REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE ABDELHAMID IBN BADIS DE MOSTAGANEM

FACULTE DES SCIENCES EXACTES ET DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

Département de biologie
3ème année génie biologique

Compte rendu des tp

Enzymologie.

Thème :
 La lipase végétale
 Hydrolyse de l’amidon par l’amylase végétale

Auteurs :
Groupe :2 Resposable du module :

Année universitaire  :2010/2011

Introduction :
Les enzymes sont des protéines essentielles à toute vie. Sans enzymes aucune activité biologique ne
se produirait. Elles catalysent, c'est-à-dire accélèrent et régularisent, la quasi-totalité des réactions
biochimiques qui se produisent dans le corps humain. Il existe de très nombreuses enzymes actives
dans l’organisme qui agissent au niveau des muscles, de la stimulation des nerfs, du rythme
cardiaque, de la fonction respiratoire ou encore cérébrale. Elles agissent à faible concentration et se
retrouvent intactes en fin de réaction.
Le complexe Enzymes végétales apporte un large éventail d’enzymes clefs exclusivement issues du
règne végétal pour aider à la digestion.

Ces différents types d’enzymes, agissent sur les grosses molécules présentent dans le bol alimentaire,
à titre d’exemple :

 Lipides : Lipases
 Amidon (glucide) : Amylase

I. Lipase:
Les lipases forment une famille hétérogène d'enzymes capables d'hydrolyser les
triglycérides à longues chaînes d'acides gras en glycerol et en acides gras
correspondants. Elles ont été mises en évidence, dès 1901, chez des bactéries
telles
queBacillus prodigiosus, Bacillus pyocyaneus et Bacillus fluorescens (respectivem
ent Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginasa et Pseudomonas fluorescens)
(Eijkmann et al., 1901). Cependant, ce n'est qu'à partir de la fin des années 1950
que l'étude des lipases a réellement pris son essor, notamment avec les travaux
de l'équipe de Desnuelle à Marseille sur la lipase pancréatique de porc.

Les lipases constituent une classe particulière d'estérases capables d'hydrolyser

des esters carboxyliques agrégés en phase aqueuse (Sarda et al., 1958). La
réaction de catalyse nécessite une molécule d'eau et se déroule à l'interface
eau / substrat insoluble. Cette particularité catalytique a été démontrée en
représentant les vitesses initiales d'hydrolyse en fonction de la concentration en
substrat.

La dénomination des lipases repose donc essentiellement sur la nature des

substrats hydrolysés préférentiellement. Toutefois, on peut distinguer d'une part
les lipases au sens strict, présentant une activation interfaciale et d'autre part, les
carboxyl-ester hydrolases, très peu actives sur les triglycérides à longues chaînes,
ne nécessitant pas d'activation interfaciale mais capables d'hydrolyser une large
gamme de substrats lipidiques. En plus de leur capacité d'hydrolyser les graisses,
 les lipases peuvent catalyser bon nombre de réactions allant de l'hydrolyse à
l'estérification sans oublier les réactions d'alcoolyse et d'acidolyse.

Cette particularité des lipases de catalyser diverses réactions en fonction du

micro-environement de l'enzyme, ainsi que leurs spécificités et leurs conditions
douces de réactions, les rendent intéressantes du point de vue industriel.

ORIGINES ET CLASSIFICATION DES LIPASES

Les lipases sont largement répandues dans la nature où elles ont un rôle physiologique
important dans le métabolisme des graisses. On les retrouve aussi bien dans le règne
végétal, chez les invertébrés et les vertébrés mais également chez de nombreux micro-
organismes, principalement sous forme de protéines extracellulaires.

Les lipases végétales

Les lipases sont largement répandues au sein de la plante bien qu'on les retrouve
principalement dans les graines où les triglycérides sont stockés dans des structures
intracellulaires appelées oléosomes (ou oil bodies) (Beisson et al., 2001). Sous l'action
des lipases, ces triglycérides sont hydrolysés sous forme d'acides gras dont le rôle est de
fournir l'énergie nécessaire à la germination de la graine et au développement de la
jeune plante (Adlercreutz et al., 1997).

Les lipases végétales peuvent être classées en trois grands groupes. Le premier groupe
est constitué par les triacylglycérol hydrolases qui sont principalement présentes dans les
graines. Leur étude revêt une importance économique capitale puisqu'elles sont
responsables en grande partie de l'altération des graines pendant le stockage. Les
constituants du second groupe, dénommés acylhydrolases, sont présents dans divers
tissus de la plante. Ces enzymes présentent peu de spécificité pour leur substrat ; elles
sont incapables d'hydrolyser les triglycérides mais elles peuvent catalyser certaines
réactions de transestérification (Hills et al., 1990). Les principales acylhydrolases sont les
phospholipases A et B ; les glycolipases, les sulfolipases et les monoglycéride lipases. Le
troisième groupe est constitué par les phospholipases C et D.
Les lipases végétales interviennent également dans le métabolisme, le réarrangement et
la dégradation de la chlorophylle lors de la croissance et de la sénescence des feuilles
ainsi que dans le processus de mûrissement des fruits. Par exemple, les chlorophylases
(chlorophylle-chlorophylido hydrolases), présentes dans la membrane des thylakoïdes
des chloroplastes, interviennent dans le catabolisme de la chlorophylle (Tsuchiya et al.,
1999).

Chez les plantes supérieures, les lipases interviennent dans la biosynthèse de

transducteur intervenant dans les mécanismes de régulation ou de défense contre une
variété de pathogènes. En effet, les oxylipines octadécanoïques telles que l'acide
jasmonique sont synthétisées à partir d'acides gras, notamment d'acide α−linolénique,
en présence de lipases membranaires (Farmer et al., 1992 ; Stelmach et al., 2001).

Certaines protéines végétales possédant une activité lipolytique peuvent avoir un effet
cytotoxique pour les cellules animales. Par exemple, la ricine, une glycoprotéine isolée de
la graine de Ricinus communis, induit le blocage de la synthèse des protéines par
inactivation des ribosomes (Lord et al., 1994 ; Lombard et al., 2001 ; Morlon-Guyot
et al., 2003). Leur étude a permis leur utilisation comme immunotoxines dans le
traitement de certains cancers (Girbes et al., 1996).

D'un point de vue industriel, l'intérêt des lipases végétales n'a cessé de s'accroître depuis
quelques années, notamment dans le domaine de la biotransformation de lipides. En
effet, les lipases végétales sont facilement isolées à partir de graines (Hassanien et al.,
1986) et elles présentent des spécificités de substrat atypique comparées aux lipases
microbiennes (Pahoja et al., 2002). Par exemple, la lipase des graines de colza
(Brassica napus), obtenue par simple homogénéisation de graine dans un tampon
adéquat, est utilisée industriellement dans la modification d'huile de tournesol ou dans
l'enrichissement de l'huile de primevère en acide γ-linolénique (Hassanien et al., 1986 ;
Hills et al., 1989).

Réaction lipase-glycérides :
II Amylase :
L'amylase (EC 3.2.1.1) est une enzyme digestive classée comme saccharidase (enzyme qui brise
les polysaccharides). C'est surtout un constituant du suc pancréatique et de la salive, requis pour
le catabolisme des glucides à longue chaîne (comme l'amidon) en unités plus petites. L'amylase
est également synthétisée dans de nombreuses espèces de fruits pendant leur maturation, ce qui
les rend plus sucrés, et aussi durant la germination des grains de céréales. Elle joue un rôle
essentiel dans l'amylolyse (ou hydrolyse) de l'amidon de malt d'orge, processus nécessaire à la
fabrication de la bière.

Deux types sont les amylases :

l'α-amylase (alpha-amylase) :enzyme d’origine animale

La bêta-amylase fait partie de la famille des amylases d’origine végétale (maltase

éxtraite du malte de l’orge).Elle libère du maltose (un sucre dimère du glucose) aux
extrémités de l’enchaînement des molécules d’amidon.

Réaction :
Partie pratique :
Tp n01 : La lipase végétale

Principe et but : Saponification d’un glycéride par la lipase du

ricin.

Matériels :

- Graines de ricin-

-L’huile (d’olive neutre)

- Solution d’acide acétique N/10 environ

- Solution de soude N/10

- Phénolphtaléine

- Mortier

- 4 erlenmeyers de 100 ml

- Pipettes bâton de 5 ml et pipette à 2 traits de 2 ml

- Pipettes Pasteur

- Burette de Mohr avec support

- Bain-marie

Technique :

Broyer dans un mortier huit graines de ricin préalablement décortiquées et répéter cette opération trois
fois en répartissant les trois fractions ainsi obtenues dans trois erlenmeyers(A,B,C).

Mettre dans chaque erlenmeyer une égale quantité d’huile d’olive neutre (5 grammes pesés
exactement).Puis procéder de la manière suivante :

Fiole A Ajouter à la pipette 2 ml d’acide acétique N/10. On réalise ainsi l’acidité optimum pour l’action
de la lipase du ricin.Agiter énergiquement et laisse au repos 30 minutes.

Fiole B Procéder comme pour A mais sans ajouter d’acide acétique.

Fiole C Procéder comme pour A mais, immédiatement après avoir ajouté l’huile d’olive, porter 10 à 15
minutes au bain-marie bouillant avant d’ajouter l’acide acétique.
Durant les 30 minutes que dure l’hydrolyse, doser à la burette la quantité de soude N/10 nécessaire
pour neutraliser les 2 ml d’acide acétique. Pour cela mettre 2 ml d’acide acétique pour neutraliser les 2
ml d’acide acétique.

pour cela mettre 2 ml d’acide acétique dans un quatrième erlenmeyer et 5 gouttes de phénolphtaléine.

Mesurer à la burette la quantité V1 de soude nécessaire pour obtenir une coloration rase
persistante.Au bout de 30 minutes, doser de la même manière l’acidité de chaque fiole après avoir
ajouté au contenu 5 gouttes de phénolphtaléine.

Résultats :

Erlens
numérotés
A B C T
 2ml acide  5gd’huile  5g d’huile  2ml acide
acétique acétique
opération +5g
d’huile
 30 min à  30 min à  10min  Dosage
températu température dans le directe
re ambiante bain sans
ambiante marie incubation
bouillant
 2ml acide
acétique
 20min à
températ
ure
ambiante
Volume 11.5ml 10.5 14.5 1.9
mesuré

Discussion :

En comparant les volumes ;on trouve que VA est supérieur à VB ,et la différence entre les deux
volumes a approximativement égale à 1.9 le volume du témoin c'est-à-dire V A-VT=le volume
nécessaire pour neutraliser les acides gras libérés par l’hydrolyse ( la moitié environ de l’huile est ainsi
hydrolysée).

Pour C, on trouve un volume VC nécessaire pour la neutralisation de l’acide acétique car L’hydrolyse
n’a pas eu lieu à la suite de l’inhibition de la lipase par la chaleur, donc V C obtenu dans notre
expérience n’est pas adéquat puisqu’on a trouvé un volume supérieur à celui du A( ça peut être dû
aux circonstances de l’expérience) .

Conclusion :

A la fin, on peut déduire que la lipase du ricin n’agit qu’en milieu acide et à température optimum .
 Tp n02 : Hydrolyse de l’amidon par l’amylase végétale

Principe et but : Hydrolyse de l’amidon en unités de glucose par l’amylase végétale.

Matériels et produits :

Graines d’orges (plantules de 4 jours).

Sable

Empois d’amidon à 1 %

Eau iodée 

 Liqueur de Fehling A et B 

Tubes à essai

Pipettes de 5 ml et de 1 ml

Erlenmeyer de 100 ml

Bain-marie à 40°C

Solution de soude NAOH 0.9%

Méthode de travail :

*faire germer les graines d’orges dane une boite qui contient du coton et un peut d’eau
pendant 4 jours

*à l’aide du sable (1g) et 25ml de l’eau distillée ,broyer dans un mortier 5 graines de plantules
*filtrer le surnageant et récupérer l’extrait enzymatique dans un tube à
essai

*répéter l’opération 3fois en récupérant à chaque fois l’amylase dans un tube à essai.

*dans chaque tube à essai il faut mettre :

 0.3ml d’empois d’amidon

 0.7ml eau distillée
 1ml solution tampon (NaCl0.9%)
 1ml d’extrait enzymatique
Réaliser en début de l’expérience un test de la liqueur de Fehling sur un des tubes.
*mettre les tubes à bain marie à400c
*Après 3 minutes, prélever quelques gouttes et les poser dans les cavités d’une plaquette test , en
effectuant la réaction à l’eau iodée. Répéter ensuite, toutes les 3 minutes pendant 15 à 20min .
En fin de cette expérience, on refait le test à la liqueur de Fehling.

Résultats :
Toutes les colorations obtenues ont été identique ,même couleur jaune- rouge brique .

Discussion.
Les résultats qu’on a trouvé ne sont pas convenables, les colorations ne doivent pas être toutes
identique, on doit obtenir une dégradation de différentes couleurs ;du bleu vers le violet vers le
jaune en suivant les étapes de la dégradation d’amidon et les molécules résultante dans la solution.
La raison ou bien la cause dont les résultats n’étaient pas considérables ;peut être inefficacité du
réactif (eau iodée) ou les plantules ont été très âgées.

Conclusion :
L’amylase végétale est une enzyme qui permet de dégrader l’amidon en unités de D-glucose
(maltose)