Vous êtes sur la page 1sur 57

Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice.

Culturi
starter de microorganisme.

1.1. BIOTEHNOLOGII ALIMENTARE – DEFINIŢIE –


OBIECTUL BIOTEHNOLOGIEI

Biotehnologia este o ştiinţă complexă, ce se caracterizează prin utilizarea integrată a biochimiei,


microbiologiei, biologiei celulare şi a ingineriei genetice. (fig. 1.1).

Figura 1.1. Biotehnologia o ştiinţă complexă

Denumirea de biotehnologie provine de la cuvintele greceşti:

„Bios” care înseamnă viaţă, „Tehnikos” care înseamnă tehnici şi „Logos” care însemnă „studiu al”.
Biotehnologia este aplicată in diverse domenii, cum ar fi : agricultură, industria alimentară, producţie
industrială, mediu şi medicină.

Biotehnologia alimentară se referă la prelucrarea industrială a diferitelor materii prime cu ajutorul


microorganismelor şi enzimelor proprii sau a unor agenţi biologici (microorganime, enzime) adăugaţi
în scopul realizării unor produse sau a ameliorării unor procese tehnologice.

Rolul biotehnologiei este covârşitor în industria alimentară. În fapt industria alimentară este o
biotehnologie deoarece materiile prime agroalimentare sunt produse biologice şi prin urmare
conservarea lor până la consum, în stare proaspătă (cazul fructelor şi legumelor) sau până la
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 2
starter de microorganisme.
industrializare (cazul tuturor produselor agroalimentare) implică controlul activităţii enzimatice proprii
ţesuturilor vegetale şi animale sau a celor elaborate de microflora de contaminare.

Enzimele proprii ţesuturilor vegetale şi animale sunt esenţiale în transformările pe care le oferă
produsele agroalimentare: maturarea fructelor şi legumelor, cerealelor şi făinurilor sau diferitelor
produse alimentare pe bază de cereale germinate, maturarea brânzeturilor, maturarea cărnii.

Enzimele pot avea însă şi rol deteriorativ cu implicaţii în modificarea caracteristicilor senzoriale şi a
valorii nutritive a materiilor prime agroalimentare până la prelucrarea termică a acestora.

De asemenea rolul microorganismelor este hotărâtor, unele dintre ele având acţiune dăunătoare,
altele având rol esenţial în obţinerea unor produse alimentare datorită acţiunii lor fermentative:
produse lactate acide, brânzeturi, bere, vin, spirt, pâine, salamuri crude, alimente fermentate din
cereale şi leguminoase.

Microorganismele intervin şi în fermentarea unor produse vegetale: varza, murături, măsline,


castraveţi, cacao, etc.

Biotehnologiile în industria alimentară s-au dezvoltat impresionant prin folosirea enzimelor exogene
(industria laptelui, berii, spirtului, amidonului, cărnii, sucurilor de fructe, zahărului, panificaţiei, etc.) şi a
culturilor starter (industria berii, laptelui, cărnii, panificaţiei, etc.) La toate acestea trebuie să avem în
vedere obţinerea de metaboliţi secundari (alcool etilic, acetonă, acizi organici, aminoacizi, etc.) prin
folosirea de microorganisme precum şi de biomasă alimentară şi furajeră, etc.

Cu ajutorul enzimelor microorganismelor se pot accelera procesele biochimice, se pot perfecţiona


procesele de producţie, se poate îmbunătăţi calitatea produselor alimentare şi se poate mări gradul
de diversificare a producţiei alimentare.

1.2. PREPARATE ENZIMATICE

1.2.1. Aspecte generale

Biotehnologia preparatelor enzimatice este un domeniu de bază al biotehnologiei, având drept scop
studierea tehnicilor de obţinere a preparatelor enzimatice folosind materii prime de origine animală,
vegetală şi microbiană, sub formă liberă sau imobilizată pentru a fi folosite ca agenţi biologici în
industria alimentară, industria furajelor, industria textilă, detergenţilor, farmaceutică, cosmetică,
chimică, etc. Prin utilizarea preparatelor enzimatice, tehnologiile tradiţionale se transformă în
biotehnologii, devenind mai eficiente şi mai puţin poluante.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 3
starter de microorganisme.
În figura 1.2. este prezentată ponderea de utilizarea a preparatelor enzimatice în diferite ramuri.

Alte domenii; 6
Morarit,
panificatie; 5
Sucuri, vinuri; 10 Amidon; 30

Bere; 4

Distilate; 5
Produse lactate;
5 Detergenti; 35

Fig. 1.2. Poderea utilizării preparatelor enzimatice

Aşa cum se observă din datele de mai sus, cea mai mare pondere o are utilizarea în industria
alimentară, urmată de industria detergenţilor.

În figura 1.3. sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice produse pe plan mondial.
Cea mai mare pondere o au preparatele de proteaze urmate de amilaze.

Glucozizomeraze;
Alte enzime; 4
Pectinaze; 10 14

Amilaze fungice;
Proteaze fungice; 18
4

Amilaze bcteriene;
10

Proteaze Proteaze de
bacteriene; 35 coagulare; 5

Fig. 1.3. Principalele tipuri de preparate enzimatice.


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 4
starter de microorganisme.

Preparatele enzimatice se comercializează sub diverse forme şi grade de purificare:

A. Preparate enzimatice solide:

1. Preparate enzimatice brute, sub formă de pulbere, obţinute prin uscarea şi măcinarea mediului
fermentat;

2. Preparate sub formă cristalizată, enzime pure utilizate preponderent în chimia analitică şi ingineria
genetică;

3. Preparate liofilizate, care sunt enzime purificate în amestec cu substanţe crioprotectoare, care sunt
urcate în vacum la temperaturi de -20......-50°C

B. Preparate enzimatice lichide

1. preparate enzimatice brute, formă sub care se livrează enzimele extracelulare (eliberate de către
microorganisme în mediul de cultură în timpul fermentaţiei)

2. preparate parţial purificate, în care se adaugă conservanţi pentru a le mări stabilitatea în timp.

In tabelul de mai jos sunt prezentate principalele tipuri de preparate enzimatice, sursele din care se
obţin şi aplicaţile în industria alimentară.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 5
starter de microorganisme.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 6
starter de microorganisme.

1.2.2. Surse de enzime.

Preparatele fabricate la scară industrială folosesc trei tipuri de surse: ţesuturi animale şi vegetale şi
microorganisme.

Sursele animale sunt reprezentate de subprodusele din industria cărnii (ficat, pancreas, inimă,
rinichi, creier, mucoasă stomacală şi intestinală). Utilizarea acestr surse este pe scară din ce în ce
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 7
starter de microorganisme.
mai redusă, fiind înlocuite de sursele microbiene, deoarece sursele animate prezintă o serie de
dezavantaje, cum ar fi: producţia limitată, apariţia unor boli cum ar fi encefalopatia spongiformă la
bovine.

Principalele enzime de origine animală care se obţin sub formă de preparate sunt chimozină (renina)
care se extrage din stomacul de miel sau viţei care se utilizează pentru coagularea laptelui la
fabricarea brânzeturilor. O altă enzimă este α -amilaza pancreatică care are utilizări în industria
farmaceutică.

Sursele vegetale sunt reprezentate de seminţe( germinate sau negerminate), rădăcini, fructe, sevă,
latexuri, frunze. Utilizarea surselor vegetale pentru obţinerea preparatelor enzimatice ridică o serie de
probleme, cum ar fi: prezenţa unor substanţe potenţial dăunătoare sănătăţii omului (ex. Compuşii
fenolici) sau a unor compuşi toxici de comtaminare. Aceste dezavantaje face ca sursele de origine
vegetală să fie destul de puţin utilizate. Principalele enzime obţinute din surse vegetale sunt.

- papaina, protează obţinută din latexul fructelor de Caryca Papaia. Enzima este utilizată
pentru tenderiyarea cărnii sau în industria berii;

- ficina, protează obţinută din latexul fructului de smochin (Ficus carica), utilizată pentru
degradarea proteinelor miofibrilare.

- bromelina, protează obţinută din sucul de ananas ( Ananas comosus ), folosită pentru
hidroliya proteinelor colagenice.

Alte enzime de origine vegetală sunt lipoxigenaza din soia şi complexul enzimatic din malţ ( amilaze,
proteaze, glucanaze). Preparatele enzimatice ale acestor enzime nu sunt purificate, fiind sub formă
de făină de soia sau de malţ.

Microorganismele reprezintă principala sursă pentru obţinerea de preparate enzimatice. Avantajele


utilizării microorganimelor constau în:

- microorganismele se pot obţine în cantităţi mari (biomasă) prin cultivare în


instalaţii speciale pe medii de cultură ieftine (tărâţă de grâu, extract de porumb, melasă, şroturi de
soia sau floarea soarelui, zer),

- ciclul de dezvoltare al microorganismelor este foarte scurt faţă de cel al


plantelor sau animalelor;

- producţia de enzime de către microorganisme poate fi mărită prin


selectarea şi utilizarea de tulpini mutante, înalt performante (productive) şi prin stabilirea
condiţiilor optime fizice şi chimice pentru producerea de enzime;
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 8
starter de microorganisme.
- proprietăţile enzimelor şi specificitatea de acţiune diferă cu natura
microorganismelor producătoare, astfel industrial se pot obţine preparate care corespund întocmai
scopului dorit.

- preparatele enzimatice obţinute pot avea activităţi diferite cu predominanţa


unei activităţi.

1.2.3. Tehnologii de obţinere a preparatelor enzimatice

Schema tehnologică generală de obţinere a preparatelor enzimatice este prezentată în figura


Tehnologia de obţinere a preparatelor enzimatice implică operaţiile indicate în schema prezentată în
fig. 1.4. din care rezultă ca preparatele enzimatice pot fi obţinute sub formă de:

- preparate enzimatice brute-uscate;

- preparate enzimatice brute – lichide concentrate;

- preparate enzimatice purificate – concentrate, respectiv şi uscate.


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 9
starter de microorganisme.
Fig. 1.4. Schema tehnologică generală de obţinere a preparatelor enzimatice

Procesele biotehnologice de obţinere a preparatelor microbiene sunt complexe, realizarea lor


presupune parcurgerea a trei etape:

1. Pregătirea mediului de cultură, prin prelucrarea mecanică şi fizico chimică a materiilor prime
ce intră în compoziţia mediului de cultură (fermentativ). Această etapă presupune operaţii de
dozare, mărunţire, solubilizare, sterilizare etc.

2. Etapa biologică care constă în obţinerea culturilor starter intermediare şi a culturii de


producţie, urmată de etapa fermentativă prorpiu-zisă.

3. Etapa de separare, purificare şi standardizare a enzimelor.


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 10
starter de microorganisme.

Fig. 1.5. Schema bloc pe operaţii de obţinere a preparatelor enzimatice microbiene brute
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 11
starter de microorganisme.

Pregătirea mediului de cultură

Materii prime utilizate pentru fabricarea mediilor de cultură.

Materiile prime trebuie să asigure principalii nutrienţi microorganismelor în vederea dezvoltării lor în
timpul fermentaţiei.

Surse de carbon. Principala sursă de carbon ( sursă de energie) pentru microorganisme o constituie
glucidele, sub formă de glucoză, fructoză, galactoză care sunt uşor asimilabile, în timp ce maltoză,
zaharoza şi lactoza sunt asimilate doar dacă microorganismele posedă enzime capabile să le
transforme în monoglucide. Poliglucidele pot fi utilizate doar de către microorganismele apte să
sitetizeze enzimele care să le hidrolizeze extracelular în monoglucide capabili să difuzeze prin
membrana celulară.

Ca surse de carbon în reţetele mediilor industriale se folosesc:

- melasele care provin de la rafinarea zahărului. În funcţie de tipul de melasă


(sfeclă sau trestie) diferă şi compoziţia în glucide. Melasa de trestie conţine aproximativ 50%
glucide totale (din care 30% zaharoză, 15% zahăr invertit şi 5% glucide nefermentescibile). În
timp ce melasa de sfeclă conţine 50% glucide totale din care 47% zaharoză, 2% hazăr invertit şi
1% glucide nefermentescibile. Melasele mai conţin şi alţi compuşi cu carbon (gume, pentozani
etc), compuşi cu azot (proteine, aminoacizi), săruri minerale şi vitamine.

- Extractul de porumb, este reprezentat de extractul obţinut din industria


amidonului după ce suferă o concentrare până la 50% S.U. pe lîngă zaharuri simple extractul
apos mai conţine şi acid lactic obţinut ca urmare a dezvoltării bacteriilor lactice.

- Leşiile sulfitice provin din industria hârtiei ca urmate a transformării masei


lemnoase în pulpă celulozică sub acţiunea bisulfitului de calciu. Leşiile bisulfitice au un conţinut
de 10% S.U., din care 20% glucide simple.

Surse de azot. Azotul din mediul de cultură are rol anabolic, participând la biosinteza proteinelor
structurale, a enzimelor şi acizilor nucleici. Principalele surse de azot sunt:

- azot anorganic: amoniac, săruri de amoniu, sulfatul de amoniu, forfatul acid de diamoniu,

- azot organic: hidrolizate proteice de cazeină, soia, carne etc.

Surse de ioni anorganici.


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 12
starter de microorganisme.
Pentru dezvoltarea microorganimelor în timpul procesului de fermentaţie este necesară prezenţa
ionilor anorganici, aceştia reprezintă circa 8% din substanţa urcată a a celulelor microbiene.
Principalii ioni anorganici care trebuie să fie prezenţi în mediul de cultură sunt: macronutrienţii ( azot,
fosfor, sulf, potasiu, şi magneziu) şi micronutrienţii (sodiu, calciu, clor, fier, cobalt, zinc, molibden,
cupru, mangan, nichel şi seleniu).

Surse de factori de creştere. Factorii de creştere sunt compuşi organici a căror prezenţă în mediul
de cultură este necesară în cantităţi mici, având un rol catalitic sau structural pentru microorganisme.
Factorii de creştere includ vitaminele, purine, pirimidine, nucleotide şi nucleozide, aminoacizi, acizi
graşi, steroli şi poliamide.

Principalele vitamine necesare ca factori de creştere sunt: biotina, acid pantotenic, acidul nicotinic,
tiamina.

Tratementul termic al mediilor de cultură. Pentru buna desfăşurare a procesului de fermentaţie


este necesară cultivarea microorgnimelor pe un mediu de cultură steril pentru a preveni
contaminarea. Sterilizarea mediului de cultură se poate realiza direct în bioreatorul în care se
realizează fermentaţia sau într-un vas sub presiune separat, ulterior fiind transferat în bioreactor.

Etapa biologică.

Obţinerea culturilor starter de producţie

Pentru producerea enzimelor, fermentaţiile industriale se desfăşoară în volume de 150 – 250 de mc


de mediu, motiv pentru care trebuie pregătită o cantitate suficientă de inocul. Cultura folosită drept
inocul trebuie să fie în faza exponenţială de creştere. La microorganismele care au viteză de creştere
redusă, se recomandă să se folosească o cantitate mai mare de inocul, pentru a se reduce durata
iniţieirii fermentaţiei. Cultura starter de producţie trebuie să conţină celule active, adaptate la mediul
industrial pentru ca fermentaţia să se declanşeze rapid. În cazul fermentaţiilor desfăşurate pe mediul
solid, pentru care se utilizează inocule sporifere se recomandă să se asigure prin inoculare
concentraţii de 105-106 spori pe g mediu, iar în cazul celor submerse cultura starter de producţie să fie
de circa 10% din mediul de cultură.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 13
starter de microorganisme.

Fig. 1.6. Etape pentru obţinere culturilor starter de producţie

Tehnici de fermentaţie
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 14
starter de microorganisme.
Pentru producţia de preparate enzimatice de origine microbiană se poate aplica două tehnici
de bază :

- fermentaţia de suprafaţă în care se utilizează un mediu solid pe care se cultivă


microorganismul (de regulă un mucegai filamentos). Această tehnică are avantajul că
mediul de cultură va deveni un mediu bogat în activitate enzimatică ;

- fermentaţia de submersă, în care mediul este lichid ce se află într-un reactor unde toţi
parametrii fermentaţiei sunt perfect controlaţi. Această ultimă tehnică este superioară
primei metode din punct de vedere tehnologic şi biochimic.

Printre speciile de microorganisme ce se folosesc menţionăm următoarele : Aspergillus niger,


Aspergillus oryzae, Mucor miehei, Saccharomyces cerevisiae, Endothia parasitica, Penicillium
emersonii, Kluyveromyces lactis, Bacillus amylolichefaciens, Bacillus licheniformis, Bacillus
stearothermophilus, Actinoplanes missouriens, Klebsiella planicola.

La sfârşitul fermentaţiei microorganismul trebuie distrus cu condiţia păstrării intacte a activităţii


enzimatice.

Aspecte biologice ale fermentaţiei principale. În cursul fermentaţiei microorganismul utilizat


se va dezvolta şi va produce enzimă, cele două procese putând fi simultane sau câteodată
complet separate.

Se pot întâlni trei tipuri de situaţii :

• Tipul I : creşterea şi producţia de enzime sunt asociate ;

• Tipul II : producţia de enzime continuă chiar după faza de creştere ;

• Tipul III : există o fază de latenţă între producţia de enzime şi creşterea microorganismelor
în mediul de cultură.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 15
starter de microorganisme.

Figura 1.7. Diferite evolutii ale concentraţiei de celule şi enzime

Aspectele biochimice ale fermentaţiei principale. Celulele microbiene utilizează foarte mult
oxigen pentru producţia de biomasă/ enzime şi anume 3 - 10 tone oxigen pentru un
3
fermentator de 100 m , precum şi substanţe nutritive în mediu de fermentaţie pentru dezvoltare
(creştere de la 1 la 10 8 în 5 – 10 zile de dezvoltare). Rezultatul este producţia de biomasă, de
CO2 şi căldură (2.106 – 6,5.106 KJ/h) iar secreţia de metaboliţi şi enzime extracelulare este de
0,1 – 40 g/l, în funcţie de caz.

Microorganismele din cultivate pot produce enzime extracelular sau intracelular. În funcţie de tipul
acestora variază şi procedeul de extracţie.

În ceea ce priveşte tipurile de culturi submerse, ne putem situa în unul din următoarele
cazuri:

Procedeul nealimentat, în care caz toate ingredientele mediului de fermentare sunt pregătite
în fermentator la pH-ul şi temperatura dorită înainte de a introduce inoculum. După
introducerea inoculum, fermentaţia principală începe şi finalizarea ei se urmăreşte prin
prelevarea de probe, în mod steril, care arată :

-creşterea microorganismelor (biomasă, vâscozitatea mediului) ;

-concentraţia în enzimă (activitatea enzimatică a mediului) ;

-consumul de glucide ;

-nivelul de proteine.

La procedeul nealimentat se pot monta diferiţi senzori care arată :

-pH-ul – care se poate regla prin adaus de baze sau acid ;


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 16
starter de microorganisme.
-temperatura – care se poate regla prin debitul de circulaţie al apei reci în mantaua
fermentatorului sau în serpentina din interiorul fermentatorului ;

-nivelul de spumă – care se poate combate cu un antispumant aflat într-un rezervor


ataşat fermentatorului ;

-presiunea – care se reglează prin supape care se deschid la presiuni de 1 până la 3


bar ;

-coeficientul respirator QR – care se măsoară prin cantitatea de CO2 produsă faţă de


cantitatea de oxigen consumată ;

-nivelul de oxigen consumat, pornind de la analiza efluenţilor.

Procedeul alimentat, în care se începe cu un volum de 10 – 30% de substrat în care se


introduce inoculum, după care fermentatorul se alimentează cu restul de mediu, după care
oprirea fermentaţiei se face după un anumit timp fixat experimental.

Acest procedeu se aplică în cazul în care sinteza enzimelor ar fi reprimată de concentraţiile


ridicate într-unul din nutrienţii mediului de cultură sau în cazul când creşterea
microorganismelor, în funcţie de concentraţia în unul din componenţii mediului, ar provoca
creşterea vâscozităţii, care trebuie să fie reglată în timp.

Alimentarea fermentatorului poate fi repetată de mai multe ori efectuându-se sutiraje (evacuări)
programate, dar întotdeauna trebuie lăsat în fermentator un volum de ≤ 30%, care serveşte în
acest caz drept cultură de producţie.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 17
starter de microorganisme.

Fig. 1.8. Cultivarea submersă a microorganismelor.

Procedeul continuu necesită alimentarea continuă a fermentatorului cu mediu şi folosirea


unei culturi concentrate de microorganisme. În acest caz, bioreactorul (fermentatorul) de
dezvoltare a celulelor este cuplat cu o unitate de micro sau ultrafiltrare. În figura 1.9. se arată
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 18
starter de microorganisme.
schiţa unei astfel de instalaţii formată dintr-un bioreactor cuplat cu o unitate de ultrafiltrare la
care există şi posibilitatea de a recicla biomasa.

Fig. 1.9. Procedeul continuu

Avantajele unui astfel de procedeu sunt următoarele :

-se poate detoxifica mediul de cultură prin eliminarea produsului de inhibare ;

-celulele reciclate devin perfuzate ;

-cantitatea de mediu de cultură care se introduce în bioreactor este controlată


de cantitatea de permeat care traversează membrana de ultrafiltrare ;

-celulele au posibilitatea de a se dezvolta până la concentraţii relativ mari (∼


300 g substanţă uscată/l, în cazul drojdiilor) ;

-aceste concentraţii mari de celule se constituie ca o barieră eficace faţă de


contaminarea exterioară ;

-retenatul poate fi evacuat şi el periodic, fiind constituit din biomasă care conţine
enzime intracelulare, după care este trecut la prelucrare ulterioară (extracţie) ;
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 19
starter de microorganisme.
-permeatul de la ultrafiltrare, care conţine enzime nu mai are celule microbiene
şi poate fi, deci, stocat sau dirijat direct la o operaţie în aval de purificare sau concentrare.

Neajunsurile acestui procedeu de obţinere a biomasei şi enzimelor sunt următoarele :

-membranele trebuie să fie rezistente la sterilizarea cu vapori de apă şi la


igienizare cu substanţe chimice ;

-costurile energetice sunt destul de ridicate;

-mediul de cultură poate fi colmatant pentru membrana de ultrafiltrare;

-chiar la densităţi mari de celule, la sfârşitul ciclului de dezvoltare este posibilă


o oarecare liză a celulelor, ceea ce face necesară o purjare a bioreactorului prin unitatea de
ultrafiltrare, fapt care conduce la micşorarea vârstei medii a celulelor care rămân în sistem.

O variantă a procedeului continuu de obţinere a biomasei/ enzimelor constă în folosirea


bioreactorului cu membrană.

Etapa de separare a enzimelor

Extracţia. La procedeul discontinuu (nealimentat) şi cel alimentat, după terminarea fermentaţiei


se separă partea solidă insolubilă (celule şi produse insolubile) de partea lichidă care conţine
enzimele, separare care se poate face prin centrifugare, filtrare frontală sau microfiltrare. Soluţia
sterilă obţinută este apoi ultrafiltrată pentru a concentra enzimele. În cazul în care enzimele
sunt destinate a intra în compoziţia unui preparat comercial lichid, ultrafiltratul se stabilizează
cu polioli (sorbitol, glicerol) şi/sau săruri (NaCl, MgSO 4), respectiv se adaugă bacteriostatici
alimentari (benzoat, sorbat, ascorbat).

În cazul în care enzima (enzimele) intră în compoziţia unui preparat comercial pulbere,
ultrafiltratul se suplimentează cu un suport şi se usucă prin atomizare (suplimentarea se face
cu amidon, dextrine). Înainte de atomizare mai poate fi realizată o filtrare sterilă.

Pentru a obţine şi enzimele intracelulare, biomasa din fermentator, separată de partea


lichidă, este supusă lizei. Liza poate fi realizată chiar de enzimele proprii microorganismelor ce
alcătuiesc biomasa, fie prin folosirea de preparate exogene, cum ar fi lizozimul din albuşul de
ou, preparate enzimatice exogene complexe de natură bacteriană care conţin chitinază,
mananază, α -1,6–glucanază, proteaze, câteodată în combinaţie cu adaosul de metabisulfit.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 20
starter de microorganisme.
În cazul în care enzima este periplasmică, un şoc osmotic este suficient pentru a
elibera enzimele. Se poate realiza şi o liză mecanică (folosire de presiuni mari de 600 – 1000
bar, urmată de detenta brutală) Se pot folosi şi ultrasunetele cu frecvenţe mai mari de 20
MHz pentru liza celulelor şi deci pentru eliberarea enzimelor intracelulare. Odată eliberate,
enzimele intracelulare sunt supuse operaţiilor aplicate şi enzimelor extracelulare.

Preparatele enzimatice se comercializează de regulă sub formă de pulbere, de microgranule,


precum şi sub formă lichidă.

Preparatele enzimatice sub formă de pulbere sunt formulate cu un suport cum ar fi amidonul,
maltodextrinele, zahărul, sarea. La aceste preparate se controlează granulometria, umiditatea (∼
6%). Suportul trebuie să nu fie higroscopic pentru a se evita formarea de cocoloaşe. În
preparatele comerciale pulbere sau lichide, conţinutul de enzimă este redus raportat la suport
şi de aceea cantitatea de preparat comercial este mult mai mare, în comparaţie cu nivelul de
enzimă conţinut

În ceea ce priveşte preparatele comerciale microgranulate, acestea se obţin dintr-un ultrafiltrat


care se amestecă cu un suport (sare, amidon solubil, maltodextrine etc.). Cantitatea de substrat
este astfel calculată încât să se obţină titrul enzimatic dorit în microgranule. Amestecul
respectiv este pulverizat împreună cu un agent liant care reprezintă 0,1% până la 0,5% faţă
de masa suportului. Picăturile pulverizate sunt uscate într-un turn de uscare, cu aer la 70 -
90°C.

Preparatele comerciale lichide sunt formulate în general cu polioli (gliceroli, sorbitol) care se
utilizează în proporţie de 20 – 50% faţă de preparatul lichid. La aceste formulări se adaogă o
substanţă bacteriostatică (de exemplu benzoat de sodiu în proporţie de 0,1 – 0,2%).

1.2.4. Enzime imobilizate

Imobilizarea unei enzime (sau a unui sistem multifuncţional) înseamnă legarea sau fixarea
acesteia de un suport care trebuie să îndeplinească următoarele condiţii :

-să fie insolubil în apă ;


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 21
starter de microorganisme.
-să asigure păstrarea proprietăţilor catalitice ale enzimelor, respectiv specificitatea de
acţiune ;

-să asigure acţiunea enzimei la un pH şi temperatură optime, apropiate de cele ale


enzimelor libere (neimobilizate).

Avantajele imobilizării enzimelor sunt următoarele :

• creşterea stabilităţii enzimei, ca proteină şi ca activitate catalitică. Această stabilitate este în


legătură cu diminuarea gradului de libertate al macromoleculei, ceea ce are consecinţă
asupra variaţiilor de conformaţie a enzimei (se diminuează aceste variaţii). Imobilizarea
conduce şi la creştere a concentraţiei locale a protein-enzimei care are un efect
stabilizant;

• se poate lucra în flux continuu din punct de vedere al catalizei enzimatice, dar şi din
punct de vedere al reglării automate a parametrilor de lucru;

• enzima nu pătrunde în substratul ce se tratează în cursul catalizei enzimatice;

• se poate modula micromediul în care acţionează enzima imobilizată (concentraţie substrat,


încărcarea suportului cu enzimă, grupările hidrofile);

• refolosirea treptată a enzimei, deci cu aceeaşi cantitate de enzimă se poate transforma o


cantitate mai mare de substrat;

• se poate lucra în sistem semicontinuu sau continuu, putându-se automatiza procesul, ceea
ce asigură un control riguros al parametrilor de lucru;

• are loc o creştere a vitezei de lucru, prin controlul riguros al vitezei fluxului de substrat şi
al concentraţiei acestuia;

• se poate stopa reacţia enzimatică la momentul dorit şi se evită trecerea enzimei în


produsul transformat;

• costurile globale de producţie sunt mai mici în comparaţie cu procedeele în care se


folosesc enzime libere;

• se pot folosi şi enzime care nu sunt trecute în liste GRAS (Generally Reconized as Safe);

Există şi dezavantaje, cum ar fi:


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 22
starter de microorganisme.
• costuri privind imobilizarea;

• pierderi ale activităţii enzimatice,

• o investiţie iniţială în utilaje mai mare,

• un proces mai complex din punct de vedere tehnic şi o supraveghere mai atentă;

• utilizarea numai a unor substraturi solubile.

Aspecte teoretice privind enzimele imobilizate.

În cazul enzimelor imobilizate se observă un comportament cinetic diferit faţă de cel al enzimelor
libere, solubile. Activitatea enzimatică scade ca urmare a imobilizării. Acest lucru se datorează
schimbărilor conformaţionale ale enzimei după imobilizare. O astfel de modificare apare în primul
rând în cazul legării covalente a enzimelor de suport. Un alt aspect este influenţa mediului, în cazul
enzimelor imobilizate acesta este diferit de cel apos. Astfel, grupările funcţionale acide

La imobilizare, în funcţie de enzimă şi catalizator se poate vorbi de :

- randament de fixare care reprezintă cantitatea efectivă de enzimă imobilizată în raport


cu cantitatea de enzimă introdusă în procesul de imobilizare :

enzimă fixată pe suport

η = · 100

enzimă utilizată

- randament de activitate care reprezintă activitatea reziduală a enzimei imobilizate:

Activitatea (E0) după fixare

· 100

Activitatea (E’0) înainte de fixare


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 23
starter de microorganisme.

Factorii critici care trebuie luaţi în consideraţie la folosirea enzimelor imobilizate

Aceşti factori se referă la :

- eficienţa economică a imobilizării determinate de : costul enzimei, costul suportului,


costul tehnicii de imobilizare ;

- activitatea enzimei imobilizate care este influenţată de : tehnica de imobilizare;


caracteristicile materialului suport, viteza de difuzie a substratului la enzimă şi a
produsului (lor) de transformare ;

- caracteristicile substratului ce trebuie transformat ;

- stabilitatea enzimei care trebuie menţinută activă un timp cât mai îndelungat ;

- contaminarea microbiologică a sistemului enzimă/suport în timpul utilizării reactorului


respectiv.

Metode de imobilizare a enzimelor


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 24
starter de microorganisme.

Figura 1.6. Metode de imobilizare a enzimelor

a) Metode fizice, la care enzima se leagă de un suport prin intermediul legăturilor


slabe sau relativ puternice (legături Van der Waals, legături de hidrogen, interacţiuni proteină –
proteină, legături ionice).

Imobilizarea în cadrul metodelor fizice poate fi :

- prin adsorbţie pe suporturi organice : amidon, colagen, Sepharoză modificată, polistiren


modificat, răşini schimbătoare de ioni (DEAE celuloză, DEAE Sephadex, carboximetil-
celuloză, Amberlit, Dowex 50 etc.) ;

- prin adsorbţie pe suporturi minerale : alumină, argilă (bentonită, montmonirolită etc.),


ceramică, hidroxiapatită, sticlă poroasă sau silice poroasă, titanit (punţi metalice cu
TiCl4).

Adsorbţia se realizează prin contactul dintre o soluţie apoasă de enzimă cu suportul solid şi
va fi influenţată de : pH, tipul de solvent utilizat pentru solubilizarea enzimei, puterea ionică,
calitatea enzimei, temperatura şi durata de contact a enzimei cu suportul. Practic imobilizarea
se face prin amestecul dintre soluţia de enzimă şi suport într-un reactor cu agitator sau prin
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 25
starter de microorganisme.
trecerea soluţiei de enzimă într-o coloană în care suportul este menţinut sub forma unui pat.
Adsorbţia enzimei de suport poate fi îmbunătăţită prin ataşarea de suport a unor cofactori,
cum ar fi piridoxal-fosfatul sau lanţuri cu grupări hidrofile.

Adsorbţia este influenţată de raportul dintre suprafaţa şi volumul suportului, mărimea


particulelor, raportul dintre grupările hidrofile şi hidrofobe.

Avantajele şi dezavantajele imobilizării prin adsorbţie

Avantaje

• Simplicitate în execuţie (incubarea enzimei cu suportul, agitare câteva minute, enzima care
rămâne în soluţie fiind eliminată prin spălare)

• Absenţa reacţiilor chimice (numai dacă nu se formează punţi metalice)

• Posibilitatea de regenerare a complexului enzimă/suport

Dezavantaje

• Stabilizare slabă

• Riscul de desorbţie a enzimei de către : fluxul de substrat, variaţie lejeră de pH, forţa
ionică, temperatură

-prin includere într-un suport, în care caz se pot include şi microorganisme. Includerea
poate fi făcută în gel, microincapsulare, includere în fibre.

Avantajele şi dezavantajele imobilizării enzimelor prin incluziune


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 26
starter de microorganisme.
Avantaje

• Reacţiile de polimerizare sau gelificare sunt bine cunoscute

• Reacţiile chimice dintre suport şi enzimă sunt limitate (enzima este inclusă în geluri
naturale)

• Se poate aplica la toate enzimele (chiar şi la amestec de enzime)

• Se pot folosi suporturi cu forme diferite : filme, fibre, bile.

• Riscul de “evadare” a enzimei este redus prin reticularea suportului după imobilizare

Dezavantaje

• Anumite polimerizări necesită agenţi denaturanţi sau radicalici

• Se pun probleme de transfer de masă (inaccesibilitatea unor substraturi la enzimă)

• Riscul de evadare al enzimei prin micropori

• Proprietăţile mecanice ale gelurilor sunt nesatisfăcătoare

b) Metode chimice de imobilizare, în care caz imobilizarea se face prin intermediul


legăturilor covalente de suporturi insolubile, care posedă grupări reactive sau care pot fi
activate prin diferite reacţii chimice. Se poate realiza imobilizarea şi prin copolimerizarea
enzimelor cu un monomer reactiv şi legarea încrucişată (Cross-linking) sau reticulară intra şi
intermoleculară a enzimelor de un suport prin intermediul unui reactiv multifuncţional.

La legarea prin legături covalente, imobilizarea poate fi făcută : prin fixare de un suport
insolubil, dar trebuie să se ţină seama de gruparea funcţională care poate reacţiona cu
protein-enzima şi de caracteristicile fizico-chimice ale suportului. Adesea este necesar să se
creeze, pe cale chimică, funcţii reactive pe suport; prin coreticulare utilizând agenţi bi- sau
polifuncţionali. Cel mai mult utilizată pentru reticulare este glutaraldehida.

Avantajele şi dezavantajele legării enzimelor de suport prin legături covalente


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 27
starter de microorganisme.
Avantaje

• Stabilitate mărită datorită faptului că legăturile covalente sunt cele mai puternice dintre
toate legăturile menţionate anterior

• Varietatea mare a suporturilor : sticlă, silice, ceramică, celuloză, polimeri sintetici etc.

• Posibilitatea de a efectua imobilizarea în prezenţa unui substrat pentru a se evita


inactivarea (protecţia situsului activ).

Dezavantaje

• Trebuie realizate reacţii chimice, adesea complexe

• Etapa de activare a suportului este lungă

• Randamentul de fixare este < 100%

• Există riscul modificării chimice a enzimei (pierdere de activitate)

• Este necesar ca enzima să fie purificată în prealabil

• Investiţia (costul) este importantă

Suporturi de imobilizare comerciale

Suporturile comerciale cele mai des utilizate pentru imobilizarea enzimelor sunt :

- polizaharide : agaroză, celuloză şi derivaţi, alginaţi, carageenani, dextrani ;

- poliacrilamide utilizate sub formă de bile ;

- polistiren (bile şi tuburi) ;

- silicea şi sticla poroasă.

1.2.5. CONDIŢIILE DE INOCUITATE PE CARE TEBUIE SĂ LE ÎNDEPLINEASCĂ


PREPARATELE ENZIMATICE

• Număr total de germeni (NTG), maximum 5.104/g ;


• Coliformi, maximum 30/g ;
• Escherichia coli – absent/ 25 g ;
• Salmonella – absent/ 25 g ;
• Activitate antibiotică de origine microbiană – absentă ;
• Aflatoxina B1, ochratoxină A, sterigmatocistină, toxina T – 2 (zearalenona) în cazul preparatelor
de origine microbiană – absente ;
• Metale grele :
-arseniu < 3 mg/Kg ;
-plumb < 10 mg/Kg ;
-alte metale grele < 40 mg/Kg (exprimată la Pb).
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 28
starter de microorganisme.

1.3. CULTURI STARTER DE MICROORGANISME

Microorganismele sunt utilizate în industria alimentară pentru:

- Obţinerea de celule (culturi starter = culturi pure) care la rândul lor sunt folosite pentru
fermentarea produselor lactate acide sau brânzeturi, la fabricarea produselor de carne (salamuri
crude uscate), produse tradiţionale vegetale, produse lactate acide, pâine etc. În acest produsele
se consumă fie împreună cu celulele respective fie după îndepărtarea celulelor cum este cazul
băuturilor de tipul berii, vinului.

- Obţinerea de biomasă care poate fi utilizată ca ingredient de fermentare (drojdia de panificaţie )


sau de îmbogăţire a unor produse alimentare cu proteine, respectiv ca furaje proteice pentru
păsări, peşte, porcine.

În ceea ce priveşte metodele de cultivare ale microorganismelor se folosesc metode periodice


(discontinui) şi metode continui, în ambele cazuri fiind necesară optimizarea.

• Metoda periodică de cultivare a microorganismelor prevede alimentarea continuă a aparatului


de cultivare cu substanţe nutritive şi înlăturarea culturii de microorganisme. În acest fel, se creează
condiţii optime de acumulare a cantităţii necesare de biomasă sau a metaboliţilor. La cultivarea
periodică concentraţia substanţelor nutritive scade, iar cea a celulelor şi metaboliţilor creşte, fapt care
conduce la modificarea cineticii creşterii microorganismelor.

La metoda periodică trebuie să avem în vedere două situaţii şi anume:

- când substratul este inhibitor pentru producţia de biomasă şi metaboliţi;

- când produsul este inhibitor.

Prima situaţie se întâlneşte la obţinerea biomasei de drojdie de panificaţie, represiunea catabolică de


către glucide antrenează şi o producţie de alcool etilic, producţie ce trebuie evitată prin două soluţii şi
anume: evitarea excesului de substrat şi lucru cu cultura “în pat” şi respectiv plasarea unui detector
de alcool în efluentul de gaz (CO2) care permite să se cunoască ce aport de substrat trebuie furnizat.

A doua situaţie se întâlneşte la producţia de culturi lactice a căror dezvoltare este însoţită de
acumularea de acid lactic ( bacterii lactice homofermentative) sau acid lactic şi acetic (bacterii lactice
heterofermentative).

Soluţia care se impune în acest caz este o dializă a culturii sau centrifugarea substratului cu celule,
celulele fiind apoi reciclate.

Dacă dezvoltarea culturii are loc fără acumularea de metaboliţi, alimentarea cu substrat se poate face
la un debit constant, dar la o concentraţie crescătoare a acestuia, respectiv la o concentraţie
constantă a substratului dar la un debit programat exponenţial.

• Metoda continuă, în care caz are loc alimentarea constantă a aparatului de cultivare a
microorganismelor cu substanţe nutritive şi eliminarea neîntreruptă a biomasei sau metaboliţilor.
Această metodă poate fi realizată prin cultivarea de suprafaţă sau de adâncime a microorganismelor.

La fermentarea continuă se are în vedere natura catalizatorului (imobilizat sau nu; sistem eterogen
sau nu; celule incluse, adsorbite, grefate prin covalenţă); gradul de reciclare al celulelor microbiene;
gradul de amestecare a fluidelor în reactorul cu funcţionare continuă.

Creşterea concentraţiei de celule se poate realiza prin: folosirea tehnicilor de membrană sau
centrifugarea; folosirea de celule imobilizate; reciclarea celulelor.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 29
starter de microorganisme.

1.3.1. GRUPE DE MICROORGANISME UTILIZATE ÎN INDUSTRIA ALIMENTARĂ

Bacteriile utilizate în industria alimentară aparţin următoarelor genuri:

• Genul Streptococcus Acest gen cuprinde specii de bacterii sub formă de coci sferici sau ovali
cu φ < 2µ , grupate în diplo sau formă de lanţuri. Sunt Gram pozitive, facultativ anaerobe, neciliate,
nesporulate, unele specii fiind capsulate.

Importanţi pentru industria alimentară sunt:


- Streptococii mezofili : Streptococcus lactis (Lactococcus lactis subsp. lactis), Str. cremoris
(Lactococcus lactis subsp. cremoris), Str. diacetilactis (Lactococcus lactis subsp. diacetilactis);
- Streptococii termofili: Str. thermophilus.
Aceşti streptococi lactici sunt homofermentativi, produc acid lactic L(+) şi prezintă următoarele
activităţi:
- activitate fermentativă: fermentează lactoza şi glucoza;
- activitate proteolitică;
- produc diacetil şi acetoină din acid citric ( în principal Str. diacetilactis).

Fermentarea lactozei de către streptococii lactici se face prin transformarea iniţială a acesteia în
glucoză şi galactoză – 6P prin intermediul fosfo-β -galactozidazei. În continuare, glucoza este apoi
fermentată pe calea hexozo – difosfatului în acid lactic, iar galactoza – 6P este utilizată pe calea
tagatozei în vederea producerii unei cantităţi suplimentare de acid lactic (fig. 1.7.).

Figura 1.7. Calea tagatozei de degradare a lactozei de către streptococii lactici


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 30
starter de microorganisme.
Fermentarea glucozei de către streptococii lactici poate fi făcută pe cale homofermentativă cu
producerea în principal de acid lactic şi pe cale heterofermentativă, în condiţile în care glucoza este
limitată, calea heterofermentativă fiind calea ribulozei – 5P cu formare de acid acetic, etanol şi acid
lactic (fig. 1.8.).

Figura 1.8. Calea homo şi heterofermentativă de degradare a glucozei de către bacteriile lactice
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 31
starter de microorganisme.
Fermentarea acidului citric cu formare de diacetil, acetoină şi 2,3 butilenglicol este arătată în figura
1.9. Acelaşi mecanism îl folosesc şi leuconostocii.

Figura 1.9. Transformarea citratului de către Str. lactis subsp. diacetilactis şi Leuconostoc

Streptococii conţin plasmide (aproximativ 14 plasmide), cele mai importante fiind cele cadifice:
- fermentarea lactozei,
- producerea de enzime proteolitice;
- utilizarea acidului citric
- rezistenţa la săruri anorganice,
- producţia de nizină.
Performanţa streptococilor ( lactococilor) este influenţată de mai mulţi factori, după cum urmează:

Prezenţa inhibitorilor Ca inhibitori din lapte pot acţiona: nizina produsă de unele tulpini de Str. lactis;
aportul neadecvat de produşi de scindare ai proteinelor necesari creşterii; antibioticele din lapte
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 32
starter de microorganisme.
(penicilina) care provin din antibioticele folosite la tratarea unor boli ale vacilor de lapte (de exemplu
mastita).

Incompatibilitatea dintre tulpini Poate să apară o incompatibilitate în culturi ce conţin tulpini diferite. La
o cultivare repetată a acestor culturi cu tulpini diferite de streptococi poate să aibă loc reducerea
numărului unor tulpini, astfel încât în cultură rămâne tulpina cea mai agresivă. Factorii care determină
selectarea sunt:

- diferenţele în ceea ce priveşte durata unei generaţii;

- sensibilitatea la acid lactic;

- producerea de substanţe bacteriocine de către unele tulpini care sunt factori de inhibare pentru
alte tulpini;

- diferenţe în ceea ce priveşte temperatura optimă de dezvoltare;

- diferenţa în ceea ce priveşte viteza de pierdere a unor plasmide.

Avantajul folosirii unei culturi conţinând mai multe tulpini de streptococi constă în rezistenţa diferită la
bacteriofagi a diferitelor tulpini din cultură.

Temperatura Există o diferenţă de temperatură optimă între specii, de exemplu între Str. lactis şi Str.
cremoris, ceea ce poate conduce la predominanţa uneia faţă de cealaltă la o anumită temperatură
optimă. Pentru o cultură cu multe specii sau tulpini de streptococi se recomandă o temperatură de
incubare de 27°C pentru a se minimaliza efectele de dominare a unei specii asupra alteia.
Temperatura optimă pentru streptococii lactici este de aproximativ 30°C.

pH-ul Streptococii lactici produc mai mult de 10% acid lactic/min, raportat la greutatea lor. Se
consideră că pH-ul are influenţă mai redusă asupra diferitelor tulpini de streptococi atâta timp cât
plasmidele respective nu au fost afectate.

Mediul de creştere Sunt streptococi care se dezvoltă mai rapid iar alţii mai lent. Cei care se dezvoltă
lent sunt cei care nu coagulează laptele degresat la temperatura de coagulare de 21-22°C în 18 ore.
Cei care se dezvoltă rapid sunt cei care coagulează laptele atunci când sunt inoculaţi în proporţie de
1%. Culturile rapide sunt mai proteolitice decât cele lente. Cele două tipuri de culturi (rapide şi lente)
pot fi diferenţiate prin creştere pe medii de cultură diferite.

Formarea de capsule şi polizaharide Streptococii lactici care se dezvoltă în laptele crud pot conduce
la formarea unui coagul gros datorită formării de capsule sau de polizaharide. Aşa este cazul lui Str.
lactis var. hollandicus.

Depozitarea Atunci când culturile de streptococi se păstrează în prezenţa acidului lactic pe care l-au
produs, streptococii respectivi pot suferi deteriorări, inclusiv pierdere de plasmide, ceea ce va
conduce în final la creşterea proporţiei de celule lente care nu mai pot fi folosite la fermentaţia lactică
a laptelui.

Culturile mature proaspete trebuie păstrate la 2-5°C. Cele congelate la -40°C sau uscate prin liofilizare
pot fi distruse chiar în proporţie de 90-95%; cea mai bună păstrare se realizează într-un antigel
subrăcit (glicerol, propilenglicol).

• Genul Leuconostoc Acest gen cuprinde bacterii cu formă sferică, lenticulară, grupate în
perechi sau lanţuri, imobile, asporogene, Gram negative, facultativ anaerobe.

Pentru dezvoltare, leuconostocii au nevoie de vitamine (acid nicotinic, tiamină, biotină) şi zaharuri
fermentescibile. Nu sunt proteolitici şi nu reduc azotaţii. Specii de Leuconostoc formează polimeri
(dextran). Se dezvoltă bine la 20-30°C.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 33
starter de microorganisme.
Genul Leuconostoc cuprinde speciile: Leuconostoc cremoris (citrovorum); Leuconostoc lactis;
Leuconostoc dextranicum; Leuconostoc mezenteroides.

Aceste specii sunt heterofermentative şi se dezvoltă greu în laptele fără adaos de stimulatori. În
produsele lactate, leuconostocii au două funcţii de bază: produc compuşi de aromă (diacetil,
acetoină); produc ochiuri de fermentare prin formare de CO2 în unele tipuri de brânzeturi (Edam,
Goude, Tilsit). Ambele funcţii sunt realizate prin metabolismul citratului, dar leuconostocii produc CO2
şi din lactoză. Leuconostocii intervin deci în metabolismul glucidelor şi al citratului.

Metabolismul glucidelor Fermentarea glucidelor de către leuconostoci se face pe calea


fosfocetohexozelor, dintr-un mol de hexoză regenerându-se câte un mol de ATP. Genele care
codifică etapele iniţiale ale fermentării lactozei (ca de altfel şi ale metabolizării citratului, producerii de
proteaze) sunt localizate în plasmide.

Metabolismul citratului Metabolismul citratului de către leuconostoci este acelaşi ca şi la streptococi


cu menţiunea că leuconostocii produc diacetil şi acetoină la pH scăzut. Acetoina se poate forma pe
două căi:

- prin decarboxilarea acetolactatului;

- din diacetil prin intermediul diacetil reductazei, într-o reacţie care necesită NADH sau NADPH.
Această ultimă cale este redusă sau chiar lipseşte în cazul lui Str. diacetilactis, din cauza capacităţii
limitate a acestuia de a produce acetil- CoA, unul din precursorii diacetilului.

În metabolismul glucidelor de către leuconostoci piruvatul este un produs intermediar (ca şi la


streptococi).

Totuşi, în cazul în care în mediu există citraţi sau o altă sursă de piruvat, nu se mai formează diacetil
şi acetoină din glucide. În prezenţa citratului, piruvatul se produce fără formare concomitentă de
NADH şi, în consecinţă, rezultă un exces de piruvat peste necesarul de reoxidare a NADH, exces
care este metabolizat la diacetil şi acetoină, ceea ce este diferit de fermentarea glucidelor, în care
caz, pentru fiecare mol de NADH format este necesar ca acesta să fie reoxidat în NAD+ pentru ca
fermentaţia să continue. Reoxidarea se face prin următoarele reacţii:

Piruvat + NADH Lactat + NAD+

Acetaldehida + NADH Etanol + NAD+

Există diferenţe semnificative între Str. diacetilactis şi Leuconostoc în ceea ce priveşte producerea de
diacetil, acetoină şi 2,3 butilenglicol. În absenţa citratului, Str. diacetilactis formează urme de acetoină
dar nu şi diacetil. În mediu conţinând citrat, Str. diacetilactis începe să formeze diacetil şi acetoină pe
măsura dezvoltării (faza logaritmică) ambii produşi ajungând la un nivel maxim în momentul dispariţiei
citratului.

Pe măsura acumulării diacetilului şi acetoinei se reprimă sinteza diacetilreductazei şi


acetoinreductazei, astfel încât reducerea diacetilului la acetoină şi a acetoinei la 2,3 butilenglicol este
nesemnificativă. În orice caz, producţia de acetoină este mai mare decât de diacetil, raportul dintre cei
doi compuşi fiind 43/1.

În cazul culturilor de Leuconostoc, producerea de diacetil şi acetoină nu are loc la pH neutru. În


condiţii de aciditate, Leuconostoc produce mai multă acetoină decât diacetil. Metabolismul citratului
are loc la pH 6,5 →4,3, optim fiind la 5,4.

Leuconostocii (ca de altfel şi lactobacilii) pot produce la unele brânzeturi unele defecte şi anume:

- crăparea pastei la brânza Cheddar ( defect numit “Blit opennes”);


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 34
starter de microorganisme.
- apariţia timpurie de gaze la brânza Goude (Str. diacetilactis poate produce şi el defectul de
“plutire” a coagulului, la brânza Cottage).

Aceste defecte se datorează formării de CO2. Pentru a se preveni defectul de “plutire” a coagulului,
brânza Cottage se fabrică cu o cultură care nu conţine Str. diacetilactis, adăugându-se apoi în brânza
obţinută o cultură de Leuconostoc citrovorum cultivată pe lapte cu adaos de citrat sau o cultură
concentrată de Leuconostoc citrovorum .

În afară de industria laptelui, leuconostocii se utilizează şi pentru:


- fermentarea unor produse vegetale (varză, castraveţi, măsline) intervenind în cadrul
microflorei spontane sau sub formă de culturi concentrate;
- fermentarea malolactică a vinurilor;
- producţia de dextran.
În industria laptelui se folosesc culturi lactice care conţin streptococi acidifianţi (Str. lactis şi Str.
cremoris), precum şi bacterii producătoare de aromă şi anume specii de Leuconostoc şi Str.
diacetilactis, ultimul fiind aromatizant şi acidifiant.

• Genul Pediococcus Acest gen aparţine familiei Streptococaceae şi cuprinde bacterii sub
formă de coci perechi sau tetrade ca rezultat al diviziunii alternative pe cele două planuri
perpendiculare. Metabolismul acestor bacterii este predominant fermentativ, homolactic. Se produce
acid lactic racemic (DL) din glucoză, fructoză, manoză. Sorbitolul şi amidonul nu sunt fermentaţi.
Pediococi nu lichefiază gelatina şi nu reduc NaNO3 la NaNO2. Sunt anaerobi – microaerofili şi au
necesităţi nutritive complexe. Multe specii sunt catalază-negative, dar se întâlnesc şi specii care au
activitate catalazică independentă de hem.

Principalele criterii de diferenţiere între diferitele specii de pediococi sunt menţionate în tabelul 3.8 din
care se observă că P.acidilacti şi P. pentosaceus se diferenţiază de P. cerevisiae prin faptul că primii
doi sunt microaerofili şi se dezvoltă la pH 7 şi la 37°C, în timp ce ultimul preferă condiţii anaerobe şi
se dezvoltă la pH 5.

P. acidilacti, în culturi starter, este utilizat pentru obţinerea de produse carnate fermentate la
temperaturi mai ridicate, deoarece are o dezvoltare bună la 42-52°C, producând rapid acidul lactic şi
deci scade efectiv pH-ul, produsul obţinut având gust acrişor. Atunci când se utilizează la fermentarea
unor produse de carne la temperatura de 16-27°C, producţia de acid lactic este mai lentă şi implicit se
pot dezvolta şi microorganismele care contaminează carnea, durata de fermentaţie fiind mai mare.

P. pentosaceus produce o fermentaţie rapidă când substratul conţine un glucid fermentescibil,


temperatura de fermentare fiind cuprinsă între 15-27°C.

Valorile pH realizate cu diferite specii de pediococi


Culturi starter Temperatura de Durata, ore pH-ul
incubare, °C
P. pentosaceus 26,7 20 5,0
P. acidilacti 26,7 38 5,65
P. pentosaceus 29,4 13 5,00
P. pentosaceus 29,4 28 5,40
Din tabelul de mai sus rezultă că P. pentosaceus este mai eficace în ceea ce priveşte producţia de
acid lactic atât la 26,7°C cât şi 29,4°C în comparaţie cu P. acidilactici.

Având în vedere că pediococii produc acid lactic şi bacteriocine, ei exercită o acţiune inhibitoare faţă
de microorganismele patogene şi cele de alterare (stafilocici, salmonele, Cl. botulinum, bacili,
enterobacterii gram negative, drojdii).
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 35
starter de microorganisme.
În produsele de carne fermentate, pediococii pot scade pH-ul de la 5,6 la 4,5-5,2 ceea ce face ca
proteinele să fie aduse aproape de punctul izoelectric fapt ce favorizează sinereza şi deci uscarea
produsului.

Acidul lactic produs contribuie la denaturarea proteinelor din carne ceea ce contribuie la realizarea
unei texturi ferme a produsului finit.

• Genul Lactobacillus Acest gen aparţine familiei Lactobacillaceae, conform manualului lui
Bergey. Această familie cuprinde bacterii sub formă de bastonaşe de lungimi şi grosimi variabile
precum şi cocobacili scurţi, aşezaţi obişnuit în lanţuri în faza de înmulţire logaritmică.

Sunt asporogene, imobile, Gram pozitive, anaerobe sau facultativ anaerobe. În general sunt catalază
–negative citocrom-oxidază –negative, nu reduc azotaţii, nu lichefiază gelatina. Au activitate
proteolitică şi lipolitică redusă. Glucidele cele mai bine fermentate sunt: lactoza, maltoza, zaharoza
(mai ales în faza de dezvoltare), apoi hexozele (glucoza, fructoza, galactoza).

Pentru dezvoltare necesită substanţe minerale şi toate vitaminele din grupul B. Se dezvoltă bine în
mediu cu pH 5,5-5,8 dar şi la pH ≤ 5 . Se pot dezvolta în limite largi de temperatură (5-53°C), dar
temperatura optimă este cuprinsă între 30 şi 45°C.

În funcţie de temperatura optimă de dezvoltare lactobacilii pot fi:


- termofili: L. lactis, L. helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, temperatura optimă fiind 37-45°C;
- mezofili: L. casei, L. plantarum, L. brevis etc.; temperatura optimă de dezvoltare fiind 26-30°C.
Orla Jensen a împărţit genul Lactobacillus în următoarele grupe:

- grupa Thermobacterium care cuprinde lactobacili homofermentativi termofili: L. lactis, L.


helveticus, L. bulgaricus, L. acidophilus, L. delbrueckii; L. leichmanii;
- grupa Streptobacterium – care cuprinde lactobacilii homofermentativi mezofili: L. casei, L,
plantarum;
- grupa: Betabacterium – care cuprinde lactobacili heterofermentativi, ce contaminează frecvent
brânzeturile: L fermenti, L. buchneri, L. brevis, L. viridiscens.
Streptobacteriile la rândul lor, au fost clasificate de către unii autori în neacidorezistente şi
acidorezistente.

Lactobacilii neacidorezistenţi produc compuşi aromatici (diacetil, acetoină). Se prezintă sub formă de
bastonaşe de lungimi variabile şi rar formează lanţuri .

Se pot dezvolta la 2-15°C. Nu se dezvoltă la pH < 5,6. Se utilizează în culturi starter la fermentarea
salamurilor crude cu pH = 5,6 – 6,1, produsele având o durată mare de maturare, iar gustul final fiind
slab acrişor dulceag.

Lactobacilii acidorezistenţi au formă de bastonaşe scurte care formează lanţuri. Se dezvoltă bine la
pH ≤ 5,0.

Activitatea metabolică a lactobacililor în produsele alimentare fermentate se referă la metabolismul


lactozei, galactozei şi glucozei. Zaharoza este fermentată numai după hidroliza acesteia în glucoză şi
fructoză.

Metabolismul lactozei Pentru a se dezvolta în lapte, lactobacilii homofermentativi hidrolizează lactoza


cu ajutorul β -galactozidazei şi/sau β -D–fosfogalactozid– galactohidrolazei, aşa cum arată în
schema din figura 1.10.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 36
starter de microorganisme.

Figura 1.10. Transformarea lactozei în glucoză şi galactoză respectiv glucoza şi galactoza 6P


de către lactobacilii homofermentativi

β -D-galactozid–galactohidrolaza este utilizată de Lb. casei iar β -galactozidaza este utilizată de


majoritatea lactobacililor (L. bulgaricus, L. lactis, L. helveticus etc.), deşi aceştia din urmă au şi
activitate β -D–fosfogalactozid–galactohidrolazică, însă mai redusă.

L. bulgaricus are β -galactozidază activă la pH = 7,0 şi este activată de Mg2+, Mn2+ şi Fe2+. În cele mai
multe cazuri, lactobacilii folosesc mai mult glucoza ca sursă de energie în comparaţie cu lactoza şi
galactoza. Unii lactobacili eliberează în mediu galactoză care se acumulează.

Metabolismul hexozelor După hidroliza lactozei în celulele lactobacililor homofermentativi, hexozele


rezultate sunt metabolizate pe calea Embden – Meyerhof.

Lactobacilii heterofermentativi fermentează hexozele pe calea hexozomonofosfatului, aceşti


lactobacili neavând aldolază şi triozofosfat izomerază care sunt enzime cheie în calea Embden –
Meyerhof. Aceasta este de fapt şi diferenţa dintre cele două grupe de microorganisme, adică
lactobacilii homofermentativi posedă atât aldolază cât şi triozofosfatizomerază, în timp ce lactobacilii
heterofermentativi nu posedă aceste enzime.

Galactoza, rezultată din lactoză, pentru a fi fermentată trebuie mai întâi să fie transformată într-un
derivat fosforilat al glucozei (glucozo-6P), care apoi suferă transformări pe calea Embden – Meyerhof
(fig. 1.11.).

Rezultatul net al fermentaţiei glucozei pe calea Embden – Meyerhof este formarea a 2 moli ATP/mol
glucoză care asigură energia dezvoltării lactobacililor.

Fermentarea galactozei conduce numai la un mol ATP/mol galactoză şi această energie este folosită
pentru transformarea galactozei în glucozo - 6P. Formarea de energie în cantitate mai mică din
galactoză decât din glucoză explică de ce unii lactobacili acumulează galactoza liberă în mediu de
cultură (lapte) în cursul dezvoltării lor.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 37
starter de microorganisme.

Figura 1.11. Transformarea galactozei în glucoză-6P de către lactobacili

Activitatea proteolitică Deşi taxonomic, lactobacilii sunt consideraţi ca având activitate proteolitică,
totuşi ei îşi pot obţine azotul necesar dezvoltării din proteine existente în mediul fermentativ.
Activitatea proteolitică a lactobacililor contribuie atât la textura cât şi la aroma unor produse
alimentare (produse lactate, produse vegetale fermentate, produse din carne fermentate etc.) dar şi la
eliberarea unor aminoacizi care stimulează creşterea şi activitatea altor bacterii lactice folosite în
culturile starter în amestec cu lactobacilii. Se consideră că activitatea endoproteinazică a
lactobacililor este asociată cu membrana celulelor, iar activitatea exopeptidazică este localizată
intracelular. Enzimele din membrana celulelor produc hidroliza parţială a macromoleculelor proteice,
din care se formează peptide suficient de mici pentru a fi transportate în interiorul celulelor unde se
continuă degradarea lor până la aminoacizi, necesari creşterii (figura 1.12.).

Activitatea proteolitică a lactobacililor este optimă la pH 5,2- 5,8 şi temperatura de 45-50°C. La


temperaturi mai mari de 55°C activitatea proteolitică este mult redusă datorită termodenaturării
enzimei iar la 70°C/1min enzimele sunt complet inactivate.

În cazul laptelui, proteinazele extracelulare ale L. bulgaricus sunt active faţă de β -cazeină, apoi
în ordine descrescătoare şi faţă de K şi β cazeină.

Figura 1.12. Acţiunea endoproteinazelor extracelulare şi a exopetidazelor intracelulare în cazul


lactobacililor
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 38
starter de microorganisme.
Producerea de compuşi de aromă şi H2O2 Principala contribuţie a lactobacililor este producţia de acid
lactic. În cazul produselor lactate acide, deşi speciile de lactobacili implicate sunt homofermentative,
acestea însă produc şi alţi metaboliţi printre care produşi volatili ca acetaldehida, diacetil şi alcool în
cantitate mai mare fiind produsă acetaldehida. În plus, L. casei produce diacetil din citrat, mai ales
atunci când laptele se suplimentează cu citrat (L. casei nu este însă un producător major de diacetil).
Anumiţi lactobacili produc H2O2 care se acumulează în mediul şi jenează dezvoltarea altora.
Acumularea H2O2 în mediul de cultură este posibilă pentru ca lactobacilii sunt catalază – negativi.
Incapacitatea lactobacililor de a distruge metabolic H2O2 explică de ce aceştia nu se dezvoltă bine în
condiţii puternic aerobe, oxigenul fiind toxic pentru lactobacili care nu posedă superoxiddismutază,
enzimă care se constituie ca un sistem de protecţie faţă de toxicitatea oxigenului, cum este cazul altor
bacterii.

Totuşi, manganul din celulele lactobacililor poate funcţiona ca un captator de oxigen. Rezultă că la
cultivarea lactobacililor trebuie evitată agitarea laptelui în care se introduce cultura de lactobacli, iar în
mediul de cultivare al lactobacililor trebuie să existe mangan.

Acţiunea lactobacililor este îmbunătăţită prin interacţiuni cu alte bacterii lactice. De exemplu, cultura
mixtă formată din L. bulgaricus şi Str. thermophilus este adecvată pentru fabricarea iaurtului,
deoarece cultura mixtă produce mai rapid acid lactic.

Interacţiunea dintre cele două bacterii lactice este benefică din următoarele motive:

- L. bulgaricus produce aminoacizi liberi, în particular histidină, care stimulează producţia de acid
lactic a lui Str. thermophilus;
- Str. thermophilus, pe de altă parte, produce acid formic, care stimulează activitatea lui L.
bulgaricus;
- Str. thermophilus, deşi produce o cantitate suficientă şi de CO2 care stimulează dezvoltarea lui
L. bulgaricus, totuşi dezvoltarea acestuia este mai redusă, deoarece Str. thermophilus utilizează mai
rapid anumite substanţe nutritive esenţiale pentru dezvoltarea lui L. bulgaricus. În plus, lactobacilii, în
general, sunt sensibili chiar la niveluri foarte reduse de antibiotice, în comparaţie cu Str. thermophilus
( de aici şi necesitatea ca laptele să nu conţină urme de antibiotice).
Şi în cazul lactobacililor putem avea infectări cu bacteriofagi. De asemenea şi lactobacilii conţin
plasmide, însă în număr redus (una sau două plasmide).
Utilizarea culturilor de lactobacili

• În industria laptelui se utilizează Lactobacillus lactis şi Lactobacillus bulgaricus, singuri sau în


amestec la fabricarea iaurtului, chefirului, cumâsului, brânzei Ementhal, brânzeturilor italiene.
Lactobacillus helveticus este şi el implicat în unele din aceste produse. Lactobacillus acidophilus este
folosit la fabricarea laptelui acidofil, laptelui acidofil nefermentat şi a altor produse acidofile.
Lactobacillus casei se utilizează pentru obţinerea produsului yakult.

• În industria cărnii interesează Lactobacillus sake, Lactobacillus curvatus şi în special


Lactobacillus plantarum care se caracterizează prin faptul că nu produce CO2 la fermentarea glucozei
dar produce CO2 din gluconat. Riboza este fermentată la acid lactic şi acid acetic. Posedă activitate
aldolazică, glucozo – 6P – dehidrogenazică. Prin fermentaţie lactică se produce acid lactic racemic
(DL). Lactobacillus plantarum este facultativ anaerob, nu produce NH3 din arginină. Poate acidifica
laptele şi are temperatura optimă de dezvoltare la 30-35°C. Nu necesită pantotenat, tiamină, niacină
pentru dezvoltare.

Lactobacillus plantarum ca şi Lactobacillus sake pot descompune acidul gluconic cu formare de acid
acetic ceea ce este dezavantajos în cazul salamurilor la care se foloseşte glucono – delta – lactona
ca acidifiant chimic. Lactobacillus plantarum poate reduce NaNO3 dacă pH-ul mediului este mai mare
de 6,0 şi nu există zaharuri fermentescibile în mediul de cultură. Lactobacillus sake şi Lactobacillus
curvatus produc H2O2 în prezenţa O2 atmosferic. Cei doi lactobacili se întâlnesc frecvent în salamurile
crude fără adaos de culturi starter (sunt componenţi ai microflorei spontane a compoziţiei de carne).
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 39
starter de microorganisme.
• Alte utilizări Lactobacilii interesează şi în fermentarea măslinelor, verzii, castraveţilor,
gogonelelor, în producerea spirtului şi drojdiei presate în vederea acidifierii plămezilor, la
fermentarea unor produse fermentate din cereale (bragă, cvas), la fabricarea acidului lactic prin
fermentare etc.

• Genul Micrococcus şi Staphylococcus Microorganismele din genurile Micrococcus şi


Staphylococcus aparţin familiei Micrococaceae care cuprinde bacterii sub formă de coci cu φ = 0,3-
0,5 µ , cu diviziune în mai multe planuri, formând grămezi sau pachete. Pot fi mobile sau imobile,
asporogene, Gram pozitive, chemoorganotrofe, cu metabolism respirator sau fermentativ, aerobe sau
facultativ anaerobe. Se pot dezvolta în medii care conţin 15% NaCl.

Pentru industria cărnii interesează anumite specii de micrococi şi stafilococi care sunt folosite pentru:
-capacitatea lor de a reduce azotaţii la azotiţi (contribuie la formarea culorii cărnii sărate în
prezenţă de azotaţi);
-activitatea lor catalazică;
-activitatea de acidificare, proteolitică şi lipolitică.
Dintre speciile de micrococci interesează Micrococcus aurantiacus şi Micrococcus varians.
Pentru industria laptelui, micrococii formează partea principală a populaţiei nelactice din laptele crud
şi respectiv brânzeturile fabricate din laptele crud. Din brânza Cheddar fabricată din lapte crud a fost
izolat Micrococcus freundenreichii, care a fost ulterior utilizat sub formă de cultură pură în scopul
accelerării formării aromei brânzei fabricate din lapte pasteurizat datorită activităţii proteolitice şi
lipolitice. Tot în scopul maturării unor brânzeturi cu pastă presată s-a utilizat un preparat enzimatic şi
anume Rulactina ce conţine o metal-protează cu activitate strict endoproteinazică obţinută din
Micrococcus caseolyticus.

Din genul Staphylococcus interesează speciile de stafilococi coagulază-negativi, nepatogeni


cum ar fi: Staphylococcus carnosus, Staphylococcus xilosus, Staphylococcus simulans.

Combinaţiile de micrococi şi stafilococi sunt eficace pentru activitatea azotat-reductazică şi catalazică.


În aceste combinaţii, Staphylococcus carnosus acţionează mai bine decât micrococii în formarea
culorii, reducând azotaţii la azotiţi şi respectiv azotiţii la oxid de azot, chiar în condiţii de aciditate
ridicată a substratului. Aroma produselor la care este utilizată cultura starter de Staphylococcus
carnosus este superioară.

Combinaţia L. pentosus + Staphylococcus carnosus se comportă mai bine decât combinaţia L.


plantarum + Staphylococcus carnosus, deoarece L. pentosus produce mai rapid şi mai intens acid
lactic în comparaţie cu L. plantarum.

• Genul Streptomyces Specii din genul Streptomyces pot altera alimentele, producând mirosuri
şi gusturi dezagreabile, altele (puţine la număr) sunt patogene.

Streptomyces griseus senso Hötter este însă inofensiv şi a fost folosit pentru capacitatea sa de a
reduce azotatul la azotit, putându-se dezvolta bine în substraturi care conţin ~ 8% NaCl şi care au pH
= 5,8-8,5. Temperatura optimă de dezvoltare este la 30°C. Este catalază – pozitiv având capacitate
proteolitică dar nu şi lipolitică. Poate fi asociat cu micrococii şi/sau lactobacilii. În salamurile crude se
inoculează la nivel de 5·103 /g compoziţie.

• Genul Propionibacterium Bacterile din genul Propionibacterium fac parte din familia
Propionibacteriaceae. Bacteriile din genul Propionibacterium sunt Gram – pozitive, asporogene,
anaerobe sau tolerant aerobe, sub formă de bastonaşe imobile cu un capăt rotunjit şi celălalt capăt
ascuţit şi ramificat şi colorat mai slab. Celulele din unele culturi pot fi cocoide, alungite, ramificate. De
obicei, celulele sunt singure, perechi sau se aranjează în configuraţie V, Y, lanţuri scurte sau
îngrămădiri. Bacteriile propionice fermentează carbohidraţii, piruvatul/lactatul. Bacteriile propionice
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 40
starter de microorganisme.
“tip lapte” sunt: Propionibacterium freundreichii (cu subspeciile freundreichii, globosum şi shermani),
Propionibacterium theonii, acidipropionici şi jensenii.

Principalii produşi de fermentaţie a bacteriilor propionice sunt CO2, cantităţi mari de acid propionic şi
acetic şi cantităţi mici de acid izovalerianic, formic, succinic, lactic. Toate speciile produc acid lactic
din glucoză. Se dezvoltă foarte bine la 30-37°C şi la pH = 7,0.

Producerea de propionat, acetat şi CO2 Lactatul (respectiv piruvatul) este transformat în propionat
prin reacţia:

3CH3-CHOH-COOH 2CH3-CH2-COOH + CH3-COOH + CO2 + H2O

Ca intermediar în această reacţie se formează piruvatul care este carboxilat la oxalacetat ce intră în
ciclul Krebs fiind transformat în malat, fumarat şi succinat, acesta din urmă sub acţiunea ATP şi CoA
trecând în succinil – CoA. La rândul său, succinil CoA este transformat sub acţiunea metilmalonil–
CoA–izomerazei şi a B12–coenzimei în metil–malonil-CoA care prin decarboxilare conduce la CO2 şi
propionil–CoA, ultimul compus fiind în final scindat în propionat şi CoA. Propionatul, acetatul şi CO 2
se formează în proporţie de 2/1/1. Diferitele tulpini de bacterii propionice se deosebesc între ele prin
raportul acid propionic /acid acetic format, o influenţă în acest sens având şi aciditatea substratului,
cantitatea de lactat şi adaosul de carbonat şi succinat.

Producerea de prolină Prolina este considerată ca principalul component care conferă aromă
dulceagă brânzeturilor de tip şvaiţer, prezenţa prolinei fiind asociată cu dezvoltarea bacteriilor
propionice la maturarea brânzeturilor de tip şvaiţer. Se consideră că există trei căi pentru producerea
de prolină:

- proteoliza generală;
- hidroliza peptidelor care conţin prolină;
- biosinteza prolinei.
La prima cale se ia în considerare producerea de prolină prin hidroliza cazeinei.

La a doua cale se ia în considerare formarea de prolină din hidrolizatul cazeinic prin acţiunea
peptidazelor (Propionibacterium shermanii posedă imidopeptidază şi proliniminopeptidază
intracelulare cu optim de pH la 5,5-6,0).

La a treia cale se are în vedere biosinteza prolinei din arginină şi mai puţin din acid glutamic, dar
calea de biosinteză este nesemnificativă în raport cu cea de-a doua cale menţionată.

În orice caz, concentraţia de prolină din interiorul celulelor este mai mică decât cea a prolinei din
mediul de cultură .

Eliberarea prolinei din peptide coincide cu eliberarea enzimelor celulare în mediu. Bacteriile
propionice singure hidrolizează încet cazeina, dar producerea de prolină în brânzeturi este sporită
prin dezvoltarea anterioară sau concomitentă a bacteriilor lactice. Viteza formării prolinei la valorile pH
şi concentraţia de NaCl atinsă în brânza şvaiţer este temporar încetinită, dar maturarea prelungită
anulează efectele de inhibare ale pH-ului şi concentraţia de NaCl. Se consideră că ionii de cupru ar
inhiba producerea de prolină pe unele căi, această inhibare parţială fiind benefică, deoarece permite
evoluarea altor procese de aromatizare.

Producerea de diacetil şi acetoină Bacteriile propionice pot produce diacetil şi acetoină, cantităţile
formate fiind mai mari la 21°C decât la 32-37°C. Producţia de diacetil este urmată de reducerea
acestuia la acetoină şi 2,3 butilenglicol. Cantitatea de diacetil creşte prin adaos de citrat, piruvat sau
glucoză în mediu de cultură. În culturile mixte de Str. lactis şi bacterii propionice, producţia de diacetil
se intensifică ca o consecinţă a scăderii pH-ului de către streptococi. Bacteriile propionice produc şi
alte substanţe care contribuie la aroma brânzeturilor: aldehidă acetică, aldehidă propionică, alcool
etilic, alcool propilic, dimetilsulfură, acid izovalerianic.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 41
starter de microorganisme.
Alte activităţi metabolice Bacteriile propionice pot avea şi activitate proteolitică şi lipolitică.

Bacteriile propionice pot contribui într-o măsură mai mică la activitatea proteolitică din brânza Şvaiţer
prin enzimele proteinazice (~12 enzime) şi peptidazice (~ 7 enzime), dar activitatea proteolitică a
bacteriilor propionice este inferioară bacteriilor lactice (L. bulgaricus, L. helveticus, Str. thermophilus).

Bacteriile propionice pot contribui şi la lipoliza trigliceridelor, eliberând acizi graşi cu lanţ lung, dar
această activitate lipolitică este nesemnificativă.

Intercorelaţii între bacteriile propionice şi alte bacterii

• Micrococii intensifică producerea de CO2 de către bacteriile propionice, fenomen nedorit în


timpul păstrării la rece a brânzeturilor. Stimularea este consecinţa producerii de biotină, acid
pantotenic sau substraturi metabolice disponibile pentru bacteriile propionice cum ar fi acidul lactic şi
peptidele. Micrococii contribuie şi la distrugerea unor substanţe cu caracter inhibitor (H2O2).

• Bacteriile lactice au efect pozitiv asupra dezvoltării bacteriilor propionice prin următoarele:

- asigură substratul pentru acţiunea bacteriilor propionice (lactatul);

- produc o proteoliză slabă, deci oferă substrat pentru bacteriile propionice;

- împiedică fermentaţiile nedorite prin faptul că produc acid lactic, care stânjeneşte
dezvoltarea bacteriilor nedorite, precum şi bacteriocine;

- procură unele substanţe care stimulează activitatea bacteriilor propionice sau care
conduc la inhibarea unor microorganisme de infecţie (prin bacteriocinele produse).

Drojdiile, ciuperci unicelulare care se înmulţesc prin înmugurire, mai rar prin sciziparitate şi care
formează ascospori (sunt şi drojdii care nu formează spori, acestea denumindu-se drojdii/false torule
şi micoderme), sunt agenţi tipici ai fermentaţiei alcoolice.

Se prezintă sub formă de celule rotunde sau ovoide (Saccharomyces cerevisiae), eliptice
(Saccharomyces elipsoideus), foarte alungite (Saccharomyces pasteurianus), de forma unei lămâi
(Saccharomyces apiculans), de forma unei sticle (Saccharomyces ludwigii) sau sub formă de cilindru
(Pichia).

La unele specii, ca rezultat al înmuguririi, celulele de înmugurire rămân ataşate de celula mamă şi,
înmugurind la rândul lor, formează un pseudomiceliu, asemănător în structură cu cea a amilopectinei
– componentă a amidonului. Desigur, forma drojdiilor este în funcţie de vârsta acestora şi condiţiile de
cultură.

Pe medii solide, drojdiile formează colonii caracteristice speciei în condiţii de cultură constante, sub
aspectul formei şi culorii.

Dintre drojdii interesează (în sens util) cele aparţinând familiei Saccharomycetaceae, genul
Saccharomyces care cuprinde drojdii alcooligene folosite în industria berii, vinului, pâinii, spirtului,
genul Kluyveromices care fermentează lactoza, genul Debaryomices care se utilizează în industria
cărnii.

Mai interesează drojdiile familiei Cryptococcaceae (genurile Candida, Torulopsis) care se folosesc ca
agenţi de fermentare şi producători de biomasă (tabelul 3.11).
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 42
starter de microorganisme.

Utilizări ale drojdiilor

Utilizarea pentru fermentarea alcoolică Pentru fermentaţia alcoolică se folosesc drojdiile adevărate
care aparţin genului Saccharomyces (Meyen) Ress şi care se caracterizează prin aceea că nu
formează micelii tipic, produc 1-4 spori, iar puterea de fermentare depăşeşte puterea de respiraţie.
Sunt adaptate la condiţii de anaerobioză şi prin urmare nu formează voaluri la suprafaţă.

După modul de comportare în timpul fermentaţiei drojdiile pot fi:

• de fermentaţie superioară care se ridică în cantităţi mari la suprafaţa lichidului de fermentare


sub forma unui strat gros de spumă care se păstrează astfel până la sfârşitul fermentării. După
sedimentare aceste drojdii rar dau un precipitat dens. Au optim de temperatură la 28…30°C şi
fermentează 1/3 din rafinoză. În categoria drojdiilor de fermentare superioară se încadrează cele care
produc fermentarea alcoolică în cazul obţinerii alcoolului etilic, pâinii şi unele suşe pentru bere
(Saccharomyces cerevisiae);

• de fermentaţie inferioară care se dezvoltă în lichidul fermentat, nu se ridică la suprafaţă în


spumă, dar formează flocoane şi se sedimentează repede. Au optim la temperatura de 8…12°C şi
fermentează complet rafinoza. Drojdiile de fermentare inferioară se folosesc la obţinerea berii, vinului,
cidrului (Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces oviformis, Saccharomyces vini,
Saccharomyces uvarum).

Fermentaţia alcoolică produsă de drojdii este influenţată de:


-concentraţia zahărului fermentescibil în must sau plămadă;
-temperatură ;
-conţinutul în alcool din substrat;
-felul drojdiei.
Concentraţia favorabilă de zahăr fermentescibil este de 10-15%. Fermentaţia alcoolică se desfăşoară
lent la pH 4-4,5, în mediu alcalin sensul fermentaţiei fiind schimbat.

Viteza maximă de fermentare este la 30°C, dar în practică se realizează la 4…28°C. Alcoolul pe
măsura acumulării în mediu devine toxic pentru drojdii. Există drojdii care se dezvoltă la 16-18%
alcool (Saccharomyces chevalieri Guilliermond, Saccharomyces oviformis), însă în cele mai multe
cazuri fermentaţia se opreşte la 12-14% (Saccharomyces uvarum, Saccharomyces carlsbergensis,
Saccharomyces vini, Saccharomyces cerevisiae).

Odată cu creşterea temperaturii de fermentare se măreşte toxicitatea alcoolului. Fermentaţia alcoolică


este un proces anaerob. Prin trecerea la aerobioză, drojdiile se înmulţesc rapid şi produc biomasă.

Fermentarea alcoolică nu este o fermentaţie pură. Se mai formează glicerină ( 8% din totalul
zaharurilor existente în mediu), acid lactic, acid acetic, substanţe acetoinice (acetil metil carbinol =
acetoină şi diacetil), acid malic, acid succinic, acid propionic, acid citramalic, acid dimetilgliceric,
alcooli superiori: izobutilic, izoamilic, amilic, care provin din aminoacizii rezultaţi la degradarea
substanţelor pectice din musturi şi plămezi.

Aceşti alcooli superiori se formează prin reacţii de dezaminare şi decarboxilare ale aminoacizilor
leucină, izoleucină şi valină.

Fermentaţia alcoolică poate fi deviată de la cursul “normal” prin adaos de diferite substanţe.

În prezenţă de acid sulfuros sau bisulfit se produce mai multă glicerină, acelaşi lucru realizându-se şi
la pH alcalin.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 43
starter de microorganisme.

Fermentaţia alcoolică se aplică la:


• obţinerea alcoolului din produse amidonoase (cartofi, porumb, secară), produse care conţin
zaharoză (sfeclă, melasă), produse care conţin lactoză (zer), produse care conţin glucoză (hidrolizate
celulozice, leşii sulfitice);
• obţinerea berii şi vinului, cidrului inclusiv cvas din pâine, rom, whisky;
• obţinerea de băuturi fermentate pe bază de cereale şi leguminoase;
• obţinerea unor tipuri de produse lactate (chefir);
• obţinerea de băuturi fermentate pe bază de zer.
Utilizarea pentru obţinerea de biomasă (s-a menţionat anterior);

Utilizarea în industria cărnii, în care caz se foloseşte drojdia Debaromyces hansenii care este
tolerantă la NaCl, nu reduce NaNO3 şi necesită oxigen atmosferic pentru dezvoltare.

Se dezvoltă bine în straturile periferice ale salamurilor neafumate sau puţin afumate. Această drojdie
are capacitatea de a consuma oxigenul din pastă şi de a distruge peroxizii produşi de bacteriile
lactice. De regulă, Debaromyces hansenii se foloseşte în combinaţie cu Staphylococcus carnosus şi
Lactobacillus plantarum sau Staphylococcus xilosus şi Lactobacillus sake. Se consideră că prin
folosirea drojdiei menţionate produsele capătă o aromă cu totul deosebită.

Utilizarea în industria laptelui La fabricarea brânzeturilor, drojdiile se dezvoltă la suprafaţa


brânzeturilor dar şi în interiorul brânzeturilor cu pastă moale sau cu mucegai în pastă în timpul
presării, zvântării şi maturării, având următoarele acţiuni pozitive:
• consumă lactatul şi în acest fel contribuie la neutralizarea pastei, îmbunătăţind prin aceasta
consistenţa şi favorizând implantarea bacteriilor;
• produc factori de creştere pentru dezvoltarea bacteriilor;
• produc o peliculă de “acoperire” la anumite tipuri de brânzeturi;
• produc proteoliză şi lipoliză şi prin urmare contribuie la consistenţa şi aroma brânzei
respective;
• produc compuşi volatili de aromă.
Dintre drojdii, Candida hansei a fost cultivată în asociaţie cu lactobacili şi Str. thermophilus,
favorizând oxidarea lactatului, scăderea potenţialului de oxidoreducere şi producerea de factori de
creştere, precum şi dezvoltarea culturilor starter în care este asociată. Drojdia Candida lipolitica este
uneori folosită la fabricarea brânzeturilor cu mucegai în pastă, datorită faptului că prin lipazele
conţinute realizează o hidroliză a lipidelor din brânză, fapt ce favorizează utilizarea acizilor graşi de
către Penicillium în reacţiile de β -oxidare. Drojdia Torulopsis candida găsită pe brânzeturi se
dezvoltă bine în medii acide şi suportă concentraţii de NaCl până la 10%. Drojdia Candida kefir şi alte
drojdii din granula de chefir realizează fermentaţia alcoolică în produsul lactat acid dietetic chefir.

Kluyveromices lactis şi Kluyveromices fragilis se utilizează la obţinerea de lactază care are multe
utilizări. Kluyveromices lactis şi Kluyveromices fragilis se utilizează la obţinerea de biomasă prin
cultivare aerobă pe zer (procedeul Bell – Franţa).

Kluyveromices fragilis şi Candida pseudotropicalis se utilizează pentru obţinerea alcoolului etilic din
zer (procedeul Carbery –Irlanda).
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 44
starter de microorganisme.

Mucegaiurile

Pentru industria alimentară interesează clasa Phycomycetes cu următoarele genuri:


• Mucor şi Rhizopus aparţinând familiei Mucoraceae. Aceste mucegaiuri care se întâlnesc
pentru diferite produse vegetale şi alimentare, sub formă de colonii pufoase, au o acţiune
fermentativă netă.
Specii de Mucor şi Rhizopus se folosesc pentru:
-obţinerea unor produse alimentare fermentate în Orientul Îndepărtat, pe bază de cereale şi
leguminoase;
- în producţia de spirt prin zaharificarea amidonului (procedeul Amilo care foloseşte
Amylomyces rouxi – Mucor rouxianus);
-în producţia de enzime, în principal amilolitice şi proteolitice
• Din clasa Ascomycetes interesează ordinul Plectascales cu genurile Aspergillus şi Penicillium.
Mucegaiurile din genul Aspergillus se utilizează în:
-producţia de şuncă în SUA şi Spania (mai puţin);
-obţinerea de produse fermentate tradiţionale în Orientul Îndepărtat (ceva mai mult);
-obţinerea de enzime: amilaze, proteaze, enzime pectolitice.
Mucegaiurile din genul Penicillium se utilizează în:
- industria brânzeturilor cu mucegai la suprafaţă şi în pastă (Penicillium camemberti şi
Penicillium roqueforti);
- industria cărnii cu mucegaiuri de acoperire (Penicillium nalgiovensis şi Penicillium
exposus);
-obţinerea de enzime amilolitice, proteolitice, pectolitice.
În industria cărnii, culturile de spori de mucegai se utilizează pentru maturarea unor şunci, care se
însămânţează cu spori de Penicillium netoxicogen, în special P. nalgiovensis, P. exposum, şi P.
chrysogenum, respectiv Country curred ham şi Jambon Serano, care se însămânţează cu spori de
Aspergillus glaucus şi a unor tipuri de salamuri crude fabricate în România , Italia, Ungaria, Elveţia,
Spania, Franţa, Bulgaria; Austria, Belgia, Germania (şi mai puţin în SUA, Israel, Iugoslavia, Polonia).

În cazul salamurilor crude afumate/neafumate, mucegaiurile de acoperire contribuie la:


- reglarea eliminării apei din produs şi a schimbului de gaze;
- formarea aromei;
- îmbunătăţirea aspectului comercial al produsului.
Aroma este mai evidentă la salamurile cu diametru mai mic. Produsele pot fi livrate cu mucegaiul de
acoperire intact sau după “ periere”. Culoarea miceliului rămas este dependentă de varietatea
mucegaiului folosit: alb-ivorie (preferabilă în Italia); gri (preferabilă în Ungaria); alb-mat (preferabilă în
România).

Prin utilizarea culturilor pure de mucegai se suprimă apariţia la suprafaţa salamurilor a mucegaiurilor
toxicogene, în special a celor producătoare de aflatoxine precum şi a mucegaiurilor de “pătare” care
produc spoturi de culoare verde sau neagră.

Penicillium nalgiovensis Se utilizează spori de Penicillium nalgiovensis pentru salamurile crude cu


miceliu alb la suprafaţă. Sporii, în suspensie, se pulverizează la suprafaţa produselor. După 3-4 zile
de la însămânţare se formează micelii, iar după 5-6 zile de la însămânţare apar corpii de fructificaţie
purtători de conidii. Temperatura optimă de dezvoltare a mucegaiului este de 22-23°C.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 45
starter de microorganisme.
Penicillium nalgiovensis foloseşte ca substrat nutritiv glucidele dar are şi activitate proteolitică şi
lipolitică. Nu are activitate celulazică şi nu produce micotoxine.

Penicillium expansum se dezvoltă bine la 22°C şi umiditatea relativă a aerului este de ~ 82% pentru
sporulare şi ~ 88% pentru germinare. Dezvoltarea bună este la ϕ = 92-95%. Sporii pulverizaţi la
suprafaţa batoanelor formează un miceliu pufos în circa 8 zile de la însămânţare, maturizarea deplină
având loc după 30 zile de la însămânţare. Penicillum expansum nu produce micotoxine dacă
substratul conţine proteine cu sulf (cazul pastei salamurilor crude).

În industria laptelui culturile de spori de mucegai se utilizează, aşa cum deja s-a menţionat, la
fabricarea brânzeturilor cu mucegai în pastă cât şi cu mucegai la suprafaţă (brânzeturi cu pastă
moale).

Pentru brânzeturile cu mucegai în pastă (Brânza Roquefort, Gorgonzola, Stilton, Gammelost) se


utilizează spori de Penicillium roquefort. Pentru brânzeturile de tip Camembert se utilizează sporii de
la două specii de Penicillium: P. camemberti şi P. caseicolum.

Mucegaiurile dezvoltate în/pe aceste brânzeturi au rol fundamental în:


- formarea aromei şi gustului;
- formarea consistenţei;
- definitivarea aspectului, procesele care intervin în formarea aromei şi consistenţei fiind
proteoliza, lipoliza şi β -oxidarea acizilor graşi.

Suspensiile de spori se pot adăuga/folosi:


- în laptele destinat brânzeturilor sau amestecarea cu coagulul obţinut în cazul brânzei cu mucegai
în pastă;
- în laptele destinat fabricării brânzei, sau pulverizare la suprafaţa brânzei formate în cazul
brânzeturilor cu mucegai la suprafaţă. Mucegaiurile mai importante pentru industria laptelui sunt:
Penicillium roqueforti Thom se dezvoltă bine la 20-25°C şi pH 4,5-7,5. Tolerează concentraţii de 5-8%
NaCl. Are activitate proteolitică, lipolitică şi de β -oxidare a acizilor graşi. Activitatea mucegaiului este
stânjenită de prezenţa acidului propionic în brânză, la concentraţii mari de 30% CO2 în aerul
depozitului. Pentru intensificarea formării aromei se recomandă ca lipidele din lapte să fie în prealabil
lipolizate cu esterază pregastrică, astfel ca pe măsură ce mucegaiul sporulează, acizii graşi liberi să
fie β -oxidaţi până la metilcetone. P. roqueforti se dezvoltă în canalele şi golurile practicate în pasta
brânzei, sporii formaţi având culoare verde închis care conferă brânzei un aspect marmorat.

Penicillium camemberti şi Penicillium caseicolum Sporii acestor mucegaiuri se utilizează în producţia


brânzeturilor de tip Camembert incluzând Camembert, Brie, Neufchatel, Coulommier, Garré de l’Est,
Olivet.

Penicillium camemberti Thom (Penicillium album) se utilizează la brânzeturile tip Camembert cu pastă
mai untoasă, mai parfumată, de culoare gri – alburie.

Penicillium caseicolum Bainer (Penicillium candidum) se utilizează la brânzeturile de tip Camembert


cu pasta mai compactă, o aromă mai delicată, mai discretă şi de culoare alb – imaculat.

La însămânţare prin pulverizare de spori la suprafaţă a brânzeturilor cu umiditate ~ 55-60% se


formează miceliile de mucegai care consumă din aciditatea pastei, consecinţa fiind creşterea pH-ului
începând cu a 12 –a zi, iar după 27 de zile pH-ul rămâne constant.

Mucegaiurile din genul Penicillium au activitate endoproteinazică faţă de α - şi β cazeină, dar au şi


activitate exopeptidazică importantă, fiind demonstrat faptul că atât P. roqueforti cât şi P. camemberti
sintetizează 2 endopeptidaze (o metal proteinază şi o aspartil proteinază) precum şi două
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 46
starter de microorganisme.
exopeptidaze cu acţiune carboxi- şi aminopeptidazică, activitatea celor două grupe de enzime fiind
relativ echivalentă în stratul de suprafaţă al brânzeturilor.

Unele specii de Penicillium camemberti pot produce o micotoxinâ (acidul ciclopiazonic, dar activitatea
toxicogenă a mucegaiului este aproape nulă la temperatura tehnologică de maturare a brânzei (14-
16°C).

La brânza Camembert se pot utiliza şi spori de Geotricum candidum care se introduc în lapte.
Geotricum reduce pericolul formării peptidelor amare, inhibă dezvoltarea lui Penicillium, consumă
acidul lactic şi deci contribuie la neutralizarea pastei, având şi acţiune protolitică şi lipolitică. Brânza
Camembert obţinută din lapte pasteurizat cu adaos de Geotricum candidum are o aromă
asemănătoare cu cea a brânzei Camembert tradiţionale, adică fabricată din lapte crud.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 47
starter de microorganisme.

1.3.2. CULTURI STARTER. DEFINIŢIE

Culturile starter sunt definite ca acele culturi care se obţin plecând de la o cultură pură stoc şi care
prin trecere prin culturi intermediare (pasaje) devin apte de a fi folosite pentru producţia unor alimente
fermentate. Culturile starter pot fi formate numai dintr-un singur microorganism sau din mai multe
microorganisme.

Culturile starter de microorganisme sunt utilizate în vederea:


• dirijării unor procese biochimice prin care se asigură produsului un anumit grad de inocuitate
(inclusiv capacitatea de conservare);
• asigurării unor însuşiri senzoriale;
• asigurării, în unele cazuri, şi a unor însuşiri nutritive.
La folosirea culturilor starter în industria alimentară trebuie să se aibă în vedere următoarele:
• să conţină un anumit număr de microorganisme viabile (g/ml) şi un număr cât mai redus de
germeni nedoriţi;
• produşii metabolici, primari şi secundari, să nu prezinte pericol pentru sănătatea oamenilor;
• să nu conţină şi să nu producă antibiotice care se utilizează în scop terapeutic la oameni;
• să aibă o anumită (anumite) activităţi specifice: de producere a acidului lactic, de reducere a
azotului etc;
• microorganismele existente în cultură să fie declarate cu numele ştiinţific întreg;
• speciile (suşele) noi care se introduc în producţie, trebuie să fie înregistrate la MS şi să fie
depozitate în colecţii cu nomenclator; înainte de utilizare în producţie să fie testate din punct de
vedere al inocuităţii în conformitate cu legislaţia în vigoare;
• suşele declarate a fi sigure trebuie controlate la intervale regulate de către institute
specializate, în ceea ce priveşte puritatea lor;
• speciile, care pe baza noilor cunoştinţe ştiinţifice au fost recunoscute ca având potenţial
patogen sau toxicogen, trebuie să fie supuse unui control riguros pentru fiecare suşă, realizându-se
studii de toxicitate pe termen lung, de carcinogenitate şi mutagenitate.
Toate cele menţionate trebuie să se constituie ca o obligativitate absolută deoarece:
• culturile starter se pot consuma în stare vie, odată cu produsul alimentar, aşa cum este cazul
produselor lactate acide, brânzeturilor, salamurilor şi cârnaţilor cruzi, a unor sortimente de bere, a
unor produse vegetale: varză murată, castraveţi muraţi, gogonele murate, măsline verzi;
• culturile starter se pot consuma după distrugerea lor, rămânând în produsul alimentar atât ele
cât şi produşii lor de metabolism, aşa cum este cazul brânzei proaspete de vaci şi a iaurtului care au
fost pasteurizate, brânzeturilor topite, produselor de panificaţie etc.;
• produşii de metabolism ai culturilor starter se consumă odată cu produsele alimentare, însă
microorganismele sunt eliminate în cea mai mare parte, aşa cum este cazul berii, vinului, alcoolului,
oţetului, acidului citric, acidului lactic etc.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 48
starter de microorganisme.

CULTURI STARTER DE BACTERII LACTICE

Culturile starter de bacterii lactice sunt folosite în diferite domenii: industria laptelui, cărnii, produselor
vegetale murate, industria vinului, industria panificaţiei, industria sucurilor de fructe şi legume
fermentate etc.

Folosirea culturilor starter de bacterii lactice asigură produselor alimentare în care se introduc un
anumit grad de inocuitate. Această asigurare este realizată deoarece bacteriile lactice produc:

• acizi organici, în principal acid lactic, dar şi acid acetic, alcool, CO2;

• substanţe bacteriocine eliberate în mediul de cultură;

• peroxizi organici (H2O2).

În plus, bacteriile lactice intră în competiţie cu microorganismele patogene şi cele de alterare în ceea
ce priveşte consumul de substanţe nutritive, iar datorită şi acidifierii mediului, consecinţă a acumulării
acizilor organici, bacteriile patogene şi de alterare sunt inhibate în dezvoltarea lor. Dintre bacteriile
patogene sunt inhibate stafilococii, salmonelele, Listeria monocytogenes, Cl. botulinum etc.

Datorită acidităţii se inhibă şi dezvoltarea microflorei cu activitate proteolitică şi decarboxilazică, deci


se formează cantităţi mai reduse de amine biogene, iar în cazul cărnurilor sărate în prezenţă de
azotiţi, datorită acidităţii se favorizează descompunerea mai completă a azotiţilor, deci scade
producţia de nitrozamine, mai ales la produsele care se supun coacerii şi prăjirii.

Culturile starter de bacterii lactice folosite ca atare sau sub formă de produse lactate dietetice acide
sunt benefice pentru sănătatea oamenilor deoarece:

• aciditatea lactică favorizează acţiunea pepsinei ce produce hidroliza proteinelor, respectiv


coagularea cazeinei laptelui care este în continuare degradată de tripsina pancreatică;

• aciditatea mediului intestinal blochează dezvoltarea microflorei cu activitate patogenă şi


favorizează implantarea bifidobacteriilor cu consecinţe pozitive pentru organismul uman (vezi capitolul
probiotice).

În legătură cu bacteriocinele, în continuare se fac următoarele precizări:

- bacteriocinele sunt secretate de bacteriile Gram negative şi despre ele se pot spune
următoarele:

- bacteriocinele sunt proteine şi activitatea lor dispare prin hidroliza lor de către proteaze;

- bacteriocinele au acţiune bactericidă, dar nizina este şi bacteriostatic. Multe bacteriocine sunt
bacteriostatice la aplicarea lor în produsele alimentare;

- bacteriocinele au locuri specifice de legătură ceea ce explică specificitatea lor de acţiune faţă
de microorganisme;

- bacteriocinele pot fi sintetizate în timpul fazei de creştere, la sfârşitul fazei de creştere sau ele
sunt produse prin biosinteză letală. În cazul nizinei, sinteza începe atunci când s-a format jumătate
din masa biomasei;

- bacteriile producătoare de bacteriocine pot produce în acelaşi timp şi o substanţă de protecţie


faţă de bacteriocina secretată; spectrul de acţiune al bacteriocinelor este redus;
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 49
starter de microorganisme.
- bacteriocinele sunt excretate în mediu în cea mai mare parte; o mică parte rămân în celulele
bacteriene;

- bacteriocinele diferă de antibiotice prin natura speciilor şi suşelor producătoare, modalităţile de


producere şi natura lor chimică;

- bacteriocinele secretate de bacteriile lactice din culturile starter sau de protecţie au un spectru
de acţiune relativ limitat în raport cu mai multe specii sau mai multe suşe ale aceleiaşi specii.
Acţiunea bacteriocinelor se manifestă în general asupra bacteriilor care sunt, din punct de vedere
taxonomic apropiate de bacteriocine; sunt însă bacterii lactice cum ar fi Lactobacillus reuteri care
produc o substanţă nepeptidică cu acţiune antibacteriană, denumită reuterină (este un derivat al
glicerolului şi anume β -hidroxipropionaldehida) care arE un spectru larg de acţiune faţă de bacterii
Gram pozitive şi Gram negative, drojdii, mucegaiuri, protozoare;

- bacteriocinele având natură peptidică/proteică sunt scindate de proteinele proteolitice proprii


laptelui sau altor ţesuturi (de exemplu ţesut muscular), precum şi de enzimele folosite la coagularea
laptelui (cheag, pepsină);

- bacteriocinele sunt sensibile la acţiunea enzimelor proteolitice metabolice, ceea ce înseamnă


că ingerarea de produse ce conţin bacteriocine nu modifică microbiota tractului intestinal şi nu va
conduce la riscuri în ceea ce priveşte folosirea de antibiotice comune;

- bacteriocinele sunt stabile la căldură, deci rezistă în laptele pasteurizat la 63°C/30s minimum
sau la 72°C/15 s; rezistenţa lor termică se datorează structurii moleculare simple (excepţie face
helveticina J care are o structură proteică mai elaborată);

- bacteriocinele sunt stabile la pH neutru sau acid, ceea ce înseamnă că sunt adaptate la
condiţiile de mediu ale bacteriilor producătoare;

- eficacitatea bacteriocinelor în produsele fermentate este limitată de condiţiile de conducere a


fermentaţiei (temperatură, pH, aw)

CULTURI STARTER UTILIZATE ÎN INDUSTRIA LAPTELUI

La obţinerea culturilor starter trebuie să avem în vedere în mod deosebit următoarele:

- mediul de cultură (laptele);

- tratamentul termic aplicat laptelui;

- condiţiile de incubare;

- interacţiunile dintre speciile/tulpinile din cultura starter;

- eventualele infectări cu bacteriofagi;

- instabilitatea culturilor starter de bacterii lactice.

De la început, facem precizarea că prin cultură starter înţelegem culturile obţinute din cultura pură
stoc (inoculum) prin diferite pasaje. Culturile starter sunt folosite la fabricarea unor produse lactate
acide, smântână, unt, brânzeturi.

Culturile starter de bacterii lactice utilizate în industria laptelui pot fi clasificate în mezofile şi termofile.

Culturile starter mezofile, care la rândul lor, pot fi clasificate în:


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 50
starter de microorganisme.
a) Culturi starter singulare (single strain starter) care conţin numai Str. lactis subsp. lactis şi respectiv
Str. lactis subsp. cremoris (Lactococcus lactis şi Lactococcus cremoris) ambii homofermentaticvi care
produc acid lactic (L+) în proporţie de 0,8%. Folosirea acestor culturi starter singulare a apărut ca o
necesitate de a se evita formarea “ochiurilor” de fermentare la unele brânzeturi, “ochiuri” formate în
urma producerii de CO2 de către bacteriile aromatizante.

Culturile starter singulare mezofile prezintă următoarele avantaje:


- se poate utiliza continuu aceeaşi cultură cu activitate relativ constantă şi previzibilă;
- nu este necesară alternarea culturilor, eliminându-se riscul deprecierii acestora de către fagi,
- se folosesc cantităţi mai mici de inoculum pentru obţinerea de cultură primară şi secundară;
- influenţele compoziţionale sezoniere ale laptelui sunt mai reduse;
- se creează condiţii de realizare a unei producţii standardizate de produse lactate de calitate
superioară;
- cultura poate fi controlată şi supravegheată din punct de vedere al caracteristicilor sale
(sensibilitate la fagi, producerea de acid lactic, compatibilitatea ei, aglutinarea şi eventual lisogenia).
Culturile starter singulare mezofile prezintă însă următoarele dezavantaje:
- pot fi depreciate de tulpinile producătoare de bacteriocine;
- pot fi depreciate de fagi, deci sunt predispuse la liză fagică;
- pot suferi pierderi de plasmide şi deci pot pierde una sau mai multe din funcţiile lor.

b) Culturi starter multiple mezofile sunt acele culturi care se bazează pe folosirea a 5-6 tulpini
selecţionate, neînrudite pe plan fagic şi cultivate separat până la stadiul de cultură primară sau chiar
până la stadiul de cultură starter de producţie când se amestecă între ele. În aceste condiţii, tulpinile
nu se dezvoltă împreună decât cel mult timp de 10 generaţii, ceea ce face ca nici o tulpină să nu
devină dominantă. Asemenea culturi pot fi folosite mai multe luni în şir fără a-şi pierde capacitatea de
acidifiere.

c) Culturi starter mezofile mixte Aceste culturi sunt formate, de regulă, din două tipuri de bacterii
lactice:

- bacterii lactice acidifiante: Str. lactis sau Str. cremoris;

- bacterii lactice producătoare de aromă: Str. diacetilactis (Lactococcus lactis var. diacetilactis)
sau specii de leuconostoci.

După tipul bacteriilor aromatizante culturile starter mixte mezofile pot fi clasificate în următoarele
grupe:

• culturi starter mixte tip L care conţin numai specii din genul Leuconostoc: Leuconostoc
cremoris (citrovorum), Leuconostoc dextranicum şi/sau Leuconostoc lactis care sunt toţi
heterofermentativi şi produc acid lactic D(-);

• culturi starter mixte de tip D care conţin Str. lactis biov. diacetilactis ca singură specie
producătoare de aromă;

• culturi starter mixte tip LD care conţin atât specii de leuconostoci cât şi Str. lactis subsp.
diacetilactis ca producători de aromă.

La folosirea culturilor starter mixte trebuie să avem în vedere că:

- streptococii acidifianţi mezofili homofermentativi produc acid lactic din lactoză;


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 51
starter de microorganisme.
- leuconostocii, cei heterofermentativi, şi Str. lactis subsp. diacetilactis (homofermentativ) produc
diacetil şi acetoină din citrat, dar produc şi acid lactic, acetic prin fermentarea lactozei şi glucozei;

Culturi starter termofile

Culturile starter termofile pot fi:


• acidifiante: Lactobacillus acidophilus;
• acidifiante/aromatizante care la rândul lor pot fi constituite din unul sau mai multe specii de
lactobacili şi dintr-o specie de streptococi. În această direcţie amintim:
- cultura starter termofilă pentru iaurt: Lactobacillus bulgaricus şi Str. therrmophilus;
- cultura starter termofilă pentru brânzeturi: Lactobacillus bulgaricus + Lactobacillus lactis +
Lactobacillus helveticus + Str. thermophilus. Această cultură starter se foloseşte la fabricarea
brânzeturilor cu pastă tare şi semitare, deci la care se practică încălzirea a doua a bobului de coagul.
Utilizarea culturilor starter termofile este benefică deoarece:

• produc acid lactic deci scad pH-ul laptelui şi determină coagularea acestuia (cazul iaurtului); la
brânzeturi acidifierea favorizează eliminarea zerului din coagul;
• au activitate proteolitică şi prin urmare contribuie la ameliorarea proprietăţilor reologice şi la
aroma produselor fermentate; ca urmare a activităţii proteolitice rezultă şi aminoacizi din proteine
care stimulează dezvoltarea celorlalte bacterii din culturile starter termofile;
• produc şi compuşi de aromă, dar în principal aldehidă acetică, acetonă, precum şi urme de
acetoină;
• produc şi substanţe cu caracter filant care influenţează vâscozitatea produsului (Str.
thermophilus în cultura pentru iaurt);
• produc o serie de bacteriocine (Lactobacillus helveticus, Lactobacillus acidophilus,
Lactobacillus casei etc.);
• produc H2O2 (Lactobacillus bulgaricus).
Având în vedere cantităţile mari de iaurt ce se fabrică pe plan mondial, este necesar să cunoaştem
factorii care influenţează performanţa optimă a culturilor pentru iaurt. Aceşti factori se referă la:

• temperatura de incubare care este de 41-42°C (apropiată de temperatura optimă de dezvoltare


a lui Lactobacillus bulgaricus ). După 3 ore de incubare se ajunge la ~ 500 mil bacterii/g, raportul
dintre L. bulgaricus şi Str. thermophilus fiind 1/1;

• tratamentul laptelui – pasteurizarea influenţează pozitiv dezvoltarea lui L. bulgaricus prin:


- modificarea structurii proteinelor;
- eliminarea parţială a oxigenului şi realizarea unei microaerofilii propice;
- distrugerea inhibitorilor din lapte;
- formarea de acid formic care favorizează dezvoltarea culturii;
• disponibilitatea substratului Laptele este un bun substrat dar trebuie arătat că Lactobacillus
bulgaricus are preferinţă faţă de glucoză şi deci ar trebui ca lactoza să fie prehidrolizată la β -
galactozidaza;

• metaboliţi produşi în mediu. Lactobacillus bulgaricus produce H2O2 în mediul de cultură şi deci
adausul de catalază va stimula producţia de acid lactic de către Str. thermophilus care este mai
sensibil la H2O2 decât Lactobacillus bulgaricus. Laptele destinat iaurtului nu trebuie să fie agitat prea
mult ca să nu includă aer (oxigen) care ar strica condiţiile de microaerofilie pentru L. bulgaricus şi ar
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 52
starter de microorganisme.
deveni toxic pentru Str. thermophilus. Lactobacillus bulgaricus se apără de acţiunea oxigenului prin
intermediul manganului intracelular care înlocuieşte acţiunea superoxiddismutazei;

• interacţiunile dintre bacterii din cultura pură (inoculum) sau cultura starter. Între cele două
microorganisme există un sinergism deosebit. Lactobacillus bulgaricus produce aminoacizi din
cazeină care sunt necesari dezvoltării lui Str. thermophilus care, la rândul său, favorizează
dezvoltarea lui L. bulgaricus prin producerea de acid formic şi CO2;

• calitatea laptelui ca substrat de fermentare. Acesta nu trebuie să conţină antibiotice, substanţe


conservante, dezinfectante şi să provină de la animale sănătoase cu maximum 400000 leucocite/ml.

Controlul culturilor starter de bacterii lactice

Controlul culturilor starter implică următoarele determinări:

• examenul microscopic care trebuie să arate raportul dintre coci şi bacili, raport care trebuie să
se situeze în limitele 1/1-1,5/1;

• activitatea acidifiantă care se urmăreşte prin determinarea acidităţii titrabile atunci când cultura
se află în fază logaritmică. În acest fel se pot pune în evidenţă culturile “rapide” şi “lente” (fast and
slow);

• rezistenţa la aciditate, ţinându-se seama că Lactobacillus bulgaricus rezistă până la ~ 1,7%


aciditate iar Str. thermophilus până la 0,8%. Rezistenţa la aciditate se urmăreşte prin determinarea
supravieţuitorilor după ce în mediul de cultură se atinge o aciditate critică;

• rezistenţa la răcire care este importantă pentru produsele lactate ce se congelează (iaurt,
îngheţata de iaurt). Rezistenţa la răcire se urmăreşte la – 6 ÷ - 9°C şi apoi la -18°C sau -25°C ;

• producerea de substanţe filante care constă în măsurarea vâscozităţii pe o probă inoculată de


lapte cu 12% s.u., cu adaos de CaCl2 0,012%, incubată 4 ore/37°C până ce se atinge un pH de 4,2-
4,3. Se pot depista în acest fel culturile filante;

• activitatea proteolitică se poate urmări pe o cultură păstrată la 4°C la care se determină tirozina
sau aminoacizii liberi prin metoda formol titrimetrică;

• activitatea lipolitică se poate determina prin măsurarea indicelui de aciditate din grăsimea
culturii (lapte);

• proprietăţile senzoriale se determină la culturile de 24-48 ore la 20°C (se pot determina şi
substanţele de aromă respectiv diacetilul, acetaldehida, acetoina).

CULTURI STARTER CONCENTRATE DE MICROORGANISME

Definiţie

Culturile starter concentrate sunt definite ca acele culturi dezvoltate în condiţii controlate, concentrate
într-un volum mic şi conservate prin congelare sau uscare în vederea depozitării şi transportului.

Culturile concentrate pot fi de bacterii, drojdii, spori de mucegai. În ceea ce priveşte culturile starter
concentrate de bacterii cele mai des utilizate sunt culturile de bacterii lactice. Pe lângă acestea se
folosesc şi alte culturi de bacterii concentrate: micrococi, pediococi, stafilococi, streptomicii, bacterii
propionice etc.

Culturile concentrate de bacterii pot fi utilizate pentru:


Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 53
starter de microorganisme.
• obţinerea culturilor starter de producţie (maiele de producţie);

• obţinerea produselor fermentate prin utilizare directă în lapte, compoziţii carnate etc.

Indiferent de domeniul de utilizare, culturile starter concentrate pot fi obţinute prin două procedee:

• procedeul de cultivare periodică;

• procedeul de cultivare continuă.

Tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrate

Tehnologia de obţinere include următoarele operaţii de bază:

• inocularea mediului de cultură cu microorganismul din cultura stoc;

• incubare pentru multiplicare la nivel maxim;

• concentrarea mediului împreună cu celulele sau separarea celulelor, de regulă prin


centrifugare şi resuspendare într-un lichid adecvat,

• conservare prin congelare şi uscare;

• depozitare în stare congelată şi uscată.

În tehnologia de obţinere a culturilor starter concentrate trebuie ales un mediu de cultură care să
asigure toate substanţele pentru dezvoltarea (multiplicarea) culturii, realizându-se un control riguros al
temperaturii şi menţinerii pH-ului la valori optime.

Pentru eventuala neutralizare a acidităţii se utilizează hidroxid de amoniu şi/sau hidroxid de calciu.

Conservarea prin congelare a concentratului de microorganisme se face în două moduri:

- sub formă lichidă, în care caz, concentratul de bacterii se suspendă într-un antigel solubil în
apă (alcooli polihidrici) care se utilizează în proporţie de 40-50% faţă de concentrat. Congelarea se
face la -40°C (de fapt se realizează o subrăcire).

Acest gen de conservare prezintă următoarele avantaje:


• se împiedică acţiunea dăunătoare a gheţii asupra celulelor de bacterii;
• manipularea concentratului este mai uşoară;
• concentratul se poate încălzi până la temperatura de utilizare chiar în timpul manipulării fără ca
celulele să-şi piardă viabilitatea şi activitatea;

- congelarea în azot lichid (-196°C) în care caz concentratul se amestecă cu un agent


crioprotector: 10% glicerol, 7,5% lactoză în cazul bacteriilor lactice.

Pentru culturile starter concentrate de pediococi s-a propus ca la concentrat să se adauge


agenţi de stabilizare cum ar fi: glicerolul, lapte praf degresat, extract de malţ, metalglicerofosfaţi
alcalini, glutamat monosodic, acid glutamic, cistină şi/sau dextran. Amestecul respectiv se introduce
în pungi de plastic care se congelează în azot lichid.

Depozitarea culturilor starter concentrate se poate face:


a) la temperaturi de –20…-40°C;
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 54
starter de microorganisme.
b) la temperatura de -196°C (în azot lichid);
- conservarea prin reducerea conţinutului de apă se face prin liofilizare, în care caz
concentratul de bacterii se amestecă cu un suport adecvat (lapte praf degresat, lactoproteine pulbere
lactoză, zaharoză) după care se liofilizează. La liofilizare (faza de desicare secundară) temperatura
produsului nu trebuie să depăşească 40-45°C. După liofilizare se face ambalarea sub vid sau în
atmosferă de gaz inert. Depozitarea produselor liofilizate trebuie să se facă la temperaturi scăzute (-
18°C).

Culturile starter concentrate trebuie să conţină între 2,5·1010 – 5,5·1010 celule viabile-active/ g sau ml.

Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii lactice în industria laptelui

Culturile starter concentrate de bacterii lactice care se folosesc în industria laptelui sunt acelea
destinate:

• pentru brânza Cheddar, brânzeturi tip italian şi elveţian;

• pentru brânza de vaci, smântână, lapte bătut, iaurt.

Avantajele şi dezavantajele folosirii culturilor starter de bacterii lactice în industria laptelui sunt arătate
în tabelul de mai jos.

Avantajele şi dezavantajele folosirii culturilor starter de bacterii lactice

Avantaje Dezavantaje
• Activitatea culturilor poate fi controlată şi • Necesită spaţii de depozitare la
supravegheată înainte de expediere temperaturi scăzute atât la producător cât şi
la cumpărător pentru păstrare până la
• Se elimină operaţiile de întreţinere şi de
folosire
preparare a maielelor intermediare (primară,
secundară, terţiară) • Concentrarea nu este posibilă la toate
culturile starter
• Se face economie la forţa de muncă
• Depozitarea în stare congelată sau
• Se pot stabili uşor sistemele de rotaţie în
uscată, în funcţie de timp, poate conduce la
vederea evitării infecţiei cu bacteriofagi
micşorarea drastică a numărului de celule
• Se obţin produse de calitate mai constantă viabile
• Se scurtează procesele tehnologice ale • Culturile pot să fie influenţate negativ
fabricării produselor prin accelerarea acidifierii, în ceea ce priveşte unele plasmide ce
deoarece se suprimă faza de dezvoltare codifică anumite funcţiuni
logaritmică în laptele de fabricaţie

Culturi starter concentrate de bacterii propionice pentru industria laptelui

Mediul de cultură pentru realizarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice poate fi laptele
degresat cu adaos de 1% tripticază, 1% extract de drojdie ca sursă de vitamine şi factori suplimentari
de creştere 1% lactat de sodiu; 0,025% KH2PO4; 0,0005% MnSO4. Mediul de cultură se ajustează la
pH = 7,0 şi se sterilizează.

Incubarea mediului de cultură inoculat cu bacterii propionice din cultura stoc se face la 32°C/3 zile.

Dacă mediul de cultură conţinând bacterii propionice dezvoltate după incubare se utilizează ca o
cultură (maia) de producţie, atunci dezvoltarea bacteriilor propionice se opreşte înainte de coagularea
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 55
starter de microorganisme.
laptelui, deoarece în stare de coagul, cultura starter se repartizează greu în laptele destinat fabricării
brânzeturilor.

Celelalte operaţii de obţinere a culturii starter concentrate de bacterii propionice sunt aceleaşi ca cele
descrise la celelalte tipuri de culturi starter concentrate.

Depozitarea culturilor starter concentrate de bacterii propionice se face la 5°C în care caz celulele îşi
păstrează viabilitatea şi activitatea 8 săptămâni. Depozitarea la 25°C poate fi făcută pentru cel mult 2
săptămâni.

Culturile starter concentrate se adaugă direct în laptele destinat fabricării brânzeturilor (deci nu se mai
folosesc obţinerea de culturi intermediare).

Utilizarea culturilor starter concentrate de bacterii în industria cărnii

Culturile starter concentrate de bacterii folosite în industria cărnii pot fi singulare sau în amestec. Ele
pot fi formate din bacterii lactice (L. plantarum, L. sake, L. pentosus, L. alimentarius), pediococi (P.
acidilacti, P. pentosaceus), stafilococi (S. carnosus, S. xilosus), micrococi (M. varians), streptomicii
(Streptomyces griseus).

În literatura de specialitate sunt menţionate următoarele culturi starter concentrate de bacterii


singulare sau în amestec:

• S. carnosus
• S. carnosus + P. pentosaceus;
• S. xylosus + P. pentosaceus;
• M. varians;
• M. varians + P. pentosaceus + P. acidilacti;
• M. varians + P. pentosaceus;
• S. carnosus + Streptomyces griseus.
Culturile starter de micrococi sau stafilococi sunt recomandate la maturarea lentă a salamurilor crude
unde se realizează o scădere lentă a pH-ului şi deci consistenţa produsului se realizează în timp.
Gustul acestor produse este puţin acrişor (pH 5,6-6,1).

Culturile starter mixte (micrococi/stafilococi/lactobacili) se utilizează la maturarea rapidă a


salamurilor crude în care caz realizarea consistenţei merge paralel cu acidifierea.

Culturile starter concentrate de utilizare în industria cărnii pot fi livrate în stare lichidă subrăcită sau
uscată. Adaosul în compoziţie trebuie să asigure o concentraţie de cel puţin 106-107/g pastă. Modul
de folosire al culturilor starter concentrate este în funcţie de modul lor de conservare. Cele congelate
în antigel se utilizează ca atare; cele liofilizate se suspend în apă pentru o distribuţie mai uniformă în
compoziţie.

Culturile starter concentrate de bacterii lactice pentru industria cărnii nu se amestecă cu sare,
condimente, acid ascorbic, acizi alimentari şi nici nu se păstrează în amestec cu substanţele
menţionate deoarece se inactivează rapid.

De asemenea trebuie să se aibă în vedere două situaţii particulare:

• Folosirea culturilor starter concentrate în pasta cu adaos de GDL (glucono delta lactona). În
condiţiile folosirii GDL pH-ul pastei scade rapid, proteinele sunt aduse la pH izolelectric şi pierd apa
de hidratare, azotitul de reduce bine la NO, se favorizează dezvoltarea bacteriilor lactice care produc
şi H2O2. Acidifierea rapidă împiedică însă dezvoltarea micrococilor care sunt necesari dacă se
lucrează cu NaNO3. La folosirea GDL este deci recomandat să se folosească culturi starter
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 56
starter de microorganisme.
concentrate de stafilococi care produc catalază, reduc azotatul la azotit şi se pot dezvolta la pH 4,7
fiind şi un bun producător de aromă;

• Folosirea culturilor starter în pasta cu adaos de uleiuri eterice. Aceste uleiuri eterice au acţiune
bacteriostatică, mai ales dacă solventul lor este şi alcoolul etilic şi, deci, inhibă culturile starter. În
acest caz se recomandă să se folosească o cantitate mult mai mare de cultură starter, pe de altă
parte uleiurile eterice să fie încapsulate.

Culturile starter concentrate folosite în industria cărnii trebuie să îndeplinească următoarele


condiţii:
- să fie tolerante la NaCl (concentraţie 2,5-3%);
- să se dezvolte bine în saramura de concentraţie 6%;
- să se dezvolte bine în prezenţă de 80-100 mg NaNO 2/kg compoziţie dar să acţioneze şi la
temperatură mai scăzută (14-24°C);
- să producă numai acid lactic (culturile starter concentrate de bacterii lactice să cuprindă numai
specii homofermentative);
- să fie puţin lipolitice şi proteolitice;
- să nu producă mirosuri şi gusturi nedorite din cauza produşilor secundari de metabolism;
- să fie nepatogene (să nu producă infecţii şi să nu producă toxine);
- să se adapteze compoziţiei de carne utilizată şi condiţiilor de fermentare a produselor,
respectiv la creşterea concentraţiei de NaCl, la temperatura de afumare rece şi de uscare, de
activitate a apei care scade progresiv pe măsura uscării produsului;
- să producă catalază şi nitratreductază (cele cu micrococi, streptomicii, stafilococi);
- să fie inactivate la 57-60°C.
Folosirea culturilor starter concentrate de bacterii (în special lactice şi pediococi) prezintă
următoarele avantaje:
- se micşorează durata de maturare a produselor carnate;
- se îmbunătăţesc proprietăţile senzoriale (gust, miros, consistenţă);
- se asigură un grad înalt de inocuitate produsului carnat (salamurile şi cârnaţi cruzi) prin
controlul dezvoltării microorganismelor patogene şi de alterare şi prin limitarea folosirii unor
substanţe cu caracter toxic (amine şi nitrozamine).
Lactobacilii din culturile starter concentrate produc în compoziţia salamurilor crude următoarele
efecte:
• acidifierea pastei cu următoarele consecinţe:
-scăderea pH-ului şi deci aducerea proteinelor la punctul izoelectric deci şi la starea de
hidratare minimă, favorizându-se în acest fel uscarea;
- reducerea mai rapidă şi mai completă a NaNO2;
- inhibarea microorganismelor patogene: Staphilococcus aureus, Salmonella, Cl. botulinum;
• producerea de substanţe de aromă;
• controlul producţiei de amine biogene prin inhibarea bacteriilor cu activitate decarboxilazică
(inhibare prin competiţie faţă de nutrienţi şi, respectiv, prin acidifiere);
• controlul producţiei de nitrozamine (aciditate formată, respectiv pH-ul scăzut favorizează
transformarea NaNO2 în NO şi deci rămâne în produs o cantitate mai mică de NaNO2 care ar putea
intra în combinaţie cu aminele secundare pentru a forma nitrozaminele;
• controlul microflorei de alterare şi patogene prin producţia de H2O2, bacteriocine.
Capitol 1. Definiţia biotehnologiei. Biotehnologia obtinerii preparatelor enzimatice. Culturi 57
starter de microorganisme.

Pediococii din culturile starter concentrate produc în compoziţia salamurilor crude următoarele efecte:

• acidifierea mai redusă a pastei la temperaturi mai ridicate fără formarea de produşi care să
afecteze negativ gustul şi mirosul;

• producerea de H2O2 , bacteriocine cu acţiune inhibitoare faţă de microorganismele patogene.

Culturi starter concentrate de spori de mucegai

Tehnologia de obţinere include următoarele operaţii:

• prepararea mediului de cultură, sterilizarea acestuia şi repartizarea în eprubete (agar înclinat);

• însămânţarea mediului în eprubete cu spori de mucegai ce se doreşte a se cultiva;

• termostatare pentru germinare spori cu organe purtătoare de spori şi sporulare;

• preluare spori cu 2 ml ser fiziologic 0,8% şi însămânţare medii de cultură Czapek cu 2% agar
aflate în vase Roux;

• recoltare spori din vase Roux cu ser fiziologic 0,8% astfel ca să se asigure în suspensie 108-
10
10 spori/ml;

• păstrare suspensie la 0-4°C.

Cultura cu spori de mucegai concentrată poate fi livrată şi sub formă de emulsie liofilizată,
emulgatorul fiind polietilsorbitanul .

Se pot realiza culturi starter concentrate de spori cu mucegaiurile utilizate în industria laptelui şi cărnii,
utilizarea lor fiind în funcţie de produsul alimentar în care se foloseşte cultura respectivă de spori de
mucegai.

Pentru industria cărnii, la utilizare suspensia de spori de mucegai concentrată se diluează cu apă
fiartă şi răcită în raport de 1/3.