6

Carbohidratos

FUNCION DE LOS CARBOHIDRATOS EN LA BIOESFERA

Los hidratos de carbo no son compuestos que contienen ademas de carbono, hidrogeno y oxigeno en proporcion de 2 a 1. Este nombre tambien se usa para algunos de sus derivados en los que la definicion dada no se cumple estrictamente.

Cx(H20)y

t t Carbono Agua Hidrato de carbono

Una fuente de energia

Estos compuestos son de importancia fundamental en la bioesfera y se elaboran durante la fotosintesis. Por fotosintesis las plantas verdes y las algas

Energia solar

co, + H,O

Cx(H,O)y Plantas verdes

co, + H,O

v '00,""

Cx(H,O)y Anrmales

0,

Figura 6.1 Ciclo del carbono en la bioesfera

152

Carbohldrato. 153

pueden usar la energia solar para sintetizar hidratos de carbona a partirde bioxido de carbono atmosferico y agua. Muchas plantas almacenan grandes cantidades de hidratos de carbona que en algunos casos, son consumidas por el hombre y los animales para su alimento. Despues de que los carbohidratos complejos han sido ingeridos, la molecula se rompe en el estomago e intestinos dando glucosa la cual es luego oxidada a CO2 y H20, 0 es almacenada temporalmente como glicogeno en el higado y los rnusculos. Durante la oxidacion de glucosa se libera energia que es empleada luego por los animales. En el hombre mas del 60% de los requerimientos totales de energia proviene de la oxidacion de los hidratos de carbono. En esta forma los ani males, que no pueden realizar fotosintesis, pueden aprovechar la energia solar (figura 6.1).

Moh!culas y estructura celular

Los hidratos de carbono son tambien componentes importantes de algunos de los materiales estructurales de los organismos vivos, como por ejemplo, las paredes celulares en las plantas, los polisacaridos en las capsulas de las. bacterias y los mucopolisacaridos en la piel y el tejido conectivo de los animales. Ademas, los monosacaridos son parte de compuestos bioquimicos importantes como los acidos nucleicos, las coenzimas, las flavoproteinas y las sustancias antigenicas de los grupos sanguineos.

ESTRUCTURA DE LOS CARBOHIDRATOS

Introducclon

Quimicamente hablando, los carbohidratos son aldehidos 0 cetonas derivados de polihidroxy y alcoholes respectivamente se conocen como aldosas 0 cetosas. '

Las unidades basicas de los hidratos de carbono son los monosacciridos, los cuales no se pueden subdividir por hidrolisis. Estos monomeros se nom bran de acuerdo al nurnero de atomos de carbono que poseen en la cadena: asi las tetrosas contienen 4, las pentosas 5 y las hexosas 6 atomos de carbono.

Estereoquimlca

Actividad optu:«. Muchas moleculas biologicas, incluyendo los azucares, poseen uno 0 mas citomos de carbono asunetricos y pueden, por 10 tanto, tener estereoisomeros. Por ejemplo, el gliceraldehido, uno de los azucares mas simples, tiene un carbona asimetrico y dos posibilidades de distribucion de los cuatro grupos unidos a dicho carbono. La formula de estos dos isorneros se da mas abajo; en ella los carbonos asimetricos estan colocados en el centro de un tetrahedro, y los 4 grupos sustituyentes estan situ ados en las esquinas. La linea interrumpida indica que esta debajo del plano del papel. Las dos formas

154 Bloqulmlca prtllctlca

pueden compararse con las imagenes de un espejo 0 con los guantes derecho e izquierdo.

Estas dos configuraciones son isomeros opticos 0 enantiomeros y hacen rotar el plano de la luz polarizada en proporcion igual pero en direcciones opuestas. Cuando el plano de la luz polarizada rota a la derecha, el compuesto es dextrorotatorio y se denomina ( d) 0 (+). Cuando el plano de la 1 uz polarizada rota hacia la izquierda, el compuesto es leoorouuorio (l) 0 (-).

Espejo

CHO H$-OH CH20H (Dextro)

d-G liceraldehido

CHO HO$H CH20H (Levo) l-Gliceraldehido

CHO HO-t-H 6H20H /

Formas D y L. Las aldosas se pueden considerar como formadas por .adicion sucesiva de grupos alcohol secundario (-CHOH) al compuesto patron, gliceraldehido. Toda vez que el gliceraldehido puede existir en dos formas, se origin an . dos familias de aldosas: aquellas derivadasdel d-gliceraldehido conocidas como D-azucares y aquellas provenientes del l-gliceraldehido denominadas L-azucares. Las letras D y L no indican actividad optica, sino que se refieren a la configuracion alrededor del atorno de carbona vecino al que se encuentra mas alejado del extremo de la cadena que contiene el grupo aldehido 0 cetona. Asi, pues, un Dsazucar puede ser dextrorotatorio (D( +) 0 levorotatorio (D ( - ) ) dependiendo de la configuracion de los otros atomos de carbo no presentes.

CHO Aldosas (6HOH)n 6H20H

Numero de
formas
D L
triosas n > 1 1 1
tetrosas n"'2 2 2
pentosas n"'3 4 4
hexosas n "',4 8 8 C.rbohldratol 155

La mas simple de las cetosas es la triosa dihidroxiacetona, pero este compuesto no tiene actividad optica; as! que la tetrosa, D-eritrulosa, es el compuesto matriz de las D-cetosas

D-Eritrulosa

CH20H

~O H-~~H tH20H

Las pentosas, hexosas, etc., se forman por la adicion de grupos alcohol secundario.

Nurnero de formas

D L

Tetrosas Pentosas Hexosas

n = 1 n = 2 n = 3

1 2 4

1 2 4

Numeracion de los atom os de carbono. Los atomos de carbono se numeran a partir del extremo de la cadena que contiene el grupo carbonilo reactivo, asi:

lCHO H-26-0H HO-3t-H H-46-OH H_s6-0H 66H20H Glucosa

lCH20H 2~O

31

HO- C-H

1 H-4C-OH

H-s6-OH 6tH20H Fructosa

Formula ciclica. Cuando se disuelve D(+)-glucosa en agua, se obtiene una rotacion espedfica de +113 grados, pero esta cambia lentamente hasta que a las 24 horas el valor obtenido es +52.5 grados. Este fenomeno se conoce con el nombre de mutarotacion y es caracteristico de algunas pentosas, hexosas y disacaridos reductores. La razon'para el cambio de rotaci6n es que la glucosa existe en solucion principalmente en Ia forma ciclica, la cual se obtiene por la forrnacion de un hemiacetal intramolecular, como se indica mas abajo.

,

156 Bloqulmlca practlca

Esto origin a otro carbona asimetrico (C1), que da lugar ados formas ciclicas ( a y (3) las cuales se conocen como anomeros.

CHO H-6-0H Ho-,-6-H H-6-0H H-6-0H 6H20H

La forma comun de la glucosa, D(+), es la forma a con una rotacion especifica de + 113 grades. Cuando esta se disuelve en agua, se establece un equilibrio con una rotacion de + 52.5 grados. Igualmente, cuando la forma ~ que tiene una rotacion de + 19.7 se disuelve en agua ocurre mutarrotacion dando un valor final de + 52.5 grados que es el de la mezcla en equilibrio. La forma de cadena abierta se encuentra tambien en equilibrio con las dos formas ciclicas y es esta la responsable de las propiedades reductoras de los azucares. La formula ciclica mostrada arrtba para la glucosa es la proueccion. de Fischer, la cual no es completamente correcta. Una mejor representacion de la estructura fue dada por Haworth, que muestra el anillo en un plano con los grupos hidroxilos orient ados por encima y por debajo de el. Para efectos de claridad, generalmente no se incluyen los atom os de hidrogeno.

QCH20H

H

HO OH

OH

o:-D-glucosa Mezcla en equilibrio: 36%

0CH20HH CHO o

OH

~~"r H~

. OH

Forma de cadena abierta

{3 -D-glucosa

0.02%

64%

El anillo formado en el caso de la glucosa contiene cinco atomos de carbono y uno de oxigeno y es analogo al pirano; por 10 tanto se dice que la glucosa existe en forma de piranosa. Muchos de los azucares comunes existen en la forma de anillo de piranosa, pero algunos existen como anillos de cuatro atomos de carbono denominados furanosas, por parecerse al compuesto furano.

Carbohidratos 157

Por ej emplo, la fructosa se presenta en forma de furanosa en la sacarosa, pero como anillo de piranosa cuando esta libre en solucion. Asi mismo, la ribosa y la deoxiribosa muestran una estructura de anillo de furano cuando hacen parte de los acidos nucleicos, pero en el estado libre existen como estructuras de pirano.

o

o

o

o

Pirano

Furano

Enlace gllc08idico

Glicosidos y disacciridos. EI grupo carbonilo presente en todos los azucares es muy reactivo y puede formar hemiacetales 0 acetales con otros compuestos hidroxilicos,

XOH --

~H ~,VOx I 'ox !'ox

Cetona

Hemiacetal

Acetal

La formacion de una estructura ciclica interna se efectua por reaccion del grupo hidroxilo en el carbono C4 0 C, con el grupo carbonilo formando un hemiacetal intramolecular, donde XOH es el resto de Ia molecula. El otro hidroxilo en el carbono Cl, conocido como el hidr6xilo glicosidico, es muy reaccionante y forma facilmente enlaces glicosidicos con otros grupos hidroxilicos mediante la eliminacicn de agua. Si el compuesto hidroxilico no es un azucar, se forma un glic6sido, tal como sucede en la condensaci6n de glucosa y metanol para dar metil glucoside. Sin embargo, el grupo hidroxilo frecuentemente proviene de otro azucar yen este caso se forma un disaccirido. Si el enlace no ocurre entre dos atomos Cl, entonces queda libre un grupo cetonico 0 aide hi do en el disacarido y la molecula exhibe todas las reacciones de estos grupos tales como la mutarotacion,

Oligosacciridos y polisacciridos. Este proceso puede repetirse, asi que el segundo monosacarido se une a un tercero con un enlace glicosidico para dar un trisaccirido y asi sucesivamente hasta obtener un oligosaccirido de 2 a 10 unidades, ligadas en una sola cadena. En el caso de los polisacaridos se juntan unidades de 10 hasta varios miles de monosacaridos por enlaces glicosidicos para formar moleculas muy gran des. Las unidades monornericas no son siempre las mismas y pueden encontrarse ramificaciones asi como sustituciones para dar molecules bastante complejas.

158 Bloqulmlca practice

Oerlvados simples de los monosacarldos

I

Productos oxidados. Los grupos aldehido y alcohol primario de las aldosas

pueden oxidarse a los correspondientes acidos aldonico y uronico. Si la oxidacion continua, se originan acidos sactiricos. A continuacion se muestra la oxidacion de un monosacarido. Los nombres dentro de los parentesis representan los productos cuando la hexosa es el monosacarrdo glucosa.

CHO (6HOH)n 6H20H

Pt/y Monosacaridc ~/H20

CHO (glucosa) COOH

(6HOH)n (6HOH)n

600H 6H20H

Acido uronico Acido aldonico

(acido glucuronico) (acido gluconico)

HN~ ~03

, COOH

(6HOH)n 600H

Acido sacarico (acido glucosacarico)

ReducciOn. Los grupos aldehido 0 cetona pueden reducirse a alcoholes primarios 0 secundarios con amalgama de sodio. Por ejemplo, la fructosa y la glucosa dan el hexahidroxy alcohol, sorbitol y el gliceraldehido es reducido a glicerol.

CHO

6HOH ~ 6H20H

G liceraldehido

CH20H 6HOH 6H20H Glicerol

..

1

Esteres. Los azucares forman Iacilmente esteres cuando reaccionan con el cloruro 0 el anhidrido de un acido en presencia de un catalizador. Los esteres de fosfato de los monosacaridos son de fundamental importancia en el metabolismo de los hidratos de carbono. Los esteres formados con .grupo alcohol primario del ultimo carbona (glucosa-f-fosfato) son usualmente los mas resistentes ala hidrolisis acida, Los hemiacetales que se forman con los

· .,' ,

-',

C.rbohldratOl 159

, grupos reductores son, por el contrario, muy inestables en acidos (glucosa-Jfosfato).

I '"

Derivados amino. El hidroxilo que se encuentra en la posicion 2 de muchos azucares puede ser reemplazado por un grupo amino como por ejemplo en galactosamina y glucosamina: Estos compuestos existen tambien como los derivados N-acetilo y hacen parte de la estructura de muchos polisacaridos, La presencia de los grupos amino cerca del enlace glicosidico hace que III molecula sea mas resistente a la hidrolisis.

CARBOHIDRATOS DE IMPORTANCIA BIOaUIMICA

Azucares simples

Los azucares simples estan ampliamente distribuidos en la naturaleza y desarrollan muchas y variadas funciones. Por razones de simplicidad, en la tabla 6.1 solo se presentan algunos azucares simples y no se inc1uyen derivados de los hidratos de carbono.

Macromoleculas

Homopolisaceridos. Son moleculas muy grandes compuestas unicamente de un tipo de monosacarido, a pesar de que varias macromoleculas diferentes pueden ser construidas a partir de la misma unidad de monos acari do. Esto se debe a que las moleculas pueden tener tarnafio diferente, grados diferentes de ramificacion y entrecruzamiento y diferentes enlaces glicosidicos. Esto se ilustra claramente para la glucosa, que es el componente basico de varios polisacaridos, en la tabla 6.2.

Heteropolisaciiruios. Estas moleculas se forman a partir de dos 0 mas unidades basic as y estan frecuentemente asociadas con proteinas. Dichos compuestos se conocen con el nombre de proteoglicans 0 mucoproteinas cuando el componente polisacaridico predomina en la molecula. Estos materiales, de naturaleza gelatinosa y viscosa, actuan como lubricantes 0 cernento in tracelular. Los complejos proteina-carbohidrato se conocen con el nombre de glicoproteinas cuando el carbohidrato es el componente menor. Las cadenas cortas de oligosacaridos, aun en pequefias cantidades, pueden tener una influencla considerable en las propiedades biologtcas de las proteinas. Por ejemplo, las propiedades antigenicas de las sustancias de los 'grupos sanguineos depende de la naturaleza quimica de estas cadenas de carbohidrato. La estructura y enlace de las unidades no se conocen en muchos casos, por 10 cual en la tabla 6.3 solo se dan los componentes.

160 Bloqulmlc8 practice

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C.rbohldretol 161
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162 ,/ Bloquln'llce practice

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Tabla 6.2 Propiedades de algunos homopolisacaridos

Carbohidratol 163

Polisacarido y unidad monosacarfdica

Estado natural y funci6n

Estructura

polisacaridos de reserva almid6n (0: -D-glucosa)

amilosa (0' -D-glucosa)

amilopectina ( O! -D-glucosa)

glicogeno

( 0: - D-gi ucosa)

inulina (~-D-fructosa)

polisacaridos estructu rales celulosa (ji-Deghrcosa)

quitina (~-D-N-acetilgl ucosamina)

Es una mezcla de amilosa y amilopectina en una proporcion de 1 a 4.

Cadena lineal de enlaces a 1-4, peso molecular aproximado de 50 000.

Cadenas lineales con enlaces 0: 1-4 con ramificacionesde enlaces ex 1-6. Peso molecular 0.2 x 106 - 1 x 106

, Una molecula en forma de arbol semejante a la amilopectina pero mas ramificada, peso mol. 1 x 106 - 3 X 106

Es el principal hidrato de carbono de reserva de algunas plantas tales como papa, cereales y arroz.

Presente en la mayoria de los almidones hasta en un 20%.

Es el principal componente del almidon (80% aproximadamente).

Es el polisacarido de reserva mas ampliamente difundido en los ani males, principalmente en el hlgado y los m usculos.

Unidades de fructosa liga- Carbohidrato de reserva en-

das por enlaces ~ 1-2. muchas plantas tales como

Peso mol. - 5000 dalias y alcachofas.

Cadenas lineales unidas por enlaces tJ 1-4.

Peso mol. - 50 000.

Cadena lineal con enlace ~ 1-4.

El principal componente de las paredes celulares de las plantas y de algunas algas y bacterias.

, El principal componente del exoesqueleto de insectos y crustaceos tales como cangrejos y langostas.

164 Bloquimlca practlca

Tabla 6.3 Algunos heteropolisacaridos comunes

Polisacarido

Unidades monosacaridicas Estado natural y funcion

111 ucopolisucdrjdos heparina (peso mol. -17000)

acido D- gl ucuronico sulfato de D-glucosamina.

acido hialuronico (peso moll x 106)

acido Dvglucuronico N-acetil-D-glucosamina

Sulfatos de condroitina Aye

acido- D-gl ucuronico sulfato de N-acetil-Dgalactosamina

complejos de poiisucdridos bacteria nos

Polisacaridos de la capsula

La cornposicion exacta depende del tipo de organismo.

mureina

N -ace til- D-glucosamina, acido- N -acetilm uramico, cadenas de oligopeptido.

Presente en las paredes arteriales y en los pulmomones. Es un anticoagulante muy util.

Cemento extracelular y liquido sinovial alrededor de las articulaciones donde actua como lubricante.

Muy abundante en el tejido cartilaginoso.

,

~sponsable de las propiedades anttgenicas de las bacterias.

Una gran red tridimensional que hace parte del esqueleto de las paredes celulares bacterianas.

PROPIEDADES QUI MICAS

Pruebas generales para carbohldratos

Se sugiere hacer las siguientes pruebas en algunos carbohidratos que se consideran tipicos de cada grupo. Para tener una idea de la sensibilidad del metoda deben probarse soluciones de 1 gil y 10 gil.

glucosa, fructosa, galactosa (hexosas), arabinosa, xilosa (pentosas).

lactosa, maltosa, sacarosa. celulosa, glicogeno, inulina, almidon.

Monosacaridos:

Disacaridos:

Polisacaridos:

100 3 I de cadauno.

Carbohldratos 165

EXPERIMENTO 6.1 Prueba de Molisch

Fundamento

EI acido sulfurico concentrado hidroliza enlaces glicosidicos para dar monosacaridos que pueden ser luego deshidratados dando furfural y sus derivados. Estos productos se combinan luego con 0' -naftol sulfonato originando un complejo purpura,

Esta reacci6n es general para los hidratos de carbona pero algunos otros compuestos organices dan tambien furfural con acido sulfurico concentrado.

Materiales

1. Acido sulf'urico (concentrado).

2. o-naftol (50 gil en etanol; preparese fresco).

Metodo

Agregue dos gotas de la soluci6n de o-naftol a 2 ml de la sustancia problema. Afiada cuidadosamente por las paredes del tuba aproximadamante 1 ml de H2S04 concentrado hasta que se formen dos capas. Observe cuidadosamente cualquier cambio de color en la interfase de los dos liquidos. Repita el procedimiento, usando agua en vez de la soluci6n de carbohidrato.

100 1500 ml 200 ml

O-CHO

o .

Furfural

~ ~

O'-Naftol

Antrona

EXPERIMENTO 6.2 Reaccion de la antrona

Fundamento

La reacci6n de la antrona es otra prueba general para hidratos de carbono. EI fundamento es el mismo que se describi6 en el experimento 6.1, excepto que el furfural reacciona con antrona (10-ceto-9,10-dihidroantraceno) dando un complejo azul-verdoso),

Materlales

1. Soluci6n de antrona (2 gil en H2S04 concentrado).

100 3 I

Metodo

A aproximadamente2 ml del reactivo de antrona agregue cinco gotasde la soluci6n problema, mezcle fuertemente y observe el cambio de color.

166 Bloquimlca ptactlca

Reacciones de los azucares reductores

\Si se calienta una suspension de hidroxido de cobre en solucion alcalina, se forma oxide cuprico de color negro:

Cu(OHh -+ CuO + H2 O.

Sin embargo, en presencia de sustancias reductoras, se precipita oxide cuproso de coloracion parda-orfn:

2Cu(OHh -+ CU20 + H20 + O.

En la practica, se usa una solucion alcalina de una sal de cobre y un compuesto organico que contiene un -OH alcoholico en vez de la suspension que se men cion a arriba. Bajo estas condiciones, el cobre forma un complejo soluble y ei reactivo es estable.

Los hidratos de carbono que pose en un aldehido libre 0 potencialmente libre 0 un grupo cetonico tienen propiedades reductoras en solucion alcalina., Ademas, los monosacaridos actuan como agentes reductoresen soluciones debilmente acidas.

EXPERIMENTO 6.3 Prueba de Benedict Fundamento

En la modificacion de la prueba de Fehling introducida por Benedict, se usa unicamente una soluci6n, 10 cualla hace mucho mas simple, con la ventaja adicional de que el reactivo es mas estable que el de Fehling.

Materlales 100

1. Reactivo de Benedict. (Disuelva 173 g de citra to de sodio y 3 1

100 g de carbonato de sodio en aproximadamente 800 ml de

agua caliente. Filtre a traves de papel de filtro en una

probeta de 1000 ml y complete con agua hasta 850 ml.

Mientras tanto, disuelva 17.3 g de sulfato de cobre en aproximadamente 100 ml de agua y complete hasta 150

ml. Vierta la primera solucion en un vasa deprecipitados

de 2 I y afiada lentamente la solucion de sulfato de cobre

agitando continuamente.)

Metodo

Agregue cinco gotas de la solucion problema a 2 ml del reactivo de Benedict y coloque en un bafio de agua hirviendo por 5 min. Examine la sensibilidad de la prueba de Benedict usando diluciones crecientes de glucosa.

Carbohidratos 167

EXPERIMENTO 6.4 Prueba de Barfoed Fundamento

EI reactivo de Barfoed es debilmente acido y solamente puede ser reducido por monosacaridos. Sise deja hervir por largotiempo existe la posibilidad de hidrolizar disacaridos dando as! reacciones falsamente positivas. El precipitado de oxide cuproso es menos den so que en los metodos previos y se recomienda dejar el tubo hasta que el precipitado sedimente. El color del 6xido cuproso es tam bien diferen te, tendiendo mas a rojo ladrillo que al pardo naranja obtenido en la prueba de Benedict.

Materlales 100

1. Reactivo de Barfoed. (Disuelva 13.3 g de acetato de cobre 31

enaproximadamente 200 ml de agua y agregue 1.8 ml de

acido acetico glacial).

Metodo

A 2 ml del reactivo de Barfoed afiada 1 ml de la solucion problema, hierva por 1 min y deje reposar.

EXPERIMENTO 6.5 Preparacumtle osazotuis Fundamento

Los compuestos que contienen el grupo -CO-CHOH- forman osazonas cristalinas con.fenilhidrazina. Los cristalesde osazona tienen forma y puntos de fusion caracteristicos 10 cual ayuda a la identificacion de los azucares reductores. Otros datos que pueden ayudar son el tiempo de formaci6n de los cristales y precipitacion de la osazona en frio 0 en caliente.

La fenilhidrazina reacciona con el grupo carbonilo de los azucares dando la fenilhidrazona que a su vez reacciona con dos moleculas mas de fenilhidrazina para formar la osazona. A continuacion se describe la formaci6n de una osazona a partir de una aldosa: sin embargo, el mecanismo de la reaccion es

mas complejo de 10 que aqui se muestra. La reaccion de una cetosa es bastante '

similar.

CHO

6HOH + I

R

Aldosa Fenilhidrazina

CH=N-NH-C6Hs

6HOH -+' H20

~ .

Fenilhidrazona

Fenilhidrazona

Osazona

168 Bloqulmlce pr6ctlce

Glucosazona (agujas 0 plumas)

•

Arabinosazona

(agujas agrupadas en bolas no muy densas)

~~~ ¥=-

Maltosazona (agujas aplanadas)

Galactosazona(aplanada)

• e_

J

Lactosazona

(ag ujas finas agrupadas en bolas)

Xilosazona

(agujas largas y finas)

Figura 6.2 Apariencia cristalina de las osazonas como se observan en el microscopio a baja potencia.

Tanto la glucosa, como la fructosa y la manosa forman la misma osazona, puesto que la configuraci6n de los atomos de carbono 3, 4, 5 y 6 es la misma para los tres azucares. La manosa forma cristales blancos de fenilhidrazona a temperatura ambiente, y la osazona de color amarillo se separa al calentarla.

Materl.lea 100

1. Acido acetico (glacial).

2. Soluci6n de fenilhidrazina.

3. Acetato de sodio.

4. Microscopios ..

M6todo

Acidifique 5 ml de la solucion de los azucares con 10 gotas de acido acetico glacial, agregue tres gotas de la solucion de fenilhidrazina y un poco de acetato de sodio solido (en la punta de un cuchillo). Caliente en un bafio de aguadurante 5 min agitando ocasionalmente, filtre y caliente el filtrado en un bafio de agua por 20 min; Deje enfriar muy lentamente y examine bajo el microscopio los cristales de osazona: compare sus formas con los dibujos de la figura 6.2.

1 1 200 ml 500 g 20

'~I •

Carbohidratos 169

Anote cuidadosamente el tiempo al cual precipita cada osazona y tam bien si se forma en solucion fria 0 caliente (ver apendice).

Prueba. para carbohldrato. Indlvlduale.

EXPERIMENTO 6.6 Prueba de Bial para las pentosas Fundamento

Cuando se calientan pentosas con HCl cone. se forma furfural que se condensa con orcinol en presencia de iones f{~rricos para dar un color verde azuloso. La reaccion no es absolutamente especifica para las' pentosas, ya que el calentamien to prolongado de algunas hexosas produce hidroximetil furfural que tarnbien reacciona con orcinol dando complejos coloreados.

Materlale. 100

1. Reactivo de Bial. (Disuelva 1.5 g de orcinol en 500 ml de 4 I

HCl cone. y afiada ·20 gotas de solucion de FeC13 roo gil).

2. Alcohol amilico. 4 1

M6todo

En un tubo de ensayo agregue aproximadamente 1 ml de la muestra a 2.5 ml de reactivo y caliente hasta que empiece a hervir. La aparicion de una coloracion azul verdosa indica resultados positivos. Enfrie el tubo, luego agregue 2-3 ml de alcohol amilico y agite.

CH3 Orcinol (3,5-dihidroxitolueno) O~ HO #OH

EXPERIMENTO 6.7 Prueba de Seliwanoff para las cetosas Fundamento

Las cetosas se deshidratan mas rapidamente que las aldosas dando derivados de furfural que se condensan con resorcinol para formar un complejo rojo; por 10 tanto, debe evitarse un calentamiento prolongado de la muestra que se esta estudiando.

OH Resorcinol (m-dihidroxibenceno) O~ #OH

Materlale.

1. Reactivo de Seliwanoff (resorcinol 0.5 gil en HCl 3 mol/l).

100 31

170 Bloqulmlca practlca

Metodo

A 2 ml del reactivo de Seliwanoff agregue dos gotas de solucion de carbohidrato y caliente durante 1 min en un bafio de agua hirviendo. Observe la

aparicion de un colot rojo intenso. .

EXPERIMENTO 6.8 . Pruebas para sacarosa

Fundamento

La sacarosa es el unico disacarido comun no reductor y por 10 tanto no.reduce las soluciones alcalinas de cobre ni forma osazonas. La sacarosa es hidrolizada en soluci6n acid a y luego se ensayan la glucosa y fructosa resultantes.

Materlales

1. Solucion de sacarosa (1 gil Y 10 gil).

2. Acido clorhidrico (conc.).

3. Hidr6xido de sodio (5 mol/I),

4. Reactivos como en los experiroentos 6~3, 6.4, 6.5 y 6.7.

Metodo

A 5 ml de soluci6n de sacarosa agregue cinco gotas de HCl conc., caliente durante 5 min en un bafio de agua hirviendo, enfrie y agregue N aOH hasta que la solucion sea neutra 0 debilmente alcalina. Con la soluci6n hidrolizada realice las pruebas para azucares reductores y la de Seliwanoff. Prepare la osazona usando el hidrolizado e identifique los monosacaridos constituyentes por medio de la cromatografia de capa delgada (experiroento 3.12).

100 11 200 ml 1 1

EXPERIMENTO 6.9 Pruebadel Yodo Fundamento

El yodo forma coroplejos coloreados de adsorcion con los polisacaridos; el almidon da un color azul con yodo, roientras que el glicogeno y el almidon parcialmente hidrolizado reaccionan dando una coloraci6n pardo rojiza.

Materlales 100

1. Soluci6n de yodo (5 mmol/l en KI (30 gil». 100 ml

2. Celulosa, glicogeno, almidon e inulina (10 gil). 200 ml

Metodo

Acidifique la muestra con HCl diluido, agregue luego dos gotas de yodo y compare los colores obtenidos con los de yodo en agua.

EXPERIMENTO 6.10 Hidt6lisis de los potisacaruios Fundamento

Los polisacaridos con tienen solo un grupo red uctor por varios cien tos 0 mas de residuos, asi que, en la practica no son reductores. La hidrolisis acida libera los monosacaridos constituyentes que pueden ser luego ensayados.

Carbohldratol 171

Materlales 100

1. Polisacaridos como en el experimento 6.9.

2. Acido clorhidrico (conc.).

3. Hidroxido de sodio (5 mol/I).

4. Solucion de yodo (aprox. 5 molll en KI (30 gil».

5. Reactivos como en el experimento 6.3, 6.5 y 6.7.

Metodo

Coloque en un tuba 10 ml de solucion de polisacaridos, afiada 10 gotas de Hel cone. y hierva cuidadosamente. Con una pipeta de Pasteur remu.eva una gota de la solucion cad a minuto y mezclela con una gota de yodo en una baldosa blanca. Al mismo tiempo, retire 3 gotas de la solucion, coloquelas en un tuba de ensayo, neutralice con NaOH y agreguefi ml de la solucion de Benedict. Continue sacando muestras durante 6 min 0 mas si 10 cree apropiado; luego colo que los tubos que contienen la solucion de Benedict en un bafio de agua hirviendo durante 3 minutos y deje enfriar. Explique los resultados.

Neutralice con alcali el resto de la solucion e identifique el azucar 0 los azucares presentes hasta don de sea posible.

200 ml 500 ml 500 mlx 100ml

Protocolo para la Identlflcacl6n de un carbohldrato desconocldo Luego de que todas las pruebas ahteriores hayan sido realizadas satisfactoriamente, disefie un protocolo para la identificacion de una solucion de carbohidratos. Compare su protocolo con el que se da en el apendice. Todas las identificaciones deben ser confirmadas mediante cromatografia de papel 0 de capa delgada.

En este punto se aconseja identificar, hasta donde sea posible, muestras desconocidas de carbohidratos.

Polarlmetria

El polarimetro. Tal como se discutio previamente, la mayoria de los azucares contienen uno 0 mas atomos de carbono asimetrico y poseen actividad optica. La rotacion del plano de laluz polarizada puede demostrarse y medirse con un polarimetro (figura 6.3). La luz monocromatica atraviesa un prisma de Nicol y sale polarizada en un plano. EI haz de luz polarizada pasa a traves de la muestra de azucar, que hace rotar el plano de la luz. Se hace entonces girar el segundo prisma de Nicol hasta cuando su plano de polarizacion se encuentre en angulo recto con el primer prisma, y por consiguiente,el rayo de luz no pueda pasar a traves del instrumento. Alternativamente se hace girar el segundo prisma hasta cuando correspond a con el plano de polarizacion del primero dan do asi un campo de maxima brillantez. El instrumento se gradua en cero en cualquiera de estas posiciones usando solvente unicarnente en la camara de muestra. En la practica, la luz emergente se ve comodos zonas semicirculares y el cero se obtiene cuando ambas mitades del campo visible

172 Bloqulmlca pracllca

lente de luz monocromatica

Luz polarizada

Polarizador

Tubo del polarimetro Que contiene la muestra

Analizador

Figura 6.3 Componentes esenciales del polarimetro

son de oscuridad 0 brillantez uniforme. Se reemplaza luego el solvente con la soluci6n que se va a investigar y se hace girar el analizador para volver a las condiciones de brillantez minima 0 maxima. Se toma nota entonces del grado y la direcci6n de la rotacion.

Si el angulo de rotaci6n avanza en la direccion en que se mueven las manecillas del reloj, el compuesto es dextrorrotatorio (+) y si 10 hace en sentido contrario, entonces el azucar es levorrotatorio (-).

Rotacum especifica. El grado de rotaci6n observado depende de un numero de factores que incluyen la longitud del tuba (l, dm) y la concentracion del soluto (c, g/rnl), asi como la temperatura (t, °C) y la longitud de onda de la luz us ada (A nm). La rotacum especifica es caracteristica de cad a compuesto y se define como la rotacion de la luz monocrornatica causada por 1 g/ml de un soluto 6pticamente activo en un tuba de 1 dm a una temperatura fija.

rotacion especifica [a] ~ = a/(l x c)

En la practica, la mayoria de los polarimetros simples usan lam para de sodio (A = 589 nm) y las observaciones se hacen general mente a 20° C y, en este caso, la rotacion especifica se da como [a] bO .

EXPERIMENTO 6.11 Mutarrotacion de la glucosa Fundamento

La D-glucosa puede cristalizarse bien sea en la forma a 0 en la (3 y, las soluciones frescas de estos an6meros tienen rotaciones especificas [aJ bO de +113° y 19° respectivamente, Luego de un tiempo, estas soluciones muestran mutarrotacion y se obtiene una mezcla de las formas ay {3 en equilibrio con una rotacion especifica de + 52.5°.

Materlale.

1. Polarimetros.

2. a -D-glucosa.

10

5 100 g

Carbohldrato8

173

3. ~ -D-glucosa.

4. Carbonato de sodio (0.1 mol/I.

5. Cron6metros. .

Metodo

Mutarrotacion en agua destilada. Enjuague el tubo del polarimetro con agua destilada y llenelo completamente de agua. Afiada las ultimas gotas con una pipeta Pasteur y tape cuidadosamente asegurandose de que no hayan quedado atrapadas burbujas de aire. Ajuste el instrumento a cero con eltubo del polarimetro lleno de agua. Vacie el tubo y sequelo completamente. Transfiera cuidadosamente 5 g de a-D-Glucosa a un matraz volumetrico seco de 50 ml, agregue 40 ml de agua para disolver la glucosa, y llene hasta la marca con agua destilada. Mezcle rapidamente la soluci6n y llene el tuba del polarimetro con la solucion de glucosa: tome una lectura de la rotacion tan pronto como sea posible y comience el cronometraje (tiempo cero). Mida la rotacion cada 10 minutos durante los 30 minutos siguientes y luego a intervalos mas largos hasta obtener un valor. constante. Repita el experimento con ~-D-glucosa y hag a un grafico del cambio de la rotacion especifica en funcion del tiempo.

100 g 50 ml 5

Mutarrotacion en cilcali. Repita el experimento anterior con las formas 0' y ~ de D-glucosa, pero esta vez agregue 1 ml de solucion de Na2C03 (0,1 mol/l) antes de completar hasta la marca. Obtenga la primera lectura tan pronto como sea posible y tome lecturas cada 2 minutos durante 10 minutos y luego a intervalos mas largos hasta que no se observen mas cambios. Haga un grafico del cambio en la rotaci6n especifica en funci6n del tiempo.

;,Hasta que punto coinciden sus lecturas de la rotacion especifica con las que se han discutido arriba?

Repita el experimento en alcali, pero ahora use sacarosa en lugar de glucosa y explique los resultados.

DETERMINACION CUANTITATIVA DE CARBOHIDRATOS

EXPERIMENTO 6.12 Determinacion de carbohidratos por el metoda de la antrona

Fundamento

La reaccion de la antrona constituye la base de un metoda rapido y conveniente para la determinacion de hexosas, aldopentosas y acidos hexuronicos, bien sea que esten libres 0 forman do parte de los polisacarrdos. La soluci6n azul verdosa muestra unaabsorcion maxima a 620 nm, aunque algunos carbohidratos pueden dar otros colores. Esta reaccion no es adecuada si en la muestra tambien se hallan presentes protein as que contengan grandes cantidades de tript6fano, puesto que en este caso se obtiene una coloraci6n roja.

174 Bloqulmlca prjctlca

La extinci6n depende del compuesto investigado, pero es constante para una molecula dada.

Materlales

1. Reactivo de 'antrona (2 gil en H2S04 cone),

2. Glucosa (0.1 gil).

3. Glicogeno (0.1 gil).

4. Otros carbohidratos con la misma concentracion si se quiere.

M6todo

Al ml de una soluci6n de carbohidrato agregue 4 ml del reactivo de antrona

"Iibre de proteina y mezcle rapidamente. (Preceucion. acido fuerte). Coloque los tubos en un bafio de agua hirviendo durante 10 minutos tapandolos con una bola de vidrio para prevenir perdidas de agua por evaporacion, Enfrie y lea la extincion a 620 nm contra un blanco.

Prepare curvas patrones para las soluciones de glucosa y glicogeno y comparelas entre S1. Recuerde que la glucosa existe en el glicogeno como glic6sido (C6 HlO Os) Y su peso mol. es 162 y no 180. Examine la pureza de varias mezclas de glicogeno comercial.

51 2 1 2 1 2 1

EXPERIMENTO 6.13 Determinacion de azucares reductores por el metoda de Somogyi-Nelson

Fundamento

Se calienta el azucar con una soluci6ri alcalina de tartrato de cobre produciendo asi oxide cuproso, que reacciona con arsenomolibdato para dar azul de molibdeno; el color azul intenso originado se mide en un colorimetro. En la mezcla de reacci6n se incluye sulfato de sodio para minimizarla entrada de oxigeno atmosferico a la soluci6n, 10 cual podria causar reoxidacion del 6xido cuproso.

La curva de calibraci6n obtenida depende en cierto grado del azucar . determinado, asi que el metodo no es apropiado para la determinacion de una mezcla compleja de azucares reductores.

Se deben remover las protein as antes de proceder a la determinacion. Esto se hace utilizando hidroxido de zinc como agente de precipitacion de proteinas para obtener asi una solucion neutra libre de proteinas.

Materlales 100

1. Solucion alcalina de tartrato de cobre. (Disuelva en agua 4 g de 2 1

CuSO •. 5H20, 24 g de Na2C03 anhidro, 16 g de tartrato

sodico potasico (sal de Rochelle), y 180 g de Na2S04 anhidro

y complete all).

2. Reactivo de arsenomolibdato de Nelson (disponible 21

comercialmen te).

Carbohldratol 175

3. Soluciones patrones primarias de azucares (glucosa, fructosa y maltosa 1 gil en acido benzoico saturado).

4. Soluciones patrones de trabajo de azucares (glucosa, fructosa y maltosa (descritos en 3) diluidas 1 en 10 .antes de usarse para obtener concentraciones de

100 pg/ml).

5. Algunas soluciones 'desconocidas' de azucares.

6. Sulfato de zinc (solucion de ZnS04 • 7H20, 50 gil).

7. Hidroxido de bario (0.3 mol/I).

8. Bafios de agua hirviendo.

Metodo

En un tubo pipetee 1.5 ml de agua y 0.1 ml de la muestra que contenga 50-150 ug de azucares y mezcle vigorosamente. Afiada a la mezcla 0.2 ml de la solucion de hidroxido de bario y 0.2 ml de sulfato de zinc acuoso, mezcle y centrifugue. Use 1 ml del sobrenadante para los analisis posteriores.

Agregue a la muestra 1 ml del reactivo alcalino de cobre y mezcle. Coloque una bola de vidrio encima de cada tuba y caliente en un bafio de agua hirviendo por 15 min. Enfrie los tubos en agua fria; agregue 1 ml del reactivo de arsenomolibdato y dejelo reposar por un minuto hasta que termine la efervescencia. Diluya el color azul con agua hasta un volumen final de 10 ml (u otro volumen adecuado) y lea la extincion a 510 nm. La sensibilidad puede aumentarse leyendo la extincion a 660 nm, perose prefieren longitudes de onda menores de 510 para minimizar los efectos de variaciones en el blanco y de la reoxidacion del oxide cuproso.

EI tiempo del calentamiento tiene que ser controlado cuidadosamente y algunos azucares pueden necesitar periodosmas cortos 0 mas largos en el bafio de agua hirviendo.

50 ml

100 ml

100 ml 250 ml 250 ml

5

EXPERIMENTO 6.14 Determinacion de glucosa por medio de la enzima glucosa oxidasa (/3-D-glucosa; oxigeno oxidoreductasa, 1.1.3.4)

Fundamento

La glucosa oxidasa es una enzima que se encuentra en el medio de crecimiento de Penicillium notatum y cataliza la oxidacion de /3 -D-glucopiranosa a D-glucono-l,5-lactona con la formacion de peroxide de hidrogeno; la lactona es luego hidrolizada lentamente a acido Dvgluconico. La enzima es especifica para /l-D-glucopiranosa, pero la mayoria de las preparaciones de la enzima contienen mutarrotasa, que cataliza la interconversion de las formas a y (3. La D-manosa y la D-xilosa son tambien oxidadas por la enzima pero a velocidades de aproximadamente 11100 de la correspondiente D-glucosa. el otro unico azucar com tin afectado es la D-galactosa que es oxidada con una eficiencia de s610 111000 en relacion con la glucosa, EI metodo es por 10 tanto altamente especifico para la glucosa. En la mezcla de.reaccion se incluye tambien peroxidasa y o-tolidina: la enzima libera oxigeno a partir

176 Bloqulmlca practlca

del peroxide de hidrogeno y reacciona con la o-tolidina para dar un color azul. La reaccion es rapida a temperatura ambiente pero el color es inestable; por 10 tanto, todos los tubos deben ser observados al mismo tiempo. El tiempo mas conveniente es cerca de 8 minutos, pero debe ser verificado mediante la soluci6n patron de glucosa.

j3-D-glucopiranosa + FAD ~ D-glucono-l,5 lactona + FADH2 D-glucono-l,5Iactona + H20 ~ acido D-gluc6nico

FADH2 + O2 ~ H202 + FAD

j3-D-glucopiranosa + H20 + O2 ~ acido D-gluc6nico + H202

Se ha reportado que la o-tolidina es carcinoqenu:a, asi que debe usarse con cuidado. No pipetee con la boca.

M~~~" 100

1. Sulfato de zinc (ZnS04 • 7H20, 100 gr/I).

2. Sulfato de sodio isotinico (93 mmolll).

3. Reactivo de sulfato de sodio y sulfato de zinc. (Diluya 55 ml de sulfato de zinc all con la solucion de sulfato de sodio.)

4. Hidr6xido de sodio (0.5 molll).

5. Amortiguador de acetato (0.15 molll, pH 5).

6., Solucion de glucosa oxidasa (Fermcozyme de Hughes y Hughes; conservese a 4° C).

7. Peroxidasa (1 mg/ml; prepare y conserve a 4° C).

8. o-tolidina (10 gil en etanol absoluto, guarde en botella oscura).

9. Reactivo combinado de o-tolidina: 150 ml de amortiguador de acetato y 1 ml de glucosa oxidasa, 1 ml de peroxidasa, 1 ml de o-tolidina. La preparacion es

activa por varias semanas si se guarda en una botella oscura a 4° C.

10. Patron de glucosa (0.1 gil, preparese fresco).

Metodo

Procedimiento. En un tubo de centrifugacoloque 1.8 ml del reactivo de sulfato de sodio-sulfato de zinc yaiiada 0.1 ml de la muestra (sangre, etc). Aiiada 0.1 ml de hidroxido de sodio, 0.5 molll, centrifugue y tome. 1 ml del sobrenadante.

200 ml 2 I

2 I

250 ml 6 1 50 ml

50 ml 50 ml

6 1

100 ml

Blanco. 1 ml de agua.

Patrones. 1 ml de solucion de glucosa de concentracion apropiada.

Agregue 5 ml del reactivo combinado de o-tolidina y mezcle vigorosamenteo Deje reposar los tubos por 8 rnin exactamente y lea el color a 625 nm.

Carbohldratos 177

Use los metodos de Somogyi-Nelsony glucosa oxidasa para determinarel contenido de fructosa y glucosa en una mezcla de azucares como la que se encuentra en la mielde abejas.

EXPERIMENTO CON POLISACARIDOS

EXPERIMENTO 6.15 Hulrolisu: acida de glicogeno y otros polisacaridos Fundamento

La hidrolisis acida de los enlaces glicosidicos 01. 1-4 y ex 1-6 que unen los resi- . duos de glucosa en glicogeno ocurre al azar y, por consiguiente, se puede formar toda una gama de oligosacaridos intermediarios, a pesar de ser la glucosa el producto final.

Otros polisacaridos pueden ser mas resistentes 0 mas susceptibles que el glicogeno a la hidrolisis acida y algunos de ell os se incluyen en este experimento como topico de investigacion.

Materlales 100

1. Preparacion de glicogeno a partir del higado de rata del 1 g

experimento 10.14.

2. Otros polisacaridos tales como celulosa, inulin a y quitina. 1 g

3. Acido clorhidrico (2 mol/I). 1 1

4. Hidroxido de sodio (4 molll). 11

5. Resina de intercambio anionico debil,

6. Reactivo dinitrosalicilato (experimento 9.9). 21

Metodo

En 10 ml de agua disuelva aproximadamente 50 mg de glicogeno y pipetee 1 ml de esta solucion en 7 tubos. Agregue a cada tubo 1 ml de agua y 2 ml de HC12 moll 1 y coloquelos en up bafio de agua hirviendo. Coloque una bola de vidrio encima de cad a tuba paraprevenir perdidas excesivas a causa de la evaporacion y durante una hora remueva tubo por tubo a intervalos convenientes de tiempo. Neutralice los contenidos de cada tubo afiadiendo 1 ml de NaOH 4 molll y calcule el poder reductor total con el reactivo de dinitrosalicilato, como se indica en el experimento 9.9. Haga un grafieo del progreso de la

hidrolisis del glicogeno y compare con el de los otros polisacaridos, .

Al mismo tiempo, en un tubo agregue 2 ml de la solucion de glicogeno a 2 ml de HCl 2 molll e hidrolice por 1 hora como se indica anteriormente. Enfrie, agite con varias porciones de la resina de intercambio anionico debil en la forma hidroxilada hasta que la mezcla tenga aproximadamente un pH neutro. Decante el sobrenadante y uselo mas tarde para cromatografia. Repita la hidrolisis con los otros polisacaridos usando condiciones apropiadas.

"

178 BloqulmlClt prjctlce

EXPERIMENTO 8.18 Hidrolisis enzimatica del glicogeno por (X 11 ~ amilasas Fundamento

La o-amilasa cataliza la hidrolisis especifica de los enlaces glicosidicos (X 1-4 en el glicogeno, pero no actua sobre los enlaces {3 de la celulosa. Los enlaces (X 1-6 no son afectados; tam poco 10 son los enlaces (X 1-4 que ligan las unidades de glucosa en la maltosa. La hidrolisis no se hace en sitios especificos y se obtienen por 10 tanto una serie de intermediarios diferentes. EI producto final es principal mente maltosa con un poco de glucosa y maltotriosa. A medida que procede la hidrolisis se puede seguir el incremento en el numero de los grupos terminales reductores, usando el reactivo de dinitrosalicilato y se pueden identificar cromatograficamente los productos finales.

La {3-amilasa de plantassuperiores cataliza la hidrolisis.de los enlaces (X1-4 para dar maltosa, pero es una exoamilasa y por 10 tanto rornpe las unidades de maltosa a partir del extreme no reductor de la cadena. Cuando se llega a un punto de ramificacion, la digestion se suspende dando una dextrina limite. Se da a Ia enzima el nombre de {3-amilasa porque el producto inicial es (3-maltosa el cual origina mas tarde una mezcla equilibrada de (X y (3-maltosa. Al igual que con la o-amilasa, la extension y el progreso de la hidrolisis puede seguirse por determinacion de la cantidad de azucares reductores producidos.

Materlales

1. o-amilasa extraida de la saliva y {3 -amilasa de las plantas.

2. Preparacion de glicogeno de higado de rata.

3. Amortiguador de fosfato (0.1 mollI, pH 6.7). Contiene cloruro desodio 0.05 mol/I).

, 4. Reactivo de dinitrosalicilato (experimento 9.9). 5. Banos de agua a 37° C.

1 g 1 1

2 1 25

Metodo

En una serie de 7 tubos disuelva 50 mg de glicogeno en 10 ml de amortiguador salina (3) y pipetee 1 ml. A cada tuba afiada 3 ml de saliva diluida aproximadamentel a 100 con agua, e incube los tubos a 37° C por 1 hora. A intervalos adecuados remueva 1 tubo, agregue 1 ml de agua y pare la reaccion agregando 1 ml del reactivo de dinitrosalicilato.

Agregue 6 ml de o-amilasa a 2 ml de glicogeno e incube por 1 h a 37° C.

Desalinice la muestra usando una resina de Iecho mixto y utilice el sobrena- , dante para cromatografia.

Repita el experimento anterior con una preparacion convenientemente diluida de {3-amilasa en vez de saliva y determine Ia cantidad de azucares reductores liberados. Compare la cantidad de maltosa liberadacon la obtenida cuando se usa o-amilasa y calcule el porcentaje de glicogeno degradado por la {3-amilasa «(X-l,4-g1ucan maltohidrolasa 3.2.1.2.).

Carbohldratos 179

EXPERIMENTO 6.17 Identificaci6n cromatogrcifica de los productos de la hidr6lisis cicida y enzimatica del glic6geno

Identifique los productos de la hidrolisis usando cromatografia descendente de papel 0 decapa delgada (experimentos 3.10 y 3.12). Corra paralelamente muestras de los azucares que pueden estar presentes.

EXPERIMENTO 6.18 Ruptura del glic6geno y producci6n de glucosa-l-fosfato por la fosfo.rilasa muscular

Fundamento

EI glicogeno est a presente en cantidades apreciables en el higado y en el musculo de los animales bien nutridos. Entre las comidas, este carbohidrato de reserva es degradado para producir energia. La primera etapa en el metabolismo del glicogeno es la ruptura de la molecula por la fosforilasa. Esta enzima cataliza la remocion de unidades de glucosa de la parte lineal de la . molecula y la forrnacion de la glucosa-l-fosfato (G-1-P) a partir de fosfato

inorganico.

fosforilasa

(glucosa) n + Pi

(glucosa) n _ 1 + glucosa-l-fosfato.

La ruptura del enlace glicosidico con introduccion de los elementos del agua se conoce como hidr6lisis, mientras que la ruptura por fosfato se denomina fosfor6lisis; de aqui el nombre de la enzimafosforilasa. La reaccion es facilmente reversible, pero en vivo la concentracion de fosfato inorganico es tal que el equilibrio favorece la degradacion en vez de la sintesis ..

La mezcla de reaccion contiene cisteina para mantener los grupos tiol (SH) de la molecula proteica de enzima en la forma reducida, mientras que el cloruro presente inhibe Ia fosfoglucomutasa que en otra forma catalizaria la conversion de - G-1-P a G-6-P. EI AMP se aiiade para obtener la maxima actividad enzimatica, ya que la fosforilasa existe en dos formas: a y b Y la forma b es activa unicamente en presencia de AMP. .,

EI G-1-P producido es aislado como sal de bario y, siendo un hemiacetal, es hidrolizado facilmente por acido diluido (H2S04 0.5 molll) dando glucosa y fosfato. La reaccion se completa practicamente en 10 min a 1000 C Y esto se usa para verificar la estequiometria de los productos.

Material.. 100

1. Fosforilasa de glic6gerto.

2. Amortiguador de {3 -glicerofosfato de sodio (10 mmolll pH 6.8 que contiene cisteina 3 mmolll y NaF 0.1 mol/I).

3. Glicogeno (1.6% p/v en amortiguador de fosfato que contiene 0.26 mol/I, pH 6.8; cistefna 6 mmolll AMP 2 molll y NaF 0.2 mol/I).

4. Amilasa.

25 ml 500 ml

500 ml

100ml

5. Acetato de bario (200 gil).

6. Indicador rojo de fenol (10 gil en etanol acuoso).

7. Hidroxido de sodio (1 mol/I). '

8. Acido sulfurico (2 mol/I).

9. Etanol absoluto.

10. Reactivo para la estimacion de fosfato (experimento 4.3).

11. Banos de agua hirviendo.

12. Banos de agua a 37° C.

13. Probetas (25 ml).

14. Hielo molido.

15. Reactivos para la determinacion de azucares reductores (experimento 6.13).

16. Glucosa-1-fosfato (10 mmolll).

17. Glucosa-6-fosfato (10 mmol/l).

Metodo

Incubaci6n. En un tuba de ensayo mezcle 5 ml de amortiguador ~-glicerofosfato con 5 ml de la solucion de glicogeno y equilibre a 37° C durante 10 min. Inicie la reaccion afiadiendo 0.2 ml de fosforilasa convenientemente diluida en amortiguador j3-glicerofosfato. Incube durante 30 minutos a 37° C y pare la reaccion colocando el tubo en un bafio de agua hirviendo durante 2 min.

180 Bloqulmlca prjctlca

250 ml 50 ml 500 ml 500 ml 11

50 20 50

100 ml 100 ml

Aislamiento. Enfrie el tuba bajo agua corriente y remueva el exceso de glicogeno afiadiendo 1 ml de solucion de amilasa y dejandolo a temperatura ambiente por 30 minutos. Despues de la incubacion con amilasa, afiada 2ml de la solucion de acetato de bario y dos gotas de indicador rojo de fenol seguido por NaOH 1 molll afiadido got a a gota hasta obtener una coloracion rosada. Mezc1e de nuevo vigorosamente y remueva el precipitado de fosfato de bario centrifugando a velocidad maxima en una centrifuga de mesa. Remueva cuidadosamente el sobrenadante, mida el volumen y coloquelo en un erlenmeyer; agregue 3 veces el volumen de alcohol absoluto, mezcle bien y deje reposar por 30 minutos en hielo. El precipitado formado bajo estas condiciones es la sal de bario de la glucosa-1-fosfato.

Decante el sobrenadante y centrifugue la suspension durante 10 minutos a velocidad maxima en la centrifuga de mesa. Remueva el sobrenadante y deje secar el precipitado invirtiendo los tubos sobre papel de filtro. Repita el procedimiento de precipitacion despues de afiadir 4 ml de agua al azucarfosfato precipitado.

Estequiometria. Disuelva la sal de bario en 5 ml de agua y pipetee 2 ml en un tuba de ensayo que contenga 2 ml de H2S041 moll I. Mezcle vigorosamente y coloque en un bafio de agua hirviendo durante 10 min. Enfrie bajo agua corriente, agregue luego 2 ml de NaOH 2 mol/l para neutralizar la reaccion; centrifugue y ensaye el sobrenadante para azucares reductores y fosfato usando los metodos que se dan en ellibro. Pipetee otros 2 ml de la muestra del

Carbohldratos 181

ester de fosfato en 2 ml de H2S04, pero esta vez agregue NaOH inmediatamente despues y no coloque los tubos en el bafio de agua hirviendo. En este control no hidrolizado se hace tam bien la prueba para fosfatos y azucares reductores. Calcule la produccion de G-1~P mediante la determinacion de azucar y fosfato, suponiendo que se ha efectuado la hidrolisis completa.

Compare los resultados con los obtenidos despues de la hidrolisis acida de una solucion de glucosa-1-fosfato 1 mmolll y de una solucion patron de glucosa-6-fosfato diluida 10 mmol/I,

Blbllografia

Guthrie, R. D., Introduction to Carbohydrate Chemistry, 4a ed. Oxford Clarendon Press, 1974.

Pigman, W. y Horten, D., The Carbohydrates, 2a ed. Nueva York, Academic Press, Vol. lA, 1972, Vois 2A y 2B, 1970.

Whelan, W. J., Biochemistry of Carbohydrates, Londres, Butterworth y University Park, University Park Press, 1975.

Whistler, R. L. Methods in Carbohydrate Chemistry, Nueva York, Academic Press, Vols 1-6, 1962-71.