El plegamiento de proteínas: un reto para la computación actual

Gildardo Sánchez Ante*

Desde hace algún tiempo se ha establecido la importancia que las proteínas tienen para la vida. Buena parte de la estructura de las células
de los seres vivos está formada por proteínas y la parte de esa estructura que no es proteína ha sido producida mediante enzimas que sí lo
son. Las enzimas son responsables de prácticamente todas las transformaciones químicas que ocurren en las células, y existen unas 100
mil proteínas diferentes en nuestros cuerpos.

Cuando esas proteínas son llevadas a ebullición con un ácido o una base diluidos las proteínas se hidrolizan dando lugar a compuestos
más pequeños llamados aminoácidos. Un hecho sorprendente es que todas las proteínas hidrolizadas dan lugar a solamente 20
aminoácidos, lo que significa que todas las proteínas se forman mediante combinaciones de 20 compuestos básicos. Esto es realmente
maravilloso, e intrigante. En pocas palabras, esto quiere decir que básicamente todo lo que soporta la vida en este planeta está formado por
cadenas de aminoácidos, integradas a partir de combinaciones de sólo 20 compuestos básicos.

Para facilitar el estudio de las proteínas se ha adoptado una notación que los científicos de ésta área usan, asignándoles un código de una
letra a cada uno de los aminoácidos. Así por ejemplo, tenemos que la alanina es representada por una “A”, la arginina por una “R”, la
asparagina por una “N” y así sucesivamente. Con este código, un trozo de una proteína puede describirse por una secuencia como la
siguiente: CGGSLIREDSSFVLTAAHC. Una molécula completa de una proteína puede tener una gran cantidad de aminoácidos, por
ejemplo, las levaduras como las que producen la cerveza tienen en promedio unos 466 aminoácidos, lo que significa que es posible obtener
20466 combinaciones. ¡Este número es mucho más grande que el número total de átomos en el universo! Abrumador, sin duda. Si nosotros
programáramos una computadora para generar todas las posibles combinaciones y generar cada una de estas combinaciones requeriera
de un micro segundo, este proceso tardaría del orden de 6.4 x 10592 años. ¡Mucho más que la edad del universo!, estimada en unos 11
billones de años.

Sin embargo, lo maravilloso de las proteínas no termina ahí. Si bien es cierto que las proteínas son moléculas lineales de aminoácidos
unidas mediante un tipo especial de enlaces, cuando una molécula de este tipo es sintetizada, inmediatamente inicia un proceso de
reacomodo como el que ocurriría si tomáramos un hilo y lo “hiciéramos bolita”. A este proceso se le conoce como el “plegamiento de la
proteína”, y es de una importancia fundamental por la siguiente razón. Si nos imaginamos la cadena de aminoácidos, uno tras otro, cada
uno de esos aminoácidos tiene elementos químicos colocados en una cierta estructura. A la hora de plegar esa cadena, algunos de esos
elementos quedarán acomodados al interior de la “madeja”, mientras que otros quedarán por fuera. Dependiendo de cuáles quedaron
dentro y cuáles quedaron fuera, la proteína actuará como atractor o repulsor de otros elementos químicos. Dicho en otras palabras, la
misma proteína puede tener diferentes funciones químicas dependiendo de cómo se pliegue. La estructura tridimensional de la proteína es
la que define la función química de la misma y no solamente la secuencia de aminoácidos. Pero lo más interesante de todo esto es que aún
no es claro para los científicos cómo es que la proteína “sabe” como plegarse de manera que su función sea la apropiada. Por supuesto
que esto ha generado una serie de hipótesis atrayendo la atención de muchos investigadores. Todos ellos modelan de alguna manera las
moléculas de proteínas y simulan en computadoras cómo ocurriría el proceso de plegamiento, para luego analizar la función química de la
molécula y compararla con resultados experimentales.

Responder a la pregunta de “cómo se pliega una molécula de una proteína dada” es sin duda uno de los retos de la ciencia actual, y los
científicos en computación tienen un papel primordial en la búsqueda de la respuesta. Es claro que hacer búsquedas exhaustivas, es decir
probar todas las combinaciones posibles no es factible, porque el tiempo requerido sería muy grande, aún usando la supercomputadora
más rápida conocida. Se requieren algoritmos eficientes para atacar este problema. Algunas de las propuestas actuales van por el lado de
modelar la dinámica química de la molécula y luego simularla en la computadora, haciendo ciertas concesiones en el modelado, para
volverlo práctico y resoluble en un tiempo razonable. Otras propuestas van más a la adaptación de métodos provenientes de otras áreas
que pudieran tener una cierta afinidad con el problema del plegamiento de proteínas. Un caso que cae dentro de la última categoría
consiste en utilizar métodos que se han empleado tradicionalmente para planificar los movimientos de un robot, con algunos resultados
alentadores. Estos métodos tienen como ventaja que pueden manejar cadenas de gran longitud en tiempos razonables, dado que son
métodos que se basan en la aleatoriedad. Por supuesto que no se ha dicho la última palabra en este tema, por lo que es posible y
necesario proponer métodos diferentes para atacar el problema de plegamiento de moléculas de una proteína.

No es raro escuchar en diversos foros que la computación en el futuro tendrá cada vez una mayor convergencia con las ciencias naturales.
Tanto en la inspiración que toman de éstas para resolver problemas (considérese el caso de la computación evolutiva o las redes
neuronales artificiales) como en las herramientas que la computación provee a otras áreas (como la biología) para simular a través de la
computadora procesos que ocurren en la naturaleza. El plegamiento de proteínas es un ejemplo del último caso y es uno en el que México
pudiera destacar, dada la tradición que tiene en la investigación en medicina y la consolidación que ha ido adquiriendo en la computación.
Investigadores despliegan moléculas de ARN usando fuerza mecánica
Al aplicar precisas fuerzas mecánicas a los extremos de las moléculas individuales de ARN,
unos investigadores han desplegado y replegado exitosamente las moléculas. Según los
científicos, las mediciones de las fuerzas necesarias para desplegar y replegar estas
moléculas producirán nueva información sobre cómo las moléculas de ARN consiguen sus
estructuras tridimensionales estables.

En un artículo publicado en el número del 27 de abril de 2001, de la revista Science , el

investigador del Instituto Médico Howard Hughes, Carlos Bustamante y los colegas Jan
Liphardt, Bibiana Onoa, Steven B. Smith e Ignacio Tinoco, Jr., en la Universidad de California,
en Berkeley, publicaron cómo utilizaron la fuerza mecánica para desplegar tres tipos de
moléculas de ARN.

“En un primer momento, queríamos estudiar un ribosoma completo, pero cuando se

hizo evidente la complejidad que estábamos observando cuando tirábamos del
ribosoma, nos dimos cuenta que iba a ser imposible entender todo desde un
principio”.
Carlos Bustamante

“Los investigadores han estado interesados en las fuerzas implicadas en el plegamiento de

proteínas y ácidos nucleicos tales como el ARN, dado que su estructura tridimensional es
crítica para su función”, dijo Bustamante. Además, las células parecen utilizar fuerzas
mecánicas para desplegar proteínas y moléculas de ARN durante el proceso de degradación,
y es poco lo que saben los científicos sobre cómo ocurre este proceso.

“Tradicionalmente, los científicos han intentado estudiar el desplegamiento fundiendo las

moléculas con temperatura o desnaturalizándolas con productos químicos. Pero el problema
con esas metodologías es que medían masivos números de moléculas a la vez y hacían un
promedio final de esa extensa población. Sumado al problema de que cada molécula puede
tomar una vía diferente para desplegarse”, dijo Bustamante.

Para medir la fuerza necesaria para desplegar una sola molécula de ARN, Bustamante y sus
colegas unieron a cada extremo de la molécula a estudiar una bolita de plástico microscópica
a través de “manijas” de ARN/ADN”. Utilizaron una “trampa óptica” que consistía en un rayo
láser que sostenía y medía la fuerza en una bolita, a medida que un actuador piezoeléctrico
unido a la otra bolita proveía de las diminutas fuerzas que son requeridas para desplegar la
molécula. Los científicos también utilizaron la técnica para medir el cambio en la longitud de
la molécula a medida que ésta se desplegaba.

“Este sistema eliminó el problema de hacer el promedio de una gran cantidad de moléculas y
el problema de las múltiples vías de reacción”, dijo Bustamante, “porque a medida que
tiramos, seguimos el desplegamiento de una sola molécula a lo largo de una vía en
particular”.

En sus experimentos, los científicos desplegaron tres clases de moléculas de ARN, cada una
más compleja que la anterior:

• la más simple, una estructura de ARN en forma de “horquilla” plegada

• un ARN que también contenía una “hélice empalmada” más compleja que se
encuentra en muchos ARNs plegados
• la más compleja, un ARN que tenía una “protuberancia” en su estructura, y que
puede lograr una estructura terciaria.

“En un primer momento, queríamos estudiar un ribosoma completo”, dijo Bustamante, “pero
cuando se hizo evidente la complejidad que estábamos observando cuando tirábamos del
ribosoma, nos dimos cuenta que iba a ser imposible entender todo desde un principio. En
última instancia, nos dimos cuenta que dado que las moléculas de ARN son jerárquicas en su
estructura, siendo cada dominio relativamente independiente, sería posible sintetizar los
diferentes dominios de la molécula y después tirar de cada tipo de dominio para entender
sus características”.
Los resultados de los experimentos de los científicos revelaron que cada uno de los tres tipos
de moléculas de ARN tenía características distintivas. Por ejemplo, los ARNs de la horquilla y
de la hélice empalmada presentaron un fenómeno que los científicos llamaron “brinco”. En
estos casos, si las moléculas eran sostenidas con una fuerza constante que fuera lo
suficientemente grande para lograr las moléculas de transición entre los estados desplegado
y plegado, éstas podrían brincar hacia adelante y atrás, yendo de un estado al otro. A partir
de este estado de brinco, los científicos podrían identificar las fuerzas requeridas para
desplegar las moléculas, medir los índices de plegamiento y desplegamiento y la energía del
proceso. También encontraron que las fuerzas de desplegamiento coincidían con las fuerzas
replegamiento. “Esto significa que todo el trabajo mecánico que se hace para tirar de la
molécula y para desplegarla, sólo va a romper los enlaces de la molécula que mantienen el
plegamiento”, dijo Bustamante. “Esto significa que se puede llevar el proceso al equilibrio”.

Los científicos también investigaron las características del plegamiento en presencia de iones
magnesio, que están involucrados íntimamente en el plegamiento del ARN. “Una vez que se
permite que la molécula logre su estructura tridimensional en presencia de magnesio, la
molécula se hace más lenta para desplegarse y replegarse, y ya no se la puede llevar a un
estado de equilibrio fácilmente”, dijo Bustamante.

En el ARN más complejo con el agregado de la “protuberancia”, los científicos observaron un

desplegamiento más complejo que llamaron “rasgadura”. En este proceso, la molécula se
puede desplegar parcialmente, luego detenerse y sólo después de un leve aumento en la
fuerza se desplegará por completo y de forma repentina.

“Cuando se empieza a observar moléculas más complejas, se comienza a ver vías diferentes,
con similares partes de desplegamiento de moléculas a fuerzas diferentes”, dijo Bustamante.

Tal riqueza de mediciones, dijo Bustamante, sugiere que la nueva técnica generará una
abundancia de datos sobre el plegamiento del ARN.

“En la actualidad, si se le pregunta a un bioquímico cuán estable es una molécula mutante, él

le puede dar una cifrasu temperatura de fusión”, dijo Bustamante. “Quisiéramos darle a ese
bioquímico una curva de la función de la energía, que le diga las barreras de energía que
mantienen unida a la molécula y qué es lo necesario para desplegarla”. Eventualmente, dijo,
la técnica de desplegamiento mecánico podía mejorar los modelos teóricos de plegamiento
molecular, al permitir que los teóricos comparen sus predicciones de plegamiento con
resultados experimentales de moléculas reales.

Plegamiento y desnaturalización

El interés sobre el plegamiento de las macromoléculas se despertó sobre al

estudiar sus reacciones de desnaturalización. Si tenemos proteínas o ácidos
nucleicos en disolución y cambiamos de forma notable las condiciones en que
suelen encontrarse en su medio biológico, pierden su estructura y función
nativas. Este proceso, llamado reacción de desnaturalización, puede ser
reversible en ciertas condiciones y los cambios pueden ser por ejemplo de

temperatura, por encima de su temperatura de fusión ( ), o en la naturaleza

del solvente. Anfinsen et al. (1961) mostró experimentalmente que la
desnaturalización es reversible al para proteínas pequeñas, añadiendo y
retirando agentes desnaturalizantes a disoluciones de enzimas que ganaban y
perdían su actividad. Así demostró que el plegamiento de una proteína
depende exclusivamente de su secuencia, aunque hoy sabemos que algunas
necesitan la ayuda de chaperoninas (Hartl & Hayer-Hartl, 2002). A día de
hoy, el proceso de plegamiento todavía no se comprende bien. Para hacerse
una idea de su complejidad y de todo el trabajo realizado en este campo una
buena introducción puede ser este trabajo de Rose et al. (2006).
 Figura 2.1: Esquema de la reacción de desnaturalización y
renaturalización (hibridación) de una molécula de ADN
tomado de http://www.ehu.es/biomoleculas.

La de los ácidos nucleicos es proporcional al contenido en bases GC de su secuencia, ya éstos pares

de bases (ver figura 1.10) establecen entre sí 3 puentes de hidrógeno, mientras que los AT/AU sólo 2. Si

la temperatura supera , las moléculas de ADN se separan en dos hebras polinucleotídicas como se
muestra en la figura 2.1), pero si la bajamos lentamente ambas hebras vuelven a unirse de forma
complementaria en una reacción llamada hibridación. De nuevo vemos cómo en este caso la secuencia
es suficiente para guiar el plegamiento, al menos para moléculas pequeñas.

EXPERIMENTO DE ANFINSEN Y PARADOJA DE LEVINTHAL

Anfinsen demostró a finales de los 60' que al desplegar la enzima ribonucleasa A con urea y
mercaptoetanol aumentaba su volumen aparente y desaparecían sus propiedades catalíticas.
Al dializar la proteína volvía a plegarse. El plegamiento de las proteínas no está inducido por
la célula sino que es el resultado de la interacción de la secuencia polipeptídica con el agua.
Toda la información necesaria para adquirir su estructura tridimensional está presente en la
secuencia de aminoácidos por lo que algún día se podrá predecir. Dada la flexibilidad de los
polipéptidos el número de conformaciones posible de una proteína es enorme. Levinthal
planteó la paradoja que lleva su nombre: si una proteína se pliega explorando al azar todas
las conformaciones posibles tardará mucho más que la edad que tiene el Universo. Como las
proteínas se pliegan muy deprisa (típicamente en milisegundos o segundos) está claro que
no exploran todas las conformaciones al azar.

MEDIDA DE LA VELOCIDAD DE PLEGAMIENTO

Las reacciones muy rápidas no se pueden medir mezclando "a mano" los reactivos. La
técnica apropiada para medir reacciones que duran entre decenas de ms y algunos segundos
es el flujo detenido (stopped-flow). Hay que registrar la evolución en el tiempo de una
propiedad espectroscópica (fluorescencia DC en el UV lejano) que distinga al estado
desplegado del plegado. El ajuste a una exponencial simple nos permite conocer la constante
de la reacción. Si la curva se ajusta a una exponencial doble indica que hay intermediarios en
la reacción y es preciso realizar un ajuste global de curvas obtenidas en distintas condiciones
para calcular las constantes de velocidad. Muchas proteínas pequeñas se pliegan sin que
aparezcan intermediarios (plegamiento de dos estados). Algunas fenómenos tempranos de la
reacción de plegamiento ocurren por debajo del milisegundo y requieren otras técnicas como
la mezcla en chorro ("jet"), o el salto de temperatura inducido por láser para poderlos
observar.

MODELOS CLÁSICOS DEL PLEGAMIENTO Y ESPECIES OBSERVADAS

La visión clásica del plegamiento de las proteínas supone que todas las moléculas siguen el
mismo camino pasando en su caso por los mismos intermediarios y por el estado de
transición. Hay dos clases principales de modelos. Los modelos de tipo armazón (frame-work)
que asumen que los procesos iniciales consisten en la formación temprana de algunos de los
elementos de estructura secundaria que aparecen en el estado final. Estas regiones chocan y
dan lugar a intermediarios que terminan plegándose. El modelo del colapso hidrófobo, sin
embargo, supone que el primer suceso relevante es el colapso al azar del polipéptido para
ocultar los residuos hidrófobos. A partir del estado colapsado se va organizando el
polipéptido y aparece la estructura secundaria de los intermediarios y , finalmente, del
estado nativo. También se postulo un modelo (de puzzle) que asumía que cada moléculas
seguía un camino distinto. Experimentalmente las especies que podemos observar y estudiar
con más o menos detalle son las siguientes:

-estado desplegado: se puede estudiar por rmn, pero con dificultad porque las señales de los
residuos del mismo tipo se solapan. Se utilizan también fragmentos de la proteína que
simulan su situación en los primeros momentos del plegamiento cuando los residuos del el
segmento estudiado todavía no han tenido tiempo de interaccionar con el resto de la cadena.
Algunas secuencias ya se pliegan, aunque débilmente, como lo hacen luego en el estado
nativo.

-intermediarios: se pueden estudiar por rmn preparando con aparatos de mezcla rápida
muestras de proteína que se incuban durante distintos tiempos (muy cortos) en H2O y luego
se transfieren a D2O. Las regiones que ya se habían plegado cuando la proteína se transfiere
a D2O retienen los protones fácilmente intercambiables con el disolvente. También se pueden
estudiar por ingeniería de proteínas midiendo la velocidad de plegamiento de la proteína
silvestre y comparándola con la de muchos mutantes de la misma. En general los
intermediarios del plegamiento estudiados se parecen ya al estado nativo (aunque con
partes desestructuradas y las demás menos consolidadas).

-estado de transición: es la conformación de alta energía por la que atraviesa el polipéptido

para plegarse. Sólo se puede estudiar por el método de comparar la velocidad de
plegamiento de muchos mutantes distintos. En proteínas pequeñas puede estar limitado a
una región pequeña (núcleo de plegamiento). En proteínas de más de 100 residuos suele
parecerse bastante a una forma distorsionada del estado nativo.

-estado nativo: su estructura se determina precisamente por rmn o rayos x.

LA ´NUEVA VISIÓN´ DEL PLEGAMIENTO

Los modelos clásicos secuenciales han sido cuestionados en los últimos años y se ha
propuesto una "nueva visión" del plegamiento en la que cada molécula se pliega por una ruta
distinta (como en el antiguo modelo de puzzle). La razón de que el plegamiento sea rápido es
que las moléculas se mueven por un paisaje de energía en forma de embudo de modo que
las interacciones nativas que aparecen tienden a conservarse y la proteína sigue plegándose
"cuesta abajo". En general las barreras de energía entre conformaciones son bajas pero
donde el embudo presenta rugosidades aparecen intermediarios.

PLEGAMIENTO IN VIVO Y CHAPERONAS

Aunque toda la información que precisa una proteína para plegarse reside en su propia
secuencia, el interior de la célula está tan repleto de proteínas que aparecen problemas de
agregación, pues los intermediarios del plegamiento pueden tener expuestas regiones
hidrófobas que son "pegajosas". Para evitar estos problemas o los que surgen como
consecuencia de un estrés térmico (intermediarios parcialmente desnaturalizados con el
mismo problema de tendencia a agregar) la célula expresa proteínas auxiliares (chaperonas)
que secuestran temporalmente las conformaciones no plegadas, o desnaturalizan las mal
plegadas y les dan otra oportunidad de plegarse correctamente (chaperoninas).

SIMULACIÓN DEL PLEGAMIENTO DE LAS PROTEÍNAS

Para estudiar las etapas más tempranas del plegamiento o para realizar estudiar aspectos
generales de la reacción se utilizan modelos simplificados y técnicas de simulación (dinámica
molecular y Monte Carlo). Estos modelos tienen de momento un elevado coste
computacional cuando son más realistas. El objetivo final es simular un modelo
suficientemente realista y conseguir calcular la conformación nativa de la proteína.

PREDICCIÓN DE LA ESTRUCTURA A PARTIR DE LA SECUENCIA

Hasta que se entienda mejor cómo se pliegan las proteínas resulta conveniente explorar
otros procedimientos menos "ortodoxos" de predecir la estructura a partir de la secuencia.
Cuando existe una proteína de secuencia parecida y estructura conocida se puede construir
un modelo realista basado en la estructura conocida (modelado por homología). Cuando no
existe ninguna proteína de secuencia parecida en que inspirarse se recurre al modelado por
hilvanado (threading) o reconocimiento del plegamiento que consiste en plegar la proteína
de todas las maneras empleadas por proteínas conocidas y calcular en cual de ellas la
energía es menor.

"Retratan" el plegamiento de una proteina

Un grupo de químicos de la universidad alemana de Ruhr de Bochum (RUB) y de la Universidad de Illinois (EEUU)
ha logrado por primera vez “retratar” el plegamiento de una proteína en agua mediante una nueva técnica denominada
KITA (espectroscopía de absorción cinética en terahercios), que permite observar el plegamiento con una resolución
de una imagen por milisegundo. El estudio se ha publicado en el último número de la revista Angewandte Chemie.

Portada de Angewandte Chemie. Foto: RUB

Combinando esta técnica con otros métodos biofísicos -como la difracción de rayos X (SAXS), la
fluorescencia y la espectroscopía CD-, los investigadores han comprobado que el plegamiento transcurre
en dos fases. En la primera, muy rápida, la proteína se pliega en menos de un milisegundo, a la vez que
tiene lugar simultáneamente una reordenación de la red proteína-agua. En una segunda fase más lenta,
después de aproximadamente un segundo, la proteína se pliega a su estado nativo.

Hasta ahora, la espectroscopía en terahercios (THz) estaba limitada a observaciones del estado
estacionario del principio o del fin del plegamiento. “Sólo ahora podemos ver el desarrollo completo de las
etapas, no sólo la escena inicial y el saludo de los actores al final", aclara la profesora Martina Havenith-
Newen, de la RUB, donde ha desarrollado las investigaciones junto al profesor Martin Gruebele.

Cómo las proteínas ordenan el agua

De su trabajo anterior, los investigadores de la RUB ya conocían la fuerte influencia que tienen las
proteínas sobre el agua de su entorno más inmediato. En la fase de agua líquida, aproximadamente cada
1,3 picosegundos se forman y destruyen enlaces de hidrógeno entre moléculas individuales de agua, lo
que tiene como resultado un líquido bastante desordenado. Sin embargo, concentraciones incluso
pequeñas de proteínas alinean más a las moléculas de agua entre sí. Los movimientos dinámicos de la
red acuosa se ven alterados por la proteína.

También se sabe que las proteínas plegadas tienen una influencia considerablemente diferente sobre las
moléculas de agua a las de las proteínas no plegadas. Ahora, por primera vez, la espectroscopía KITA ha
permitido hacer observaciones durante el período de tiempo que transcurre entre estos dos estados.

La dinámica del agua y de las proteínas están estrechamente correlacionadas

En la espectroscopía KITA se usa la emisión de pulsos breves en teraherzios para proporcionar imágenes
únicas de los procesos observados con una resolución de milisegundos. Los químicos de la RUB iniciaron
el proceso de plegamiento y a continuación monitorizaron el transcurso de los acontecimientos. Resultó
que en menos de diez milisegundos se habían alterado los movimientos de la red acuosa, y la propia
proteína se estaba reestructurando.

“Estos dos procesos tienen lugar prácticamente de forma simultánea", señala la profesora Havenith-
Newen, que añade: “Ambos están estrechamente correlacionados". Estas observaciones apoyan la ya
controvertida sugerencia de que el agua juega un papel fundamental en el plegamiento de las proteínas, y

por lo tanto en la función de las proteínas, y que no tiene una función pasiva. Tras la reestructuración
inicial, tiene lugar una segunda fase significativamente más lenta (con una duración de 0,9 segundos) que
tiene lugar dentro de la proteína. En este proceso, la proteína se pliega hasta su estructura nativa final.

---------------------------------

Referencia bibliográfica:

Seung Joong Kim, Benjamin Born, Martina Havenith, and Martin Gruebele: Real-time detection of protein-
water dynamics upon protein folding by Terahertz absorption. In: Angewandte Chemie (Online published

Estudio del plegamiento "downhill" y de la hipótesis del reostato molecular

Uno de nuestros más excitantes descubrimientos fue darnos cuenta de que el plegamiento sin barreras (i.e. el
plegamiento downhill) implica una transición de desplegamiento de equilibrio continua. Con esta idea derivamos un
test diagnóstico para el plegamiento downhill que usamos para demostrar que la proteína pequeña BBL tiene estas
características. Como corolario, propusimos que las proteínas downhill podrían actuar como reostatos moleculares, en
los cuales la intensidad de una señal se modula mediante cambios graduales en el colectivo de conformaciones. En el
futuro queremos investigar los condicionantes físicos y los lazos evolutivos del plegamiento downhill. Las
propiedades de las proteínas con plegamiento downhill ideales que se derivan de nuestro trabajo son: 1) dominios de
50 residuos o menos; 2) fajos de a-hélices; y 3) núcleos hidrófobos con muy poco contenido en residuos aromáticos.
Al buscar en la base de datos con estos criterios hemos encontrado una serie de candidatos, que serán estudiados con
los métodos de nuestro grupo. En paralelo, el análisis de homólogos funcionales de BBL mostrará si en efecto el
plegamiento downhill se conserva a lo largo de la evolución. BBL es parte del complejo multienzimático 2-oxo
glutarato reductasa (OGDH) de E. coli, que es homólogo estructuralmente al complejo piruvato deshidrogenasa
(PDH). Ambos están presentes en todos los organismos, y deben haber divergido muy pronto en la evolución. Hemos
estudiado la proteína PDD, que es el homólogo de BBL en B. stearothermophilus. El plegamiento de esta proteína
había sido catalogado como de dos estados. En un análisis más detallado hemos encontrado que PDD tiene una
barrera de plegamiento marginal que permite la transición de desplegamiento continua. El siguiente paso implica
invetigar otros dominios parecidos a BBL de hipertermófilos y organismos superiores.
Para probar la hipótesis del reostato molecular directamente planeamos estudiar la funcionalidad de PDH entero. El
dominio homólogo a BBL de la subunidad 2 está implicado en dos procesos en el complejo: la sincronización de las
subunidades de unión 1 y 3, y el "brazo oscilante" que canaliza el sustrato hacia el sitio activo. Hemos propuesto que
la sincronización de la unión de dos ligandos grandes (subunidades 1 y 3) puede lograrse mediante la unión a
diferentes sub-estados conformacionales de BBL. Además, nuestras medidas FRET del plegamiento sugieren que
parte del desplegamiento de BBL puede funcionar como un mecanismo de re-enrollamiento para el "brazo oscilante".
Probaremos estas ideas estudiando la reacción enzimática completa en partículas de PDH individuales (la subunidad
2 de PDH forma un complejo icosaédrico de 60 monómeros acompañado por moléculas de las subunidades 1 y 3)
usando en tiempo real el modo tapping de un microscopio de fuerza atómica (AFM) en líquido y microscopía de
fuerza atómica de una sola molécula. Se trata de un problema ideal para técnicas de una sola partícula porque no hay
sincronización entre monómeros en el complejo. Esperamos poder observar la unión mediante AFM porque las
subunidades 1 y 3 son grandes y su unión produce un cambio conformacional alostérico en PDH. El movimiento del
"brazo oscilante" se monitorizará mediante FRET de una sola molécula usando partículas de PDH marcadas
únicamente en la subunidad 2. Para medir actividad enzimática modificaremos el ensayo de fluorescencia tal cual es
para adaptarlo a la detección de una sola molécula. Después de caracterizar el complejo wild type, planeamos hacer
ingeniería con las propiedades del plegamiento de los dominios homólogos de BBL y estudiar cambios en su
funcionalidad. Por ejemplo, introduciremos puentes disulfuro únicos para bloquear el desplegamiento de diferentes
zonas, y modularemos su estabilidad con mutaciones puntuales. También estamos rediseñando el núcleo hidrófobo de
los dominios homólogos de BBL para convertirlo en una proteína de dos estados manteniendo intactas las superficies
de unión. Si tenemos éxito en el diseño pondremos a prueba la funcionalidad del dominio de dos estados insertándolo
en la subunidad 2 wild type. Este proyecto se encuentra en una etapa temprana, pero ya hemos subclonado las
proteínas, hemos puesto a prueba su expresión y hemos desarrollado un protocolo de purificación sencillo. Un
procedimiento para reconstituir complejos de PDH in vitro también está disponible. La técnica de AFM ya funciona
en nuestro laboratorio y el aparato de una sola molécula está siendo construido.