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Mtodos de Identificacin de Aminocidos y Protenas 1

Universidad de San Carlos de Guatemala rea Bsica Bioqumica Licenciado Julio Turcios

REPORTE DE LABORATORIO MTODOS DE IDENTIFICACIN DE AMINOCIDOS Y PROTENAS

Anelena Ferrigno Cruz Carmen Mara de Len Castillo Angel Michel Garca Vsquez Karla Paola Castillo Burmester Mnica Christaly Martnez Lpez

2004 2008 2008 2008 200817299

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INTRODUCCIN
Al hablar de aminocidos y protenas se tiene la idea de sustancias en un la boratorio qumico, aisladas y nicamente al alcance de profesionales, sin embargo, los aminocidos y protenas se pueden encontrar en la vida cotidiana. Desde tempranas horas del da, tomar un bao, el desayuno, el cepillado dental, etc. Estamos involucrados con productos y procesos que involucran la presencia de aminocidos y protenas. Las protenas son parte de las sustancias de mayor abundancia en el organismo, por lo tanto, se puede deducir que tanto aminocidos como protenas, son de vital importancia para la supervivencia. Los aminocidos pueden ser tiles para producir energa, conservacin del equilibrio de nitrgeno y dixido de carbono e incluso para la elaboracin de peinados. Hay un sinfn de usos para los aminocidos que sera difcil hacer una lista de cada uno de sus usos. Pero Qu son aminocidos y protenas? Qumicamente hablando, los aminocido son molculas orgnicas con un grupo amino (-NH2) y un grupo carboxlico (-COOH; cido). Los aminocidos ms frecuentes y de mayor inters son aquellos que forman parte de las protenas. Dos aminocidos se combinan en una reaccin de condensacin que libera agua formando un enlace peptdico. Todos los aminocidos componentes de las protenas son alfa-aminocidos. Por lo tanto, estn formados por un carbono alfa unido a un grupo carboxilo, a un grupo amino, a un hidrgeno y a una cadena (habitualmente denominada R) de estructura variable, que determina la identidad y las propiedades de los diferentes aminocidos. Se le llama protena a aquellas cadenas que contienen ms de 50 aminocidos. Gracias a las investigaciones de cientficos involucrados con estas sustancias como el botnico ruso Mikhail Tswett, hoy podemos identificar de manera sencilla los aminocidos y protenas en sustancias por medio de cromatografa. Tswett estableci las ventajas de la cromatografa y fue el primero en utilizar este trmino. Existen otros mtodos como el uso de reactivos para identificar aminocidos y protenas como el de Biuret, Benedict o ninhidrina, pero cual sea el mtodo que se utilice todos tienen la caracterstica de ser de fcil uso. El objetivo general planteado para este laboratorio fue: Identificar de forma cualitativa la presencia de determinados componentes en aminocidos, protenas o carbohidratos.

Los objetivos especficos planteados fueron: Identificar de forma cualitativa la presencia de grupos alfa amino o aminas secundarias en aminocidos, enlaces peptdicos en protenas o grupos reductores en los carbohidratos.

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Determinar la composicin qumica de los reactivos y la reaccin que sucede en cada una de las sustancias utilizadas.

Para la realizacin de los objetivos planteados se utilizaron series de reacciones con base a reactivos como Biuret, ninhidrina y Benedict; y procesos como la cromatografa en papel, as como algunas sustancias para determinar su contenido de aminocidos, protenas o azcares reductores. Se utilizaron otras sustancias extras como el jarabe Medox ABC y Alicol D. algunas sustancias dieron la prueba positiva y otras la dieron negativa.

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Resumen
CROMATOGRAFA EN PAPEL: Proceso muy utilizado en los laboratorios para realizar anlisis cualitativos, no requiere de ni un tipo de equipo extraordinario y es una tcnica muy eficiente. Cuenta con dos fases una fase mvil, y una fase estacionaria est constituida simplemente por una tira de papel de filtro. La muestra se deposita en un extremo colocando pequeas gotas de la solucin y evaporando el solvente empleado como fase mvil se hace ascender por capilaridad. Se colocara la tira de papel verticalmente y con la muestra del lado de abajo dentro de un recipiente que contiene fase mvil en el fondo. Despus de unos minutos cuando el solvente deja de ascender o ha llegado al extremo se retira el papel y se seca. Si el solvente elegido fue adecuado y las sustancias tienen color propio se vern las manchas de distinto color separadas cuando los componentes no tienen color propio el papel se somete a procesos de revelado, en este caso, la ninhidrina es sumamente til para revelar aminocidos.

Se recurri al uso de cromatografa en papel ya que es ms fcil y rpido en su aplicacin adems de observacin de las reacciones. La preferencia en el uso d el papel whatman 1, se debe a la caracterstica de su polaridad este impide el rompimiento del papel.

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La lnea trazada ms importante fue la inferior que media 2cm esto nos daba la pauta de inicio de los aminocidos. Todos los trazos se hicieron a lpiz porque si se usaba lapiceros hubiera reaccionado con los aminocidos impidiendo la observacin de los mismos debido a la tinta orgnica de los lapiceros. Las paredes internas de la cmara se revistieron con papel alto en celulosa. Esto previno que las que la presin externa de la cmara interviniera en los procesos cromatogrficos. La fase estacionaria no toca la cmara cromatogrfica porque est saturada de agua (para la adherencia) en sus paredes, si el papel de la fase estacionaria toca las paredes, el papel que las recubre absorbe fcilmente el agua ya no se puede observar con claridad el avance de los aminocidos. Al momento de sembrar la muestra se requiri el uso de capilares para tener una muestra ms exacta. El orden de la siembra de las muestras no afectaba nuestros resultados, lo nico importante era colocar la misma cantidad de aminocidos en cada punto, y no contaminar el papel de la fase estacionaria. La fase estacionaria se doblo hacia fuera para que las muestras de los aminocidos no entraran en contacto entre ellos (y as fuera ms fcil la absorcin de la fase mvil) colocndole grapas en los extremos para unirlos, porque si hubiramos utilizado masking tape se hubiera despegado, rompiendo la estructura requerida de la fase estacionaria. Al momento de realizar fase mvil tuvimos el cuidado de que la cmara estuviera tapada para que no se contaminara o no reaccionara con ot ro compuesto. Al momento de sacar la fase estacionaria de la fase mvil era necesario colocarse guantes debido a los componentes qumicos que podran afectar la mano. Era importante secar la fase estacionaria porque se tena que revelara con ninhidrina, disminuyendo as la cantidad de los eluentes para evitar la reaccin de los mismos, Obteniendo as la coloracin de los aminocidos. La cistena corri mas debido a su bajo peso molecular, y la Gluteina corri menos debido a su alto peso molecular. En la combinacin de los aminocidos se puede observar que su recorrido es el promedio de los recorridos de la Cisteina y la Gluteina, La Cisteina hizo que la mezcla de ambos aminocidos corriera mas pero al mismo tiempo la Gluteina impidi que siguiera avanzando esto se debe a la diferencia de los pesos moleculares que existe entre ellas. IDENTIFICACIN DE PROTENAS: REACCIN DE BIURET: La Reaccin de Biuret se utiliza para detectar la presencia de protenas, pptidos cortos y otros compuestos con dos o ms enlaces peptdicos en sustancias de composicin desconocida. Para llevar a cabo esto se tomaron 6 tubos de ensayo, en

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cada uno de ellos se colocaron diversas sustancias para verificar la presencia o ausencia de enlaces peptdicos. Se colocaron 10 gotas en cada tubo de las siguientes sustancias: Tubo 1: 10 gotas de agua + 10 gotas de NaOH + 10 gotas de Biuret Tubo 2: 10 gotas de gelatina + 10 gotas de NaOH + 10 gotas de Biuret Tubo 3: 10 gotas de casena + 10 gotas de NaOH + 10 gotas de Biuret Tubo 4: 10 gotas de albmina + 10 gotas de Na OH + 10 gotas de Biuret Tubo 5: 10 gotas de Medox ABC + 10 gotas de NaOH + 10 gotas de Biuret Tubo 6: 10 gotas de Alicol D + 10 gotas de NaOH + 10 gotas de Biuret Luego, se mezcl vigorosamente cada uno de los tubos y se dejaron reposar por 15 minutos para observar los cambios sucedidos en la intensidad de color con el transcurso del tiempo. REACCIN DE NINHIDRINA: La Reaccin de ninhidrina cuantifica la reaccin de los aminocidos del grupo alfa amino. La ninhidrina reacciona rpidamente con el grupo amino, lo oxida y libera amonio el cual se condensa con la ninhidrina reducida, y con otra molcula de ninhidrina libre, para producir un producto prpura . Para determinar esto, se utilizaron 6 tubos de ensayo con diversas sustancias dentro de ellos de la siguiente manera: Tubo 1: 10 gotas de agua + 10 gotas de solucin de ninhidrina Tubo 2: 10 gotas de cistena + 10 gotas de solucin de ninhidrina Tubo 3: 10 gotas casena + 10 gotas de solucin de ninhidrina Tubo 4: 10 gotas de albmina + 10 gotas de soluci n de ninhidrina Tubo 5: 10 gotas de Medox ABC + 10 gotas de solucin de ninhidrina Tubo 6: 10 gotas de Alicol D + 10 gotas de solucin de ninhidrina Teniendo los 6 tubos de ensayo con las sustancias debidas, se mezclaron y se colocaron 5 minutos en bao mara para observar los cambios de coloracin que hubo debido a la presencia de calor. REACCIN DE BENEDICT:

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La reaccin de Benedict identifica azcares reductores (aquellos que tienen su OH anomrico libre), como la lactosa, la glucosa, la maltosa, y celobiosa. En soluciones alcalinas, pueden reducir el Cu 2+ que tiene color azul a Cu +, que precipita de la solucin alcalina como Cu2O de color rojo-naranja. Al igual que los dos reactivos anteriores, se utilizaron 6 tubos de ensayo con diversas sustancias para verificar la existencia de azcares reductores de la siguiente manera: Tubo 1: 10 gotas de agua + 10 gotas de solucin de Benedict Tubo 2: 10 gotas de glutamina + 10 gotas de solucin de Benedict Tubo 3: 10 gotas de casena + 10 gotas de solucin de Benedict Tubo 4: 10 gotas de albmina + 10 gota s de solucin de Benedict Tubo 5: 10 gotas de Medox ABC + 10 gotas de solucin de Benedict Tubo 6: 10 gotas de Alicol D + 10 gotas de solucin de Benedict Se mezcl la solucin formada en cada uno de los tubos y se expusieron 5 minutos a bao mara para observar los cambios en cuanto a color que sucedieron debido a la presencia de calor.

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RESULTADOS
REACCIN DE BIURET REACCIN DE NINHIDRINA Tubo 1 2 contenido 10 gotas de agua + 10 gotas de ninhidrina 10 gotas de cistena + 10 gotas de solucin de ninhidrina Resultado Solucin incolora. La solucin se encontraba dividida en dos partes, una superior de color caf oscuro y otra inferior de color amarillo suave. La solucin presentaba dos coloraciones, una superior de color azul oscuro y un residuo al fondo del tubo de ensayo de coloracin blanca. Solucin de color blanco y apariencia lechosa. La solucin present dos coloraciones, una superior de color morado oscuro, y una inferior de color amarillo. Solucin color rojo.

10 gotas de casena + 10 gotas de solucin de ninhidrina

4 5

10 gotas de albmina + 10 gotas de solucin de ninhidrina 10 gotas de Medox ABC + 10 gotas de solucin de ninhidrina

10 gotas de Alicol D + 10 gotas de solucin de ninhidrina

Reaccin de Benedict Tubo 1 2 Contenido 10 gotas de agua + 10 gotas de solucin de Benedict 10 gotas de glutamina + 10 gotas de solucin de Benedict Resultado Solucin con color celeste muy suave, transparente. Solucin con color celeste, aunque una tonalidad ms oscura que la solucin del tubo 1. La solucin presentaba dos coloraciones, una inferior caf y una superior caf oscuro.

10 gotas de casena + 10 gotas de solucin de Benedict

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4 5 6

10 gotas de albmina + 10 gotas de solucin de Benedict 10 gotas de Medox ABC + 10 gotas de solucin de Benedict 10 gotas de Alicol D + 10 gotas de solucin de Benedict

Solucin color caf, transparente. Solucin color amarillo fuerte. Solucin color caf oscuro.

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DISCUSIN DE RESULTADOS
CROMATOGRAFA EN PAPEL: REACCIN BIURET:

REACCIN DE NINHIDRINA: La ninhidrina es un poderoso agente y reactivo comn para visualizar las bandas de separacin de aminocidos por cromatografa o electroforesis, tambin es utilizada con fines cuantitativos para la determinacin de aminocidos. Reacciona con todos los aminocidos alfa cuyo pH se encuentra entre 4 y 8, con los aminocidos en medio cido (pH entre 3 y 4) dando una coloracin que vara de azul a violeta intenso. Este producto colorido, llamado prpura d e Ruhemann, se estabiliza por resonancia, la coloracin producida por la ninhidrina es independiente de la coloracin original del aminocido. El mtodo se basa en la reaccin entre la ninhidrina y el grupo -amino de aminocidos, pptidos y protenas, dand o un compuesto coloreado azul o azul - violeta. La reaccin con la ninhidrina produce colores que sirven como base para la cuantificacin de todos los aminocidos primarios se evala midiendo la absorcin de la luz con la longitud de onda de 540 nm. Aminocidos secundarios como la prolina forman productos ligeramente distintos; estos son amarillos t tienen su mxima absorcin a 440 nm. El clculo de la concentracin se basa en la relacin de Beer-Lambert. Calentar en presencia de ninhidrina produce la desaminacin oxidativa de los grupos amino lo que implica la reduccin asociada de la molcula de ninhidrina.

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La ninhidrina reducida reacciona con el amonio y con otra ninhidrina oxidada para dar ligar a un compuesto coloreado llamado azul - violeta de Ruhermann. La prolina y la oxiprolina reaccionan con la ninhidrina, pero dan un positivo de color amarillo. La reaccin de la ninhidrina puede dar positivo con ciertas aminas, aminas cidas y algunos otros compuestos. En la cuantificacin de los aminocidos individuales puede utilizarse el coeficiente de absorcin molar del compuesto coloreado, aunque su valor vara de un aminocido a otro y debe determinarse para las condiciones particulares del anlisis. Sin embargo, se debe escoger un valor de referencia para utilizarlo en la cuantificacin de los aminocidos totales de una mezcla. La reaccin coloreada de la ninhidrina se utiliza en trabajos analticos, as como en la visualizacin de las bandas de los aminocidos despus de su separacin por electroforesis o por cromatografa. El reactivo que se utiliza en estas circunstancias se prepara generalmente disuelto en etanol; cuando se aade 2,4-6colidina, las diferencias de color entre cada mancha ayudan a la identificacin de los distintos aminocidos. La reaccin entre un aminocido y la ninhidrina es:

Todos los tubos de ensayo fueron expuestos a bao mara durante 5 minutos con el objetivo de producir una desaminacin oxidativa de los grupos amino de las sustancias utilizadas y su reduccin asocindose con la molcula de ninhidrina. Durante este proceso, las sustancias liberaron diversos aromas debido a la presencia de grupos aromticos en la solucin de ninhidrina. Tubo 1: El resultado fue una solucin incolora debido a que el agua carece de pptidos y de grupos alfa amino, por lo tanto, no es un aminocido y la prueba es negativa. Tubo 2: El resultado fue una solucin de coloracin amarilla debido a la presencia de aminas secundarias y resultan en una sal de imino y la coloracin caf se debe a la ausencia de

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grupos amino libres pero la presencia de un grupo amino en la cadena lateral, por lo tanto la prueba es positiva. Tubo 3: Se obtuvo como resultado una solucin de color azul oscuro con un precipitado de color blanco al fondo del tubo de ensayo, este color identifica la presencia de grupos alfa amino en la solucin. La casena es una fosfoprotena, lo que implica que posee pocos grupos aminos libres para reaccionar, sin embargo, son suficientes para que la solucin de ninhidrina los identifique y de un resultado positivo. Tubo 4: El resultado fue una solucin de color blanco con apariencia lechosa debido a que la solucin de ninhidrina no pudo identificar ningn grupo alfa amino en la estructura debido a que la albmina es una protena que reaccionara de mejor manera con alguna solucin para identificar protenas, por lo tanto, la prueba es negativa. Tubo 5: Se obtuvo como resultado una solucin de dos colore s, el morado oscuro indica que el medicamento llamado Medox ABC posee grupos amin o en sus diferentes componentes como la lisina y el color amarillo indica que no presenta grupos amino libros, sino que, presenta grupos imin o en las estructuras. Tubo 6: El resultado fue una solucin de color rojo, este color realmente no est representando nada, ya que la solucin era originalmente roja, as que se puede deducir que no hubo cambio de coloracin, por lo tanto, no hay presenci a de grupos alfa amino en ningn lugar dentro de las estructuras de los componentes del medicamente Alicol D, as que la prueba es negativa. REACCIN DE BENEDICT: Una de las reacciones ms comunes en la identificacin de carbohidratos es la reaccin de Benedict. La reaccin o prueba de Benedict identifica azcares reductores (aquellos que tienen su OH anomrico libre) como la lactosa, la glucosa, la maltosa, y celobiosa. Todos los monosacridos poseen un grupo reductor libre. Los disacridos maltosa y lactosa tienen grupos reductores libres, pero la sacarosa no los posee, ya que se pierden los grupos reductores de sus componentes cuando sta es formada. Se basa en la capacidad del carbohidrato de reducir el Cu2+ en un medio alcalino. Este Cu1+ se oxida y precipita en forma de Cu2O, lo que proporciona la coloracin p ositiva de la reaccin. La coloracin depender de la concentracin de xido de cobre y sta a

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su vez de la reduccin del cobre; va desde verde, amarillo, anaranjado o rojizo, dependiendo de la coloracin. En Todos los casos, en presencia de un azcar o carbohidrato que posea libre su grupo carbonilo, el sulfato de cobre xida el monosacrido al cido correspondiente; mientras el cobre II se reduce a cobre I, que precipita rojo (ladrillo o terracota). Por ejemplo la glucosa formar cido glucurnico mientras el cobre precipita. Los disacridos demoran en dar la reaccin. El almidn no da esta reaccin de oxidacin de glcidos. Los almidones no darn esta reaccin a menos que primero sufran hidrlisis. Tubo 1: El resultado obtenido fue una solucin de color celeste suave, se sabe que las pruebas positivas dan coloracin desde verde a roja, sin embargo, el color celeste no se encuentra en esta clasificacin, por lo tanto, la prueba par a carbohidratos es negativa, es decir, hay ausencia de grupos reductores libres. Tubo 2: La solucin obtenida es de color celeste intenso, por lo tanto se puede deducir que no es un carbohidrato debido a la ausencia de grupos reductores libres e n la estructura de la glutamina y el resultado es negativo. Tubo 3: El resultado obtenido fue una solucin de dos col ores, uno inferior caf y una acumulacin densa superior de color caf claro. El color caf no identifica ningn grupo reductor libre en su estructu ra, por lo tanto, la prueba es negativa. Tubo 4: El resultado obtenido fue una solucin de de color caf suave, al igual que la solucin en el tubo # 3, no se identific ningn grupo reductor libre en la estructura de albmina, por lo tanto, la prueba es negativa. Tubo 5: La solucin de este tubo fue de color amarillo, lo cual indica que el medicamento llamado Medox ABC contiene grupos reductores libres en las estructuras de sus componentes debido a la presencia de algn edulcorante como la sacarosa, as que, la prueba para identificar carbohidratos es positiva. La coloracin amarilla se debe a que los carbohidratos se encuentran en un medio alcalino, se oxida el Cu+1 y se precipita en forma de Cu2O. Tubo 6:

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El resultado obtenido fue una solucin de col or caf oscuro, debido a esta coloracin se puede deducir que hay ausencia de grupos reductores libres, por lo tanto la prueba es negativa.

CONCLUSIONES
La tcnica de cromatografa en papel se basa en la velocidad de desplazamiento diferencial de los solutos al ser arrastrados por una fase mvil sobre una estacionaria que puede ser slida o liquida. Esta diferencia ser la que nos permita tanto identificar cuantos componentes tiene una disolucin como separarlos. El mtodo de identificacin por cromatografa en papel es efectivo ya que los elementos utilizados como eluentes son ideales para correr en el papel alto en celulosa y disolver los aminocidos, adems conforme avanza el tiempo la corrida del papel variara dependiendo del peso de los aminocido s a mayor peso ms lento el recorrimiento a menor peso ms veloz. Las interacciones del solvente y el soluto dieron a mostrar las caractersticas de cada aminocido. Las fibras rectas del papel cromatogrfico Whatman no.1 favorecen la captacin y transporte de agua. Las sustancias que se movilizan menos en la fase estacionaria son las que tienen ms afinidad al agua, mientras que las que se desplazaron ms muestran menos afinidad al agua y ms afinidad al solvente. El reactivo de Biuret se utiliza para detectar la presencia de protenas, pptidos o simplemente enlaces peptdicos en sustancias acuosas dando una coloracin rosada a violeta. La ninhidrina identifica grupos libres y grupos alfa amino en sustancias, al dar un prueba positiva se presenta una coloracin violeta o azul y este proceso se conoce como condensacin de la ninhidrina. Durante el uso de la ninhidrina ocurre un proceso de oxidacin del grupo amino para liberar amonio.

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El reactivo de Benedict se utiliza para identificar azucares reductores en sustancias y da como respuesta positiva la coloracin verde, amarilla, naranja o rojiza. No todas las sustancias dieron la prueba positiva, pero en las que lo hicieron sus resultados fueron totalmente claros.

RECOMENDACIONES
Al realizar la cromatografa en papel es de importancia tomar en cuenta las medidas de proteccin necesarias ya que algunas sustancias utilizadas como el cido actico pueden causar graves irritaciones y quemaduras en la piel o en los ojos y llevar a dao ocular. Mantener las ventanas abiertas para evitar la inhalacin de cualquier sustancia y evitar daos en las vas respiratorias superiores. Observar detenidamente las soluciones utilizadas para la identificacin de aminocidos, protenas y azcares fermentables ya que el cambio de coloracin al pasar el tiempo es un indicio de que una reaccin se est llevando a cabo. Durante el proceso dentro de la fase estacionaria es de importancia colocar la disolucin mediante instilacin, sino se hace de esta manera puede haber una saturacin de disolucin en la fase mvil. Tomar en cuenta los 5 minutos exactos en bao mara, a una temperatura adecuada para que se puedan ver los resultados de la desaminacin oxidativa de los grupos amino lo que implica la reduccin asociada de la molcula de ninhidrina.

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BIBLIOGRAFA
Libros: Bioqumica Mdica, Baynes, John, Editorial Elsevier, Segunda Edicin, Espaa, 2006, 703 pp. Fundamentos de Bioqumica, Voet, Pratt, Editorial Mdica Panamericana, Segunda Edicin, Argentina, 2007, 626 pp. Tcnicas Analticas de Separacin, M. Valcrcel, Editorial Revert S. A., Espaa, Primera Edicin, 1988, 776 pp. Internet: http://latina.chem.cinvestav.mx/RLQ/tutoriales/cromatografia/Gas.htm http://www.patacake.net/panreac/spanish/practicas/practicas25.htm http://exa.unne.edu.ar/depar/areas/quimica/quimica.analitica/qa_arch_matdi d/arch_teoria/Temas%20teoricos/Profesorado/Cromatografia.pdf

Revistas: