando a los alumnos los diferentes
conceptos prácticos sobre los diferentes métodos a usar durante el desarrollo del curso.

Breve repaso de las normas de seguridad, Manejo de micro pipetas, preparación de

diluciones, obtención de un suero a partir de una muestra de sangre extraída de un
animal

1.5 Resultados

Inventario de los equipos de laboratorio, formación de los grupos de práctica

1.6 Cuestionario

Que impresión tuvo del laboratorio de prácticas?

Ud cree que necesita más equipos? Cuáles?

1.7 Fuentes de información

http://medicinausach.iespana.es/fisiopat/inmgen.htm

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II. PRACTICA Nº 2 Inoculación de animales de Laboratorio
2.1 Marco Teórico
El sistema inmune de los seres vertebrados solo puede ser evidenciado cuando se le
coloca sustancias extrañas a EL que permitan el reconocimiento y desencadenar una
respuesta inmune contra el antígeno que lo ha desencadenado.
Por su naturaleza química los antígenos pueden ser proteínas, carbohidratos, ácidos
nucleídos y lípidos. La capacidad inmunógena de los antígenos se debe a:
- ser reconocida por CMH de clase II y ser reconocido por receptores de membranas de los
linfocitos
- Debe ser metabolizable
- Debe de tener epítopos capaz de ser reconocidos por los anticuerpos de los L B.
Estas características son las tres propiedades químicas intrínsecas que se necesitan para
que una molécula estimule una buena respuesta de anticuerpos. Sin embargo existen
otros factores que pueden intervenir y modular la respuesta inmune:
- La dosis
- El estado del inmunógeno
- El uso de adyuvantes
- Vía de inoculación

Se inocularán antígenos a conejos a fin de obtener anticuerpos circulantes. Los mejores

resultados se logran al provocar al animal una respuesta inmune humoral secundaria,
inoculando el antígeno en más de una dosis, es decir, se debe hiperinmunizar al conejo.
Los anticuerpos circulantes tienen un alto titulo de Ig G específica, son de alta afinidad y
de muy elevada diversidad.
Los antígenos a inocularse pueden ser solubles o particulados. Los solubles se emulsionan
con adyuvante y los particulados se inoculan sin adyuvante.

2.2 Competencias

• Reconocer las formas de inoculación en los animales de laboratorio

• Reconocer los productos de inoculación
• Obtener muestras del animal de laboratorio con cantidad suficiente de anticuerpos

2.3 Materiales y equipos

-Eritrocitos: las suspensiones de eritrocitos son usados con frecuencia como agentes
inmunizantes en la preparación de sueros para tipificar sanguínea. Solo usar sangre fresca, no
contaminada.
- Sangre humana del tipo “O” extraídos con ACD o citrato de sodio al 10%, en una relación de
10 volumenes de sangre por 1 volumen del anticoagulante.
- Un conejo en buen estado de nutrición (conejos Nueva Zelanda de 2-2.5 Kg de peso
-Suero fisiológico tamponado
-Gradilla y tubos de prueba de 13x100
-Jeringas y agujas descartables de 3 ml x aguja 21, 23, y 26”.
-Alcohol yodado. Algodón.

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 2.4 Procedimiento

Inocular conejos con sangre total por vía intracutanea seguida de glóbulos rojos al 20% en
solución salina 0.85% con sulfato de magnesio por vía endovenosa; se obtienen títulos más
altos de anticuerpos.
-Retirar al conejo de su jaula y colocarlo en la mesa de trabajo
-Cargar la suspensión en la jeringa según protocolo
-Inmovilizar al conejo. Sujetar la oreja del animal y frotar la región marginal con algodón
embebido en alcohol.
-Insertar la aguja en la vena. Desplazar el embolo hacia arriba. Si aparece sangre en la
jeringa, inocular el antígeno lentamente.
-Al terminar la inoculación, esperar unos segundos y después retire la aguja. Colocar un trozo
de algodón sobre el sitio de inoculación y esperar hasta que se coagule la sangre.
Se usan las dosificaciones según tabla adjunta, si el titulo no satisface se inocula nuevamente
dosis E.V.
Día Dosis Vía Material inoculado
1 0.5 I.D Sangre total Grupo “O”
3 1.0 I.D “
5 1.5 I.D “
7 2.0 I.D “
9 2.5 I.D “
12 1.0 E.V G.R.”O” al 20% en sol.
15 1.0 E.V Salina 0.85% con sulfato
18 1.0 E.V Magnesio al 0.01%
21 1.0 E.V
23 1.0 E.V
25 Sangría de prueba

2.5 Resultados

Una buena inoculación se evidencia por la ausencia de edema en la zona de inoculación.

Al final del proceso de inoculación se tendrá un conejo hiperinmunizado, con una
concentración alta de anticuerpos.

2.6 Cuestionario
- Animales frecuentes de inoculación?
- Vía de inoculación más frecuente?
- Cuales son las Sustancias que producen mejor respuesta inmune?

2.7 Fuentes de información

- Vaitukaitis JL. Productión of antisera with small doses of immunogen: multiple intradermal
injections. Methods Enzymol 73: 46-52, 1981.
- Pillot, J. y Peltier, Q. Examenes de Laboratorio. Técnicas en Inmunología. Editorial Jims,
Barcelona, 1975.
- Cornejo W., Alva P. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. 2ºed. UNMSM, 2007.

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III. PRÁCTICA No. 3 Identificación de órganos linfoides

3.1 Marco teórico

Órganos Linfáticos.

Órganos primarios
Como órganos primarios tenemos al timo, donde maduran los linfocitos T, y la médula
Ósea, sitio de linfopoyesis y maduración de los linfocitos B. En etapas tempranas del
Desarrollo fetal, el hígado asume estas funciones, aunque paulatinamente se ve
Substituido por la médula el cual es el otro órgano primario que por su importancia en la
Hematopoyesis será tratada en capítulo correspondiente a este tejido conjuntivo
Especializado.

Timo.
Es un órgano localizado en el tórax, por encima del corazón.
Este órgano está lleno de células linfoides denominadas timocitos, distribuidas en una
corteza de gran densidad celular y una médula de menor densidad celular.
Las células no linfoides del estroma expresan en sus superficies moléculas MHC de tipo I
y/o II, y participan en la maduración y selección de los timocitos hacia células T maduras.
Desarrollo y evolución del timo.
En humanos, al nacer, el timo pesa 10-15 g, alcanza su máximo desarrollo en la
adolescencia, época en la que llega a pesar 30-40 g, y va involucionando con la edad, de
modo que en la vejez (> 60 años) pesa entre 10 -15 g. Por lo tanto, en la vida adulta, la
producción de linfocitos T en el timo decae bastante, aunque siempre existe una actividad
residual.
En la fase adulta, cuando el timo ha involucionado, sigue habiendo maduración de
linfocitos T en otros lugares, principalmente en el epitelio intestinal, donde se produce
linfopoyesis de célula T que permanecen en el epitelio intestinal o migran a la lámina
propia.

Medula ósea.
Durante mucho tiempo no fue tenido en cuenta, el papel que desempeña la medula ósea
en la respuesta secundaria. Durante esta respuesta, los órganos secundarios
"clásicos" responden rápidamente, pero durante poco tiempo. En cambio, la médula ósea
con una respuesta lenta pero más prologada de producción de anticuerpo llega a ser
responsable de aproximadamente el 80 % de la respuesta secundaria. Es por esta razón que
debe de incluirse dentro de los órganos secundarios aunque también juegue un papel
fundamental como órgano primario, en el suministro de las células que intervienen en la
defensa del organismo.

Órganos secundarios
Los órganos secundarios están representados por el bazo, el cual procesa los antígenos que
transitan en la sangre, los ganglios linfáticos que lo hacen de los existentes en los tejidos y
por último tenemos el tejido linfoide asociado a mucosa, que se encarga de realizar esta
función en las mucosas de los órganos como el pulmón, las vías digestivas y el tracto
urinario. También se debe de tener en cuenta que en la respuesta secundaria la médula
ósea se comporta como un órgano secundario.

Bazo.
El bazo es el mayor de los órganos linfoides ubicado dentro de la cavidad abdominal.
Varia mucho su volumen de acuerdo a con la cantidad de de sangre que retenga en su
interior y según la actividad hematopoyética que realice. Su color purpúreo se debe a la
gran cantidad de sangre que contiene. Es una víscera blanda y muy friable, lo cual tiene
importancia para los traumatismos abdominales.

Ganglios linfáticos.

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 Es la primera estructura linfoide organizada que se encuentra un antígeno que proceda de
los espacios tisulares y están especialmente diseñados para retener antígenos, que vienen
en la linfa la cual al circular por su interior pone en contacto a los antígenos con los
linfocitos y las otras células inmunocompetentes, responsables de iniciar la respuesta
inmune específica.
En este órgano se llevar a cabo una respuesta inmunológica específica, frente a la entrada
de un antígeno al organismo y se debe tener en cuenta que estos eventos acontecen de
manera dinámica cambiando la morfología del ganglio en dependencia de la actividad
funcional en que se encuentra en el momento que se extrae y procesa para su observación.

3.2 Competencias

Conocer los órganos linfoides de ratones que tienen semejanza con los órganos linfoides de
los seres humanos.

3.3. Materiales y equipos

- Ratones adultos, no importa el sexo.
- Material de disección: Guantes, tijeras, bisturí, pinzas, jeringas y agujas para insulina.
- Vaso de precipitado de 1000 cc
- Papel aluminio
- Tubo de 50 ml con tapa.
- Tubos de ensayo de 5 ml y gradilla.
- Pipetas de 5-50 µl y 200-1000 µl y puntas.
- Contenedor para material cortante.
- Placas de petri
- Etanol 70%
- Eter dietílico anestésico
- Tampón PBS pH 7.2
- Suero fisiológico
- Papel toalla
- Pipeta pasteur
3.4. Procedimiento
En inmunología humana es frecuente el empleo de animales de laboratorio. En esta práctica
se aprenderán las técnicas básicas de manipulación de ratones que pueden tener utilidad en
Inmunología. Se llevarán a cabo extracción de órganos linfoides y aislamiento de células a
partir de estos tejidos sólidos.

Los ratones deben ser manipulados con cuidado pero con decisión para evitar estresar al
animal, lo que puede resultar en mordeduras o arañazos al experimentador y en daños
innecesarios al animal. Debe tenerse en cuenta que los ratones son más agresivos que las ratas
y tenderán a morder instintivamente.

Extracción de órganos linfoides (bazo, ganglios y timo)

1. Sacrificar al animal por dislocación cervical: Colocar un mango de bisturí detrás de las
orejas, cruzando la nuca, tirar del rabo hacia atrás con la otra mano mientras se presiona
hacia abajo en la nuca.
2. Colocarlo de espaldas sobre un papel secante.
3. Esterilizar con alcohol la zona de la línea media.
4. Cortar por la línea media con tijeras.
5. Retirar la piel con los dedos.

Bazo:

6. Girar al animal para exponer su flanco izquierdo.

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 7. Abrir el peritoneo con una incisión de 2-3 cm mediante unas tijeras.
8. Localizar el bazo y extraerlo con unas pinzas, cortando el tejido conectivo.
9. Colocar el bazo en una placa petri con 1 ml de PBS.

Ganglios:

10. Diseccionar la región axilar y localizar algún ganglio linfático.

11. Extraer, depositar en una placa petri y limpiar de tejido graso y conectivo. Añadir 1ml
de PBS.

Timo:

12. Tumbar al ratón de espaldas.

13. Abrir el tórax mediante una incisión, con tijeras, desde el xifoides hasta el cuello.
14. Abrir las costillas con las pinzas.
15. Extraer el timo con las pinzas y colocar en una placa petri con 1ml de PBS.

3.5 Resultados

3.6 Cuestionario
3.7 Fuentes de información
- Stevens A, Lowe J. Texto y atlas de histología. Mosby/Doyma Libros. Barcelona-España.
1992.
- Cornejo W., Alva P. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. 2ºed. UNMSM, 2007.
http://www.med.uva.es/~pingo/Inmunologia/Apuntes/tema2.htm

IV. PRÁCTICA No.4 Fagocitosis

4.1 Marco Teórico.
La fagocitosis (del griego phagein, 'comer' y kytos, 'célula'), es un tipo de endocitosis por el cual
algunas células (neutrófilos y macrófagos) rodean con su membrana citoplasmática a un antígeno
y lo introducen al interior celular. La unión se realiza mediante la emisión de pseudopodos por
parte del macrófago, englobando al microorganismo. Dando lugar al fagosoma. En la posterior

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 destrucción del microorganismo intervienen los lisosomas. Esta destrucción puede llevarse a
cabo: a) Por mecanismos dependientes de oxígeno. Al activarse rutas metabólicas que consumen
oxigeno. la activación de esta ruta produce la liberación de radicales que son toxicos para los
microorganismos. b) Mecanismos independientes del oxigeno. Mediante la liberación de enzimas
tipo hidrolítico que destruirán los microorganismos.
Para que se pueda producir la fagocitosis es necesario que el macrófago se una al
microorganismo y activarse para poder emitir el pseudópodo y englobarlo. En esta activación
interviene la ruta alternativa del complemento.
En Inmunología las pruebas de función fago citica pueden ser in vitro o in vivo. Las pruebas in
vitro miden la capacidad de los leucocitos PMN y de los macrófagos de ingerir partículas o
bacterias. Las pruebas mas comúnmente usadas son el ensayo microbicida, la eritrofagocitosis y
la prueba de reducción del azul de tetrazolio.

4.2 Competencias
- Reconocer la fagocitosis como parte del sistema inmune innato
- Conocer la importancia de los PMN como primera línea de defensa del huésped

4.3 Materiales y equipos

-Ratones adultos
-Eritrocitos de carnero al 20%
-Solución Hanks, con anticoagulante
-Colorante para células, Giemsa o Leishman
-Agua tamponada
-Metanol
-Cloroformo
-Alcohol etílico al 70%
-Placas petri con laminillas
-Pipeta pasteur con tetina
Jeringa de 1 ml con aguja Nº 25
-Pinzas y tijeras
-Tabla de disección y alfileres
-Algodón
-Papel filtro
-Microscopio y aceite de inmersión

4.4 Procedimientos
Media hora antes de la práctica, los ratones habrá recibido 0.1 ml de eritrocitos por vía
intraperitoneal.
- Inocular 1 ml de solución Hanks al ratón, por vía intraperitoneal.
- Después de 10 minutos, sacrificar al animal con cloroformo en una cámara mortuoria.
Colocar al ratón en posición ventral sobre una tabla de disección, mojar la piel del animal con
alcohol y con la ayuda de una pinza levantar la piel y hacer una incisión en la línea ventral, sin
romper la pared muscular.
-Retirar la piel traccionando con los dedos índice y pulgar de ambos manos en direcciones
opuestas.
- Pasar un algodón impregnado en alcohol por el musculo abdominal. Introducir la aguja hacia
un costado de la cavidad abdominal, formando una especie de bolsa con el líquido peritoneal.
El bisel de la aguja debe de estar hacia el interior de la cavidad peritoneal.
- Extraer el líquido peritoneal y colocarlo sobre las laminillas de la placa petri. Si es
necesario, lavar la cavidad peritoneal con 0.1 ml de solución Hanks y retirar mas células,
depositándolas en laminillas no usadas.

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 - Incubar las células a 37ºC durante 1-2 horas para favorecer la adherencia de los macrófagos
al vidrio de la laminilla.
- Retirar las laminillas d3e la placa petri y lavarlas a chorro directo con la solución de hanks.
Repetir 2-3 veces. Luego, colocar las laminillas en posición casi vertical, sobre papel filtro,
para secarlas. En todo momento se debe saber sobre cual superficie se han adherido los
macrófagos.
-Introducir la laminilla en la placa con colorante y dejar colorear por 1-5 minutos.
-Para la observación bajo el microscopio de luz, montar la preparación con una gota de
glicerina entre lámina y laminilla.

4.5 Resultados
Se considera fagocitosis positiva cuando al menos un eritrocito fue incorporado al citoplasma
del macrófago.

4.6 Cuestionario
- Qué importancia tiene la fagocitosis?
- La fagocitosis solo se da en humanos?
- La fagocitosis pertenece a la inmunidad innata o adquirida?

4.7 Fuentes de información

- Stuart a. E. Techniques for the study of phagocytes. Handbook of experimental immunology,
Weir D M (ed), Blackwell Scientific Publications, Cap. 32, 1967.
- Janses WTM y col. Comparison of a classical phagocytosis assay and a flow citometry assay for
assessment of the phagocytic capacity of sera from adults vaccinated with pneumococcal. Clin
Diag Lab Inmunology 2001; 8:245-250.
- Cornejo W., Alva P. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. 2ºed. UNMSM, 2007.

V. PRÁCTICA Nº5 CUANTIFICACIÓN DE ANTICUERPOS POR ELISA

5.1 Marco Teórico
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas) es
una técnica de inmunoensayo en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo
enlazado a una enzima capaz de generar un producto detectable como cambio de color o algún otro
tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costes del ensayo, nos encontramos con que existe un
anticuerpo primario que reconoce al antígeno y que a su vez es reconocido por un antígeno
secundario que lleva enlazado la enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes
permite medir indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para determinar si un anticuerpo particular está presente en la
muestra de sangre de un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un gran
número de variables, tales como selección de reactivo, temperatura, medición de volumen y tiempo,
que si no se ajustan correctamente puede afectar a los pasos sucesivos y al resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente
tiene una infección o una enfermedad autoinmune. Un resultado positivo indica que el anticuerpo está
en la sangre e implica que la persona ha contraído una determinada enfermedad.

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Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple
en su realice, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la fracción retenida y la
fracción libre.
Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la
cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de
anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc.

5.2 Competencias
• Conocer los principios básicos de cuantificación de anticuerpos mediante el uso
de la técnica de ELISA.
• Conocer la utilidad de la prueba de ELISA en la detección de anticuerpos.
5.3 Materiales y equipos
Lector de ELISA
Kit para ELISA
Placas de ELISA
Micropipetas
Puntas
5.4 Procedimiento
1. Cubrir la placa de ELISA con el antigeno diluido e incubar durante la noche en 4c.
2. Lave 4 veces los pocillos con PBS-Tween 20.
3. Bloquee el atascamiento no específico usando el 1% BSA/PBS e incube por
30 minutes en la temperatura ambiente.
4. Lave la placa. Agregue los estándares y 100uL de muestras diluidas a los pocillos
apropiados.
5. Incube por 1 hora a temperatura ambiente.
6. Agregue la dilución apropiada 100 ul del anticuerpo secundario conjugada con la
fosfatasa alcalina (AP) o la peroxidasa (HRP) e incube por 30 minutos.
7. Agregue 100uL del substrato a cada pocillo e incube a temperatura ambiente por 30
minutos.
8. Leer las placas en un lector de ELISA.

5.5 Resultados

(A) Un ELISA indirecto, la producción de color indica la cantidad de un anticuerpo para

un antígeno especifico

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 (B) En ELISA sandwich, la producción de color indica la cantidad de antígeno

5.6 Cuestionario
Los anticuerpos detectados por la prueba de ELISA son de tipo G o M?
La prueba de Elñisa solo sirve para detectar anticuerpos?
El método ELISA es difícil de realizar en los diferentes laboratorios de salud pública?

5.7 Fuentes de información

o Abbas AK y Lichtman AW (2004) Inmunología celular y molecular. 5ª ed., McGraw-
Hill – Interamericana, Madrid.
Janeway CA Jr, Travers P, Walport M y Shlomchik M (2003) Inmunobiología. El
sistema inmune en condiciones de salud y enfermedad. 5ª ed., Masson, Barcelona.
o R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H. Freeman
and Company, 2000), p. 162.]
o Cornejo W., Alva P. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. 2ºed. UNMSM,
2007.
http://en.wikipedia.org/wiki/ELISA

VI. PRÁCTICA No. 6 Sangría de animales de Laboratorio

6.1 Marco teórico
El en área de la Inmunología encontramos una gran variedad de procedimientos para lograr
diversos objetivos.
Para cada animal de experimentación se utilizan técnicas de sangría diferentes, teniendo en
cuenta que en algunas se quiere mantener vivo al animal(sangría parcial o de prueba), mientras
que en otras ocasiones se extrae el máximo de sangre posible(sangría total o en blanco).

Después de lograr la sangre del animal mediante técnica adecuada de punción, se procede a la
separación de la muestra y la obtención de los antisueros que gracias a ellos es que podernos
contar hoy en día con las vacunas, gran avance que en tiempos pasados no se tenía, lo cual
era causante de muchas muertes por enfermedades que podían ser tratadas o evitadas con
solo una inyección de este antisuero, claro y especifico para determinada enfermedad.
Incluso hoy en día estamos en continua lucha por seguir encontrando mas opciones de cura
para otras enfermedades que nos afligen.

Esta obtención de antisuero es gracias a un procedimiento que se les realiza a las bacterias o
agente infeccioso causante de la enfermedad.
En este proceso tornarnos el antígeno bacteriano ya sea cápsulas, flagelos, proteínas entre
otros, y les realizamos una serie de pruebas en las cuales el producto final es el antisuero.
Para verificar la eficacia de estos, necesitarnos un animal de prueba al cual se le llevara un
seguimiento de la acción del antisuero, pero para eso necesitamos saber las técnicas
adecuadas de inoculación para estos animales y la diferencia entre cada técnica para tener una
acción más confiable del producto final que es el antisuero.

6.2 Competencias
• Adquirir conocimientos sobre las técnicas a utilizar en el laboratorio de
Inmunología y saber con que tipos de animales podemos realizar estas
técnicas.
• Aprender las bases sobre cómo se obtiene un antisuero
• Obtener un conocimiento previo teórico sobre las áreas donde se deben
realizar las punciones en los animales.

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 6.3 Materiales y equipo
En los conejos inmunizados en las prácticas anteriores se les harán sangrías para detectar la
presencia de anticuerpos circulantes; luego, si se decide que el nivel de anticuerpos es el
adecuado, se procederá a la sangría total.
- Conejos inmunizados
- Tubos de 13x100 mm
- Jeringas de vidrio de 20-50 ml
-Agujas de 18x1 ½
- Agujas de 20x1
-Algodón y alcohol

6.4 Procedimiento
SANGRIA DE PRUEBA
- Desinfectar el area donde se localiza la vena central de la oreja, dejar evaporar el alcohol y
luego introducir la aguja en la vena; la evidencia que la aguja está en la vena es el flujo
continuo de sangre.
- Colectar 3 ml de sangre en un tubo de prueba.
- Para terminar la sangrí, colocar un trozo de algodón sobre el area de sangría y extraer la
aguja. Presionar ligeramente sobre la vena hasta que coagule la sangre.
- Dejar coagular la sangre obtenida.

SANGRÍA TOTAL
- Agitar al animal, colocarlo en posición ventral sobre una superficie lisa horizontal, sujetándolo
por las patas anteriores y posteriores.
- Palpar los latidos del corazón y desinfectar el area.
- Introducir la aguja hacia el corazón, en una inclinación de 45º y hacia el centro de la cavidad
toráxica; la evidencia de que la aguja está en el corazón es el flujo continuo de sangre.
- Extraer la jeringa, retirar la aguja y depositar la sangre en los tubos de prueba.
- Repetir el procedimiento una o mas veces, a fin de obtener la mayor cantidad posible de
sangre.(La sedación del animal facilitará la tarea)

6.5 Resultados
- La sangría total de un conejo rendirá entre 60-120 ml de sangre. En las sangrías parciales es
generalmente, suficiente 3-10 ml de sangre.

6.6 Cuestionario
- Se puede usar suero hemolizado para pruebas de laboratorio?
- El mejor animal para inocular es el conejo? Porque?
-Cuanto de suero es lo ideal para una buena sangría?

6.7 Material de referencia

- Harlow E. Lane D. Antibodies: A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York;
Cap 5, 1988.
- Cornejo W., Alva P. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. 2ºed. UNMSM, 2007.

SEPARACIÓN DEL SUERO

La detección o cuantificación de anticuerpos séricos generalmente requiere de una muestra de
suero transparente y libre de contaminación. Por lo tanto, el suero deberá obtenerse 1-2 horas
después de extraída la sangre, cuidando no hemolizarlo y evitando su contaminación.

Materiales:

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 -Tubos 10x75 mm
- Pipetas pasteur con chupón
- Criotubos
- Centrífuga
Procedimiento
← Dejar los tubos con sangre, ligeramente inclinados, hasta que coagule.
← -Colocar los tubos en estufa de 37ªC por 30 minutos; luego trasladarlos a 4ªC para que
liberen el suero.
← - Con una pipeta pasteur, colectar el suero y colocarlo en un tubo de 10x75 mm
← - Centrifugar el suero a 2500 rpm durante 5-10 minutos.
← - Colectar el suero libre de eritrocitos y envasarlo en criotubos. Rotular convenientemente y
guardar a -20ªC.
← Resultados
← - El suero no hemolizado es incoloro o presenta un color ligeramente amarillo.
← - Dependiendo del volumen de suero obtenido, repartir entre 0.05-0.5 ml de suero por cada
criotubo.
← El suero problema se puede guardar en congeladora solo o se le puede agregar
solución para conservar mejor los anticuerpos y evitar la contaminación bacteriana.
← Preparar en volúmenes iguales el suero con la glicerina y repartirlos en alícuotas,
envasándolo y conservándolos en congelador a -20ªC.
←
← Solución Madre:
← Con una de las alícuotas preparada, preparar una dilución 1/100 de la siguiente
manera:
• Hemolisina al 50% en glicerina………..2ml
• Sol. Salina tamponada 0.85%..............94 ml
• Fenol al 5% en suero fisiológico………4 ml
← Esto se conserva estable en refrigerador sin congelar.

←
←
←
←
←
←
← VOLUMENES DE SANGRE QUE SE PUEDEN OBTENER DE VARIAS ESPECIES
ANIMALES

F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

 Especie Volumen total de sangre Volumen disponible en la Volumen máximo de
promedio(ml/Kg) sangría seguridad en una
total(ml/Kg) sangría
parcial(ml/Kg)
Caballo 75 40 8
Bovino 60 30 7
Cabra 70 30 7
Carnero 60 25 6
Perro 90 45 9
Conejo 70 35 7
Cobayo 75 35 7

VII. PRÁCTICA No.7 Titulación de Suero(Hemolisina)

7.1 Marco Teórico
La forma habitual de evaluar la respuesta inmunitaria humoral en personas o en animales de
laboratorio consiste en la detección o medición de inmunoglobulinas, anticuerpos y proteínas del
complemento por técnicas serológicas. La medición de anticuerpos se lleva a cabo titulando
seriadamente el suero problema en diluciones al doble en presencia una cantidad constante de
antígeno. El titulo alcanzado por el suero es un indicador para establecer si hay una relación causal
entre los anticuerpos anti-eritrocitos de carnero(hemolisina) contenidos en el suero de un animal
hiperinmunizado.

7.2 Competencias
- conocer como se realiza una titulación de anticuerpos en muestras de sueros
- realizar correctamente diferentes diluciones de muestras

7.3 Material y equipos

-Hemolisina diluida 1:5(Solución madre de hemolisina1/50)
- Eritrocitos 1-2%
- Solución salina
-Tubos 10x15 mm
-Pipeta de 1 ml
-Puntas para micropipeta
- Bocal con lejía
- Baño maría

7.4 Procedimiento
Se hace preparando una serie de tubos de hemólisis en los cuales se mezclan volúmenes iguales de
diluciones crecientes de hemolisina en suero fisiológico y una suspensión al 1% de hematíes humano
“O” lavados y no sensibilizados.

TITULACION DEL SUERO ANTIGLOBULOS ROJOS HUMANOS “O”

1 2 3 4 5 6 7
Reactivo
Sol. Salina 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Sol. Madre Hemolisina 0.2 Mezclar
1/50
Mezclar el contenido del tubo 1 y pasar 0.20 ml al tubo siguiente hasta el tubo 7. Descartar 0.2 ml.
Usar controles de GR.
G.R.”O” 1% 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Dilución 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 1/12800
Se colocan en baño maría a 37ªC por 2 horas y en refrigeración a 4ªC por 18 horas.

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La primera dilución que no presenta aglutinación visible, es considerada la dilución a usar para la
sensibilización.

7.5 Resultados
La aglutinación se lee en el fondo del tubo según la manera que se han depositado los eritrocitos.
Incline ligeramente el tubo de prueba, si los eritrocitos caen a manera de lágrima es porque están
sueltos(aglutinación negatica); si por el contrario, los eritrocitos forman una malla la aglutinación es
positiva.
El titulo de la hemolisina va a estar dado por la máxima dilución donde acurre la hemaglutinación.
El titulo es la inversa de la dilución donde ocurre la máxima hemaglutinación.

7.6 cuestionario
- El titulo es lo mismo que la dilución?
- Se puede usar cualquier GR para la titulación?
- No se deben usar tubos controles en la titulación? Porque?

7.7 Material de referencia

- Alton G G, JonesL.M. Las técnicas de laboratorio en brucelosis. 2º ed. OMS, 1976.
- Almeida J O, Fife E H. Métodos de fijación del complemento estandarizado cuantitativamente para la
evaluación crítica de antígenos preparados con Trypanosoma cruzi. OPS, Of Sanit Panam, Pub.
Cientif. 319, 1976.
- Cornejo W., Alva P. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. 2ºed. UNMSM, 2007.

IX. PRÁCTICA Nº9 Determinación de Linfocitos en sangre: Rosetas T

9.1 Marco teórico
Las células indiferenciadas que migran al timo encuentran el microambiente para su diferenciación en
linfocitos T. Estas células pueden participar en ciertos mecanismos inmunológicos como el rechazo de
injertos, reacciones de hipersensibilidad retardada, reacciones de injerto contra huésped, defensa
contra virus y células tumorales, o en proceso de regulación de la respuesta inmune. La maduración
de los linfocitos T en el timo, su primer marcador que aparece en la superficie es el CD2 (receptor
para glóbulos rojos de carnero), posteriormente aparece el receptor CD3. Al madurar los linfocitos
todavía en el timo le aparecen los marcadores CD4 y CD8 entre otros receptores y es en el timo
donde se lleva a cabo una selección de los linfocitos T.
Desde el punto de vista morfológico, se encuentra poca diferencia entre los linfocitos pequeños B y T,
examinados al microscopio óptico o al electrónico, pero se han utilizado marcadores de superficie
para diferenciar las poblaciones.
Las inmunoglobulinas son fácilmente demostrables en la superficie de los linfocitos B, pero no de los
T, usando técnicas de inmunoflorecencia y reactivos tales como sueros anticadenas ligeras de
inmunoglobulinas, marcados con fluoresceína. Una gran proporción de células B llevan IgD e IgM, en
la superficie, pero una parte se tiñen con antisueros dirigidos contra la parte Fc de otras clases de
inmunoglobulina, parte de las células T se tiñen para inmunoglobulinas. La inmunoglobulina no es un
producto procedente de las células T, si no que es absorbida del exterior y probablemente representa
complejos inmunes, que se unen a los receptores para la región Fc de la inmunoglobulina que poseen
algunas células T.
Estos receptores se demuestran por la formación de rosetas con eritrocitos recubiertas con anticuerpo
IgG; un racimo de eritrocitos rodea al linfocito, al cual se unen mediante el fragmento Fc de la IgG,
que les recubre. En las células T humanas pueden ser inducidas a formar las llamadas rosetas
espontaneas con simples eritrocitos de carnero.
Las células T sanguíneas normalmente típicas, carecen de antígenos Ia, receptores de complemento
y receptores Fc de IgE, fácilmente detectables y se los reconoce por formar rosetas con eritrocitos de
carnero (rosetas E), una propiedad que no comparten con los linfocitos B. Tales células T representan
aproximadamente del 72 al 92 % de los linfocitos en sangre periférica. La división amplia de los
linfocitos en células B y T típicas, da cuenta de este modo del total, menos quizás el 3 al 10 %, de
linfocitos en sangre periférica.

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Existen varios métodos para cuantificar los linfocitos, se puede usar por citometría de flujo, utilizando
anticuerpos monoclonales, marcados con una sustancia fluorescente. También se puede hacer la
determinación mediante inmunofluorescencia o técnica de rosetas.
CD(Cluster of differentiation)

9.2 Competencias
- Reconocer la presencia de los L T mediante la roseta T.
- Diferenciar los L B de los LT

9.3 Materiales y equipos

- Ficoll-Hypaque de 1077 de densidad
- Buffer salino fosfato(PBS)
- Suero de ternera fetal al 2%
- Tubo de 13x100 mm con 1.5 de Ficoll-Hypaque
- G.R. lavados al 0.5% en SS
- Azul de Toluidina al 0.5% en BPS
- Laminas, laminillas y parafina solida calentada.
- Tubo de 16x150 mm
- Tubo de 10x75 mm
- Pipeta de 1 ml
- Puntas para pipeta
-Jeringa de 2-3 ml con aguja Nº21
-Algodón y alcohol yodado
- Manguera para hacer torniquete
- Frasco de penicilina con perlas de vidrio y tapa de jebe
- Bocal con lejía

9.4 Procedimiento
- Colocar un torniquete por encima del codo de la persona cuya sangre se va a extraer y pedirle que
cierre y abra la mano para aumentar la circulación.
- Seleccionar la vena por inspección y palpación.
- Desinfectar el area con alcohol yodado y dejar evaporar el alcohol
-Preparar y probar la jeringa y aguja
- Pedir al voluntario que cierre la mano e introducir la aguja en la vena
- La sangre fluirá dentro de la jeringa espontáneamente. Extraer de 5-6 ml de sangre
- Retirar el torniquete, pedir a la persona que abra la mano, extraer la aguja
- Colocar un algodón y presionar de 3-5 min.
- Rapidamente retirar la aguja de la jeringa y depositar la sangre en el frasco de penicilina con perlas
de vidrio, colocar la tapa de jebe y rotar el frasco suavemente durante 5-7 min. La fibrina queda
atrapada en las perlas de vidrio, evitando así la coagulación de la sangre.

Separación de Linfocitos
Los linfocitos se obtienen de sangre defibrinada y se separan de los eritrocitos pasándolos a través de
Ficoll-Hypaque de 1077 de densidad. El Ficoll-Hypaque es una mezcla de 12 partes de Ficoll al 9% y
5 partes de Hypaque al 34%
- Tomar 1 ml de sangre defibrinada y depositarla en u tubo de 16x150 mm
- Agregar 3 ml d PBS para diluir la sangre 1:4. Mezclar bien y depositar en zona, 3 ml de sangre en el
tubo que contiene 1.5 ml de Ficoll-Hypaque
- Centrifugar a 3000 rpm durante 15 minutos
- Separar suavemente el anillo de linfocitos con la pipeta pasteur y transferirlos al tubo de 10x75 mm.
Agregar 0.5-1.0 ml de PBS.
- Centrifugar a 800 rpm durante 3 minutos. Descartar el sobrenadante y agregar 0.5-1.0 ml de PBS.
Resuspender las células, agitando suavemente. Esto se hace para lavar los linfocitos y retirar restos
de Ficoll-Hypaque.
- Centrifugar nuevamente a 800 rpm durante 3 minutos y descartar el sobrenadante.
- Resuspender las celulñas en aproximadamente 0.5 ml de PBS, agregando una gota de suero de
ternera fetal

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Formación de Rosetas T 6
La suspensión de linfocitos debe tener de 1-10x10 células x ml y debe contener 80-90% de células
vivas. Las rosetas T solamente se forman alrededor de células vivas.
- Depositar dos gotas de la suspensión de linfocitos en un tubo de prueba 7x100 mm
- Colocar 2 gotas de eritrocitos al 0.5%
- Centrifugar a 800 rpm x 1minuto
- Con la pipeta pasteur con tetina, separar y descartar una gota del sobrenadante, sin resuspender
las células del fondo del tubo
- Cuidadosamente, tomar las células del fondo y colocarlas en una lámina con una gota de azul de
toluidina. Cubrir con la laminilla y sellar con parafina licuada
- Observar al microscopio

9.5 Resultados
Observar que alrededor de algunas células (linfocitos T) hay adheridos eritrocitos de carnero,
formando rosetas. Para que sea considerada una roseta, el numero de eritrocitos tendrá que ser
mayor de tres.

9.6 Cuestionario
- Las rosetas T se observan en los LB?
- Se pueden usar G.R.humanos para observar las rosetas T?
- El ficoll-Hypaque se necesita para separar solo los anticuerpos?

9.7 Material de referencia

- Bach J.F. Evaluation of T-cells and thymic serum factors in man using the rosette technique.
Transplant Rev 16: 196:217, 1973.
- Pharmacia Fine Chemicals. Folleto “Ficoll-Hypaque for in vitro isolation of lymphocytes. 1975.
- Fukusaki I. Marcadores de linfocitos T y B humanos en sangre periférica. Tesis de bachiller en
Ciencias Biológicas, UNMSM, 1977.
- Cornejo W., Alva P. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. 2ºed. UNMSM, 2007.

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X. PRÁCTICA Nº10 Actividad lítica del complemento
10.1 Marco teórico El sistema del complemento es una cascada bioquímica que ataca las superficies
de las células extrañas. Contiene más de 20 proteínas diferentes y recibe ese nombre por su
capacidad para complementar la destrucción de patógenos iniciada por los anticuerpos. El sistema del
complemento es el mayor componente humoral de la respuesta inmune innata. Muchas especies
tienen sistemas de complemento, el mismo no sólo se presenta en los mamíferos, sino que las
plantas, peces y algunos invertebrados también lo poseen.

En los seres humanos, esta respuesta es activada por la unión de proteínas del complemento a
carbohidratos de las superficies de los microorganismos o por la unión del complemento a anticuerpos
que a su vez se han unido a los microorganismos. Esta señal de reconocimiento produce una rápida
respuesta de destrucción. La velocidad de la respuesta es el resultado de la amplificación de la señal
que ocurre tras la activación proteolítica secuencial de las moléculas del complemento, que también
son proteasas. Tras la unión inicial de proteínas del complemento al microbio, aquéllas activan su
capacidad proteásica, que a su vez activa a otras proteasas del complemento y así sucesivamente.
Esto produce una cascada catalítica que amplifica la señal inicial por medio de una retroalimentación
positiva controlada.50 La cascada origina la producción de péptidos que atraen células inmunitarias,
aumentan la permeabilidad vascular y opsonizan (recubren) la superficie del patógeno, marcándolo
para su destrucción. Esta deposición del complemento puede también matar células directamente al
bloquear su membrana plasmática.

10.2 Competencias
- conocer como actúa el complemento en la reacción antígeno-anticuerpo
- conocer la presencia del complemento en las muestras de los pacientes

10.3 Material y equipos

- Suero humano, grupo “O”
- Eritrocitos humanos grupo A o B al 2%
- Complemento
- Suero fisiológico
- Tubos de 13x100mm en gradilla
- Pipetas de 1 ml
- Gradilla para tubos
- Baño maría a 56ºC
- Baño maría a 37ºC
- Centrifuga

10.4 Procedimiento
- Inactivar el suero humano, incubándolo a 56ºC en baño maría por 30 minutos
-Rotular 3 tubos y repartir los reactivos como se indica:

reactivos
Tubo 1 2 3
Suero humano inactivado ml 0.25 0.25
Eritrocitos ml 0.25 0.25 0.25
Complemento ml 0.25
Suero humano no inactivado ml 0.25
Solución salina ml 0.25 0.25

- Incubar los tubos a 37ºC durante 30 minutos

-Centrifugar los tubos a 1500 rpm durante 3 minutos

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 ←
10.5 Resultados
La actividad lítica del complemento se evidencia por el enrojecimiento del medio(hemolisis) en los
tubos de ensayo que contienen complemento(tubos a y b). El tubo c no debe mostrar hemolisis.

10.6 Cuestionario

- El complemento es una proteína que lisa GR?

- El complemento es útil en las defensas del huésped?
- La reacción antígeno-anticuerpo es necesaria para destruir al germen?

10.7 Material de referencia

- Kabat E.A. Structural concepts in inmunology and inmunochemistry. 2º ed. Holt, Rinehart and
Winston, New York, 1976.
- Cornejo W., Alva P. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. 2ºed. UNMSM, 2007.

XI. Práctica XI. Determinación de la actividad hemolítica del complemento

11.1 Marco Teórico.
Este método se basa en la actividad de la vía clásica del complemento para producir hemólisis de
eritrocitos sensibilizados con cantidades óptimas de anticuerpos antieritrocitarios(Hemolisina)
Es un ensayo de las Proteínas del Sistema Complemento circulantes. Las muestras de Suero
diluido se añaden a Eritrocitos recubiertos con Anticuerpos, midiendo el porcentaje de lisis celular.
Los valores se expresan por el llamado CH50, unidades de Proteínas del Sistema Complemento
por mililitro, que es la Dilución de Suero necesaria para lisar el 50 por ciento de los Eritrocitos en la
prueba.

11.2 Competencias
- Conocer la importancia del complemento en la hemolisis de los hematíes
- Conocer la función del complemento dentro del sistema antígeno-anticuerpo

11.3 Materiales y equipos

- Suero problema
- Eritrocitos de carnero sensibilizados al 1%
- Buffer barbital sódico 0.025M, PH 7.5
- Agua destilada
- Tubos de 13x100 mm
- Pipetas de 1 ml
- Pipetas de 100 uL
- Puntas
- Baño maría a 37ºC
- Centrifuga
- Espectrofotómetro
- Bocal con lejía

11.4 Procedimiento
- Preparar en buffer sódico 2 ml de las diluciones 1/25, 1/50, y 1/75 del suero a titular
- Colocar en una gradilla sobre hielo una serie de 14 tubos. Añadir:

1 2 3 4 Positivo Negativo
Suero problema ml 0.50 0.35 0.25 0.15 - -
Buffer Barbital ml 0.40 0.55 0.65 0.75 - 0.90
G.R. sensibil. ml 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60 0.60

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- Preparar series idénticas para las diluciones 1/50 y 1/75, incluyendo los tubos controles
- Agitar bien los tubos y colocarlos en baño maría a 37ºC por 30 minutos
- Añadir 0.5 ml de buffer 4ºC a todos los tubos, excepto al control positivo, al cual se añade 1.4 ml de
agua destilada. Agitar suavemente.
- Centrifugar todos los tubos a 1500 rpm durante 5 minutos
- Leer la D.O.(Densidad Optica) de los sobrenadantes a 550 nm utilizando como blanco el control
negativo.

11.5 Resultados
- En papel semilogaritmico, graficar los porcentajes de hemólisis (ordenada) contra el volumen de
suero diluido(abscisa) que se añadió a cada tubo.
- Trazar la mejor recta e interpolar para cada dilución del suero problema el volumen que produce el
50% de hemólisis. Este volumen corresponde a una unidad hemolítica (UH) 50%. Calcular las UH en
1 ml y multiplicar por la dilución correspondiente.
- Valores esperados en suero de adultos: 80-100 UH.

11.6 Cuestionario
- Cual es la importancia de esta prueba?
- Se necesita medir esta prueba a los pacientes para medir su inmunidad?
- Los controles permiten verificar el correcto actuar del sistema?

11.7 Material de referencia

- Brown D. Complement and complement fixation. Techniques in clinical immunology, Thompson R A
ed, Blackwell Scientific Publications, Oxford, Cap. 4, 1977.
- Cornejo W., Alva P. Manual de Practicas de Inmunología y Vacunas. 2ºed. UNMSM, 2007.+

XII. PRACTICA 12. Prueba de Waaler Rose modificado

12.1 Marco Teórico.

Los autoanticuerpos son anticuerpos dirigidos contra antígenos del propio organismo;
muchas veces son hallazgos serológicos en pacientes con enfermedades reumáticas
sistémicas.
De los anticuerpos identificados hasta ahora, solo algunos tienen importancia en el
diagnóstico de las enfermedades reumáticas y pueden considerarse como marcadores
serológicos. Otros son característicos de una enfermedad determinada pero no son
específicos.

La prueba de Waaler Rose es una prueba inmunológica que se utiliza para poner de manifiesto el factor
reumatoideo. Se basa en el hecho de que los pacientes que poseen dicho factor aglutinan los eritrocitos
previamente sensibilizados. La reacción sale positiva en pacientes con artritis reumatoide o ciertas colagenosis.
Aglutinación de hematíes de cordero (previamente sensibilizados en contacto con un suero de conejo
anticordero) por suero humano privado de sus heteroaglutininas naturales. La aglutinación para una
dilución superior a 1/32 es casi característica de enfermedad del colágeno.

La obtención de una hemolisina anticarnero de alto poder es una necesidad para mejorar el sistema
hemolítico; y, la posibilidad de los laboratorios pequeños para contar con un bioterio adecuado de
donde obtener fácilmente los glóbulos rojos de carnero.
En el presente trabajo se expone una técnica sencilla y fácil de realizar por personal capacitado, con
la cual nos permite obtner altos títulos de suero hemolítico, al inyectar a un conejo, primero sangre
humana total del grupo "O" por vía intracutánea, en dosis crecientes para luego continuar inyectando
por vía endovenosa glóbulos rojos "O" al 20%.

Posteriormente se realizó una técnica distinta utilizando glóbulos rojos "O" humanos sensibilizados
con el suero hemolítico obtenido, obteniéndose resultados idénticos.

12.2 Competencias

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- Conocer las pruebas de hemaglutinación para el diagnóstico de enfermedades reumatológicas.
- Efectuar modificaciones en las diferentes pruebas de un laboratorio de inmunología

12.3 Materiales y equipos

- Suero problema
- G.R. sensibilizados 1%
- Suero fisiológico
- Pipeta de 1 ml
- Pipeta de 100 uL
- Puntas para pipetas
- Tubos 13x100 mm
- Gradillas

12.4 Procedimiento
La sensibilización de los G.R. se realiza por la mezcla de volúmenes iguales de la suspensión al 2%
de hematíes “O” lavados y del inmunosuero de conejo diluido en suero fisiológico a la dilución
determinada con anterioridad. La mezcla se incuba a 37ºC por 1 hora agitando cada 10 minutos.

El suero problema debe inactivarse a 56ºC por 30 minutos.

Para cada suero problema se prepara una serie de 10 tubos de hemólisis en los cuales se vierten 0.2
ml de suero fisiológico. Se añade seguidamente 0.2 de suero problema diluido ¼ al primer tubo, se
retira 0.2 ml y se añade al segundo tubo, y así sucesivamente hasta llegar al tubo 8 del que se
extraen 0.2 y se descarta. Al tubo 10 se añade 0.2 de suero diluido al ¼ y después de mezclar se
descarta 0.2 ml. A los 9 primeros tubos se le añade 0.2 ml de hematíes sensibilizados al 1%.
Tenemos de este modo una serie de diluciones del suero desde 1/8 hasta 1/1024, así como un testigo
de hematíes sensibilizado sin suero y otro de suero más hematíes no sensibilizados. Los tubos son
agitados vigorosamente e incubados 2 horas a 37ºC, luego a 4ºC toda la noche.

Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Dilución 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512 1/1024 0.2 0.2
SF 0.85% 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
SP 1/4 0.2 0.2
G.R.sens.1% 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
G.R.no sens. 0.2

12.5 Resultados
Los dos testigos deben ser negativos
La reacción se considera positiva cuando hay aglutinación al 1/32 o más

12.6 Cuestionario
- La prueba de Waaler Rose es la única para enfermedades reumatológicas?
- La prueba sólo usa glóbulos rojos de carnero?
- Es recomendable hacer esta prueba en los laboratorios de salud pública?

12.7 Material de referencia

- Carazas, Ignacio; Ramos, Arturo; Benites, Juan; Rodríguez, Fernando. Utilización de hematíes
humanos "O" en la prueba de Waaler-Rose. Rev. Sanidad FFPP, Lima, 1985.

XIII. PRÁCTICA No.13 METODOS DE DIAGNOSTICO EN EL LABORATORIO DE INMUNOLOGIA

13.1 Marco teórico
El laboratorio en la inmunología diagnóstica

Paulatinamente la inmunología se ha convertido en una ciencia individual y como todas las

ciencias modernas, tomó conceptos de otras ciencias Biológicas y químicas a las cuales

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 también ha enriquecido; incluyendo a la microbiología, la bioquímica, la genética, la
medicina, la patología y la biología molecular, entre otras.
De una manera un poco simplista, podemos hablar de subdivisiones de la inmunología,
como inmunidad, serología, inmunoquímica e inmunobiología. Durante los primeros años de
esta ciencia, inmunología e inmunidad eran prácticamente sinónimos y se enfocaba en
forma casi exclusiva a la prevención de las enfermedades infecciosas mediante vacunación,
y aunque actualmente se destina gran parte de los esfuerzos de investigación a la mejora de
vacunas y de las técnicas de inmunización, las diferencias entre ambas son tangibles. La
serología como tal se convirtió en un elemento con fines meramente diagnósticos,
actualmente no sólo se busca descubrir nuevas pruebas en serología especificas para cada
enfermedad, sino también mejorar y sobre todo, automatizar las técnicas existentes. Por otro
lado, la inmunoquímica y la inmunobiología se han dedicado al estudio del conocimiento de
la estructura de los antígenos, inmunoglobulinas, la química del complemento y otros
componentes del sistema inmune, así como al estudio de las bases biológicas, genéticas y
moleculares de la respuesta inmune.

Dado que las líneas divisorias entre estas áreas de la inmunología son poco claras, un
laboratorio de inmunología diagnóstica moderno, deberá involucrar técnicas que permitan
evaluar la respuesta inmune. Actualmente podemos clasificar las técnicas diagnósticas en:
a) cuantificación y detección de anticuerpos o antígenos específicos mediante interacciones
antígeno-anticuerpo, b) detección, enumeración y fraccionamiento de celulas
inmunocompetentes, c) ensayos de inmunidad celular, d) evaluación de los componentes del
complemento y su función y e) inmunología de transplantes.

La cuantificación y detección de anticuerpos o antígenos específicos mediante interacciones

antígeno-anticuerpo, es definitivamente el área más importante dentro de un laboratorio de
inmunología, ya que la mayoría de los análisis son IgG e IgM específicos contra agentes
infecciosos, determinación de inmunoglobulinas totales (IgA, IgG e IgM) y las subclases de
IgG, determinación de autoanticuerpos, e IgE alergenos específicos, determinación de
marcadores de infección como la Proteína C Reactiva, marcadores tumorales y la
cuantificación de linfoquinas.

La detección, enumeración y fraccionamiento de celulas inmunocompetentes prácticamente

se realizan en forma exclusiva mediente citometría de flujo, lo que hace imprescindible una
relación estrecha entre el laboratorio de inmunología y el laboratorio de citometría de flujo.

La evaluación de la respuesta celular en un paciente involucra desde pruebas muy sencillas

y prácticamente rutinarias como son las intradermoreacciones, hasta pruebas sumamente
especificas como la evaluación de la función fagocítica y de la capacidad microbicida de los
fagocitos (NBT) así, como pruebas de estimulación linfocítica a mitógenos y a antígenos
específicos. Evaluar los componentes del complemento y su función, pretende determinar la
concentración de los componentes individuales del complemento (C3, C4, C1q, inhibidor de
Cl), y determinar su capacidad funcional. (CH50 o CHl00).

La inmunología de transplantes ha tomado mucha importancia en los últimos años dentro de

los laboratorios de inmunología, la determinación de los antígenos de HLA, tanto clase I
como clase II, así como las pruebas cruzadas son casi imprescindibles tanto en los
transplantes de órganos sólidos como en los de medula ósea Lo ideal seria poder identificar
los antígenos de HLA por técnicas moleculares aplicando Ia tecnología de la reacción en
cadena de Ia polimerasa (PCR), pero si no es posible, se deberá aplicarse al menos en los
transplantes de médula ósea, Ia determinación de HLA clase I por técnicas serológicas de
micro-citotoxicidad y Ia determinación de HLA clase H por PCR. En aquellos transplantes de
órganos sólidos, en los cuales Ia compatibilidad de HLA entre receptor y donador no sea tan
relevante, se recomienda realizar las pruebas cruzadas, y el conocimiento del HLA (clase I y
II) le ayudaría al médico a estimar el grado de rechazo y la sobrevida del órgano
transplantado.

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 Las técnicas utilizadas en el laboratorio de inmunología diagnóstica varían a gran velocidad,
cada día son más las técnicas moleculares y genéticas que están a disposición y es por ello,
que el personal profesional y técnico debe estar actualizado constantemente; sin embargo,
la incorporación de algunas de estas novedosas técnicas resulta costoso, no sólo desde el
punto de vista de adquisición de los reactivos, sino también en cuanto a infraestructura
necesaria; pero hay que reconocer que nuestro país cuenta con el equipo humano capaz de
trabajar cualquiera de estas técnicas modernas. Las autoridades en Salud deben impulsar el
uso rutinario de estas técnicas no solamente con fines diagnósticos, sino también
promoviendo la investigación para el desarrollo de las diferentes áreas de la inmunología
diagnóstica.

13.2 Competencias

Conocer las técnicas utilizadas para la generación de conocimiento

13.3 Materiales y equipos

Multimedia
Pizarra acrílica

13.4 Procedimiento
Análisis detallado de los procedimientos diagnósticos más utilizados en la practica

13.5 Resultados

13.6 Cuestionario

13.7 Fuentes de información

Rev. costarric. cienc. méd v.21 n.1-2 San José jun. 2000

XIV. PRÁCTICA No. 14 PCR y Citometría de flujo. Fundamentos de la técnica. Aplicaciones.

Ejemplos representativos. Mostrativo
14.1 Marco teórico
La Citometría de Flujo (CMF) es una técnica de análisis celular multiparamétrico cuyo
fundamento se basa en hacer pasar una suspensión de partículas (generalmente células)
alineadas y de una en una por delante de un haz de láser focalizado. El impacto de cada
célula con el rayo de luz produce señales que corresponden a diferentes parámetros de la
célula y que son recogidos por distintos detectores. Estos convierten dichas señales en
señales electrónicas que posteriormente serán digitalizadas para permitir la medida
simultánea de varios parámetros en una misma célula. Estos parámetros son:
- Parámetros relacionados con características intrínsecas de la célula, como su tamaño y
la complejidad de su núcleo y citoplasma.
- Parámetros relacionados con características antigénicas de cada célula
(inmunofenotipo).

F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

 Por lo tanto la CMF es capaz de identificar una célula por medio de sus características
antigénicas y/o por sus características morfológicas de tamaño y complejidad.

14.2 Competencias

Entender las bases de la citometria de flujo, la técnica de diagnostico de proteínas

14.3 Materiales y equipos

Multimedia

Proyector

14.4 Procedimiento

Lectura y comprensión de un artículo científico

Aplicación de la citometría de flujo en el diagnóstico inmunológico de los linfomas

cutáneos T

Lic. Bertha B. Socarrás FerrerI; Lic. Lázaro O. del Valle PérezI ; Dra. Vianed Marsán
SúarezI; Dra. Miriam Sánchez SeguraI; Lic. Ruby Alonso RamírezII; DraC. Consuelo Macías
AbrahamII
I
Instituto de Hematología e Inmunología. Cuba.
II
Centro de Inmunología Molecular. Cuba.

RESUMEN

Se comunican las características inmunofenotípicas de 7 pacientes (5 del sexo masculino

y 2 del femenino) con el diagnóstico clínico-morfológico de linfomas cutáneos de células
T, atendidos en la consulta de Hematología del Instituto de Hematología e Inmunología.
La edad de los pacientes osciló entre 17 y 88 años. El inmunodiagnóstico se realizó por
inmunofluorescencia directa con un panel de anticuerpos monoclonales que incluyó
marcadores linfoides B y T: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD19, CD22 y CD25. La
lectura se realizó en un clitómetro de flujo FaCScan (Becton-Dickinson ). Cada marcador
se consideró positivo si un porcentaje mayor al 20 % de los linfocitos expresaba el
antígeno. Nuestros resultados mostraron que en la mayoría de los pacientes predominó el
patrón general de los linfocitos T con función auxiliadora (CD3+, CD4+, CD8-). Se
corrobora que la citometría de flujo es un procedimiento más rápido y menos laborioso
que otros métodos de inmunofenotipaje celular, que nos permite un diagnóstico de
certeza y la aplicación de una terapia efectiva.

Palabras clave: linfomas cutáneos T, citometría de flujo.

INTRODUCCIÓN

Los linfomas cutáneos (LC) son procesos linfoproliferativos malignos cuyo órgano diana es
la piel, y según su origen se clasifican en T o B.1-3

La incidencia global de los linfomas cutáneos de células T (LCCT) es de alrededor de 0,36

casos por 100 000 habitantes al año, lo que constituye una proporción pequeña dentro de
los linfomas no hodgkinianos.4,5 Estas neoplasias aparecen fundamentalmente entre los 45
y los 65 años y son 2,2 veces más frecuentes en el sexo masculino que en el femenino.
Las presentaciones clínicas más reportadas son la micosis fungoides (MF) y el síndrome de
Sézary (SS).5-9

F-CV3-3B-2 Rev. Junio 2007

 La MF es la forma más común de LCCT y a la vez, es la que presenta mayores dificultades
diagnósticas, particularmente en la fase inicial de su desarrollo. Su incidencia es de 0,29
casos por 100 000 habitantes al año y su etiopatogenia se desconoce.10,11

Por otro lado, el síndrome de Sézary es considerado como la expresión leucemizada de la

MF; se caracteriza por eritrodermia, poliadenopatías y elevado número de linfocitos
atípicos en sangre periférica (células de Sézary). Otras manifestaciones clínicas que se
pueden presentar son: hiperpigmentación progresiva, hiperqueratosis palmoplantar y
pérdida de pelos y uñas.3,12

Tradicionalmente, el diagnóstico de cualquier lesión cutánea está basado en criterios

clínicos e histopatológicos. Ninguno de estos criterios es absoluto, de ahí que se destaque
la trascendencia de los estudios citogenéticos, inmunológicos y moleculares para un
diagnóstico de certeza y pronóstico de la enfermedad, por lo que nos propusimos aplicar
la citometría de flujo para el inmunodiagnóstico de 7 pacientes con LCCT atendidos en la
consulta de Hematología del Instituto de Hematología e Inmunología.

MÉTODOS

Se estudiaron 7 pacientes (5 del sexo masculino y 2 del femenino) con un rango de edad
que osciló entre 17 y 88 años, con diagnóstico clínico-morfológico LCCT. Las muestras se
obtuvieron de sangre periférica y se depositaron en tubos con EDTA al 10 %.

Marcadores inmunológicos: El estudio inmunofenotípico se realizó por un método de

inmunofluorescencia directa con un panel de anticuerpos monoclonales (AcMo) que
detectan antígenos en linfocitos B y T. El análisis se realizó por citometría de flujo en un
FaC Scan (Becton-Dickinson, EE.UU.) mediante el examen de la reacción con los AcMo en
la ventana de la población linfoide. 13 El panel utilizado incluyó: CD2, CD3, CD4, CD5,
CD7, CD8, CD19, CD22 y CD25. Algunos AcMo estaban conjugados con ficoeritrina (RPE) y
otros con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (tabla 1). Todas las muestras fueron
fijadas con una solución de paraformaldehído al 1 %. La lectura se realizó mediante la
adquisición de 10 000 células en cada tubo. Cada marcador se consideró positivo si un
porcentaje superior al 20 % de los linfocitos expresaban el antígeno.

RESULTADOS.

La distribución de los casos diagnosticados con LCCT se describe en la tabla 2. En la

mayoría de los pacientes predomina el patrón general de los linfocitos T con función
auxiliadora CD3+, CD4+, CD8- (71,40 %). En la minoría (1 paciente) se expresan los
marcadores con función citotóxica CD3+, CD4-, CD8+ (14,3%). Un caso diagnosticado con SS
mostró predominio de linfocitos T CD4+ (14,3%). Hay otros marcadores con fines
diagnósticos de células T como CD5 y CD7, que fueron variablemente positivos. Los
marcadores B (CD19, CD22) y el de activación CD25 resultaron negativos en la población
celular T.

DISCUSIÓN.

Los LCCT constituyen un grupo de enfermedades neoplásicas caracterizado por infiltrados

de células T malignas; dentro de estos se encuentran la MF y el SS, que son entidades que
aunque difieren en sus manifestaciones clínicas se cree que son variantes de un mismo
trastorno linfoproliferativo del linfocito T CD4.

El estudio inmunofenotípico en sangre periférica mostró la presencia de linfocitos T con

predominio de T cooperadores CD3+, CD4+, CD8, y en el caso del paciente con SS, se
apreciaron cifras de CD4 superiores al 90 % y disminución de las células CD3. Estos
resultados corroboraron lo planteado por otros investigadores.4,5,14

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 Un adecuado tratamiento depende de un diagnóstico de certeza morfológico,
citogenético, inmunológico y molecular. En la actualidad se utiliza la aplicación
intravenosa de anticuerpos monoclonales contra antígenos de diferenciación de células T
y se trabaja en proposiciones experimentales para el tratamiento de los linfomas
cutáneos que incluyen vacunación, terapia génica y trasplante antólogo de células
madre, 15,16 lo que permitiría una rápida curación, una mayor sobrevida y la incorporación
de estos individuos a la vida útil de la sociedad.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Jahn S, Asadullah K, Walden P, Steny W. Cutaneous malignant lymphomas. Immunol

Today 1998;19:70-3.

2. Landis S, Murray T. Bolden Statistics 1998. Cancer J Clin 1998;48:6-29.

3. Faxas ME. Actualidad clínica biológica de los linfomas T cutáneos. Rev Cubana Med
2003;42:72-8.

4. Vieites B, Suárez JM. Linfomas cutáneos de células T. Revisión de los aspectos

histopatológicos más relevantes. Rev Española Pat 2004;37:1-35.

5. Socarrás BB, del Valle LO, Marsán V, Macías C. Linfomas cutáneos. Aspectos
relevantes. Rev Cubana Hematol Inmunol Hemoter 2005;21(1) (citado el 14 de junio
2007). Disponible en: www:http://scielo.sld.cu/scielo.php?
script=sci.arttex&pid=S0864.02892005000100001&ing=es&nrm=iso>.ISSN

6. Vinogradova IE, Giliazitdinova EA, Zamulaeva IA, Zybunova EE, Kaplanskaia IB,
Kranvchenko SK, et al. Clinicomorphological characteristics of Sezary`s disease and
mycosis fungoides. Ter Arkh 2005;77:61-5.

7. Weiroch MP, Cornillet P, Perceau G, Durlach A, Bernard P. Frequency of associated

malignancies in cutaneous lymphoma. A retrospective study of 86 ases. Ann Dermatol
Venezol 2004;131:339-45.

14.5 Resultados

14.6 Cuestionario

1.- DESCRIBA EN FORMA CONCISA LO QUE MAS APRENDIO LEYENDO EL ARTÍCULO

2.- SI TUVIERA QUE DECIDIR EN IMPORTANCIA, CUAL SEGMENTO ES EL MAS IMPORTANTE,

PORQUE?

14.7 Fuentes de información

www.citometriadeflujo.com

Inmunologia Molecular I y II
14.1 Marco teórico

Parte de la biología que trata de los fenómenos biológicos a nivel molecular. En sentido
restringido comprende la interpretación de dichos fenómenos sobre la base de la
participación de las proteínas y ácidos nucleicos.

14.2 Competencias

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 Conocer las técnicas utilizadas para la generación de conocimiento. Hacer ejercicios de
comprensión y retención de conocimientos.

14.3 Materiales y equipos

Multimedia

Proyector

14.4 Procedimiento

Seminario dirigido sobre un tema de investigación

14.5 Resultados

14.6 Cuestionario

14.7 Fuentes de información

Biologia Molecular
14.1 Marco teórico

PCR en tiempo real es un tipo de PCR cuantitativo que mida la cantidad de DNA o de
mRNA en una muestra, de una población de células (cultura del tejido fino o de célula), o
iguala recientemente de una célula. El tiempo real se utiliza comúnmente para

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 determinar la expresión del mRNA de un gene, y su expresión nivela (número de la copia
del mRNA) durante ciertas condiciones (tales como tratar las células con una droga). PCR
en tiempo real se puede utilizar para comparar muestras normales (del control) a las
muestras de la enfermedad, dando una idea en cuanto a los cambios de la expresión que
ocurren con patogenesia. PCR en tiempo real debido a su sensibilidad también se utiliza
en la detección de patógeno en la sangre tal como virus.

El desarrollo de PCR cuantitativo en tiempo real ha eliminado la variabilidad asociada

tradicionalmente a PCR cuantitativo, así el permitir cuantificación rutinaria y confiable
de los productos de PCR.

14.2 Competencias

Asimilar como la tecnologia se actualiza cada dia

14.3 Materiales y equipos

Multimedia

Proyector

14.4 Procedimiento

El docente presenta un seminario sobre lo que significa PCR en tiempo real como un arma
significativa de la Inmunologia molecular.

14.5 Resultados

14.6 Cuestionario

14.7 Fuentes de información

http://www.molecularstation.com/es/real-time-pcr/

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XV. PRÁCTICA No. 15 Seminario: Enfermedades autoinmunes

15.1 Marco teórico

Estas enfermedades son consecuencia de una respuesta inmune exagerada en contra de

algún componente propio. Potencialmente, cualquier estructura del cuerpo puede
desencadenar respuestas autoinmunes, pero hay unas que lo hacen con mayor frecuencia
que otras. El daño al organismo, y por lo tanto las manifestaciones clínicas, depende del
auto-antígeno en cuestión, que puede hallarse sólo en un tipo particular de tejido o bien
ser una molécula que se localiza en diferentes órganos. En el primer caso, la enfermedad
autoinmune es llamada órgano específica y en el segundo, generalizada.

15.2 Competencias

Propiedades generales y descripción de los diferentes mecanismos que conducen a una

respuesta inmunitaria frente a un antígeno propio.- Fundamentos del tratamiento
utilizado.

15.3 Materiales y equipos

Multimedia

Proyector

15.4 Procedimiento

Los alumnos presentan en grupos preestablecidos, un tema relacionado a una enfermedad

autoinmune: Diabetes, Lupus eritematoso, artritis reumatoide, etc.

15.5 Resultados

15.6 Cuestionario

15.7 Fuentes de información

http://www.healthsystem.virginia.edu/uvahealth/peds_hrpregnant_sp/autohub.cfm

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