Vous êtes sur la page 1sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie CIN I.

LMENTS DE CINTIQUE CHIMIQUE


A. VITESSE DUNE RACTION A.
Voir Doc 1 et exercice N1. On peut suivre une cintique enzymatique de 2 manires : - En mesurant la disparition du substrat en fonction du temps - En mesurant lapparition du ou des produits en fonction du temps

F. LAURO

Soit la raction : A P La vitesse de raction est directement proportionnelle la concentration du ractif A qui varie au cours de la ration selon la vitesse V = -d [A] / dt = d [P] / dt = k.[A] (1) k est la constante de vitesse pour la raction. La disparition du ractif A est de type exponentielle. - Si les concentrations sont exprimes en mole/L (M) - Si le temps en secondes (s) -1 V sexprime en M.s -1 k en s . On voit donc que la vitesse dcroit au cours du temps
1 Concentration relative en substrat

0,5

temps t1/2

On peut exprimer lquation (1)sous la forme : -d [A] / [A] = d ( ln [A] ) = -k.dt (2) Si on intgre cette quation de [A0] (concentration initiale de A t=0) jusqu [A] (concentration de A au temps t) on obtient lquation suivante : Ln [A] = ln [A0] kt (3) Ou [A] = [A]0 e
-kt

(4)

Si on considre lquation (3) on a une quation de la forme Y = - a.X + b - Y = ln [A] - a = k coefficient directeur de la pente - X=t - b = ln [A0] On peut alors tracer le graphe ln [A] = f(t) et on obtient une droite de pente k qui coupe laxe des ordonnes pour ln [A] = ln [A0] Page 1 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie


Ln [A] Ln [A]0 Ln [A] = - kt + ln [A0] Y = -aX + b

F. LAURO

Pente = - k = yB-yA / xB - xA yB - yA

xB - xA

temps Trac de Ln [A] en fonction du temps pour une raction dordre 1

B. ORDRE DUNE RACTION B.


Soit la raction : A+B La vitesse dune raction dpend de diffrents facteurs : [ ] en ractifs et produits Temprature Milieu C+D

La vitesse de cette raction sexprime de la manire suivante : o

V = k.[A].[B]

k reprsente la constante de vitesse ; elle dpend de la temprature [A] et [B] reprsentent les concentrations de A et B + reprsente lordre global de la raction NB : Dans une raction simple, et sont les coefficients stoechiomtriques. Si lordre de la raction est nul : + = 0 ( cest dire = 0 et = 0 ), on a :
V

[A]

La vitesse dapparition du produit est donc indpendante de la concentration des ractifs.

Si la raction est du premier ordre ou dordre 1 : + = 1 ; on a

Page 2 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie


Vi

F. LAURO

[A]

La vitesse dapparition du produit est directement proportionnelle la concentration du substrat. Si la raction est dordre 2 ou suprieur : + = 2 ou > 2, on a

Vi

[A]

La vitesse dapparition du produit dpend directement des concentrations de 2 substrats. NB : Si lon suit lvolution dune raction en fonction du temps, on obtient le trac suivant :
[A] 1

Zone 1 : V = k.[A] ordre de la raction = 2 Zone 2 : V = k.[A] ordre de la raction = 1 Zone 3 : V = k ordre de la raction = 0

temps

Page 3 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie


Dtermination exprimentale de lordre dune raction : 1. Dtermination grce Vi sur un graphe [Vi] = f[A] Si entre [A1] et [A2] = [2A1] :
Vi = constante Ordre 0 Vi double (x2) Ordre 1 -

F. LAURO

Vi quadruple (x4)

Ordre 2

2. Dtermination par essais successifs : Mesure de [A] en fonction du temps : [A] = f(t) - [A] = f(t) est une droite - Ln [A] = f(t) est une droite - 1/[A] = f(t) est une droite 3. Mthode de Vant Hoff V = k.[A]m Ln V = Ln k + m Ln [A] e[A] = f(t) determination graphique de V Ln V = f(Ln [A]) droite de pente m

Ordre 0 Ordre 1 Ordre 2

La demi-vie ou t1/2 Une des caractristiques des ractions dordre 1 est que le temps ncessaire pour que la moiti du substrat initialement prsent soit transform, nomm demi-vie et not t1/2, est une constante. La demi-vie est en fait indpendante de la concentration initiale du substrat. Dmonstration : Ln [A] = ln [A0] kt soit [A] = [A0] / 2 : la moiti du substrat initialement prsente a t transform Ln ([A0]/2) = Ln [A0] kt1/2 Ln ([A0]/2) Ln ([A0]) = -kt1/2 Ln ([A0]/2 / [A0]) = -kt1/2 Ln (1/2) = -kt1/2 - Ln 2 = t1/2 t1/2 = Ln2/k Raction dordre 2 ou bimolculaire : En fait 2 cas de figure : - soit il y a 1 seul substrat : 2A P - soit il y a 2 ractifs nots A et B conduisant un produit P : A + B

La vitesse des ractions est fonction de la concentration des 2 ractifs en prsence - soit A, A : le ractif A disparat la vitesse V = -d [A] / dt = k.[A] - soit A et B : le ractif A disparat la vitesse V = -d [A] / dt = k.[A].[B] La vitesse dapparition du produit dpend directement soit des concentrations de 2 substrats, soit du carr de la concentration dun seul substrat. Mais cette fois la vitesse V est proportionnelle un produit de 2 concentrations. Comme V est toujours en M.s-1 alors la constante k sexprime en M-1.s-1. Remarque : si le ractif B est largement excdentaire dans le milieu rationnel de telle sorte que sa concentration soit pratiquement constante on retrouve une raction dordre 1

C. QUILIBRE DUNE RACTION C.


La plupart des ractions sont rversibles et atteignent un quilibre (voir doc 3)
1

A+B
2

C+D

Les vitesses de raction sexpriment de la manire suivante : Dans le sens 1 : V1 = k1 [A].[B] Dans le sens 2 : V2 = k2 [C].[D] Quand la raction atteint lquilibre, V1 = V2, donc Et donc k1 / k2 = [C].[D] / [A].[B] = Ke = constante dquilibre Une raction en quilibre se caractrise par sa constante dquilibre.

D. FACTEURS INFLUENANT LA VITESSE DUNE RACTION D.


La vitesse dune raction dpend de : - la concentration des ractifs - de la nature du milieu (pH, temprature) - de k la constante de vitesse. Page 4 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie CIN EXPRIMENTALE II. CINTIQUE ENZYMATIQUE : TUDE EXPRIMENTALE
Dans le cas des ractions enzymatiques, lenzyme nest pas consomme. Lquation globale peut scrire sous la forme : E+S E= enzyme ; S= substrat ; P= produit

F. LAURO

E+ P

Exemple : On prend lexemple de la -fructosidase (invertase ou saccharase) qui est une enzyme intestinale que lon trouve galement dans la paroi de la levure. Elle catalyse la raction suivante : Saccharose + H2O -D-glucopyranose + -D-fructofuranose

Ltude cintique de cette raction enzymatique peut tre ralise : Par mesure de la quantit de glucose form par unit de temps par colorimtrie (mthode au DNS = ac 3-5 dinitrosalicylique) Par mesure de la quantit de saccharose restant par polarimtrie.

A. VITESSE INITIALE DE LA RACTION A.


Voir exercice N2 Conclusion : Pour tudier une cintique enzymatique, on a intrt mesurer la vitesse au dbut de la raction, lorsque peu de substrat a t transform et peu de produit form. On nglige ainsi la raction inverse. En pratique, pour raliser ces conditions appeles conditions initiales, on introduit un large excs de S, la pente est alors maximale, ce qui permet de mesurer correctement la vitesse initiale.

B. INFLUENCE DE LA CONCENTRATION EN ENZYME SUR LA Vi B.


Voir exercice N3 Conclusion : Quand on se place dans les conditions initiales, cest dire quand t tend vers 0 et concentration en substrat saturante, on a Vi proportionnelle la concentration en enzyme dans le milieu. Application : on peut doser ainsi une enzyme dans un milieu ractionnel.

C. INFLUENCE DE LA CONCENTRATION EN SUBSTRAT SUR LA Vi C.


Voir exercice N4 NB : On dfinit aussi une concentration en substrat appele Km, qui correspond la concentration en substrat pour laquelle Vi = Vmax / 2. Sur la courbe, on obtient Km = 2.6.10-2 mol/l de saccharose.

Page 5 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie TH III.CINTIQUE ENZYMATIQUE : TUDE THORIQUE CIN
A. MODLE DE MICHALIS MENTEN A.
Plusieurs hypothses ont t mises : Il se forme un complexe transitoire entre S et E, soit la raction :
1 3

F. LAURO

S+E
2

ES
4

E+ P

On se place dans les conditions initiales, cest dire quand il y a trs peu de P form ; on peut alors ngliger la raction 4.

k1
S+E ES

k3
E+ P

k2
On aura donc : V1 = k1 [S] [E] V2 = k2 [ES] V3 = k3 [ES]

La vitesse de catalyse Vi est directement lie la raction 3 qui est la raction limitante, cest elle que lon mesure, soit Vi = V3 = k3 [ES] Equation ( 1 ) On se place dans les conditions de ltat stationnaire ; cest dire o [ES] est une constante, il y a autant de complexe ES qui se forme que de complexe ES qui est dtruit . La vitesse de formation de ES est la vitesse V1 et celle de sa destruction est V2 + V3, donc si [ES] est constante, V1 = V2 + V3 Do k1 [S] [E] = k2 [ES] + k3 [ES] = ( k2 + k3 ) [ES] k2 + k3 k1 = [S] [E] [ES] = Km = constante de Michalis exprime en mol/L Equation ( 2 )

Or, [E] = [E total] - [ES] . En remplaant [E] dans lquation 2, on obtient : [S] ( [E total] - [ES] ) = [ES] [ES] [S] [E total] - [S] [ES] = [ES] [S] [E total] - [S] = Km

[S] [E total] = Km + [S] [ES] [ES] =

[S] [E total] Km + [S]

En remplaant [ES] dans lquation 1, on obtient : k3 [E total] [S] Vi = k3 [ES] = Equation ( 3 ) Km + [S] Quand [S] est >>> Km (conditions saturantes en S ), tous les sites enzymatiques sont occups et donc [ES] = [E total] Do Vi = Vmax = k3 [E total] En remplaant k3 [E total] dans lquation 3, on a : LEquation de Michalis Menten Vmax [S] Vi = Km + [S] Page 6 sur 25

F. LAURO Lquation de Michalis est une fonction de forme y = ax / b + x , fonction dune hyperbole, o - y = Vi - x = [S]
Vm

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie

Vi

Quand Vi = Vmax / 2, daprs lquation de Michalis Menten , on a : Vmax / 2 = Vmax [S] / Km + [S] Do [S] = ( Km + [S] ) / 2 Km + [S] = 2 [S] 2 [S] - [S] = Km [S] = Km

Vm / 2

Km

[S]

B. LES CONSTANTES CINTIQUES B.

1) Dfinition du Km et de Vmax
On a dfinit Km comme la constante de dissociation du complexe ES ( k2 + k3 ) / k1 = [S] [E] / [ES] = Km NB : k3 est ngligeable devant k2. k1 Kd = [S] [E] / [ES] = Km S+E ES K a = 1 / Kd et K m = 1 / Ka k2 et donc Km est linverse de la constante daffinit de E pour S. Plus laffinit du S pour lE est grande et plus Km est petit. Vmax est la vitesse initiale maximale quand [S] est >>>>> [E] dans des conditions exprimentales dtermines ( [E], pH, nature du S, composition du milieu, temps de contact ), donc toute lenzyme est sous forme ES, do : Vmax = Vi quand [ES] = [E total] et donc Vmax = k3 [Et] ; il y a donc proportionnalit entre la Vmax et la conc en E. La mesure de Vmax permet donc indirectement de doser lenzyme et donc de reprsenter lactivit enzymatique.

2) Dtermination graphique
Nous avons vu que lon pouvait dterminer Km et Vmax partir de la courbe Vi en fonction de [S], mais cest une dtermination imprcise. En utilisant la reprsentation des doubles inverses ou reprsentation de Lineweaver et Burk, on obtient une plus grande prcision. Vi = Vmax [S] / 1 / Vi = 1 / Vi = 1 / Vi = ( Km ( Km Km / Km / + [S] ) + [S] ) / Vmax [S] Vmax [S] + 1 / Vmax Vmax * 1 / [S] + 1 / Vmax

On obtient une quation du type y = a x + b, avec a = Km / Vmax et b = 1 / Vmax

Page 7 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie


Donc en traant la courbe 1 / Vi en fonction de 1 / [S], on obtient une droite qui coupe laxe des ordonnes en y = b = 1 / Vmax ( x = 0 ) qui coupe laxe des abscisses en x = - b / a = - 1 / Km de pente Km / Vmax

F. LAURO

1 / Vi Km / Vmax

1 / Vmax

- 1 / Km Voir exercice N5.

1 / [S] Reprsentation de Lineweaver et Burk

Page 8 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie IV. LACTIVIT EXPRESSIONS DE LACTIVIT ENZYMATIQUE
Lactivit enzymatique est une vitesse, elle peut sexprimer de plusieurs manires : Lactivit catalytique z en Katals ( kat ) ou catabilit = unit officielle = nombre de moles de P form ou de S transform par seconde.

F. LAURO

Le Katal nest jamais utilis car beaucoup trop grand. On prfrera des sous-units comme les katals) ou les nkat (10-9 katals) ou les pkat (10-12 katals)

kat (10-6

Lunit internationale UI ou UA ou units dactivit (prfre par les biochimiste). = nombre de moles de P form ou de S transform par min. Reprsente la quantit denzyme qui catalyse la transformation d1 mole de substrat par minute. 60 UI = 1 kat. La concentration dactivit catalytique ( b ou Catc ) = nombre de katal.L-1 : cest la concentration qui transforme 1 mole de substrat par seconde dans des conditions dfinies. = nombre de UI.L-1 : cest la concentration qui transforme 1 mole de substrat par minute dans des conditions dfinies Cest lactivit enzymatique ramene un volume de milieu ractionnel. Pour cette concentration il faut tenir compte de la dilution du volume denzyme dans le milieu ractionnel. Quand le substrat est saturant Vi = Vmax ce qui permet dexprimet la concentration dactivit catalytique (b ou catc) en fonction de Vmax.

b ou Catc

(kat.L-1 )

= Vmax (en moles.L-1.min-1) x (Vract / Venz) x 1/60


(UI.L-1 )

(en s)

b ou Catc

= Vmax (en

moles.L-1.min-1)

x (Vract / Venz)

Lactivit spcifique ( Zsp ou AS ) ou catabilit spcifique = nombre de UI . mg 1 denzyme (unit courante). = nombre de kat . g-1 denzyme Cest lactivit catalytique (z) dune enzyme ramene la masse denzyme contenue dans le systme ; Cest aussi la concentration catalytique (b ou catc) rapporte la concentration massique en enzyme (). Cette dernire valeur ntant gnralement pas connue on considre lensemble des protines contenues dns le systme. Ce paramtre permet de comparer la puret dune enzyme.

Zsp = z / qmprotine = b / protine


Quand le substrat est saturant Vi = Vmax ce qui permet dexprimer lactivit spcifique (Zsp ou AS) en fonction de Vmax.

Zsp (en kat. g-1) = Vmax (en moles.L-1.min-1) x 1/60 (en s) / [E]ract (en g.L-1) Zsp (en U.mg-1) = Vmax (en
moles.L-1.min-1 ou UI.L-1)

/ [E]ract (en mg.L-1)

Le nombre de rotation (kcat) = le nombre de moles de P form ou de S transform par moles denzyme par seconde. Lactivit enzymatique molaire ZM (AES ) ou activit molaire spcifique (AMS) = nombre de UI . mole 1 denzyme. Cest lactivit enzymatique ramene une mole denzyme. Reprsente le nombre de moles de substrat transform par mole denzyme (kcat x 60). Page 9 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie

F. LAURO

CALCULS DE RENDEMENTS LORS DE PURIFICATION DENZYMES

Au cours dune purification denzyme on mesurera donc rgulirement : Grce Lactivit totale z (en IU ou kat) La quantit totale de protines q (mg) Le volume total v de solution (mL)

ces 3 valeurs on va pouvoir calculer : Lactivit spcifique (Zsp) = z / q (en IU.mg-1 ou kat.mg-1) Le rendement R = z / z0 (activit totale / activit totale avant la 1re tape de purification) Le taux de purification = Zsp/Zsp0 (activit spcifique / activit spcifique avant la 1re tape de purification) Lactivit spcifique et le taux de purification atteignent une valeur maximale lorsque lenzyme est pure.

MESURE DE LACTIVITE ENZYMAIQUE A PARTIR DE MESURES DABSORBANCE


Les mesures dactivit se rduisent souvent une mesure de variation dabsorbance en fonction du temps ; on aura donc une formule du type :

Page 10 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie


A. MISE EN VIDENCE EXPRIMENTALE (voir doc 3) A.

F. LAURO

R V. INFLUENCE DES AGENTS PHYSIQUES SUR LA RACTION ENZYMATIQUE


Lapproche exprimentale propose concerne une enzyme de levure qui agit sur un sucre non rducteur, le saccharose. Cest un diholoside constitu de lassociation dune molcule de glucose et dune molcule de fructose. Le tableau ci-dessous rsume les conditions exprimentales utilises pour tudier laction de linvertase contenue dans des levures de boulanger Saccharomyces cerevisiae. Ces levures sont des champignons microscopiques qui se dveloppent dans un milieu sucr. Chaque tube numrot de A H est plac au bain marie lectrique pendant 20 minutes. La temprature est rgle 37C. Au bout de 20 minutes, lexprimentateur ralise alors les tests la liqueur de Fehling et des tsts leau iodo-iodure ou lugol. Le signe + signifie que le test est positif et le signe indique que le test est ngatif.
Rappel : - La liqueur de Fehling de couleur bleue verse dans un tube essais et lensemble est port bullition. Si un prcipit rouge brique se forme, cela signifie que des sucres rducteurs sont prsents dans le tube test. Le test est alors positif. Le lugol, de couleur marron clair, devient bleu indigo (ou bleu nuit) en prsence damidon. Le test est alors positif. Cette raction a lieu froid.

TUBES Levures fraiches Levures chauffes Eau distilles Saccharose 2% Empois damidon 1% pH Test au lugol Test la liqueur de Fehling

A 2 mL 10 mL

B 2 mL

C 2 mL

D 2 mL

G 2 mL

H 2 mL

10 mL 10 mL + + -

10 mL

10 mL 10 mL

10 mL HCl -

10 mL NaOH -

+ -

Le tableau de rsultats montre que seul le saccharose est transform en sucres rducteur par les levures. Ces champignons prsentent donc une spcificit daction sur ce substrat et nagissent pas sur lamidon. Linvertase est nomme aussi saccharase car elle agit sur le saccharose. A pH acide ou basique, il ny a pas daction enzymatique. Linvertase des levures ncessite donc des conditions de pH particulires. Enfin le chauffage empche laction enzymatique par dnaturation. Les enzymes tant de nature protique, la configuration tridimensionnelle de lenzyme est perturbe par la haute temprature provoquant une perte de sa fonction biologique.

Page 11 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie


B. LA TEMPRATURE B.

F. LAURO

Pour tudier linfluence de la temprature sur la raction enzymatique, on mesure la Vi en ne faisant varier que la temprature, les autres facteurs sont constants. On obtient une courbe biphasique : Vi Courbe de dnaturation
Laugmentation de la T provoque une augmentation d e la cintique ractionnelle. laugmentation de la T provoque une augmentation de lagitation molculaire ce qui augmente la probabilit de rencontre des molcules ractives. Les ractifs acquirent un excs dnergie dactivation Par contre au-del dune certaine valeur de T la vitesse , enzymatique chute (cest toujours le cas dans les ractions biocatalyses). La T optimale est la T pour laquelle la Vi est la plus grande Au-del dune certaine T il y a dnaturation de la protine ce qui ralentit puis arrte la raction.

Courbe dactivation
T optimale

Courbe de vitesse
T critique

T dinactivation

T C

Cette courbe est la rsultante de deux phnomnes : - courbe 1 : action de la T sur la dnaturation de lenzyme - courbe 2 : action de la T sur la Vi ( la Vi augmente de faon exponentielle ) On peut dfinir ainsi pour chaque enzyme : - une T optimale (Vi max sans dnaturation de lE - une T critique : dpend de lE et du milieu - une T dinactivation De 0C 40C environ, la vitesse de la raction augmente avec la temprature. Cela sexplique par une augmentation de la concentration de complexe Enzyme Substrat (ES) activ. Quand la T est trop basse, il y a renforcement des liaisons hydrogne (ou liaison H) mais affaiblissement des interactions hydrophobes. Il en rsulte une inactivation qui est rversible. Au-del de 45C environ (cette valeur varie selon les enzymes), cest la dnaturation de la protine qui perd sa configuration spatiale par destruction des liaisons faibles (liaisons H, liaisons ioniques, forces de Van der Walls). De plus, llvation de TC tend renforcer les liaisons hydrophobes ce qui rigidifie la molcule. La raction ralentit et sarrte rapidement au-del dune certaine zone de temprature (55 environ). Cette dnaturation est irrversible. Les limites daction de la T sont donc imposes par la nature protique de lenzyme. X La courbe de vitesse est donc la rsultante de la courbe dactivation et de la courbe de dnaturation : La T optimale est la T pour laquelle activation et dnaturation squilibrent. Rem : Rgle du Q10 Dans la 1re partie de la courbe, la vitesse de la raction double chaque fois que la T augmente de 10C. Cette rgle nest plus valable au-del dune certaine T. NB : On peut tudier la dnaturation thermique en faisant chauffer la solution enzymatique pendant un temps constant diffrentes T et on ramne ensuite la prparation une T optimale et on mesure lactivit rsiduelle. On peut ensuite calculer un % dinactivation chaque T. Page 12 sur 25

F. LAURO Comment la temprature peut agir sur les tats dquilibre et sur la cintique ractionnelle : - en altrant la stabilit du complexe ES - en ionisant certains sites de lenzyme formant ainsi de nouvelles liaisons Certaines enzymes sont particulirement rsistantes la chaleur car leur conformation est stabilise par : - Des ponts disulfures (liaisons covalentes) (ex : la ribonuclase pancratique). - Des ions mtalliques (ex : la thermolysine). De manire gnrale les enzymes sont moins sensibles la chaleur en prsence de leur substrat car linteraction Enzyme Substrat stabilise la structure tridimensionnelle.

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie

C. Le pH C.

1) Il existe un pH optimum pour chaque enzyme


Les variations de pH ont un effet : - Soit sur lenzyme - Soit sur le substrat - Soit sur les 2. A quel niveau agit le pH : - Modification du degr dionisation de certains groupements fonctionnels dont la charge positive ou ngative est indispensable la formation et/ou la transformation du complexe Enzyme Substrat. - Le degr dionisation peut affecter aussi la conformation spatiale native de la protine enzymatique. En effet la structure 3D de la molcule peut rsulter (en partie) de liaisons ioniques. Ce changement de conformation peut concerner le site actif ou bien une autre partie de la molcule. - Le nombre de liaisons hydrognes peut varier en fonction de la disponibilit en protons dans le milieu. - Le pH agit sur la vitesse de la raction catalytique notamment lorsque son mcanisme est bas sur des changes de protons avec le solvant (Cf. Ribonuclase). Il est donc primordial dutiliser un tampon pour annuler les variations de pH lors de la raction. Pour tudier leffet du pH, on dtermine la Vi de la raction enzymatique diffrents pH, les autres facteurs tant constants. Si on trace Vi en fonction du pH, on obtient une courbe en cloche : La pepsine : - Protase gastrique - Activit optimale pour un pH = 2 - Peu surprenant tant donn son lieu daction, lestomac, organe dont lacidit est trs importante car il scrte du HCl. Lamylase salivaire et la trypsine : - Ont leur maximum defficacit pH neutre - Ce sont les conditions qui rgnent dans la bouche et lintestin, leur lieu de scrtion. Le lysozyme : - Prsente un maximum defficacit pour un pH 5 Lactylcholinestrase : - Ne devient efficace qu partir de pH 6 et le reste jusqu pH 9,5. Pour la plupart des enzymes, la courbe de vitesse de la raction en fonction du pH prsente une mme allure en cloche sauf pour lactylcholinestrase. De part et dautre de loptimum (sommet de la cloche) la Vi dcroit trs rapidement : 2 units pH de part et dautre de cet optimum, Vi est 100 fois plus faible. Page 13 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie

F. LAURO

Le complexe ARN Rnase

Importance du pH sur le degr de protonation des rsidus His de lARNase et sur son activit enzymatique.

Exercice n6 On dtermine lactivit de la glutamate dshydrognase dshydrognation de lacide glutamique en prsence de NAD+.

(GDH),

qui

permet

daboutir

la

1. Ecrire lquation de la raction catalyse par la GDH sachant que lacide glutamique est un diacide -amin possdant 5 atomes de carbone. Ecrire substrats et produits sous forme chimique.

2. On mesure lactivit de la GDH en tudiant la raction dans le sens de formation de lacide glutamique. Pour cela, on verse successivement : 0.2 mL dune solution de sulfate dammonium 2.4 mL de solution tampon pH = 8 0.1 mL dune solution de NAD rduit (quantit en excs) 0.1 mL dextrait enzymatique purifi 0.2 mL dune solution de substrat S1 (diacide -ctonique 5 carbones) a) Expliquer le rle de la solution tampon La solution tampon maintient approximativement le mme pH 8 malgr l'addition de petites quantits d'acide (CG) pour que lenzyme puisse fonctionner son pH optimum.

Page 14 sur 25

F. LAURO b) Quelles prcautions faut-il prendre quant la temprature avant et pendant la raction ? Justifier la rponse. Il faut faire en sorte dtre la temprature optimale de la GDH cest--dire 37C. Pour cela il faut que lensemble des ractifs soient ports avant la raction 37C. c) On mesure 340 nm labsorbance obtenue en fonction du temps dans une cuve spectrophotomtrique dont le trajet optique est gal 1 cm. Justifier le choix de cette longueur donde. La forme rduite du NAD (NADH) possde un maximum d'absorption 340 nm. En suivant l'absorbance 340 nm, on pourra ainsi suivre l'volution de la [NADH] cest--dire lvolution de la concentration en substrat en fonction du temps. On peut ainsi suivre la cintique de la raction enzymatique. On obtient les rsultats suivants : Temps en min 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 A 340 nm 1.800 1.760 1.718 1.675 1.635 1.595 1.550 1.510 1.476 1.450 1.430 Tracer le graphe reprsentant labsorbance en fonction du temps.
Abs 340 nm
1950 1900 1850 1800 1750 1700 1650
(4,1635)

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie

(0,1800) (1,1760) (2,1718) (3,1675)

1600
(5,1595)

1550 1500 1450 1400 1350 1300 1250 1200 1150 1100 1050

(6,1550) (7,1510) (8,1476) (9,1450) (10,1430)

Temps (min)
1000 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5 5 5.5 6 6.5 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 11 11.5

d) Justifier la diminution de labsorbance en fonction du temps. En suivant l'absorbance 340 nm, on pourra ainsi suivre l'volution de la raction enzymatique : - une augmentation d'absorbance indiquera une formation de NADH partir de NAD+ : la raction va dans le sens de l'oxydation du substrat : L-Glu + NAD+ CG + NADH, H+. - une diminution d'absorbance indique la consommation de NADH, donc une formation de NAD+ : la raction va dans le sens de la rduction du substrat : CG + NADH, H+ L-Glu + NAD+ La courbe A= f(t) correspond la courbe Vi=f(t) (voir quation de Michaelis-Menten). Ainsi, l'absorbance maximale correspond la vitesse initiale maximale de l'enzyme. Page 15 sur 25

F. LAURO e) Que reprsente la pente de la courbe ? Comment et pourquoi varie-t-elle ? Comment voluerait-elle si lon continuait la raction au-del de 10 min ? La courbe est une droite dcroissante dont le coefficient directeur A/t reprsente la vitesse constante de la raction de disparition de NADH. Cela correspond la vitesse initiale de la raction de rduction de lCG en L-Glutamate par le NADH. Si on continuait la raction au-del de 10 min, la courbe montrerait un inflchissement de la vitesse de disparition du NADH avec une tangente la courbe de plus en plus horizontale signifiant que la vitesse tend vers 0 : la raction se termine car tout le substrat est consomm soit lquilibre est atteint. f) Calcul de lactivit enzymatique : sachant que le coefficient dabsorption molaire de NAD rduit est gal 6.3.103 mol1.L.cm-1 340 nm. Dterminer la concentration de coenzyme transform en mol.L-1.min-1 Coefficient directeur (pente) = 41,53 A/min A/min = .l. C/min C/min = A/.l = (41,53/6,3.103).106 = 6592 mol.L-1.min-1 Dterminer la quantit de coenzyme transform en mol.min-1 dans 3 mL de milieu ractionnel en priode initiale. 6592 mol.min-1 1.000 mL ? 3 mL Z.min-1 pour 3mL = 3 x 6592 / 1000 = 19,776 mol.min-1

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie

En dduire lactivit enzymatique en milliunits dactivit (mUA) par mL dextrait enzymatique, puis la donner en katal par mL denzyme. 0,1 mL dextrait enzymatique dans les 3mL de milieu ractionnel 19,776 mol.min-1 -1 0,1 mL 19,776 mol.min 1 mL b(UI/mL) Catc = b(UI/mL) = 19,776 x 10 = 197,76 UI.mL-1 dextrait enzymatique 60 UI = 1 kat 197.76 UI = 197.76/60 = 3,296 Catc = b(kat/mL) = 3,296

kat

kat.mL-1 = 3,296.10-6 kat.mL-1 denzyme

Calculer lactivit spcifique en mUA.mg-1 de protine, sachant que 5 mL de lextrait purifi contiennent 8 mg de protines. 5 mL 8 mg 1 mL 8/5 = 1,6 mg Soit 1,6 mg de protine par mL dextrait purifi : (mg/mL) = 1,6 mg.mL-1 AS = Zsp
(UI/mg)

= b(UI/mL) / (mg/mL) = 197,76 / 1,6 = 123,6 UI.mg-1

Dterminer lactivit spcifique molaire de la GDH, sachant que sa masse molaire est gale 560.103 g.mol1. LAMS (activit molaire spcifique) = nombre dUI par mole denzyme. M = 560.106 mg.mol-1 560.106 mg 1 mole Or on a 123,6 UI dans 1 mg On a donc 123,6 x 560.106 UI dans 560.106 mg Soit 123,6 x 560.106 UI pour 1 mole AMSGDH = 6,9216.1010 UI.mole-1

Page 16 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie VI. R LES EFFECTEURS DE LA RACTION ENZYMATIQUE

F. LAURO

Un effecteur est une substance chimique qui modifie lactivit enzymatique. Les effecteurs sont rpartis en deux groupes : Les activateurs : qui augmentent lactivit enzymatique Les inhibiteurs : qui diminuent lactivit enzymatique

A. LES INHIBITEURS A.

1) Rsultats exprimentaux
Voir exercice N7.
Dfintion : Un inhibiteur est une substance qui diminue la vitesse d'une raction catalyse par une enzyme. En se liant sur une enzyme, un inhibiteur peut empcher la fixation du substrat sur le site actif, ou provoquer une dformation de l'enzyme qui rend celle-ci inactive (inhibiteur allostrique). L'inhibition des enzymes joue un rle important dans le contrle des mcanismes biologiques, et notamment dans la rgulation des voies mtaboliques. En enzymologie, les inhibiteurs sont trs utiliss pour dterminer le mcanisme d'action d'une enzyme. Des applications existent dans de nombreux autres domaines : beaucoup de mdicaments, pesticides ou insecticides sont des inhibiteurs enzymatiques. L'affinit d'un inhibiteur pour une enzyme est donne par la constante d'inhibition KI, : - KI reprsente la concentration en inhibiteur pour laquelle la moiti des sites enzymatiques sont occups. - Ainsi, l'affinit d'un inhibiteur est d'autant plus grande que le KI est petit. Cette constante d'inhibition, exprime en mole par litre correspond aussi la constante de dissociation du complexe enzyme-inhibiteur. On distingue gnralement : - les inhibiteurs rversibles, qui se lient l'enzyme par des liaisons de faible nergie (cas des inhibitions comptitives, incomptitives, non comptitives, mixtes et par excs de substrat ou de produit). - les inhibiteurs irrversibles, qui se fixent de manire covalente (cas de linhibition suicide).

2) Inhibition comptitive
La reprsentation de Michalis-Menten montre quen prsence dinhibiteur comptitif : - Vmax est inchange : Vmax = Vmax - Km (constante daffinit) augmente : Km > Km La prsence de cet inhibiteur rend lenzyme moins affine pour son substrat. Donc pour atteindre Vmax il faut augmenter la quantit de substrat dans le milieu. On obtient comme trac :

Page 17 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie

F. LAURO

Exemple pour un inhibiteur avec KI = 4 mM - [I] = 0, 2, 4, 8 mM - Et donc des KM apparents = 3, 4.5, 6 et 9 mM - Les quatre courbes ont la mme asymptote vmax = 5

kat

En double-rciproque (reprsentation de Lineweaver-Burk), on obtient des droites de pentes diffrentes qui se croisent 1/[S] = 0 : - La droite tourne dans le sens trigonomtrique autour dun axe constitu par le point 1/Vmax - 1/vmax est donc le mme - mais -1/KM est de plus en plus petit (flches colores), alors que la pente augmente.

Page 18 sur 25

F. LAURO Mcanisme daction : Ces inhibiteurs sont toujours des analogues structuraux du substrat : mcanisme bas sur la ressemblance entre linhibiteur (I) et le substrat (S). Linhibiteur (I) se fixe donc sur le site de fixation de lenzyme, sans tre transform. Le substrat ne peut alors pas se fixer : il y a comptition entre le (S) et l(I). Quand [S] devient trs grande, on peut dpasser linhibition et atteindre Vmax car quand [S] >>> [I] la probabilit de rencontre entre (E) et (S) est beaucoup plus forte que la probabilit de rencontre entre (E) et (I) et donc (E) se fixera beaucoup plus (S) que l(I).

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie

Or Km = [E] [S] / [ES] En prsence d(I) : - [ES] diminue - et donc Km apparent (Km) augmente (il y a perte apparente d'affinit pour le substrat) Dans l'quation de Michalis-Menten, KM est remplac par: Km' = Km (1 + [I]/KI) o KI = ki/k-i = [E].[I] / [EI] : est la constante de dissociation entre l'inhibiteur et lenzyme. (I) se lie de faon rversible (E). Le complexe (EI) est inactif. Il en rsulte que [E]libre susceptible de se lier (S) diminue. Le KM apparent augmente, donc il y a perte apparente d'affinit pour le substrat.
Un nombre croissant de mdicaments sont des inhibiteurs comptitifs. Leur dveloppement est facilit par l'identification d'une enzyme cible, sa purification et sa cristallisation. La connaissance prcise de la structure tertiaire permet l'adaptation plus prcise au site actif, afin de diminuer le risque d'effets indsirable sur des enzymes apparentes. La mme approche permet aussi de dvelopper des inhibiteurs irrversibles. Exemples de mdicaments: Le mthotrexate, un analogue structurel du ttrahydrofolate, est un inhibiteur comptitif de la dihydrofolate rductase, sur laquelle il se fixe 1000x mieux que le substrat naturel. C'est un mdicament anticancreux. Zanamivir (Relenza), utilis par inhalation, et GS4104 (Tamiflu) forme utilisable oralement de la substance active, GS4071, sont des inhibiteurs comptitifs (KI < 1 nM) de la neuraminidase du virus de la grippe. Le virus a besoin de cet enzyme pour se dtacher de la cellule qui l'a produit. Le sildenafil citrate (Viagra) est un analogue du cGMP et en consquence un inhibiteur comptitif de la phosphodiesterase de type 5 spcifique du cGMP (PDE5). Il augmente l'effet du signal transmis par le NO dans les corps caverneux du pnis et renforce l'rection. Slectivit: plus efficace sur PDE5 que sur PDE6 (10x), PDE1 (>80x), PDE2, PDE3, et PDE4 (>1000x). PDE6 est implique dans la vision des couleurs, PDE3 dans la contraction cardiaque, ce qui explique certains effets secondaires.

3) Inhibition non comptitive


(I ) se combine lenzyme dans un site de fixation diffrent du site actif. Pas de comptition entre le (S) et l(I). La reprsentation de Michalis-Menten montre que la fixation de (I) : - ne modifie pas le Km de lE pour son S : Km = Km - par contre la vitesse diminue : Vmax < Vmax

Page 19 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie

F. LAURO

Exemple pour un inhibiteur avec KI = 4 mM : - [I] = 0, 2, 4, 8 mM - Vmax = 5, 3.33, 2.5, 1.67 kat - Les quatre courbes ont le mme KM = 3 mM donc la prsence de cet effecteur na aucune incidence sur laffinit de (E) pour (S). Laugmentation de [S] dans le milieu ne permettra pas datteindre la Vmax obtenue en absence dinhibiteur. En double-rciproque (reprsentation de Lineweaver-Burk), on obtient une droite qui tourne dans le sens trigonomtrique autour dun axe constitu par le point -1/KM

Linhibiteur se fixe lenzyme mais sur un site diffrent du site actif. Linhibiteur nempche donc pas la formation du complexe (ES). Les molcules denzymes peuvent donc former 3 types de complexes : - (ES) complexe binaire actif - (EI) complexe binaire inactif - (ESI) complexe ternaire inactif. Page 20 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie

F. LAURO

Dans l'quation de Michalis-Menten, Vmax est remplac par: Vmax' = Vmax / (1 + [I]/KI) KI = [ES].[I] / [ESI] = [E].[I] / [EI]: est la constante de dissociation entre (I) et le complexe (ES) ou linverse de laffinit de (E) pour (I). Linhibiteur agit en diminuant le turn over de lenzyme mais pas le nombre de substrats lis lenzyme: cest pour cela que la vitesse diminue en presence de linhibiteur alors que le Km reste inchang. Cest un mode de competition rare. Les inhibiteurs non-comptitifs se comportent comme des effecteurs allostriques puisqu'ils agissent ailleurs (allo-) dans lespace par rapport au site actif et ils affectent la conformation de lenzyme dont lactivit diminue. On peut donc considrer que le site inhibiteur constitue un site allostrique et que linhibition non comptitive est un phnomne allostrique.

4) Inhibition incomptitive
Linhibiteur ne se fixe quune fois le complexe (ES) form mais il se lie directement au complexe (ES) sans pouvoir se lier lenzyme libre (E). Vmax diminue alors.

Exemple pour un inhibiteur avec KI = 4 mM : - [I] = 0, 2, 4, 8 mM, - Km apparents = 3, 2, 1.5, 1 mM - Vmax = 5, 3.33, 2.5, 1.67 kat Page 21 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie


En double-rciproque, on obtient des droites parallles de pente constante Km / vmax

F. LAURO

Dans ce cas : - Vmax et Km diminuent du mme facteur (1 + [I]/KIs ) - Mais Km / Vmax reste inchang. - L'affinit apparente de l'enzyme pour le substrat augmente donc! Vmax' = Vmax / (1 + [I]/KIs ) Km' = Km / (1 + [I]/KIs )

5) Inhibition par excs de substrat


Il arrive que lon observe in vitro une inhibition par excs de substrat : pour de fortes [S] la loi de Michalis-Menten nest plus valable. Il y a une inactivation partielle et rversible de lenzyme : une 2me molcule de substrat se fixe lenzyme, produisant un complexe SES partiellement inactif.

Page 22 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie

F. LAURO Exemple : lActylCholineEstrase (Achase) : - Enzyme qui dtruit lAch, NT de la synapse neuro-musculaire chez les vertbrs. - Enzyme prsente dans la fente synaptique et qui empche une action trop durable du NT, contribuant ainsi la rapidit de la transmission synaptique.

La reprsentation de Michalis-Menten de la Vi en fonction [S] prsente lallure suivante :

Cintique enzymatique de laction de lactylcholinestrase sur lactylcholine. Au-del dune certaine [S] note S sur le graphe, la vitesse nest plus maximale et elle dcrot. Mcanisme de linhibition : - Dans les conditions normales lenzyme possde un site de positionnement (niche anionique) sur lequel se fixe lazote de lAch et un site catalitique estrasique (cuvette cationique) sur lequel se fixe lO du groupement carbonyle de la mme molcule dAch. - Lorsque lAch est en excs, les 2 sites sont occups par 2 molcules de substrat diffrentes et lenzyme nest plus fonctionnelle.

6) Inhibition par excs de produit


Dfinition : Si dans le milieu ractionnel contenant enzyme et substrat, on rajoute une quantit donne de produit P, celui-ci sera reconnu par lenzyme avec qui il peut former un complexe. On observe alors un ralentissement de la raction enzymatique. La modlisation montre quil sagit dun cas dinhibition comptitive par le produit P. Cas frquent en enzymologie. Intrt biologique : Les ractions enzymatiques cellulaires font souvent partie de voies mtaboliques. Ces voies ncessitent des mtabolites que la cellule doit se procurer ou produire elle-mme. Les cellules sont donc de vritables usines trs efficaces mais trs conomes galement car elles ne gaspillent ni nergie ni matriaux. Pour stopper la fabrication dun produit si celui-ci est dj abondant, elles utilisent le mcanisme de rtroinhibition : le flux de mtabolites dans une voie sarrte lorsque la 1re enzyme de la voie est inhibe par le produit final de cette voie. Ce produit agit en se fixant sur un site de rtroinhibition diffrent du site actif. Page 23 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie


7) Inhibition irrversible ou inhibition suicide

F. LAURO

Il y a formation d'un complexe stable avec l'enzyme visant l'inactiver de faon permanente : - L'enzyme reconnait l'inhibiteur comme son substrat et commence la modification de ce dernier. - Intervient alors une tape au cours de laquelle l'inhibiteur modifi devient trs ractif et se lie de faon trs stable l'enzyme (en gnral par liaison covalente). - L'enzyme contribue ainsi sa propre inactivation irrversible d'o le nom d'inhibition suicide . - Leur effet est de diminuer la quantit totale d'enzyme disponible, leur effet sur la cintique ressemble donc l'inhibition non-comptitive pure (! ne pas confondre). - Comme les inhibiteurs comptitifs, les inhibiteurs irrversibles ressemblent souvent au substrat, ce qui leur permet de se fixer sur le site actif de l'enzyme

Exemples de mdicaments qui sont des inhibiteurs irrversibles : L'aspirine (= actylsalicylate) modifie chimiquement la cyclo-oxygnase et empche ainsi la synthse de prostaglandines, signaux d'inflammation. La pnicilline est un inhibiteur suicide de la transpeptidase des bactries peptidoglycane. Elle modifie de manire covalente l'enzyme des bactries et les empchant ainsi de construire leur paroi, les fragilise et les empche de se diviser. Sa liaison bta-lactame tant trs labile elle est mise en position de ragir sur le site actif de l'enzyme par l'enzyme elle-mme. Elle se fixe alors de faon thermodynamiquement trs stable l'enzyme au niveau de son site actif. L'Orlistat (Xenical) est driv de la substance bactrienne lipstatine. Il inhibe la lipase pancratique (C50 = 0.14 M) et empche ainsi la rsorption des graisses des aliments. Propecia inhibe la testostrone 5--rductase et empche la production de la dihydrotestostrone, responsable de la perte des cheveux chez certains hommes. Exemples dangereux: Certains gaz de combat agissent en modifiant l'actylcholinestrase, qui est ncessaire pour inactiver le neurotransmetteur actylcholine. Complment sur les inhibiteurs irrversibles Conception dinhibiteur irrversibles :
On dveloppe donc souvent un inhibiteur irrversible partir de la structure d'un substrat ou inhibiteur comptitif connu, en ajoutant un groupe ractif (parfois photoactivable). Si on y ajoute un marqueur radioactif ou fluorescent, on obtient un marqueur d'affinit. Si l'inhibiteur doit d'abord tre activ par l'enzyme-cible, il s'agit d'un substratsuicide. Pour des polymrases, un inhibiteur peut agir de manire indirecte. Ainsi les inhibiteurs de la transcriptase rverse utiliss contre des virus (en particulier HIV) sont des analogues de substrat incorpors correctement dans l'ADN. Ils rendent l'ADN inutilisable comme substrat pour la raction suivante.

Remarque:
Beaucoup d'enzymes ont besoin d'un ion mtallique comme cofacteur. On peut inhiber ces enzymes en complexant le mtal pour le rendre indisponible. Ainsi la lactate dshydrognase (LDH) musculaire besoin de Zn2+ et est inhibe par l'o-phnanthroline. La plupart des enzymes agissant sur l'ADN (nuclases, polymrases, etc.) ont besoin de Mg2+ et sont inactives en prsence d'EDTA, qui entre dans la composition de tous les tampons de stockage d'ADN. Par contre les ribonuclases se passent de magnsium. On les inactive l'aide de DEPC. Exemples concrets d'inhibiteurs irrversibles: Un nombre croissant de mdicaments sont des inhibiteurs irrversibles. Leur dveloppement est facilit par l'identification d'une enzyme cible, sa purification et sa cristallisation. La connaissance prcise de la structure tertiaire permet l'adaptation plus prcise au site actif, afin de diminuer le risque d'effets indsirable sur des enzymes apparentes. La mme approche permet aussi de dvelopper des inhibiteurs comptitifs. Les dossiers d'information pour mdicaments ne sont pas toujours prcis quant au mode d'action: des substances sont appeles "inhibiteurs spcifiques" sans prciser s'ils sont comptitifs ou irrversibles. L'effet des inhibiteurs irrversibles est plus durable, puisque l'activit enzymatique est perdue, jusqu' ce que l'organisme ait resynthtis l'enzyme. Les inhibiteurs rversibles peuvent tre rapidement perdus par dilution et l'enzyme retrouve alors son activit.

Page 24 sur 25

Chapitre 2 CINETIQUE DE LA REACTION ENZYMATIQUE Enzymologie


B. LES EFFECTEURS ALLOSTERIQUES B.

F. LAURO

Les enzymes allostriques sont des enzymes jouant un rle fondamental dans la rgulation des voies mtaboliques chez tous les tres vivants : - Dans la voie mtabolique A B C D->Z, lenzyme E1 qui catalyse la 1re raction A B est inhibe par le produit final Z (inhibition par rtrocontrle ngatif ou rtroinhibition) - Lenzyme E1 fixe rversiblement le produit Z sur des sites diffrents du site catalytique appels sites allostriques (-allo = ailleurs dans lespace). - Ces enzymes sont dites allostriques et Z est un effecteur allostrique de E1 sy fixant rversiblement par liaison non covalente. Exemple de lhexokinase : - Enzyme qui catalyse en prsence dATP, la phosphorylation du glucose en G6P. - Enzyme dimrique dfinissant entre ses 2 domaines une cavit permettant la fixation des substrats. - LATP et le glucose sont les 2 substrats de lhexokinase mais leurs sites de liaison sont distincts. - La fixation du glucose lhexokinase provoque un rtrcissement de la cavit et lenzyme passe de sa forme ouverte ferme . - Cette modification conformationnelle d lenzyme augmente laffinit de celle-ci pour lATP dun facteur 50. - Ce couplage conformationnel est appel allostrie et lenzyme est dite allostrique La cintique des enzymes allostriques nobit pas lquation de MichalisMenten : - Une enzyme cintique michalienne a une courbe en hyperbole - Une enzyme allostrique a une courbe en forme de S, courbe sigmode.

C. LES ACTIVATEURS C.
Etude exprimentale : voir exercice N8 Caractristiques dun activateur : - Il augmente la Vi de la raction : Vi > Vi - Km reste constant : Km = Km Ce sont des molcules ou des ions qui sassocient avec lenzyme ou au complexe ES. En gnral, ce sont des cations mtalliques. Les activateurs sont des espces qui augmentent lactivit enzymatique sans tre eux-mmes impliqus dans la raction catalyse par lenzyme. Ces espces : - peuvent tre ncessaire lactivit catalytique de lenzyme, tels que des groupements prosthtiques ou cofacteurs - peuvent augmenter lactivit spcifique dune enzyme qui est dj active (ex. ions inorganiques). une concentration sature et constante du substrat, des concentrations croissantes de lactivateur augmentent la vitesse initiale de raction; une vitesse limitante est atteinte des concentrations leves dactivateur. lexception des groupes prosthtiques ou co-facteurs, les activateurs ne sont pas gnralement spcifiques et plusieurs espces peuvent avoir le mme effet dactivation sur une enzyme (ex : lamylase est activ par une varit danions, incluant le Cl-). Page 25 sur 25

Vous aimerez peut-être aussi