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Les acides nucliques

1. 2. DFINITION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 LES NUCLOTIDES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 2.1. 2.1.1. 2.1.2. 2.1.3. 2.1.4. 2.1.5. 2.2. 2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.2.4. 2.2.5. 2.2.6. 2.3. 2.3.1. 2.3.2. 3. LES BASES AZOTES ................................................................................................................2 Les bases pyrimidiques et les bases puriques ..........................................................................2 Les bases modifies dans l'ADN ou l'ARN ..............................................................................3 Des drivs : molcules d'intrt biologique ...........................................................................3 Des analogues synthtiques .................................................................................................4 Des proprits importantes des bases azotes .........................................................................4 LES NUCLOSIDES ...................................................................................................................7 Le pentose des nuclosides ..................................................................................................7 La liaison osidique ............................................................................................................7 Nomenclature ...................................................................................................................8 Les nuclosides naturels .....................................................................................................8 Des nuclosides naturels et singuliers ...................................................................................8 Des analogues synthtiques .................................................................................................9 LES NUCLOTIDES ...................................................................................................................9 Nomenclature ................................................................................................................. 10 Les nuclotides d'intrt biologique .................................................................................... 11

LES ACIDES NUCLIQUES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 3.1. 3.1.1. 3.1.2. 3.2. 3.2.1. 3.2.2. 3.2.3. 3.2.4. 3.2.5. 3.3. 3.3.1. 3.3.2. 3.4. 3.4.1. 3.4.2. 3.4.3. LA STRUCTURE PRIMAIRE DES POLYMRES.............................................................................. 13 La taille des polymres nucliques...................................................................................... 13 La liaison phosphodiester ................................................................................................. 13 LES DIFFRENTS GROUPES IONISABLES DES ACIDES NUCLIQUES.............................................. 14 Les groupes phosphates .................................................................................................... 14 Les azotes des cycles des bases pyrimidiques et puriques ........................................................ 15 Les groupes amino lis aux cycles des bases ......................................................................... 15 Les formes tautomres (lactame et lactime) .......................................................................... 15 En guise de conclusion ..................................................................................................... 15 L'HYDROLYSE DES ACIDES NUCLIQUES.................................................................................. 17 L'hydrolyse chimique ....................................................................................................... 17 L'hydrolyse enzymatique ................................................................................................... 17 S TRUCTURE SPATIALE DES ACIDES DSOXYRIBONUCLIQUES .................................................. 19 Quelques rsultats exprimentaux sur les acides dsoxyribonucliques ...................................... 19 Les doubles hlices .......................................................................................................... 21 Retour sur les quelques rsultats exprimentaux sur l'ADN natif............................................... 25

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3.4.4. 3.4.5. 3.4.6. 3.5. 3.5.1. 3.5.2. 3.5.3.

Quelques exemples de molcules d'ADN .............................................................................. 26 Des proprits physico-chimiques souvent utilises................................................................ 26 Pour la suite................................................................................................................... 26 S TRUCTURE SPATIALE DES ACIDES RIBONUCLIQUES............................................................... 27 Les hlices d'ARN............................................................................................................ 27 Les motifs lmentaires de structure secondaire d'ARN........................................................... 28 Pour la suite................................................................................................................... 29

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Les acides nucliques

1.. Dffiin iittiio n 1 D n o n


Le mdecin suisse MIESCHER isola en 1869, partir de leucocytes de pus de plaies infectes, une substance organique remarquablement riche en phosphore qu'il baptisa nucline. Sa nature chimique fut lucide par les travaux initiateurs de KOSSEL partir de 1882 jusqu' ceux de LEVENE en 1927 : il s'agissait de l'acide dsoxyribonuclique dont l'abrviation est ADN (DNA : anglo-saxon), polymre d'units dnommes nuclotides. Les polynuclotides biologiques sont : - le support molculaire de l'information gntique : l'ADN (et ARN pour certains virus) est le support de l'hrdit et du codage des composs biologiques (les ARN, les protines) - des effecteurs de l'expression de l'ADN en peptides et protines : acide ribonuclique dont l'abrviation est ARN (RNA : anglo-saxon) regroups en trois classes : - les ARN messagers (ARNm) - les ARN de transfert (ARNt) - les ARN ribosomaux (ARNr) Les nuclotides ont des fonctions varies et importantes, ce sont : - des composs "haut potentiel nergtique" dont dpendent l'activation de molcules entrant dans des ractions endergoniques dans les ractions cellulaires, - des composs structuraux de coenzymes, - des seconds messagers intracellulaires de signaux et des mdiateurs extracellulaires, - des rgulateurs d'activit de protines lors de modifications covalentes.

2.. L es n u cllo ttiid es 2 L es n u c o d es


Un nuclotide rsulte de : 1) la condensation d'un ose (pentose) avec une base nuclique (htrocycle azot) qu'on appelle nucloside. 2) l'estrification de l'ose d'un nucloside par l'acide phosphorique produit un nuclotide.

phosphate(s)

pentose

base azote

nucloside nuclotide
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2.1.

Les bases azotes

Cinq bases majeures, partages en deux sries, entrent dans la composition des nuclotides et leurs polymres. Elles vont confrer aux composs biologiques dont elles font partie des proprits capitales.

2.1.1. Les bases pyrimidiques et les bases puriques

Les drivs oxy ou/et amino de la pyrimidine et de la purine forment les deux familles de base des nuclotides naturels. NH 2
4

O HN O N H uracile HN O

O CH3

N
2 1

N N O N H cytosine

pyrimidine

N H thymine

2-oxy-4-aminopyrimidine

2,4-dioxypyrimidine

5-mthyl-2,4-dioxypyrimidine

bases pyrimidiques NH 2
6

O N HN H 2N N guanine
2-amino-6-oxypurine

N1
2

N
7 9

N N adnine

N N H

N purine

N H

N H

imidazopyrimidine

6-aminopurine

bases puriques Les noms courants des diffrentes bases n'ont aucun lien avec la nomenclature classique de la chimie organique, certains font rfrence leurs conditions de dcouverte (thymine : thymus de veau). Les nuclotides de l'ADN, comme ceux de l'ARN ne comportent que quatre de ces bases azotes : - deux puriques communes aux deux types d'acides nucliques - une pyrimidique commune : la cytosine - une pyrimidique spcifique : l'uracile pour l'ARN et son driv mthyl, la thymine pour l'ADN
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2.1.2. Les bases modifies dans l'ADN ou l'ARN

Les modifications peuvent avoir lieu sur des sites cycliques ou exocycliques : - la 5-mthylcytosine est trouve dans l'ADN des plantes et des animaux sauf les insectes. Cette mthylation est un signal ngatif de la rgulation de l'expression des gnes, le groupe mthyle favorisant une conformation de l'ADN qui ne peut fixer un facteur de transcription. - la N6-mthyladnine est prsente dans les bactries. Cette mthylation permet aux enzymes de restriction de la bactrie de reconnatre son propre ADN vis--vis d'ADN trangers (virus). D'autres mthylations permettent le fonctionnement d'un systme de correction des ventuelles erreurs de rplication de fonctionner. - Les ARN et principalement les ARNt contiennent une varit tendue de drivs : des drivs hydrogns (5, 6-dihydrouracile) ou soufrs (thiouracile ou 2-oxy-4-thiopyrimidine) des pyrimidines, ou encore des formes altres de la guanine, la xanthine (2, 6-oxypurine) et l'hypoxanthine (6-oxypurine).

2.1.3. Des drivs : molcules d'intrt biologique

- Lorsqu'elles ne sont pas recycles, les bases puriques sont dgrades en acide urique par passage par des formes dsamines hypoxanthine et xanthine. Celui-ci, trs peu soluble, est excrt par les primates.

O N O N N O N acide urique HO N

OH N OH N N

(forme cto)

- des produits de mtabolisme des alcalodes vgtaux sont des produits usage pharmacologique : cafine (stimulant), thobromine et thophylline (stimulants cardiaques, relaxant des muscles lisses et vasodilatateurs)

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O (CH3) N1
3

(CH3) N
7

N (CH3)

1,3-dimthylxanthine ou thophylline 3,7-dimthylxanthine ou thobromine 1,3,7-trimthylxanthine ou cafine produits de dgradation d'alcaloides vgtaux

2.1.4. Des analogues synthtiques

Des analogues des bases nucliques sont utiliss : - comme molcules de marquage en biologie molculaire : 5-bromouracile sur lequel peuvent tre greffs des molcules marqueurs - comme agents thrapeutiques, agissant en comptition avec les bases naturelles, ils bloquent la multiplication des bactries, la mitose : - antitumoraux : ce sont les drivs fluors (5-fluorouracile), thiols (6-thiopurine) ou encore aza (N remplace un C : 8-azaguanine) qui sont utiliss - un antiviral classique (acyclovir) est un driv de la guanine : (2-hydroxythoxyl)9-mthylguanine O N H 2N N N N mdicament acyclovir ther CH2 O CH2 CH2OH

2.1.5. Des proprits importantes des bases azotes

Leurs formules chimiques indiquent : - les htrocycles azots sont susceptibles d'ionisation - les doubles liaisons crent des systmes conjugus pour lesquels certaines proprits physiques sont remarquables (spectre, hydrophobicit, empilement (stacking)) La conjugaison des doubles liaisons La rsonance entre de nombreux atomes dlocalise les lectrons des doubles liaisons avec les consquences suivantes : - la molcule est fortement stabilise dans une configuration plane - la molcule existe sous diffrentes formes tautomres
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O ctone HN O ctone N uracile O N

OH nol N N HO

H N N O ctone N

H amine nol N N N

H imine

cytosine

HO

O HN H2 N N

ctone N N guanine

nol N H2 N

OH N N N

Equilibres tautomriques pH 7 des diffrentes bases lies un ose (nucloside ou nuclotide) : - forme lactame gauche (ctone) - forme lactime droite (nol) Les formes prpondrantes pH7 sont les formes lactame (cto) et amino. Les proprits spectrales Les htrocycles des diffrentes bases ainsi que leurs drivs, nuclosides ou nuclotides, prsentent des spectres d'absorption caractristiques dans l'ultraviolet, spectres dpendant du pH. L'aire de ces spectres dans cette rgion est plus leve pour les purines ( deux cycles) : leurs absorptions sont donc plus importantes. Ces proprits optiques sont communment utilises pour la dtection, le dosage et le contrle de puret d'acides nucliques. La fluorescence de ces bases est par contre inutilisable : l'mission se situe dans la rgion UV 300-320 nm et elle est trs faible (400 fois plus faible que celle du tryptophane pour les purines et 2500 fois pour les pyrimidines).
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Adnine

Cytosine Guanine

Uracile Thymine

220

240

260

280

300

nm

Les transformations chimiques des bases 1) la lente dsamination est spontane dans les cellules (100 fois moins importante pour les purines par rapport aux pyrimidines) : cytosine uracile 5-mthylcytosine thymine adnine hypoxanthine guanine xanthine 2) les radiations altrent les bases : - l'irradiation dans l'ultraviolet ouvre les liaisons de deux bases superposes et les ponte par des liaisons covalentes - les radiations ionisantes (rayons X ou gamma) ouvrent les cycles et les cassent. 3) de nombreux agents chimiques ragissent avec les bases : - l'acide nitreux (HNO 2 ) et l'hydrognosulfite de sodium HNO-,3 ont une action dsaminante. Ils font partie des conservateurs dans l'industrie alimentaire. - les espces ractives de l'oxygne (peroxydes, radicaux libres) font subir des dommages oxydatifs

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2.2.

Les nuclosides

Une liaison covalente (liaison N-osidique) fixe les bases un pentose.

2.2.1. Le pentose des nuclosides

Il s'agit du ribose dans les acides ribonucliques (ARN) et de son driv 2-dsoxyribose dans les acides dsoxyribonucliques (ADN) avec les caractristiques suivantes : - l'nantiomre est de la srie D - l'ose est sous forme hmiactalique (furanose) - l'anomre est en conformation

2.2.2. La liaison osidique

La liaison avec la base est de type N-osidique entre le carbone 1' (carbone anomrique) du furanose en conformation et l'azote N1 des pyrimidines et N9 des purines. Exemple pour une base pyrimidique : NH 2 N O HOH2C O N H OH
5'

cytosine N

NH 2

HOH2C

O O
1' 2'

N liaison N-osidique

OH 2-dsoxy--D-ribofuranose

OH nucloside : 2'-dsoxycytidine

Exemple pour une base purique : O -D-ribofuranose + guanine HOH2C O H 2N


1'

N1 N

N
9

nucloside : guanosine OH OH

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2.2.3. Nomenclature

Les noms des nuclosides ont comme suffixe : - "osine" pour les nuclosides puriques - "idine" pour les nuclosides pyrimidiques Bases azotes Nom cytosine uracile thymine adnine guanine xanthine hypoxanthine Symbole Cyt Ura Thy Ade Gua Xan Hyp Nom cytidine uridine thymidine* adnosine guanosine xanthosine inosine Ribonuclosides Symbole Nom Cyd Urd Thd Ado Guo Xao Ino 2'-dsoxycytidine 2'-dsoxyuridine (2'-dsoxy)thymidine* 2'-dsoxyadnosine 2'-dsoxyguanosine 2'-dsoxyxanthosine 2'-dsoxyinosine dAdo dGuo dXao dIno Dsoxyribonuclosides Symbole dCyd dUrd

* le nom de thymidine a t consacr pour la 2'-dsoxythymidine : pour diffrencier ce ribonucloside, on le dsigne sous le nom de ribosylthymidine.

2.2.4. Les nuclosides naturels

Les nuclosides apparaissent en tant qu'intermdiaires dans le mtabolisme des nuclotides, mais aussi comme cofacteurs ou coenzymes : - la S-adnosylmthionine est un cofacteur de transfert de groupement mthyle. Le carbone 5' de l'adnosine est li de manire covalente avec le groupement sulfhydril de l'acide amin mthionine. - le coenzyme B12 (ou vitamine B12), dont la fonction permet de dplacer des groupes de manire intramolculaire, est la 5'-dsoxyadnosine lie au cobalt du noyau corrine.

2.2.5. Des nuclosides naturels et singuliers

- On trouve dans les ARN de transfert (ARNt) de l'uracile qui est li au ribose non par l'azote mais par le carbone C5 : c'est une liaison C-osidique. On trouve aussi des drivs 2'-Omthyls du ribose : la prsence du mthyle donne une rsistance l'hydrolyse enzymatique ou mme alcaline l'ARNt. - Certains microorganismes produisent des nuclosides libres dans lesquels l'ose est l'arabinose (quelquefois appels spongonuclosides pour avoir t isols dans des spongiaires).
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L'arabinosylcytosine est utilis comme mdicament dans le traitement de l'herps, l'arabinosyladnosine dans les leucmies. - La puromycine est un antibiotique scrt par Streptomyces. La base est l'adnosine Nmthyle, le pentose la ribosamine dans lequel le carbone C3' est li par une liaison amide une O-mthyltyrosine.

2.2.6. Des analogues synthtiques

- les formes dsoxy, halognes ou non, des nuclosides puriques ou pyrimidiques sont des bactriostatiques, par exemple la 3'-dsoxyadnosine. - la 6-azauridine (carbone 6 remplac par un azote) sont des mdicaments utiliss dans les maladies prolifratives de l'piderme.

2.3.

Les nuclotides

Ce sont des esters-phosphates de nuclosides (condensation alcool-acide). Exemple de nuclotides : NH 2 liaison ester O O
-

N N
1'

N N

liaison anhydride d'acide O O


-

NH 2 N N N N

O O P O
-

P O
-

CH2 O

5'

P O
-

CH2 O

OH

OH

OH adnosine 5'-diphosphate (ADP)

OH

adnosine 5'-monophosphate (AMP)

- la phosphorylation peut concerner un ou plusieurs hydroxyles de l'ose. - le groupe ester-phosphate peut tre engag soit : - avec d'autres molcules d'acide phosphorique (ADP, ATP) - avec un autre acide (adnosine 3'-phosphate 5'-phosphosulfate) - avec un autre hydroxyle par une deuxime liaison ester dans les nuclotides cycliques

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2.3.1. Nomenclature

Les noms des nuclotides obissent la rgle suivante : nucloside n'[,n"] nb phosphate : (n' numro du carbone portant le phosphate) nucloside n'[:n"] nb phosphate, cyclique pour les nuclotides cycliques Les symboles ou abrviations classiques sont pour les nuclotides une seule liaison ester : - symbole nucloside n' P[P] - symbole nucloside (une lettre) N P (N nombre de phosphate : M 1, D 2, T 3) pour le symbole 3 lettres qui suppose que la liaison ester est port par le carbone 5'. Lorsque l'ose est le dsoxyribose, le symbole est prcd de d (exemple dAMP) Pour leur caractre acide, d au groupement phosphate, les nuclotides monophosphates ont aussi la dnomination suivante : acide n' [dsoxy] (radical de la base) idylique : (n' numro du carbone portant le phosphate) Par exemple : - adnosine 3', 5'-biphosphate : l'adnosine porte 2 groupements phosphate, l'un sur la carbone C3 et l'autre sur le C5. - adnosine 3'-(mono)phosphate 5'-phosphosulfate (PAPS) : l'adnosine porte un groupement phosphate en C3' et un groupement phosphate en C5' qui est lui-mme li un sulfate par une liaison anhydride d'acide. - adnosine 5'-triphosphate (Ado5' PPP ou ATP) : le plus connu des nuclotides o l'adnosine porte un groupement phosphate en C 5', li un autre phosphate par une liaison anhydride d'acide, lui-mme li un autre phosphate par une liaison anhydride d'acide. - adnosine 3':5'-(mono)phosphate, cyclique (Ado3':5' P ou AMPc) : 2 liaisons esters sur les carbones C3' et C5' avec un seul groupement phosphate - dsoxyadnosine 5'-(mono)phosphate (dAdo5' P ou dAMP) : l'adnosine porte un groupement phosphate en C5', (ou encore acide 5' dsoxy adnylique) - adnosine 5'-(mono)phosphate (Ado5' P ou AMP) : l'adnosine porte un groupement phosphate en C5', (ou encore acide 5' adnylique) - cytidine 5'-(mono)phosphate (Cyd5' P ou CMP) : la cytidine porte un groupement phosphate en C5', (ou encore acide 5' cytidylique) - uridine 5'-(mono)phosphate (Urd5' P ou UMP) : la cytidine porte un groupement phosphate en C5', (ou encore acide 5' uridylique)
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NH 2 N O O
-

NH 2 N N N CH2 O O N N

O O P O
-

N O CH2 O O O
-

S O

P O
-

OH

P O

OH

adnosine 3'-phosphate 5'-phosphosulfate

adnosine 3': 5'-(mono)phosphate, cyclique

2.3.2. Les nuclotides d'intrt biologique

Les nuclosides monophosphates La phosphorylation sur le carbone C5' est la plus courante. L'AMP est l'un des composs que l'on trouve dans de nombreuses ractions du mtabolisme. Les nuclosides 5'-phosphates sont les lments de bases de polymres tels que l'ADN et l'ARN que l'on trouve dans tous les organismes vivants. Les nuclosides diphosphates Le PAPS (adnosine 3'-(mono)phosphate 5'-phosphosulfate) est impliqu dans des ractions de sulfatation des glycannes et des lipides. L'ADP (et les autres nuclosidesPP classiques) est un compos qui a de nombreuses diffrentes fonctions, citons parmi elles : - molcule haut potentiel nergtique (hydrolyse de la liaison anhydride d'acide) - molcule intermdiaire dans la production d'ATP - activateur d'enzyme allostrique comme la L-glutamate-dshydrognase Les nuclosides triphosphates - L'une des molcules les plus "universelles" est l'ATP : ses deux liaisons anhydride d'acide (enthalpie libre d'hydrolyse d'une liaison de l'ordre de 30kJ.mol -1) sont une source d'nergie utilisable : - par des ractions de catalyse enzymatique impossibles sans couplage - pour le transport transmembranaire actif - pour la contraction musculaire - etc D'autres nuclosides 5' triphosphates jouent un rle identique celui de l'ATP mais un degr beaucoup plus minoritaire.
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Les nuclosides 5' triphosphates sont aussi des donneurs de phosphates. - Les nuclosides 5' triphosphates sont les prcurseurs de base dans la biosynthse des acides nucliques. Des constituants de coenzymes Citons : - l'adnosine 3'-phosphate 5'-diphosphate est une partie de la molcule d'un coenzyme d'actylation, le coenzyme A. - l'adnosine 5'-diphosphate fait partie de la structure de deux coenzymes d'oxydo-rduction : le nicotinamide adnine dinuclotide (NAD) et le flavine adnine dinuclotide (FAD) - le PAPS est impliqu dans des ractions de sulfatation des glycannes et des lipides Les seconds messagers Un second messager est une molcule qui assure le relais intracellulaire d'un signal extracellulaire. L'AMPc fut identifi comme le second messager universel et dans quelques cas, ce ft le GMPc. Il est produit sur la face intracellulaire de la membrane plasmique aprs fixation externe d'une molcule signal.

3.. L es aciid es n u clliiq u es 3 L es ac d es n u c q u es


Les acides nucliques sont des enchanements de nuclosides 5'-phosphates dont l'assemblage est ralis par une liaison phosphodiester. Les deux types d'acides nucliques sont : - ADN (acide dsoxyribonuclique) compos de : - un ose qui est le 2'-dsoxyribose - la base est soit : adnine ou guanine (purine), soit cytosine ou thymine (pyrimidine) - ARN (acide ribonuclique) compos de : - un ose qui est le ribose - la base est soit : adnine ou guanine (purine), soit cytosine ou uracile (pyrimidine) Remarquons que l'ADN peut contenir des bases mthyles et que l'ARN contient de nombreuses diffrentes bases modifies (voir le paragraphe des bases). La diffrence entre les 2 oses a des consquences trs importantes entre ces deux polymres : la prsence de l'hydroxyle en 2' du ribose interdit tout appariement pour former des duplex de chanes.

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3.1.

La structure primaire des polymres

3.1.1. La taille des polymres nucliques

La taille des acides nucliques est exprime en trois units selon l'usage : - la longueur - la masse molculaire en Dalton (Da) - le nombre de nuclotides (ou bases), not b, pour les molcules simple brin et le nombre de paires de base, not pb, pour les molcules double brin. Pour les ARN, le nombre de nuclotides varie de plusieurs dizaines plusieurs milliers : - ARN ribosoamux : de 100 5000 b - ARN de transfert : de 75 90 b - ARN messagers : fonction du gne transcrit Pour les ADN, le nombre de nuclotides varie de 5000 plus de 100 millions de pb.

3.1.2. La liaison phosphodiester

Les acides nucliques sont des enchanements de nuclosides 5'-phosphate dont l'assemblage est ralis par une liaison phosphodiester :
-

O O
-

5'

O Base O condensation par liaison ester


-

P O

CH2 O
3'

5'

P O

CH2 O
3'

Base
5'

+
O
-

OH O P O
-

OH
5'

O Base O
-

OH O CH2 O
3' 5'

3'

CH2 O
3'

P O

Base

pont phosphodiester OH

OH

OH

OH

La chane est vectorise : elle est crite de gauche droite et dans le sens, extrmit phosphate 5' 3' . C'est le sens dans lequel les squences d'acides nucliques sont utilises comme molcules informationnelles (transcription, traduction). L'usage a consacr des reprsentations simplifies d'un polymre l'aide d'abrviations ou sigles suivants :
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Base OH P OH ou P

Base

Base ou P OH P

Base

ribonuclique Exemple d'une polymre de type ADN :

dsoxyribonuclique

s'crit aussi : C p5'dA3'p5'dT3'p5'dG3'p5'dC3'p5'dT3'p5'dC ou encore pdApdTpdGpdCpdTpdC


5' 3'

ou encore 5 ' ATGCTC 3 '

3.2.

Les diffrents groupes ionisables des acides nucliques

Les diffrents groupes ionisables des acides nucliques sont de trois types et d'un type particulier correspondant aux formes tautomres de l'quilibre forme cto et forme nol (lactame et lactime). La nature de l'ose n'a aucun effet pour ces phnomnes d'ionisation.

3.2.1. Les groupes phosphates

- le groupe phosphomonoester possde deux fonctions acides dont les valeurs des pK sont respectivement 1,5 2 et 7,2 7,5.

O O ose O P OH ose OH ose pK 1,7 ou O P OH O O P O


-

pK 7,3 ose

O O P O
-

+ H OH

O + H

- le groupe phosphodiester, participant aux ponts phosphodiester, possde une seule fonction acide de pK gal 1,5 2
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O ose O P OH O ose

pK 1,7 ose

O O P O
-

ose

+ H

Chacun de ces groupes possde donc au pH physiologique (6,5) un seul groupement ionis : l'acide nuclique portera un nombre de charges ngatives (contribution des phosphates) gal au nombre de nuclotides.

3.2.2. Les azotes des cycles des bases pyrimidiques et puriques

Lorsque les bases puriques ou pyrimidiques sont lies un ose (liaison N-osidique), la protonation d'un azote du cycle correspond au cas plus simple des bases de type pyrrole ou pyridine. Il faut noter que la conjugaison des liaisons du doublet libre de l'azote avec les doublets des lectrons aboutit la rgle simple suivante : - la protonation d'un azote d'un cycle empche la protonation des autres azotes. - l'uracile et la thymine n'ont aucun azote proton.

3.2.3. Les groupes amino lis aux cycles des bases

Les groupements amino lis au cycle peuvent tre protons et ce plus facilement qu'un azote du cycle. Le doublet de l'azote de ce groupement amino peut se conjuguer partiellement avec les lectrons du cycle, empchant la protonation des autres azotes.

3.2.4. Les formes tautomres (lactame et lactime)

Nous avons vu (page 5) que la prsence d'un groupement cto li un cycle entranait l'existence de formes tautomres par le passage de la forme cto en forme nol. Cette dernire fonction peut librer un proton pH basique (acide faible de pK d'environ 9,2 9,5), entranant l'apparition d'une charge ngative.

3.2.5. En guise de conclusion

Les bases puriques et pyrimidiques, lies un ose (liaison N-osidique), portent des groupes ionisables qui peuvent librer des protons :

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Cytosine + NH3 N ou O N O N + HN

NH2

NH2 N

NH N

pK 4,2 O

pK 9,3

O N

Uracile ou thymine O H HN O N pK 9,3 O

- N
O N

Adnine + NH 3 N N N N H

NH 2 N N N N

pK 3,5

Guanine

O H HN + H 3N N N N

O HN N N N

N N

N N

pK 2,1 H 2N

pK 9,3 H 2N

A un pH voisin du pH physiologique (6,5), les bases puriques ou pyrimidiques ne portent aucune charge.

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Les acides nucliques dans une solution dont le pH est voisin du pH physiologique sont des polymres chargs ngativement, charges dont la contribution est uniquement due aux groupements phosphates.

3.3.

L'hydrolyse des acides nucliques

La dgradation d'un polynuclotide peut tre chimique ou enzymatique, elle concerne : - l'enchanement phosphodiester - les units nuclotidiques : composants et liaison osidique

3.3.1. L'hydrolyse chimique

Le traitement acide affecte de la mme faon les ADN et les ARN - la dgradation du squelette phosphodiester est obtenue dans des conditions drastiques (acide concentr et chauffage) auxquelles ne rsistent pas les autres liaisons, cette dgradation conduit la libration d'un mlange de phosphates, oses et bases. - dans des conditions douces (pH 4), seules les liaisons N-osidique avec les purines sont hydrolyses. Les ARN et les ADN ragissent diffremment l'hydrolyse alcaline - les ADN rsistent aux pH basiques : par exemple, pH 13 et 37C on a une dizaine de coupures de ponts phosphodiester par million de ponts - les ARN sont totalement hydrolyss en leurs ribonuclotides en quelques minutes 37C et pH 11. C'est la prsence de l'hydroxyle libre en 2' qui permet cette hydrolyse qui donne un intermdiaire cyclique 2':3' P, aboutissant des nuclotides 2' P ou 3' P.

3.3.2. L'hydrolyse enzymatique

Les enzymes qui catalysent l'hydrolyse de la liaison phosphodiester des acides nucliques, prsents dans la plupart de toutes les cellules, sont des phosphodiestrases spcifiques appeles nuclases. Des endonuclases de trs haute spcificit sont prsentes dans les bactries, ce sont des dsoxyribonuclases dsignes sous le nom d'enzyme de restriction. Les nuclases Elles prsentent des niveaux de spcificit et sont classes par : - leur mode d'attaque de la chane : extrmit (exo) ou intrieur (endo) - leurs spcificit vis--vis du substrat : ADN, ARN ou les deux et de la structure, simple ou double brin
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- leur spcificit de reconnaissance des sites : bases ou leur enchanement - le type de coupure de la liaison phosphodiester
5' 3'

Base (OH) P
3'

Base (OH) P
5'

Diffrents types de coupure d'un pont phosphodiester

Exemple de quelques nuclases avec leurs spcificits : nuclases phosphodiestrase de venin phosphosdiestrase de la rate exonuclase I d'E.Coli exonuclase III d'E.Coli endonuclase S1 d'Aspergillus ARNase T1 d'Aspergillus ARNase de pancras ADNase II de thymus substrats exonuclases ARN, ADN (s) ARN, ADN (s) ADN (s) ADN (d) endonuclases ARN, ADN (s, d) ARN (s) ARN (s) ADN (s) 3' 5' 5' 5' alatoire -G # N-Pyr # N-dPyr # dPur3' 5' 3' 3' extrmit 3' extrmit 5' extrmit 3' extrmit 3' type coupure spcificit coupure

s : simple brin, d : double brin N : reprsente n'importe lequel des nuclotides Les enzymes de restriction Chaque espce de bactries produit une collection d'endo-dsoxyribonuclases, dont le site est spcifique d'une squence de 4 10 nuclotides, qui leur permet de s'opposer l'infection de certains virus en hydrolysant leur ADN, sans hydrolyser leur propre ADN protg par le biais d'une mthylation des squences partielles spcifiques. On parle de restriction virale et on a appel ces nuclases des enzymes de restriction. Ces dsoxyribonuclases hydrolysent un pont phosphodiester de chacune des 2 chanes d'acide dsoxyribonuclique dont la structure est un double brin. L'ADN double brin est form de deux chanes complmentaires de sens oppos (voir plus loin). La plupart du temps la squence nuclotidique reconnue (lue dans le mme sens) est identique sur les deux brins, on dit que le site est palindromique :
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5'-------ACGCGT--------3' palindromique 3'-------TGCGCA--------5' Voici deux exemples d'enzymes de restriction :

ADN

double

brin

site

5' 3'

G AATTC CTTAA G

3' 5'

5' 3' 5 'AATTC 3 'G

G 3' CTTAA 5 '


3' 5'

Hydrolyse par l'enzyme de restriction : EcoRI site : GAATTC (coupure dbordante)

5' 3'

GG CC CC GG

3' 5'

5' 3' 5 ' CC 3 ' GG

GG 3 ' CC 5 '
3' 5'

Hydrolyse par l'enzyme de restriction : HaeIII site : GGCC (coupure franche) Ces enzymes sont un outil de choix pour toutes les techniques de biologie molculaire d'autant que le nombre d'enzymes de restriction purifis est relativement grand : environ 500.

3.4.

Structure spatiale des acides dsoxyribonucliques

3.4.1. Quelques rsultats exprimentaux sur les acides dsoxyribonucliques

La composition en bases Les molcules d'ADN prsentent la caractristique suivante : - quelle que soit l'origine de l'ADN, le nombre de purines est toujours gal au nombre de pyrimidines : [Pur] = [Pyr] ou encore [A] + [G] = [T] + [C] - de plus, les fractions molaires des bases sont telles que : A = T et G = C Cette caractristique est dsigne sous le nom de rgle de Chargaff qu'il observa en 1940. Les bases A et T sont dites complmentaires, il en est de mme pour G et C. Bien sr les proportions ([A] + [T]) et ([G] + [C]) ne sont pas gales et varient de 35 75% selon l'ADN tudi.
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Le titrage des groupes basiques Si on titre les bases de l'ADN (charge moyenne de la molcule en fonction du pH) en prsence d'un agent dnaturant, comme l'ure, le pK moyen obtenu est de l'ordre de 4,5. Si on titre les bases de l'ADN dans des conditions non dnaturantes, on trouve un pK moyen augment d'une unit, environ 5,5 L'effet hyperchrome

A x 1,6

ADN dnatur

A 160% refroidissement rapide refroidissement lent ou chauffage

ADN natif

100% 260 Spectre d'absorption d'ADN nm Tm temprature

Courbe de fusion d'ADN

- Le spectre d'absorption de l'ADN natif n'est pas identique celui du mme ADN dnatur par la chaleur (chauffage 100C) ou par l'ure ou encore pH trs alcalin. L'ADN dnatur a une absorption 260 nm plus leve que l'ADN natif, d'un facteur 1,6. Cette proprit est appele l'effet hyperchrome ou hyperchromicit. - L'absorption de l'ADN natif, 260 nm, en fonction de la temprature (courbe de fusion), prsente l'allure d'une sigmode : le point d'inflexion de cette courbe, qui correspond la demi-variation d'absorbance, est la temprature de fusion de la molcule, note Tm. - Lors d'un refroidissement lent, l'absorption suit la courbe de fusion en sens inverse. Lors d'un refroidissement rapide, l'absorption ne suit pas la courbe de fusion en sens inverse mais une autre courbe qui n'aboutit la mme valeur originale de l'absorption, mais une valeur plus leve : c'est le phnomne d'hystrsis. - Il faut noter que la temprature de fusion Tm est dpendante de la force ionique du milieu et qu'elle diminue lorsque cette dernire augmente (dans des milieux o [NaCl] > 1M). - La valeur de la temprature de fusion Tm est d'autant plus leve que le pourcentage de bases G + C est grand : - 65 C pour l'ADN de E. Coli o G+C est gal 50%, - 76 C pour l'ADN de P. aeruginosa o G+C est gal 68%
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La structure rvle par la diffraction aux rayons X L'analyse aux rayons X de cristaux de molcules d'ADN, ralise en 1953 par Watson et Crick, indique une structure ayant la configuration suivante : - une double hlice forme de deux chanes d'ADN dont les paires de bases sont complmentaires - les deux chanes sont antiparallles - les enchanements oses-phosphates forment les squelettes hlicoidaux parallles extrieurs, les plans des oses tant presque perpendiculaires au plan des bases - les plans des bases sont perpendiculaires l'axe de l'hlice et chacune des bases d'une chane est apparie celle de l'autre chane par des liaisons hydrogne, les deux bases tant situes dans un mme plan - les bases apparies sont complmentaires (A / T) et (G / C) et sont l'intrieur du cylindre central de l'hlice.
thymine CH3 H N (dRib) O N H 0,29nm H 2 liaisons hydrogne adnine N N O 0,28nm H H N N H N C 1' (dRib) H C 1' (dRib) N N cytosine H H N H H 0,28nm O

N 0,29nm N O H H N N N 0,28nm C 1' H (dRib) 3 liaisons hydrogne guanine

Appariements pyrimidines-purines selon Watson et Crick

3.4.2. Les doubles hlices

Une double hlice est forme de deux chanes antiparallles d'ADN qui s'enroulent soit droite (sens du tire bouchon ou sens des aiguilles d'une montre) soit gauche. 5' A G T 3' T C 3'

C A G 5'

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Cette double hlice est caractrise par : - son axe principal, - le sens d'enroulement, - le pas.
5'

ose base ose base o axe de l'hlice

O P O

5' 3'

Vue dans l'axe de l'hlice d'un des brins d'ADN

Vue perpendiculaire l'axe de l'hlice d'un des brins d'ADN

Du fait de la position de l'axe au centre de chaque paire de base complmentaire et de leur attachement dissymtrique sur le squelette ose-phosphate, deux sillons d'ouverture et de profondeurs diffrentes vont alterner sur les flancs de la double hlice :

grand sillon

plan de paire de bases complmentaires

ose

36 petit sillon

Vue dans l'axe de la double hlice : reprsentation d'un enchanement

La stabilit de la structure secondaire de ces diffrentes double hlices d'ADN est essentiellement due aux : - liaisons hydrogne entre les bases complmentaires de chacun des brins - interactions hydrophobes et lectrostatiques des bases successives empiles dans la structure de l'hlice, dont la distance des plans varie de 0,26 0,37 nm.
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Cette stabilit n'entrane pas une rigidit de la molcule d'ADN et celle-ci peut adopter des conformations diffrentes selon les rgions. Plusieurs conformations correspondant des sens d'enroulement diffrents ou des pas diffrents ont t trouves, les principales tant :

Conformation B : c'est le modle de Watson et Crick, le plus stable dans les conditions physiologiques. - enroulement droit - pas : 3,4 nm - 10 pb par tour - rotation du plan des bases : 36 Conformation A : - enroulement droit - pas : 2,8 nm - 11 pb par tour - rotation du plan des bases : 33 Conformation Z : - enroulement gauche - pas : 4,5 nm - 12 pb par tour - rotation du plan des bases : - 30 Modle de Watson et Crick La stabilit de la structure secondaire de ces diffrentes double hlices d'ADN est essentiellement due aux : - liaisons hydrogne entre les bases complmentaires de chacun des brins - interactions hydrophobes et lectrostatiques des bases successives empiles dans la structure de l'hlice, dont la distance des plans varie de 0,26 0,37 nm. Cette stabilit n'entrane pas un rigidit de la molcule d'ADN et celle-ci peut adopter des conformations diffrentes pour diffrentes rgions. Conformation B C'est celle du modle dcrit par Watson et Crick et que l'on trouve comme la forme principale native dans les conditions physiologiques.
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C'est une hlice droite de pas gal 3,4 nm (10 pb par tour). - L'inclinaison des bases par rapport leur axe de rotation perpendiculaire l'axe principal de l'hlice est de 1. - La distance entre deux plans de bases successifs est de 0,34 nm. Conformation A Lorsque la teneur en eau d'une solution contenant une molcule d'ADN est diminue, par exemple lors de la cristallisation, la molcule change de conformation et adopte une conformation note A. Ce changement est rversible. La conformation A a les spcificits suivantes : - hlice droite (idem conformation B) - hlice plus compacte - pas de 2,8 nm (11 pb par tour) - distance entre les plans de bases successives de 0,26 nm - les plans des bases sont tourns de 180 par rapport la conformation B - l'inclinaison des bases par rapport leur axe de rotation perpendiculaire l'axe principal de l'hlice est de 20. Cette conformation est trouve in vivo dans : - l'ADN de certaines spores bactriennes, formes en rponse la dessication du milieu - les hybrides ADN-ARN qui se forment transitoirement l'amorce de la rplication, et pendant la transcription. Conformation Z Cette conformation est prsente dans des rgions courtes de l'ADN dans une conformation gnrale de type B (native). Ces rgions spcifiques sont en gnral des segments de squence alterne Pur/Pyr (G-C-G-C). La conformation Z a les spcificits suivantes : - hlice gauche - pas de 4,5 nm (12 pb par tour) : la molcule est plus tire dans cette conformation - distance entre les plans de bases successives de 0,37 nm - l'inclinaison des bases par rapport leur axe de rotation perpendiculaire l'axe principal de l'hlice est de 9. Cette conformation est trouve in vivo pour des segments de la molcule d'ADN, avec des enchanements alterns Pur/Pyr dont les bases sont souvent mthyles. Celle-ci aurait un rle dans l'expression des gnes. Ces diffrentes conformations dcrivent la structure secondaire des molcules d'ADN double brin. Ces conformations sont trs stables, mais possdent une flexibilit assez grande qui peut dfinir des structures tertiaires (structure dans l'espace d'une double hlice) diffrentes :
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celles-ci vous seront dcrites dans des cours ultrieurs et vous verrez, par exemple, les phnomnes de surenroulement.

3.4.3. Retour sur les quelques rsultats exprimentaux sur l'ADN natif

La structure en double hlice, les liaisons hydrogne entre les bases complmentaires et les interactions hydrophobes entre bases successives peuvent clairer les observations du paragraphe 3.4.1 (Quelques rsultats exprimentaux sur les acides dsoxyribonucliques) : - composition en bases : vident - titrage : l'engagement de l'hydrogne d'un azote dans une liaison hydrogne avec la base complmentaire fait apparatre un doublet lectronique sur cet hydrogne qui par dlocalisation renforcera la liaison avec un hydrogne supplmentaire. L'ion H+ sera plus difficilement libr et le pKa de ce groupe augmentera. - effet hyperchrome : l'arrangement spatial des bases successives dans la double hlice d'un brin d'ADN, empilement des plans avec une distance pouvant varier de 0,24 0,37nm, permet des interactions hydrophobes entre bases successives (contact de Van der Waals) qui ont des rpercussions sur le nuage lectronique des cycles et donc sur leurs proprits spectrales. Ce phnomne diminue l'absorption des bases dans l'ultraviolet : effet hyperchrome. Cet effet peut tre enlev en dnaturant la molcule : destruction de la double hlice qui supprime les interactions entre bases qui retrouvent leurs proprits spectrales originales. La dnaturation, qui libre chacun des deux brins d'ADN, est obtenue par destruction des liaisons hydrognes soit : - par addition d'ure en concentration > 6M - par augmentation de la temprature - phnomne d'hystrsis : aprs dnaturation par chauffage, les deux brins d'ADN sont libres. Un refroidissement lent permet un rappariement des deux brins d'ADN qui aboutit la double hlice originale. Un refroidissement rapide ne permet pas un rappariement total des deux brins, seules certaines rgions complmentaires des deux brins reforment des doubles hlices partielles. L'absorption de la molcule aura une valeur intermdiaire entre celle de la molcule native et de la molcule dnature : phnomne d'hystrsis. - temprature de fusion : la temprature de fusion de molcule d'ADN en double hlice est dpendante de la composition du pourcentage de bases G + C. Elle est d'autant plus leve que celui-ci est lev : ceci peut s'expliquer par le fait que les appariements de ces bases fait intervenir trois liaisons hydrogne alors que les appariements A-T en font intervenir seulement deux. Une prsence importante d'ions dans la solution (force ionique leve : NaCl 1M) perturbera les liaisons hydrogne et provoquera une diminution de la temprature de fusion.

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3.4.4. Quelques exemples de molcules d'ADN

Les molcules d'ADN des organismes vivants sont toutes des molcules double brin de rares exceptions prs, comme par exemple l'ADN du phage X174. Taille de gnome en nombre de bases Organisme phage X174 E. Coli Drosophile Drosophile / Chr 1 Homme Homme / Chr9 Nb bases (kb) 5,4 4000 ~ 137 000 27 000 ~ 3 000 000 145 000 simple brin double brin double brin double brin double brin double brin circulaire circulaire linaire linaire linaire linaire 23 4 Nb chromosomes

Les molcules d'ADN peuvent tre circulaires par formation de liaison ester 3'-5' de ses extrmits : certains virus ou bactries, etc.. L'ADN des organites (chloroplastes ou mitochondries) sont circulaires l'exception de gnomes mitochondriaux de quelques algues et protozoaires.
3.4.5. Des proprits physico-chimiques souvent utilises

La structure de la double hlice donne une nature fibreuse la molcule d'ADN dont les proprits sont exploites dans de nombreuses expriences de biologie molculaire : - les alcools, et en particulier l'thanol, prcipitent les molcules d'ADN sous forme d'agglomrat en longues fibres - la densit des molcules d'ADN est telle qu'on peut les sparer par ultracentrifugation dans des gradients de densit (chlorure de csium) - la charge de ces molcules pH physiologique est ngative et directement proportionnelle leur longueur (nb de nuclotides). Cette proprit est utilise pour les sparer par lectrophorse. - clonage et squenage (structure primaire) de l'ADN qui exploitent la complmentarit des bases

3.4.6. Pour la suite

Dans ce module, nous nous sommes intresss uniquement aux proprits essentiellement physico-chimiques de l'ADN. Dans des cours ultrieurs, seront dveloppes les proprits biologiques de ces molcules : - molcule support d'information : code gntique, rgions spcifiques de rgulation, recombinaison gntique - interactions ADN-protines et rgulation de l'expression gnique
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3.5.

Structure spatiale des acides ribonucliques

L'ARN deux brins apparis est l'exception de quelques rares virus. Les diffrents types d'ARN sont des molcules formes d'un seul brin et quelquefois des molcules faisant partie d'hybrides ARN-ADN. Les principaux types de molcules d'ARN prsentes dans les cellules d'organismes vivants sont : - les ARN gnomiques : virus (poliovirus, virus de la grippe, etc..), rtrovirus (oncognes, sida, herps, etc..) - les ARN ribosomiques (ARNr) [80% ARN totaux] : les ribosomes sont des complexes nuclo-protique contenant 3 types d'ARNr, qui sont le sige de la biosynthse des protines (traduction) - les ARN de transfert (ARNt) [15% ARN totaux] : interviennent dans l'longation de la chane polypeptidique, lors de la traduction - les ARN messagers (ARNm) [5% ARN totaux] : support de l'information transcrite partir de l'ADN, qui interviennent dans la traduction - les ARN htrognes nuclaires (ARNhn) [< 2% ARN totaux] : sont les prcurseurs des ARNm - et les petits ARN stables [< 2% ARN totaux], soit cytosoliques (ARNsc), soit nuclaires (ARNsn) qui existent sous forme de ribonucloprotines appeles snRNP (small nuclear ribonucleoproteins). L'usage a consacr de caractriser les ARNr, ARNt par leurs proprits de sdimentation qui sont lies leur masse volumique, y compris l'eau d'hydratation, et on parle par exemple d'ARN 23S o est le Svedberg (1 S = 10-13 seconde). Type d'ARN ARNm ARNr ARNt ARNhn ARNsc ARNsn Nb nuclotides variable 120 - 5000 75 - 90 variable 90 - 330 58 - 220 (5S, 16S, 23S)* (5,8S, 18S, 28S)** 4S coeff sdimentation

* : procaryotes - ** : eucaryotes
3.5.1. Les hlices d'ARN

Sous l'action des forces d'empilement (interaction de Van der Waals) entre bases successives, le squelette d'une molcule d'ARN tend former spontanment une hlice simple droite irrgulire.
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Les conformations stabilisantes sont des rgions en double hlice que l'on trouve, en dehors de deux brins d'ARN ou hydrides ARN-ADN, dans des rgions o deux segments distants du mme brin d'ARN prsentent une complmentarit suffisante pour un nombre d'appariements suprieur ou gal 3 (appariement A/U par deux liaisons hydrogne et G/C par trois liaisons hydrogne). Ce type de conformation implique des structures secondaires de type pingle cheveux.

3.5.2. Les motifs lmentaires de structure secondaire d'ARN

pingle cheveux boucle 4 et 7 bases o o renflement o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o extrmit pendante o o o o o o o o o o o o boucle interne o boucle multiple o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o o tige o o o o o o o o boucle o o o o o o o o o liaisons hydrogne

Ces diffrents motifs de structure secondaire ont t trouvs dans les ARN ribosomiques et les ARN de transfert : - les tiges sont des hlices dont la conformation est proche de celle de la conformation A de l'ADN : les hydroxyles en 2' des riboses s'opposant un enroulement de type B.
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- les boucles : celles participant un motif d'pingle cheveux stabilisent cette structure, en particulier les ttraboucles de squence UNCG (N reprsentant l'une des quatre bases).

3.5.3. Pour la suite

Dans des cours ultrieurs, seront dveloppes les proprits biologiques et les structures des molcules d'ARN : - molcule support d'information : transcription de l'ADN en ARN et traduction des ARN messagers - interactions ARN-protines : biosynthse des protines avec en particulier la structure des ARN ribosomiques et des ARN de transfert (feuille de trfle).

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