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Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudio de la Salud Laboratorio Central de Referencia en Salud Pblica. Panam.

Diagnstico de Leptospirosis mediante la Prueba de Microaglutinacin (MAT) en muestras de pacientes con Sndrome Febril. Enero Junio 2009

Preparado por: Licda. Amarielsy Batista I. T.M. Licdo. Juan C. Domnguez G T.M.

Asesora: Dra. Markela de Quinzada, PhD.

Consultores: Lic. Carlos Justo. T.M. Licda. Dianik Moreno. T.M.

Diciembre, 2009

INDICE GENERAL
INTRODUCCION PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA OBJETIVOS CAPITULO I 1.1. Historia 1.2. Generalidades de la Leptospirosis 1.3. Etiologa de la Leptospirosis 1.4. Reservorio de la Leptospira 1.5. Epidemiologa de la Leptospirosis 1.6. Fisiopatologa de la Leptospirosis 1.7. Aspectos clnicos de la Leptospirosis 1.7.1. Leptospirosis Anictrica 1.7.2. Leptospirosis Ictrica 1.8. Vas de transmisin de la Leptospirosis 1.9. Diagnstico diferencial 1.10. Diagnstico de Leptospirosis 1.10.1. Diagnstico de Laboratorio Tcnicas Indirectas a. Naturaleza de la respuesta de anticuerpos b. Tcnica de Microaglutinacin (MAT) c. Tcnica Inmunoenzimtica tipo ELISA d. Tcnica de Inmunofluorescencia e. Prueba de Tamizaje Tcnicas Directas

a. Observacin al Microscopio de Campo oscuro. b. Cultivo de Leptospira c. Tinciones d. Tcnica de Reaccin en Cadena de la Polimerasa 1.11. Tratamiento CAPITULO II 2.1. METODOLOGIA 2.1.1. rea de estudio 2.1.2. Tipo de estudio 2.1.3. Universo 2.1.4. Muestra 2.1.5. Variable 2.1.6. Recoleccin de datos 2.1.7. Materiales 2.1.8. Reactivos 2.2. PREPARACION DE REACTIVOS Y MEDIOS a. Soluciones tampn y medios para aislamientos de Leptospira b. Preparacin del cultivo de Leptospira para la prueba de MAT c. Preparacin de antgenos para la prueba de MAT PRUEBA DE MAT d. Fase 1: Tamizaje preliminar e. Fase 2: Titulacin de muestras positivas por MAT f. Lectura g. Interpretacin CAPITULO III

3.1. RESULTADOS 3.2. DISCUSION DE LOS RESULTADOS CONCLUSIONES RECOMENDACONES BIBLIOGRAFIA ANEXOS

INTRODUCCION

En Amrica Central cmo en Amrica de Sur, la Leptospirosis est asociada con el aumento de la pobreza, modificaciones en las urbanizaciones (asentamientos, invasiones de tierras, viviendas precarias en terrenos

inundables) y con las condiciones climticas y la falta de agua potable. El propsito de este estudio es dar a conocer la incidencia que ha tenido la Leptospirosis en la poblacin panamea, as como tambin conocer todos aquellos factores asociados a la presencia de casos positivos en nuestro pas. En este estudio se utilizar una tcnica indirecta, como es la Tcnica de Microaglutinacin (MAT), para el diagnstico de la seropositividad a la Leptospirosis en muestras de sueros de pacientes que han presentado los primeros sntomas de la infeccin. El MAT es el mtodo serolgico de referencia en donde el suero de los pacientes reaccionan con antgenos vivos de Leptospiras de 7 a 10 das de crecimiento en medio lquido de EMJH; despus de incubados, se observa la aglutinacin del suero con cada uno de los distintos serovares al microscopio de campo oscuro Leptospira. El diagnstico de Leptospirosis debe ser investigado en todo paciente con fiebre y mialgias, toda vez que las manifestaciones clnicas son para estudiar la presencia de anticuerpos contra la

superponibles con otras enfermedades. La mayora de los errores de diagnstico puede evitarse con la realizacin de una historia y examen fsico detallados.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

En los ltimos aos, la Leptospirosis ha reemergido como una importante enfermedad infecciosa de distribucin universal, en la que se han reportado varias especies de Leptospira entre patgenas y saprfitas en los ltimos aos.

Las condiciones ambientales y los efectos del cambio climtico prevalentes en la mayora de pases tropicales y subtropicales de Amrica favorecen la transmisin. En zonas de alta endemicidad de Amrica Latina, el riesgo de contraer Leptospirosis es de cuatro de cada diez personas.

La Leptospira despus de penetrar la piel o las mucosas erosionada o con abrasiones hace una bacteremia que inicialmente alcanza todas las partes del cuerpo, incluyendo el lquido cefalorraqudeo (LCR) y los ojos, y genera la produccin de anticuerpos aglutinantes y el fenmeno de opsonizacin. Si esta respuesta no es suficiente para detener su progreso, la Leptospira avanza en los tejidos. All se multiplica en forma acelerada.

Por esta razn es importante la realizacin de un diagnstico para tratar al paciente de forma oportuna y eficaz, ya que muchas veces la sintomatologa cursa igual a otras enfermedades.

OBJETIVOS Objetivo General:

Determinar la seropositividad de la infeccin por Leptospira mediante la prueba de Microaglutinacin (MAT) en muestras de sueros de pacientes con Sndrome febril enviadas al Laboratorio Central de Referencia en Salud Pblica del Instituto Conmemorativo Gorgas de Estudio de la Salud

Objetivos Especficos:

Evaluar la seropositividad a la Leptospira en Panam.

Identificar los diferentes serotipos existentes de Leptospira a que han estado expuestos los pacientes con reactividad positiva.

Comparar la relacin que existe entre las actividades ocupacionales de los pacientes y la reactividad a la Leptospira.

Marco Terico

LEPTOSPIROSIS: ZOONOSIS DE IMPORTANCIA MUNDIAL

1.1. HISTORIA

Probablemente Lacereaux (Leons de la piti) hizo en 1802, la primera descripcin clnica de Leptospirosis; mientras que en 1883, Landarouzi describi un caso tpico con ictericia y hemorragias

denominndolo tifus heptico. Tres aos despus, en 1886, Mathieu en Francia y Adolf Weil (Farrar ,1995) en Alemania describen cuadros agudos febriles con ictericia y

manifestaciones de agresin renal. nombre de Enfermedad de Weil.

Goldschimidt en 1887,

propuso el

Es en 1914 que los japoneses Inada e Ido

(1916)

encuentran una

espiroqueta en el hgado de cobayos infectados con sangre de enfermos mineros febriles. En el cobayo aparecieron fenmenos hemorrgicos y es por esta razn, que los investigadores japoneses llamaron al agente encontrado Spirochaeta icterohaemorrhagiae. El mismo equipo japons encontr la relacin de este microorganismo con las ratas de desage y al estudiarlas encontraron que el 40% de esas ratas eran portadoras de la Spirochaeta icterohaemorrhagiae. En 1917 y 1918, Noguchi estudi varias muestras aisladas en diferentes lugares y propuso la creacin del genero Leptospira. Y en 1922, Eodsworth inform el primer caso en seres humanos adecuadamente documentado con aislamiento del agente. Desde entonces, con el correr de las investigaciones, se han venido identificando nuevos serotipos de

Leptospiras patgenos para animales y el hombre, que comprometen no slo la salud sino la economa de las regiones afectadas.

1.2. GENERALIDADES DE LA LEPTOSPIROSIS La Leptospirosis es una enfermedad febril aguda producida por una bacteria del Orden: Spirochaetales, Familia: Treponemataceae, Genero: Leptospira, del cual existen varios tipos. Se trata de una zoonosis, es decir, una enfermedad propia de los animales que el hombre contrae en forma accidental. La bacteria responsable para esta patologa se encuentra en el sistema urinario (riones) de una gran cantidad de animales, como: perros, cerdos, vacas, caballos, ratas, conejos, entre otros; y se transmite a los humanos al estar en contacto con agua o alimentos contaminados directa o indirectamente con la orina de estos animales infectados. Es importante mencionar que la transmisin de la Leptospirosis es favorecida por un ambiente permanentemente hmedo. Tambin es posible que infecte al

hombre al penetrar pequeas heridas en la piel o por las conjuntivas. El padecimiento se ha presentado posterior a baarse en aguas contaminadas
(Vlez, 2006)

La enfermedad es un peligro profesional entre trabajadores de rastros, granjeros, trabajadores de alcantarillas, plantadores de arroz y otros.

Leptospirosis es una enfermedad que ocurre espordicamente y que puede presentarse como epidemia, es decir, con mayor nmero de casos en un momento dado, y con relacin importante con periodos de lluvias e inundaciones.

1.3. ETIOLOGIA DE LA LEPTOSPIROSIS La enfermedad es producida por muchos serotipos de espiroquetas del gnero Leptospira. Las Leptospiras se clasifican entre las bacterias de la siguiente manera:

ORDEN: Spirochaetales FAMILIA: Treponemataceae GENERO: Leptospira.

Las Leptospiras son microorganismos helicoidales de 5-18 m de longitud y 0.1-0.2 m de ancho, que estn constituidos por un cuerpo citoplasmtico y un axstilo que se disponen en forma espiral. (Correa, 1987) Una membrana envolvente recubre ambas estructuras. El axstilo consiste en dos filamentos axiales que se insertan en la extremidad del cuerpo citoplasmtico, por medio de botones terminales. Esta

organela es la encargada de la motilidad de la Leptospira.


(Correa, 1987)

Tiene

un

activo

movimiento de rotacin pero no se le conocen flagelos.


(Jawetz, 1983)

. La pared es similar a la de

otros Gram negativos, con una fina capa de peptidoglican y una membrana externa con lipopolisacrido de poca actividad endotxica. Las Leptospiras son microorganismos aerobios obligados, oxidasa positivos y catalasa positivos. Para su cultivo necesitan medios enriquecidos con suero de conejo o albmina bovina, como el Stuart, EMJH o Korthoff.

Todas son muy sensibles a la desecacin, al calor y fro excesivo, as como a las variaciones del pH no tolerando el medio cido, el pH ptimo para su multiplicacin es 7,2- 7,4. En el agua salada no sobreviven, al contrario de los largos perodos que pueden permanecer en el agua dulce, principalmente si se encuentra almacenada (hasta 180 das). animales infectados, las Leptospiras
(CENEPI, 1997)

En la leche de

no sobreviven, salvo que sta est

diluida en agua a la razn de 1:20 o ms. (Correa, 1987)

En el fro puede sobrevivir hasta 100 das a 20 C. Es importante mencionar que la pasteurizacin no destruye a las Leptospiras, lo que indica que es necesaria la ebullicin para cumplir con su destruccin. A los diez segundos muere con 100 y solo a los 10 minutos si la temperatura es de C 56 C. La orina cida es letal para las Leptospiras y por eso, es necesario alcalinizarla si se pretende aislarla de la orina de un enfermo. En el medio cido pierde su motilidad tan rpido como en 15 minutos.

Este gnero contiene especies patgenas, para los seres humanos (por ejemplo: L. interrogans) y no patgenos (por ejemplo: L. biflexia). El complejo interrogans, con base en las propiedades antignicas, se subdivide a su vez en varios serotipos. Estos serotipos, por su comportamiento inmunolgico, se han dividido en otros subgrupos. Entre los ms comunes se encuentran: L. icterohaemorrhagiae, L. autumnalis, L. canicola, L. pomona, L.australis, L. grippotyphosa. No hay especificidad de husped ni de cuadro clnico como se crea antes.

Tabla n 1. Clasificacin de la Leptospiras

Especie Leptospiras patgenas

Serogrupo

Serovar

Cepa de referencia

L .interrogans

L .alexanderi L. fainei L. inadai L. kirshneri

L. meyeri

Australis Australis Bataviae Canicola Hebdomadis Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae Icterohaemorrhagiae Pomona Pyrogenes Sejroe Manhao Hurstbridge Lyme Autumnalis Cynopteri Grippotyphosa Pomona Semaranga Ballum Ballum Javanica Sejroe Tarassovi Celledoni Autumnalis Panama Bataviae Mini Ranarum Icterohaemorrhagiae Semaranga

Australis Bratislava Bataviae Canicola Hebdomadis Icterohaemorrhagiae Copenhageni Lai Pomona Pyrogenes Hardjo Manhao 3 Hurstbridge Lyme Bim Cynopteri Grippotyphosa Mozdok Semaranga Ballum Castellonis Javanica Sejroe Tarassovi Celledoni Fortbragg Panama Brasiliensis Georgia Pingchang Hualin Saopaulo

L. borgpetersenii

L. weillii L .noguchi L .santarosai

Ballico Jez Bratislava Van Tienen Hond Utrecht IV Hebdomadis RGA M 20 Lai Pomona Salinem Hardjoprajitno L 60 BUT 6 10 1051 3522 C Moskva V 5621 Velrad Semaranga 173 Mus 127 Castellon 3 Veldrat Bat 46 M 84 Perepicilin Celledoni Fort Bragg CZ 214 K An 776 LT 117 80-412 LT 11-33 Sao Paulo

Genomospecies 1 Genomospecies 4 Genomospecies 5

Leptospiras saprfitas Genomospecies 3 L. biflexa L. wolbachii Holland Semaranga Codice Holland Patoc Codice Was Holland Patoc I CDC

Fuente: Brihuega B. 2008. Leptospirosis: diagnstico y tipificacin de Leptospira. Buenos Aires. Argentina.

1.4. RESERVORIOS DE LA LEPTOSPIRA Animales. La Leptospirosis afecta una gran variedad de animales, tanto salvajes como domsticos, los ms importantes son las ratas y las vacas. Este hecho se explica porque el pH alcalino de la orina de estos animales favorece la sobrevivencia de la Leptospira. Como el hombre tiene una orina relativamente cida para la Leptospira, se considera un mal reservorio.

La excrecin de la Leptospira en la orina de los reservorios puede ocurrir por perodos prolongados y contaminar el ambiente (Gillespie, 1963)

Los tres reservorios ms comunes de la infeccin se encuentran en:

las ratas (Leptospira icterohaemorrhagiae), en los perros (Leptospira canicola) en ganado y cerdos (Leptospira pomona). otras variedades tambin pueden causar la enfermedad, pero la ms grave es la causada por la Leptospira icterohaemorrhagiae.

Agua dulce. Para que ocurra la infeccin en el medio, las Leptospiras necesitan una supervivencia en este medio primero, la cual tiene una vinculacin tremenda con la humedad relativa alta y la temperatura a su punto ptimo en el lugar de aparicin. La temperatura del agua tiene un efecto beneficioso, ya sea baja o alta. Las bajas temperaturas disminuyen la multiplicacin de los microorganismos, pero el tiempo de supervivencia aumenta y las altas temperaturas favorecen la multiplicacin, pero con menos tiempo de supervivencia. Esto permite que las Leptospiras puedan sobrevivir

y mantener sus capacidades infectantes en el agua durante 22 das y en el barro 5-6 das.
(lvarez, 2007)

El agua contaminada con orina de animales

infectados, es el vehculo ms comn de transmisin de este organismo al ser humano, y es una fuente importante de epidemias en nadadores y campesinos. (Kaufmann, 1965-1974)

Las aguas estancadas con contaminacin alta son desfavorables para que sobreviva la Leptospira.
(Nogushi, 1918)

Bajo condiciones favorables, el

microorganismo puede sobrevivir en el agua hasta 180 das. (Okazaki, 1975)

El suelo. Es tambin un vehculo importante de transmisin. Algunos trabajos han demostrado que el microorganismo sobrevive hasta 15 das en suelos con orina. (Nogushi, 1918)

Figura n 1. Fuente: Leptospirosis. Mdulos Tcnicos. Serie Documentos Monogrficos N Oficina General de Epidemiologa. Instituto Nacional de 2. Salud. Lima 2000

1.5. EPIDEMIOLOGIA DE LA LEPTOSPIROSIS

La mayora de los afectados son adultos jvenes entre 20-40 aos, con ms frecuencia en hombres. La mayor fuente de infeccin para las personas la constituye la exposicin directa a la orina de animales infectados o el contacto con agua y/o suelo contaminados con tales orinas, ya sea a travs de actividades ocupacionales o recreativas (INTA, 2005)

Por lo general, el hombre es un husped terminal, lo que significa que la transmisin de persona a persona es sumamente rara. La poblacin con riesgo de enfermar comprende la que habita zonas endmicas de los pases tropicales subdesarrollados. La exposicin ocupacional (veterinarios,

criadores de animales, agricultores, etc.) y la exposicin recreacional (excursionistas, exploradores, etc.) hacen ms probable la infeccin. (INTA, 2005)

Es una enfermedad ms frecuente en la poblacin rural que en la urbana. Las condiciones ambientales prevalentes en la mayora de pases tropicales y subtropicales de Amrica (lluvias abundantes, desborde de aguas residuales suelos no la durante cidos, las altas

inundaciones,

temperaturas) favorecen
(INTA, 2005)

transmisin.

Frente a la notificacin de un caso sospechoso, se debe: Consideracin del sndrome clnico presentado por el paciente, prestando especial atencin a la evolucin del mismo en el tiempo. Bsqueda de exposicin a factores de riesgo para la adquisicin de la enfermedad. La investigacin del terreno que aproxima al conocimiento de la probable fuente de infeccin y al mecanismo de transmisin actuante. As mismo, permite verificar las condiciones del ecosistema (estados del suelo,

presencia de acmulos de agua dulce, proliferacin de roedores, etc.). La investigacin epidemiolgica debe aportar como conclusin la existencia o inexistencia de factores epidemiolgicos de riesgo para la adquisicin de la enfermedad.

En Panam es poco lo que se puede conocer acerca de la enfermedad, ya que es a inicio del ao 2000 que se vienen a reunir datos por parte del LCRSP/ICGES acerca de casos positivos de la enfermedad. Estos datos no muestran el 100% de casos positivos a nivel nacional, debido a que la enfermedad tiende a confundirse con otras enfermedades (dengue, malaria, hepatitis, entre otras) o no se tena conocimiento de esta enfermedad por parte de los mdico, por lo que muchas veces se pasaba por alto la Leptospirosis, y no se enviaba muestras para estudios o registros de casos sospechosos al LCRSP.

Casos de Leptospira Notificados por ao 2000-2008


Preliminar
35 30 25 20 15 10 5 0 2000 2001 2002 2003 2004 Ao
Fuente: VIGEPI-MINSA-LCRSP/ICGES, 2008

Numero de casos

2005

2006

2007

2008

1.6. FISIOPATOLOGIA DE LA LEPTOSPIROSIS

La Leptospira penetra a travs de mucosas o de piel con lesiones y/o abrasiones. Entra a la sangre y rpidamente se distribuye por todo el organismo, incluyendo el lquido cefalorraqudeo. Las caractersticas morfolgicas de la Leptospira le confieren gran movilidad y la presencia de hialuronidasa, son los mecanismos que facilitan el ingreso a diferentes rganos. (INTA, 2005)
(1968)

Brito

colaboradores,

utilizando

tcnicas

de

inmunoelectromicroscopia, confirman la posible participacin de antgenos (Leptospira) en el proceso de lesin de la clula de hospedero, que se inicia por la interaccin de la bacteria con protenas de la superficie de la membrana celular, culminando con la penetracin y posterior agresin celular. La participacin directa del agente infeccioso parece, por lo tanto, desempear funcin destacada en la gnesis de la lesin celular, que

comienza con un fenmeno de adhesin especfica y que se complementa con la invasin celular. Para estos autores, aparte de la especificidad de la interaccin bacteria clula, hay una relacin significativa entre intensidad de adhesin y patogenicidad del microorganismo. Asociada a la agresin de las clulas parenquimatosas, el endotelio capilar es lesionado con intensidad, probablemente por la accin de las citotoxinas. De Brito y cols. , observaron en la clula endotelial de capilares del pulmn, rin y diafragma, alteraciones mitocondriales y del retculo

endoplasmtico, semejantes a las detectadas en los hepatocitos. Con la evolucin natural de estos fenmenos, se instala un cuadro de anoxia tisular que agrava y perpetua el proceso lesivo de las formas graves de Leptospirosis, considerado por De Brito
(1968)

mas una vasculitis infecciosa

que enfermedad de un rgano o tejido especfico. Las lesiones endoteliales han sido comprobadas por la microscopa electrnica, principalmente en mitocondrias y retculo endoplasmtico. Las mitocondrias se encuentran dilatadas, mientras que el retculo

endoplasmtico est aumentado en su tamao. Todos estos fenmenos precederan a la lesin final: la necrosis celular. EL lipopolisacrido aislado de la Leptospira, llamado L-LPS, parece actuar intensamente en el desencadenamiento de graves fenmenos inflamatorios, que agreden a la clula endotelial y liberan citoquinas y potentes compuestos vasoactivos.

La Leptospirosis puede ser considerada como una enfermedad generalizada, sistmica, traducida fundamentalmente por una vasculitis

(inflamacin de los vasos sanguneos) infecciosa. La lesin vascular, predominantemente capilar, es un factor prominente de la Leptospirosis y responsable del edema y la ditesis hemorrgica. Afecta fundamentalmente a los capilares de hgado, pulmn y rin (Vlez, 2006).

1.7. ASPECTOS CLNICOS DE LA LEPTOSPIROSIS La Leptospirosis presenta cuadros clnicos diversos, conforme a: El tropismo del agente, intensidad de la infeccin y condiciones inmunitarias del hospedero.

La presencia de mialgias y fiebre puede ser los sntomas tempranos predominantes. Despus de un perodo de incubacin de 7 a 12 das, la enfermedad ofrece un curso bifsico. (INTA, 2005) Durante la primera semana de la enfermedad, se puede aislar la Leptospira de lquido cefalorraqudeo (LCR), pero no se manifiestan signos menngeos. A partir de la segunda semana, con la aparicin de anticuerpos se puede presentar meningitis, pero sin que se logre aislar la espiroqueta; esto sugiere que la meningitis se puede deber a la reaccin antgenoanticuerpo (INTA, 2005).

1.7.1. Leptospirosis Anictrica. En la Fase Sptica la enfermedad se caracteriza por ser de inicio sbito con fiebre remitente alta, cefalea persistente y mialgias intensas, dolor abdominal; adems, malestar general y astenia. Esta es la forma leve de la Leptospirosis. Estos signos y sntomas se mantienen por 4-7 das.
(Farrar

Edmund, 1995)

De manera general, no hay muertes en esta fase, puede suceder

que no pase a la fase inmune. Los pacientes en esta fase estn agudamente enfermos, febriles y con bradicardia relativa; adems, de normotensos,
(Sanford, 1987)

la cefalea es

intensa y su presencia y severidad puede anunciar que se inicia la meningitis.


(Farrar Edmund, 1995)

Las mialgias comprometen a la regin paraespinal, el

abdomen y el cuello pero caractersticamente a los msculos gemelos de las pantorrillas. (Berman, 1973) La asociacin de vmitos, dolor abdominal y naseas ocurren hasta en el 95% de los pacientes (esto es muy inespecfico). La hepatomegalia (<15%) y la esplenomegalia (< 22%) son poco frecuentes en la forma anictrica.
(Berman, 1973) (Farrar Edmund, 1995)

Lo ms frecuente en la fase

sptica, es la sensibilidad muscular y las manifestaciones oculares como hemorragias conjuntivales, fotofobia y dolor ocular.
(Farrar Edmund, 1995)

Ocasionalmente, los pacientes presentan diarrea, menos frecuentemente, aparecen: irritacin farngea, linfadenopatas, hemorragias cutneas y rash maculopapular o urticarial que se presenta en el tronco. (Sanford, 1987)

En la segunda semana de la enfermedad se inicia la Fase Inmune. En ella, la fiebre, en caso de estar presente, es baja y dura de uno a tres das. Esta fase se correlaciona con la aparicin de anticuerpos IgM circulantes, mientras que la concentracin de C3 se encuentra en el rango normal.
1987) (Sanford,

El dato ms importante, desde el punto de vista clnico, es la presencia

de la meningitis asptica. En esta fase, las Leptospiras ya desaparecieron del LCR; sin embargo, aparecen las manifestaciones clnicas relacionadas a la aparicin de anticuerpos. De esta manera el 80-90% (Farrar Edmund, 1995) de los

pacientes con leptospirosis anictrica (durante la fase inmune) pueden presentar pleocitosis del LCR y el 50% de ellos aparecern con signos de meningitis. Las manifestaciones no son especficas y el diagnstico puede ser confundido con meningitis de etiologa viral, debido a la presencia de pleocitosis mononuclear. Cuando las fases estn bien definidas, el doctor tiene mayor probabilidad de diagnosticar meningitis asptica por

leptospirosis. Esta manifestacin neurolgica dura algunos das (raramente hasta tres semanas) y no es fatal sobretodo en los casos anictricos. Al examinar el LCR los mononucleares no son ms que 500 clulas por mm3, hay proteinorraquia, glucosa normal y clnicamente no hay focalizacin ni encefalitis, presentan cefalea intensa. Todos los serotipos patognicos para el humano son probablemente capaces de causar meningitis asptica. Los serotipos con mayor prevalencia son icterohaemorrhagiae, cancola y pomona. (Sanford, 1987)

1.7.2. Leptospirosis Ictrica (Sndrome de Weil). La forma ictrica pero fue se descrita observa originalmente casi en con la especie tipo de

icterohaemorrhagiae,

cualquier

leptospira.(Farrar Edmund, 1995) Este sndrome tiene como caracterstica principal la disfuncin renal y heptica con fenmenos hemorrgicos, colapso vascular, as como alteraciones graves de conciencia y una mortalidad que puede llegar al 5- 10%
(Farrar Edmund, 1995)

de los pacientes. Las manifestaciones de de

este sndrome comienzan a aparecen entre el tercero y sexto da

enfermedad, pero es en la segunda semana que se les identifica plenamente.

Las manifestaciones gastroenterolgicas

(Sanford, 1987)

incluyen el dolor

en el cuadrante derecho y aumento de las transaminasas hasta en cinco veces el valor normal. La hiperbilirubinemia es conjugada y parece que el mecanismo fisiopatolgico incluye el bloqueo intracelular heptico que le impide la excrecin de bilirrubina. Hay hepatomegalia en el 70 % de los casos. (CENEPI, 1997) En los nios
(Viana Martins, 1998)

pueden presentarse hipertensin,

colecistitis acalculosa, pancreatitis, as como vasculitis necrotizante perifrica. En los casos graves hasta el 10% de los pacientes pueden presentar alteraciones respiratorias. (Correa, 1987) Los pacientes graves pueden presentan tos disnea y hemoptisis,
(Correa, 1987)

inclusive hasta Sndrome de Dificultad

Respiratoria del Adulto que puede ser de difcil diagnstico con el cuadro pulmonar que presenta el compromiso por hantavrus.
(CENEPI, 1997)

Algunos

autores mencionan que, inclusive, en la fase sptica pueden aparecer manifestaciones pulmonares en el 25-86% de los pacientes, las cuales se caracterizan por tos y dolor torcico, siendo la hemoptisis de presentacin muy rara. La leptospirosis puede presentar coagulacin intravascular diseminada
(Macdo, 1973)

que podra ser consecuencia del ingreso a la circulacin de

sustancias procoagulantes como la tromboplastina de los tejidos o de cogulos en la superficie del vaso lesionado. El compromiso renal
(Farrar Edmund, 1995)

es bastante variable, puede ser

poco expresivo y presentar solo albuminuria y hematuria en muchos casos o presentarse como insuficiencia renal grave con oliguria progresiva. La insuficiencia renal generalmente es producto de la disminucin de la

perfusin renal, relacionada a la deshidratacin y con menor frecuencia a la disfuncin miocrdica.


(Viana Martins, 1998)

La excrecin urinaria cae y en

ocasiones hay anuria. El compromiso renal y sus complicaciones son las principales causas de mortalidad en la Leptospirosis. La insuficiencia cardaca congestiva y el shock cardiognico pueden estar presentes en los casos graves.
(Farrar Edmund, 1995)

Sin embargo, son

menos frecuentes que las alteraciones

electrocardiogrficas, como las

alteraciones del ritmo y bloqueos diversos que pueden verse agravados por los disturbios metablicos como la hiperpotasemia y la uremia. La miocarditis
(Sanford, 1987)

es otra de las formas de expresin y presenta

intensidad variable. Los serotipos que han sido relacionados con la miocarditis son el icterohaemorrhagiae, pomona y grippothyphosa.

Figura n 2. Manifestaciones clnicas de la Leptospirosis.

Fuente. Leptospirosis. Mdulos Tcnicos. Serie Documentos monogrficos N Oficina General de Epidemiologa / Instituto N acional de Salud. Lima. 2. 2000

1.8. VIAS DE TRANSMISION DE LA LEPTOSPIROSIS

Piel y mucosas. La penetracin por la piel con aberturas o erosionada y por las mucosas intactas como (nariz, boca, ojos) pueden ser modos de contaminacin por Leptospira. Se puede uno contaminar tambin por la piel si se ha permanecido mucho tiempo bajo el agua. Los ganaderos estn expuestos a la orina de animales directamente o por aerosol
(Acha, 1986)

que

puede contaminar sus conjuntivas o piel. El caminar descalzo por estos suelos contaminados es una forma indirecta de contaminacin. La exposicin a aguas contaminadas, por roedores que infestan los campos, es una forma frecuente de infeccin en trabajadores agrcolas (caa de azcar, arrozales por ej.) o militares en maniobras en terrenos abiertos. Esta exposicin tambin puede darse como consecuencia de ocupaciones riesgosas como limpiar desages (Acha, 1986) o actividades recreativas

Va oral. Por ingestin de alimentos o aguas contaminadas con orina de enfermos o de reservorios. Antes se consideraba una va importante, pero hoy se le da poco valor como modo de transmisin.

Transplacentaria. Se demostr que en animales, principalmente de criaderos (vacas, cerdos, etc.) produjo retardo del crecimiento o prdida de los productos (abortos) con graves repercusiones econmicas. En los seres humanos hay algunos datos recientes sobre esta forma de transmisin.
(Coghlen, 1969)

Lactancia. Es otro modo de transmisin poco estudiado, pero s hay informes al respecto. (Bolin, 1989)

1.9. DIAGNSTICO DIFERENCIAL


El diagnstico de Leptospirosis debe ser investigado en todo paciente con fiebre y mialgias,
(Oficina General de Epidemiologa, 1998)

toda vez que las

manifestaciones clnicas son confundibles con otras enfermedades. La mayora de los errores de diagnstico puede evitarse con la realizacin de una historia y examen fsico detallados. Enfermedades que en ocasiones tienen una presentacin clnica indistinguible de la Leptospirosis, pueden ser sospechadas por la historia epidemiolgica como el dengue o la malaria. En nuestro pas la necesidad de exmenes de laboratorio se hace imperante para el diagnstico diferencial de malaria, dengue toda vez que pueden manifestarse de manera similar dentro de un sndrome icterohemorrgico. DENGUE La diferenciacin bsicamente ser por la procedencia del paciente y los datos epidemiolgicos; adems, por las pruebas de laboratorio especficas de cada enfermedad. Clnicamente las caractersticas son similares, aunque la intensidad de los dolores musculares podra ser mayor en el dengue. HEPATITIS Las hepatitis virales son de inicio menos brusco con fiebre de menor intensidad y que desaparece al iniciarse la ictericia. Frecuentemente, no hay mialgias y compromiso renal. Los diferentes tipos de hepatitis viral necesitarn del laboratorio para su diferenciacin.

MENINGOENCEFALITIS El diagnstico diferencial de las formas menngeas de la Leptospirosis es generalmente, establecido por el examen del lquido cefalorraqudeo y la evolucin del cuadro. El LCR de las meningitis bacterianas presentar leucocitosis con hipoglucorraquia lo que no ocurre en la Leptospirosis. MALARIA POR P. VIVAX O P. FALCIPARUM La curva trmica caracterstica ayudar al diagnstico; adems, existe hepatoesplenomegalia, anemia de rpida progresin y no es frecuente la leucocitosis con neutroflia, as como la presencia de congestin cutneomucosa. Otras enfermedades pueden eventualmente ser confundidas con la Leptospirosis como colecistitis, infecciones respiratorias, sarampin, rubola, pielonefritis, sepsis, brucelosis con ictericia, sepsis bacterianas graves con ictericia, endocarditis. Por lo que, el examen clnico epidemiolgico ser de gran utilidad en el diagnstico diferencial de esta enfermedad

1.10. DIAGNSTICO DE LA LEPTOSPIROSIS

La enfermedad se sospecha en aquellas personas con sntomas compatibles que han tenido una exposicin previa a aguas contaminadas directa o indirectamente con la orina de animales portadores de la bacteria. Este antecedente es muy importante y a veces pasa desapercibido; por esto, se deben tener en cuenta, incluso, exposiciones stiles a aguas estancadas, pantanos, charcos y dems.

1.10.1. Diagnstico de Laboratorio

Las tcnicas bacteriolgicas son las ms complejas, pero nos brindan resultados muy importantes, tales como: la observacin, el aislamiento y la identificacin del microorganismo. (Adler, 1978) El diagnstico debe basarse en el conocimiento de la patogenicidad del microorganismo, as como de sus propiedades. Estos mtodos se pueden dividir en: Tcnicas indirectas: que detectan anticuerpos frente a las

Leptospiras. Tcnicas directas: encaminadas a la deteccin de Leptospiras o sus antgenos y/o cidos nucleicos en los tejidos y/o fluidos corporales.

Las muestras apropiadas y que ms comnmente se colectan son: 1. Sangre con heparina (para prevenir coagulacin) para cultivo en los primeros 10 das. El cultivo de la sangre despus de los 10 das de la aparicin de la enfermedad no es recomendado, ya que las Leptospiras han desaparecido en su mayora de la sangre y los anticuerpos habrn comenzado a ser detectables en el suero permitiendo el serodiagnstico. Muestras para cultivo deben ser guardadas y transportadas a temperatura ambiente, debido a que las bajas temperaturas son perjudiciales para las Leptospiras patgenas. 2. Sangre coagulada o suero para serologa. Deben obtenerse preferiblemente dos muestras con un intervalo de varios das en base

a la fecha de aparicin o inicio de la enfermedad y el tiempo probable de seroconversin. El anlisis de muestras pareadas es necesario para detectar un incremento en los ttulos entre ambas muestras o la seroconversin, y por tanto, para confirmar el diagnstico de la Leptospirosis. Un resultado serolgico negativo en la fase aguda de la enfermedad no excluye la Leptospirosis. 3. Orina para cultivo. Las Leptospiras mueren rpidamente en la orina, por lo que el uso de orina para cultivo puede ser valioso solamente cuando es posible obtener una muestra limpia que pueda ser inoculada en un medio de cultivo apropiado en no ms de 2 horas despus de haber sido recogida. La supervivencia de las Leptospiras en la orina cida puede incrementarse haciendo la orina neutra. 4. Muestras postmortem. Es importante colectar muestras del mayor nmero de rganos posibles, incluyendo cerebro, lquido

cefalorraqudeo, humor acuoso, pulmones, riones, hgado, pncreas y corazn, y si es posible, sangre del corazn, para serologa. Las muestras postmortem deben ser obtenidos aspticamente y tan pronto como sea posible despus de la muerte; deben ser inoculadas en el medio de cultivo lo ms rpido que se pueda. Las muestras deben ser guardadas y transportadas a + 4 previniendo la a utolisis de las C, clulas a 4 y una consecuente disminucin del pH, lo que C compensar la reduccin en la viabilidad de las Leptospiras patgenas a bajas temperaturas. Tejidos frescos o fijados pueden ser tambin examinados para la presencia de Leptospiras, usando anticuerpos marcados con marcadores de fluorescencia. Adems,

otros

mtodos

como

tincin

con

plata,

inmunotincin

inmunohistoqumica pueden ser de utilidad, pero son tcnicamente demandantes y requieren de una experiencia considerable para su correcta interpretacin. 5. Lquido cefalorraqudeo y dializado para cultivo

En caso de muestras procedentes de fetos, las tcnicas directas estn ms indicadas que las indirectas, ya que el diagnstico individual cobra mayor importancia. Para propsitos epidemiolgicos, pueden obtenerse muestras de agua y suelo, y en caso de epidemias o epizootias, sangre, rin, hgado de animales capturados (roedores u otros animales silvestres). Tcnicas Indirectas Los mtodos serolgicos nos brindan un diagnstico en corto tiempo y son capaces de detectar anticuerpos antileptospirales (que pueden ser de la clase IgM e IgG), las que constituyen las tcnicas de eleccin. Adems, son las pruebas de laboratorio ms utilizadas en el diagnstico de la Leptospirosis, al igual que para la realizacin de estudios epidemiolgicos. El mayor problema que presenta es los niveles de anticuerpos, aunque se mantengan durante aos, alcanzan niveles tan bajos en animales y personas infectadas crnicamente que no siempre se detectan; adems en los casos de infeccin por serovares adaptados, un porcentaje de los animales pueden no presentar respuestas con anticuerpos.

a. Naturaleza de la respuesta de anticuerpos Los seres humanos reaccionan a una infeccin con Leptospiras con la produccin de anticuerpos especficos anti Leptospira. La seroconversin puede ocurrir de 5 a 7 das despus de la aparicin de la enfermedad, pero algunas veces solo despus de 10 das o incluso ms. Los anticuerpos IgM aparecen, ms temprano que los anticuerpos de clase IgG y, permanecen usualmente detectables por meses o an aos aunque a bajos ttulos. La deteccin de anticuerpos IgG es ms variable; algunas veces pueden no ser detectables en absoluto o ser detectables por perodos relativamente cortos de tiempo, pero ocasionalmente pueden persistir por varios aos. Los anticuerpos son dirigidos contra: Antgenos comunes (llamados antgenos gnero especficos) que son compartidos por todas las Leptospiras, tanto patgenas como saprofitas; Antgenos serovar especficos y serogrupo especficos.

Los pacientes con Leptospirosis pueden producir anticuerpos que reaccionan con varios serovares. Este fenmeno, llamado reaccin cruzada, que se observa con frecuencia en la fase inicial de la enfermedad. Despus de la enfermedad aguda, los anticuerpos que presentan reaccin cruzada desaparecen gradualmente en la medida que el sistema inmune madura, usualmente en el curso de semanas o meses; mientras que los anticuerpos especficos para serogrupos y serovares pueden persistir por aos. Los anticuerpos gnero especficos permanecen habitualmente detectables por meses y los anticuerpos serovar especficos por aos. Reacciones cruzadas

dbiles pueden ocurrir con otros grupos de microorganismos variando con el mtodo serolgico usado (Leptospirosis humana, VP/OPS/OMS, 2008.)

Figura n 3. Naturaleza bifsica de Leptospira dentro de sus diferentes estados de enfermedad.

Fuente: Manuel Cspedes Z. Laboratorio de Leptospiras, Centro Nacional de Salud Pblica, Instituto Nacional de Salud. Lima, 2000.

Para el diagnstico serolgico se ha utilizado tcnicas tales como: b. Tcnica de Microaglutinacin (MAT) Es el mtodo serolgico de referencia a la hora de evaluar otras pruebas para el diagnstico de Leptospirosis. Se emplea para detectar anticuerpos en sueros de pacientes sospechosos o enfermos (humanos y animales) donde el suero reacciona con antgenos vivos de Leptospiras de 7

a 10 das de crecimiento en medio lquido de EMJH enriquecido, y es el ms utilizado cotidianamente. (Ellis, 1996) Antiguamente, era conocido como la prueba de aglutinacin lisis por la formacin de lisis de las bolas o lisis de glbulos de despojos o ruinas celular en la presencia de alto ttulos de antisuero, pero Borg-Peterson, Wolff et al., demostraron que no se produca una lisis sino una aglutinacin. En la actualidad, para obtener una adecuada sensibilidad, se recomienda utilizar cepas representativas de todos los serogrupos presentes en un lugar determinado concreto y de la especie objeto de estudio. Tambin hay reportes de una sensibilidad y especificad de MAT hasta 92 % y 95 %, respectivamente, con un valor predictivo positivo de 95 % y negativo de 100%. (Herrera, 2002) Para la realizacin de la prueba se utilizan cultivos de siete a diez das de crecimiento. Adems, es necesario determinar el punto de corte, ttulo por debajo del cual es considerado que la aglutinacin es debido a reacciones inespecficas. El ttulo de anticuerpos del suero ser la dilucin ms alta en la cual aun encontramos 50 % de aglutinacin. (Herrera, 2002) En seres humanos para este mtodo se considera lo siguiente: En caso de una sola muestra, el ttulo serolgico mayor de 1:80 confirma el diagnstico. Los ttulos comprendidos entre 1:40 y 1:80 deben ser interpretados en el marco de la situacin clnicoepidemiolgico del paciente. Para las muestras pareadas, un aumento del ttulo 4 veces a la primera muestra es confirmativo.

Al igual que otras pruebas serolgicas, para diagnosticar una infeccin individual mediante MAT, se requiere estudiar dos muestras pareadas de 7-14 das de intervalo de la primera y si se observa que ha habido seroconversin, se considera de valor diagnstico un cambio en el titulo de al menos, cuatro veces el titulo inicial. (Hartskeerl, 2000)

A pesar de ser la prueba ms recomendada y extendida, presenta una serie de desventajas: no distingue anticuerpos vacunales de los de infeccin, resulta difcil su estandarizacin, ya que su valoracin es subjetiva, requiere el mantenimiento de cultivos de Leptospiras y no siempre detecta a los animales infectados, en especial cuando el serovar implicado es L. hardjo, que presenta como caractersticas ser poco antignico. c. Tcnica Inmunoenzimtica tipo ELISA.

Los anticuerpos si estn presentes en el suero se combinan con el antgeno de Leptospira fijado a la superficie de los micropocillos de poliestireno. El suero residual se remueve al lavar y se aade conjugado antiinmunoglobulina humana IgM o IgG ligado a una enzima peroxidasa. Los micropocillos son lavados y coloreados por un substrato (perxido de hidrgeno) ms un cromgeno que es aadido. Al hidrolisarse el sustrato por la enzima, el cromgeno cambia de color. La intensidad del color se

relaciona con la concentracin de anticuerpo contra Leptospiras presentes en la muestra. Esta tcnica es capaz de detectar la IgM durante la primera semana de la enfermedad y la deteccin tarda de IgG que permite diferenciar

infecciones recientes de pasadas. La deteccin de anticuerpos especficos IgM con una sola muestra es confirmatoria de una infeccin reciente por Leptospiras. Adems, se considera como ms sensible que MAT, es fcil de estandarizar los antgenos, pueden almacenar durante meses, no tiene ningn riesgo para los tcnicos y pocas reacciones cruzadas; tampoco diferencia los anticuerpos vacunales de las infecciones. A pesar de que es una prueba muy eficaz, aun no est considerada como prueba oficial.
1999). (Guijarro,

Figura n 4. Estandarizacin de un kit para el diagnstico serolgico de la Leptospirosis humana. Dr. Alberto Montoya Prez. 2004

d. Tcnica de Inmunofluorescencia

Es otra de las tcnicas diagnosticas utilizadas, revela especialmente ra la aparicin de anticuerpos IgM y puede ser positivo ms precozmente que el MAT. La misma consiste en la fijacin de los serovares ms frecuentes en onsiste lminas de Inmunofluorescencia. Una vez fijado el antgeno con acetona, se fijado coloca una dilucin 1:100 del suero del paciente en cada uno de los hoyos y se incuban durante 30 minutos a 37 C. Luego de varios lavados con PBS, se colocan 50 microlitros de una dilucin de anticuerpos de conejo anti antiinmunoglobulina humana conjugados con isotiocianato de fluorescena en munoglobulina cada hoyo y se incuban en cmara hmeda por 30 minutos para ser nuevamente lavadas y secadas. Posteriormente se montan los preparados Posteriormente, con glicerol y se observan al microscopio de fluorescencia. En los sueros fluorescencia. positivos se aprecian las espiroquetas color verde manzana manzana. Figura n 5. Tcnica de Inmunofluorescencia Directa (IFD): mtodo diagnstico para dete deteccin de leptospiras utilizando un conjugado polivalente.

e. Prueba de Tamizaje Un nmero de pruebas como la aglutinacin macroscpica, la prueba de aglutinacin macroscpica con antgeno termorresistente, aglutinacin en microcpsula, aglutinacin de ltex, pruebas de dipsticks, y la prueba de hemoaglutinacin indirecta, son fcilmente realizadas y dan resultados relativamente rpidos. Los resultados de las pruebas de rastreo, tanto si son positivos o negativos, deben ser confirmados por otras pruebas y preferiblemente por la MAT. Tcnicas Directas La demostracin de la presencia de Leptospiras, o sus componentes en la sangre, tejidos, y lquidos corporales de humanos con signos clnicos es de gran valor diagnstico: a. Observacin al Microscopio de Campo Oscuro

Este mtodo se realiza para la observacin de Leptospiras en los fluidos orgnicos como sangre, orina, LCR, lquido de dilisis. Pero a la vez, es poco sensible y carente de especificidad debido al gran nmero de artefactos que, por su parecido con las Leptospiras, pueden crear confusin. Adems, precisa que haya un gran nmero de microorganismos en las muestras. (Ellis, 1996)

La observacin de la sangre a travs de microscopa de campo oscuro solo es de valor durante los primeros das de la enfermedad, mientras que la fase de leptospiremia se produce.

Figura n 6.

Microfotografa de leptospirosis. Prueba de aglutinacin

microscpica con antgenos vivos utilizando la tcnica de micro microscopa de campo oscuro. Fuente: CDC. Enfermedades bacterianas y micticas: Enfermedades Leptospirosis.

b. Cultivo de Leptospira

Tpicamente, las Leptospiras son cultivadas a 30 en el medio C Ellinghausen-McCullough McCullough-Johnson-Harris (EMJH), el cual puede ser

suplementado con 0,2 0,2-1% de suero de conejo para favorecer el crecimiento de las cepas.(Jonshon, sodio difsico,
1963)

El medio de cultivo est constituido por fosfato de

fosfato de potasio monobsico, cloruro de sodio (que

mantiene el balance osmtico), cloruro de amonio, tiamina, todo a un pH final de 7.3 0.2. Adems, es enriquecido con albumina, polisorbato 80 y factor de crecimiento para Leptospira. El crecimiento de contaminantes puede ser inhibido por la adicin de 5 fluorouracilo al medio de cultivo.

El crecimiento de Leptospira patognicas en un medio nutritivo artificial como el EMJH se hace notable a los 4 das; el crecimiento de las cepas 4-7 l saprofticas ocurre a los 2 o 3 das. La temperatura mnima de crecimiento de especies patognicas es de 13 15 Debido a que la temperatura mnima 13-15 C.

del crecimiento de las especies saprofticas es de 5-10 la habilidad de las C, Leptospira de crecer a 13 puede ser usada para distinguir entre los C organismos patognicos de las que son flora saprofticas. El pH ptimo para el crecimiento de Leptospira est entre 7,2-7,6.

Por sus caractersticas de aerobiosis, las Leptospira usa como fuente principal de carbono y energa durante el crecimiento in vitro, los cidos grasos de cadena larga, los cuales son metabolizadas por medio de oxidacin.
(Jonshon, 1963)

Los cidos grasos son suministrados en medios como

el EMJH en la forma de polisorbato. Las molculas de cido graso estn ligadas a albmina en EMJH y son lentamente liberadas al medio de cultivo para prevenir su acumulacin txica.

Como la mayora de las bacterias, las Leptospiras requieren hierro para su crecimiento. (Faine, 1959) L. interrogans y L. biflexa tienen la habilidad de obtener hierro en diferentes formas. Se requiere de un receptor TonBdependiente para la utilizacin de la forma ferrosa del hierro, el cual se ha encontrado en L. biflexa y un homlogo del receptor es codificado en el genoma del L. interrogans. L. interrogans puede tambin obtener hierro del grupo hemo, el cual contiene casi todo el hierro en el cuerpo humano. La protena de unin a la hemina HbpA, que puede estar involucrada con la obtencin de hemina que ha sido identificada sobre la superficie de L. interrogans. Aunque otras cepas patognicas de Leptospira y L. biflexa

carecen de HbpA, otra protena de unin a la hemina, LipL41, puede ser la que les permita la habilidad de usar hemina como su fuente de hierro
2007) (Asuthkar,

Aunque L. biflexa y L. interrogans no secreten siderforos, si tienen la

capacidad

de

obtener

hierro

de

siderforos

secretados

por

otros

microorganismos.

Figura n 7. Leptospira sp vista al microscopio de campo oscuro de un spp oscuro, cultivo de sangre en medio lquido EMJH despus de cuatro seman de lquido semanas incubacin.

c. Tinciones Las Leptospiras pueden ser coloreadas por una variedad de mtodos de coloracin, pero muy dbilmente o no pueden ser coloreadas por

coloracin convencional de Gram. La coloracin con plata puede dar resultados satisfactorios; se han usado mtodos de coloracin inmunolg inmunolgica, tales como la inmunofluorescencia directa y variantes como la coloracin de inmunoperoxidasa. Los mtodos de coloracin pueden ser tiles en diagnsticos postmortem y en tejidos fijados o no. Sin embargo, todos los mtodos de coloraci sufren los mismos errores de la microscopia de campo coloracin oscuro, como son los altos riesgos de falsos positivos y falsos negativos. Los artefactos son fcilmente confundidos con Leptospiras, cuando pocas estn presentes. particularmente

Figura n 8. Leptospira en orina, mediante la tcnica de Warthin Warthin-Starry. (Tincin argntica).

d. Tcnica de Reaccin en Cadena de la Polimerasa ( (PCR) EL PCR es un mtodo de amplificacin de segmentos especficos del DNA de Leptospira, por ejemplo en muestras clnicas como sangre, hasta , que alcancen niveles detectables. De esta manera, la presencia de Leptospiras es confirmada por la deteccin e identificacin de segmentos especficos del ADN de Leptospira. La PCR puede confirmar rpidamente el diagnstico en la fase diagnstico temprana de la enfermedad, cuando la bacteria puede estar presente y antes que los ttulos de los anticuerpos alcancen niveles detectables. Desventajas: La PCR requiere de equipos especiales y la dedicacin de un espacio de laboratorio, al igual que personal altamente calificado, laboratorio, puede dar resultados falsos positivos por la presencia de mnimas cantidades de ADN extrao que puede contaminar el rea de trabajo. Tambin puede dar resultados falsos negativos por la presencia de inhibidore en los inhibidores materiales clnicos que estn siendo examinados. Si bien la tecnologa de PCR es ampliamente aplicada al diagnstico de muchas enfermedades, su valor general para el diagnstico rpido de la

Leptospirosis

no ha sido evaluado a nivel mundial y no es ampliamente

usada, particularmente, en los pases del trpico y subtrpico.

1.11. TRATAMIENTO Los estudios realizados indican que el tratamiento con penicilina o tetraciclina podra acortar la duracin de la fiebre y reducir la incidencia de complicaciones renales, hepticas, hemorrgicas y neurolgicas. En algunos casos, el manejo de un paciente con leptospirosis ictrica requiere su ingreso en unidad de cuidados intensivos, hemodilisis de urgencia y monitoreo electrocardiogrfico. Tabla n 2. Recomendaciones para quimioprofilaxis o tratamiento de las Leptospirosis Indicacin Quimioprofilaxis Tratamiento de Leptospirosis leve Droga o Producto Doxiciclina Doxiciclina Dosificacin 200 mg/semana

100 mg, dos veces al da Ampicilina 500/750 mg cada seis horas Amoxicilina 500 mg cada seis horas Leptospirosis moderada Ampicilina 0,5 a 1 g I/V cada seis a severa horas Penicilina G 1,5 MU I/V cada seis horas Fuentes. Recomendacin de Mandel y col.: Enfermedades Infecciosas.

2.1. METODOLOGA 2.1.1. rea de estudio. Esta investigacin est enfocada a la seccin de Microbiologa Clnica.

2.1.2. Tipo de estudio. Es un estudio Prospectivo con carcter Descriptivo acerca de la incidencia de Leptospirosis en la Repblica de Panam.

2.1.3. Universo. Est conformado por 64 muestras que fueron enviadas al LCRSP/ICGES por presentar sintomatologa febril sin un diagnstico confirmado.

2.1.4. Muestra. Suero de pacientes que presentan una reaccin febril sin diagnstico conocido que son referidos de diferentes instituciones de Salud a nivel nacional al LCRSP/ICGES.

2.1.5. Variables. Las variables de esta investigacin son la Concentracin de Anticuerpos que desarrolla el paciente con la evolucin de la enfermedad en relacin a la positividad a la Leptospira en la tcnica de Microaglutinacion.

2.1.6. Recoleccin de muestras. 1. Las muestras de los pacientes que son referidos al LCRSP/ICGES por sospecha de Leptospirosis, vendrn con su respectivo formulario indicando los datos personales y generales del paciente (ver anexo). 2. Al llegar la muestra al laboratorio, se le registra el nmero de muestra, la fecha de entrada, nombre del paciente y otras.

3. Una vez registrada la muestra del paciente, se le realiza las pruebas de screening (ELISA IgM) y con este se da un Informe Preliminar si el paciente presenta anticuerpos anti Leptospira o no; luego se procede a realizar la prueba de MAT. 4. Se solicita una segunda muestra (7-10 das) de suero para realizar la prueba por MAT; primero realizando un tamizaje y se le realiza la prueba de titulacin de MAT. Siempre es necesario solicitar una segunda muestra de suero para determinar si hay seroconversin o aumento de los ttulos. Independiente de los resultados de la primera muestra. 2.1.7. Materiales Incubadora a 30 C Cmara de flujo laminar Microscopio de campo oscuro Microplatos de poliestireno Micropipetas rango graduable: 2-20 l, 10-100 l y 100-1000 l Multipipeta multicanal 30-300 l Papel toalla Guantes Jabn Contenedor de materiales contaminado Reloj Potencimetro Rotador Puntas para micropipetas Tubos de dilucin 15 x Lminas portaobjetos Filtros de 0.2 micra Jeringas de 20 cc Agujas estriles Balanzas

2.1.8. Reactivos Buffer fosfato salino (PBS) pH 7.4 Solucin salina fisiolgica 0.85% Antgeno de Leptospira de 5-7 das de crecimiento Medio de cultivo EMJH. Aceite de inmersin Reactivo 5- fluoracil Solucin 0.5 Macfarland

Foto no 2. Cmara de Flujo Laminar

2.2. PREPARACION DE REACTIVOS Y MEDIOS. a. Soluciones Tampn y Medios para Aislamiento de Leptospiras Tampn fosfato salino PBS (500 ml) Reactivo NaCl Na2HPO4 KH2PO4 KCL H2O pH 7.2

Cantidad 4g 0.45 g 0.07 g 0.10 g 500 ml

Medio para aislamiento EMJH semislido (500 ml y 1000 ml) Reactivo (1000 ml) Cantidad Reactivo (500 ml) Cantidad Medio EMHJ 2.3 g Medio EMHJ 1.15 g H2O 900 ml H2O 450 ml Agar 3.2 g Agar 1.6 g Autoclavar 121 C Autoclavar 121 C (15 (15 min) min Medio enriquecido 100 ml Medio enriquecido 50 ml EMJH EMJH Para preparar medio EMJH lquido se sigue el mismo procedimiento sin agregar agar. Reactivo Cantidad H2O 50 ml 5-fluoracil 1.0 g NaOH 2M 2.0 ml Aforar a 100 ml y ajustar a pH 7.6 Filtrar por membrana 0.2 M Por 100 ml de medio de cultivo ,agregar 1 ml de solucin

Preparacin del 5- fluorouracil (100 ml) Reactivo Solucin cloruro de bario 0.5 % en agua destilada Solucin de acido sulfrico al 1% en agua destilada Cantidad 0.1 ml 9.9 ml

Preparacin solucin 0.5 de Macfarland

b. Preparacin del cultivo de Leptospira para la prueba de MAT. a. Colocar una gota del cultivo en un portaobjeto para observar al microscopio de campo oscuro el grado de contaminacin de las distintas cepas de Leptospira del cultivo anterior de 5-7 das de crecimiento. b. Si la cepa presenta grado de contaminacin mayor de 2+ (50%), se para eliminar bacterias u otra

realizara el filtrado (filtro de 0.2 micra)

contaminacin que puedan afectar el crecimiento de las cepas. c. Si no presenta contaminacin se traspasaran con pipetas de 5-50 l, 15 l del cultivo anterior en 4.5 ml del medio de cultivo EMJH. Agitar el medio antes de servir. d. Realizado el procedimiento anterior para cada una de las cepas, se incubara a una temperatura de 30 C por 5-7 das.

c. Preparacin de antgenos para la prueba de MAT. a. Se rotulan los tubos, con la numeracin de la cepa que le correspondan. b. Se toma los tubos del cultivo anterior previamente observadas al microscopio de campo oscuro y que contengan de 150 a 200 leptospiras por campo. c. Se realiza la dilucin del antgeno con PBS hasta lograr una opalescencia de 0.5 de la escala de Macfarland.

PRUEBA DE MAT d. Fase 1: Tamizaje preliminar 1. Selecciona la muestra a ser analizadas y prepare el protocolo respectivo.

2. Encienda la cmara de flujo laminar y deje 30 minutos con luz ultravioleta encendida antes de iniciar el trabajo. 3. En la cmara de flujo laminar, distribuir la microcubeta en 8 columnas para la dilucin del suero y 14 filas para los antgenos. 4. Agregar 50 l de PBS a cada pocillo de la microcubeta 5. Agregar 40 l de PBS a los pocillos de la columna de dilucin 1:20. 6. Agregar 10 l de suero a los pocillos de la columna de dilucin 1:20. 7. Con una pipeta multicanal, extraer 50 l de la dilucin resultante (1:10) en la columna de dilucin 1:20 y hacer dilucin seriada hasta dilucin 1:80, y descartar los 50 l restantes. 8. Posterior a esto se procede a la adiccin del antgeno 50 l, agitarlo levemente para que la muestra de suero y antgeno se mezclen adecuadamente. 9. Cubrir la microplaca con papel platino e incubar por 2 horas a 30 C Tabla n 3. Esquema del Tamizaje para la prueba MAT.
Dil. Suero

1:10 1 1:20 50 l
suero + 50 l Ag.

1:20 1:40 50 l
suero + 50 l Ag.

1:40 1:80 50 l
suero + 50 l Ag.

Ctrl
50 l PBS + 50 l Ag.

1:10 1:20

1:20 1:40

1:40 1:80

Ctrl 10 S E R O V A R E S

S E R O V A R E S

2 3 4 5 7 8 9

11 12 13 14 15

e. Fase 2: Titulacin de muestras positivas por MAT para Leptospirosis. 1. Despus de realizar el Tamizaje de las muestras y si se observa que la dilucin 1:80 presenta aglutinacin igual o mayor a 2+ con uno o ms serogrupos, se tiene que titular el suero. 2. Hacer una dilucin 1:10 el suero de prueba(20 l suero + 980 l PBS) 3. En una placa de 96 pozos realizar diluciones seriadas de la siguiente manera: i. ii. iii. iv. Agregar 50 l de PBS en todos los pocillos Agregar 40 l de PBS en el pocillo de dilucin 1:20. Agregar 10 l de suero en el pocillo de la dilucin 1:20. Usando la micropipeta multicanal, mezclar el suero diluido con el PBS o SSF en la segunda columna, luego extraer 50 l y verterlo v. En la tercera columna, y as sucesivamente, continuar con todas las diluciones a lo largo de la fila, hasta la ltima columna. vi. vii. Descartar los ltimos 50 l. Revisar los cultivos de leptospiras y ajustar por la optima concentracin viii. En cada fila, agregar 50 l de los cultivos correspondientes (antgenos) segn el orden correspondiente. ix. Posterior a la adicin de los antgenos, colocar la microplaca sobre el shaker y rotar a una revolucin 500 rpm durante 4 segundos. x. Cubrir la microplaca con papel platino e incubar a 30C por 2 horas.

Tabla n 4. Esquema para la realizacin de la Prueba MAT

f. Lectura Utilizando las puntas de la micropipeta multicanal, extraer 3 a 5 l de mezcla antgeno-suero y del control y traspasarlos a una lmina portaobjetos. Puede usar tambin un asa bacteriolgica y un incinerador elctrico. La lectura se realizara utilizando un microscopio de campo oscuro con objetivo de 10X y 40X sin cubreobjetos. Observar el grado de aglutinacin de cada antgeno en relacin con el antgeno control segn la escala. El ttulo final estar dado por la dilucin del suero que presenta 50% de aglutinacin, y que se reporta como cruces de aglutinacin( de 1+ a 4+) Cuando una muestra es negativa, no se presenta aglutinacin, observndose la muestra de suero igual al antgeno control.

Tabla n 5. Lectura para la prueba de MAT.

Cruces (aglutinacin) + ++ +++ ++++

Observacin 25% aglutinacin con 75% de clulas libres. 50% aglutinacin con 50% de clulas libres 75% aglutinacin con 25% de clulas libres 100% aglutinacin con 0-25% de clulas libres.

Figura n 9. Reacciones de la prueba de aglutinacin microscpica. MAT. Fuente: Manuel Cspedes Z. Laboratorio de Leptospiras, Centro Nacional de Salud Pblica, Instituto Nacional de Salud. Lima

a: Lmina control b: Lmina con 25 % de aglutinacin c: Lmina con 50 % de aglutinacin d: Lmina con 75% de aglutinacin

e: Lmina con 100% de aglutinacin f: Lmina con 100% de aglutinacin y lisis g: Lmina con 100% de lisis h: Lmina negativo

g. Interpretacin Un suero se considera positivo cuando se observa una aglutinacin de 2+ en una dilucin de suero igual o mayor a 1:80. Un suero se considera negativo cuando no se observa aglutinacin con ningn serovar en una dilucin de suero menor a 1:80. En una infeccin temprana es frecuente observar reacciones cruzadas en ms de dos serovares homlogos que reaccionan con el suero. Es necesario una segunda muestra 7-21 das posterior de tomada la primera muestra Durante la tercera y cuarta semana de producida la enfermedad, el ttulo de anticuerpos hacia el serovar infectante es mayor, facilitando la identificacin. Durante los primeros das de la enfermedad, cuando la produccin de anticuerpos aglutinantes es menor, esta prueba puede salir negativa o reaccionar a ttulos menores a una dilucin de 1:80. Para considerar una muestra positiva en muestras pareadas, es necesario que se produzca un incremento del ttulo de anticuerpos de dos a cuatro diluciones con respecto a la primera muestra. En algunos casos se puede observar un ttulo bajo persistente con un serovar. Esto puede deberse a que el serovar infectante no est incluido en la batera de antgenos. En aquellos casos que no se observe un incremento en el ttulo de anticuerpos entre la primera y la segunda muestra, se puede interpretar que es una infeccin pasada.

3.1. RESULTADOS Tabla n 6. Pacientes positivos para la pruebas de MAT. (Datos generales de los pacientes)

No Sexo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 M M M M F F F M F F F M F M M M M

Edad 53 23 21 31 18 44 23 No tiene datos 14 16 66 44 33 45 50 40 46

Ocupacin Procedencia Agricultor Agricultor Agricultor Agricultor Ama de casa Ama de casa Ama de casa Estudiante Estudiante Estudiante Pescador Cocinero Guardavida Albail Albail Albail Soldador Los Santos Los Santos Herrera Herrera Chiriqu Veraguas Herrera Veraguas Veraguas Veraguas Panam Panam Panam Los Santos Panam Panam Los Santos

Distrito Guarar Pocr Las Minas Las Minas David Santa F Chitr Calobre Santa F Santa F Arraijan Panam Panam Pocr Arraijn Panam Pocr

Corregimiento Sin datos Lajamina Las Minas Chepo Pedregal Santa F La Arena Chitra Santa F Santa F Burunga Chilibre Parque Lefevre Pocr Bique Tocumen Pocr

Grfica n 2. Frecuencia de Leptospirosis por la Prueba de MAT. .

100%

53.1%

26.56%

20.31%

Tabla no 7. Serotipos reactivos en los pacientes positivos. Muestras reactivas 2 3 3 1 8 1 2 2 1 2 5 2 3 3

Especie L. interrogans L. biflexa L. borgpetersenii L. interrogans L. interrogans L. interrogans L. interrogans L. interrogans L. interrogans L. borgpetersenii L. borgpetersenii L. santarosai L. biflexa L. biflexa

Serotipos automnalis andamana ballom canicola grypotypho icterohaemo pomona pirogenes Sjroe Hardjo Sjroe M84 Tarasovi shermani biflexa semaranga patoc

. Grfica n 3. Serotipos reactivos en los pacientes positivos

Grfica n 4. Distribucin de Leptospirosis segn la ocupacin de los . pacientes

Agricultor
4

Albail Ama de casa Estudiante


2

Soldador Pescador

Guarda vida Cocinero

Grfica n 5. Distribucin de Leptospirosis segn la procedencia de los . pacientes positivos.

18 16 14 12

17

Panam Los Santos Herrera Cocl

10

Colon
8

Veraguas
6 4 2 0 0 0 5 4 3 1 0 0 4

Chiriqu Bocas del toro Darin Total

Grfica n 6. Frecuencia de Leptospirosis segn la edad de los . pacientes positivos.

Rango de 60 a 69 50 a 59 40 a 49 30 a 39 20 a 29 10 a 19 0 1 2 3 4 5 Cantidad de Pacientes

Grfica n7. Frecuencia de Leptospirosis por sexo de los pacientes positivos.

10 8 6 4 2 0 10 7

masculino femenino

masculino

femenino

Tabla n 8. Principales sntomas presentes en los Pacientes Positivos Principales sntomas presentes en los pacientes positivos Sntomas no pacientes Fiebre 10 Cefalea 7 Nasea 3 Vmitos 3 Dolor abdominal 2 Ictericia 10 Diarrea 4 Disnea 1 Insuficiencia renal 1 Dolor muscular 8 Dolor retroorbital 2 Hepatomegalia 2 Esplenomegalia 1 Escalofro 3 Hemorragia ocular 1 Total de pacientes positivos 17

Tabla n9. Factores involucrados en los Pacientes Positivos Contacto con animales Rata Perro Cerdo Vaca Ratones Contacto con agua Aguas estancadas Servicio de hueco (letrina) Contacto con basureros no de pacientes 10 12 3 3 1 o n de pacientes 5 2 1

Grafica n 8. Principales signos y sntomas presentes en los Pacientes Positivos


10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 10 7 10 8

fiebre cefalea nasea vmito dolor abdominal Ictericia

Grafica n 9. Factores relacionados con los Pacientes Positivos.

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

Rata Perro Cerdo Vaca 12 10 Ratones 5 agua estancada letrina

3.2. DISCUSION DE LOS RESULTADOS Todas las muestras de sueros analizadas por la Tcnica de Microaglutinacion (MAT), fueron primeramente analizadas por la tcnica de ELISA IgM. Esta prueba es un screening para determinar la presencia de Leptospirosis en la fase aguda de la enfermedad. (Anexo, Tabla n 13) Adems del ELISA, todos los sueros fueron analizados por la prueba de tamizaje de MAT, la que nos ayuda a clasificar los sueros como reactivos para cualquiera de los 14 serovares de referencia con que cuenta el LCRSP/ICGES, esto hasta una dilucin de 1/80 y as descartar los serovares que no presentaron reactividad con el suero del paciente. A las muestras reactivas se le realizaba la Prueba de MAT con una mayor dilucin de los sueros para analizar el grado de aglutinacin de los anticuerpos del suero con los serovares. De los 64 pacientes, cuyos sueros fueron analizados por la tcnica de MAT, 17 pacientes fueron diagnosticados como casos positivos por Leptospirosis, lo que representa un 26.56 % (aqu se considera tanto las muestras pareadas positivas como las muestras nicas positivas); adems, se reporto 13 pacientes indeterminados (20.31%), que no se pueden clasificar como positivo o negativo, debido a que no se ha recibido la segunda muestra de suero del paciente para seguir estudios y poder clasificarla. Para los pacientes con sueros pareados, una muestra se considera positiva cuando presenta un aumento en el ttulo de anticuerpos para un serovar especfico, con respecto a la primera muestra (Anexo, Tabla n 14); aunque hay pacientes que mostraron reactividad para ms de un serovar, en

donde no se puede identificar el que est causando la infeccin, por que presentan igual ttulo en ambos sueros. En los pacientes con sueros nicos positivos (Anexo Tabla n15) se presentan varios serovares reactivos, esto debido a reaccin cruzada de anticuerpos en el suero contra antgenos de Leptospira, la cual se debe a que el suero del paciente presenta anticuerpos contra antgenos comunes por el tiempo corto de exposicin. Por lo que es de importancia, solicitar una segunda muestra de suero del paciente de 7-10 das despus de la primera muestra, ya que en este tiempo el paciente ha desarrollado anticuerpos especficos contra el serovar infectante de Leptospira cantidad de reacciones cruzadas. Los pacientes indeterminados (Anexo, Tabla n 16) se han clasificado de acuerdo a los resultados del ELISA IgM y los resultados del MAT. Estos pacientes presentan resultado de ELISA IgM negativo y reactividad positiva a la Prueba del MAT. No se puede descartar las muestras como negativa por el ELISA IgM, debido a que pueden ser pacientes con una infeccin pasada o puede presentarse por antibiticos que el paciente este recibiendo, por lo que los niveles de anticuerpos IgM han disminuidos como para ser detectados por el ELISA IgM; y que son detectados por la Prueba de MAT (detecta tanto IgM como IgG del paciente). Los Serotipos que han tenido una mayor reaccin con los sueros positivos, tanto los pareados como los nicos, ha sido el serovar grypotypho, seguido por el serovar Tarasovi. Hay que tener en cuenta que las muestras reactivas para estos serovares son muestras nicas y presentan reaccin cruzada para ambos serovares, por lo que no se puede deducir con certeza y as reducir la

cual serovar es el reactivo con la muestra. El serovar grypotypho, segn estudios realizados en otros pases ha tenido relacin con una gran variedad de animales, entre ellos el ganado, perros, cerdos; teniendo relacin con las muestras positivas, debido a que estas muestras proceden de las provincias centrales, cuya ocupacin de los pacientes es la agricultura, representando un mayor porcentaje, y la ganadera, por lo que se mantiene una relacin directa con estos animales que pueden ser portadores de la Leptospira y con el medio ambiente que puede estar contaminado con esta bacteria. Adems, en las ocupaciones se ha encontrado positividad en las amas de casa y estudiantes, que a pesar de que este grupo no tienen una exposicin ocupacional pueden verse afectadas por factores que se encuentren en sus residencias o alrededor de ellas; como por ejemplo mascotas infectadas, presencia de roedores en graneros, entre otras. Con los resultados obtenidos se ha podido demostrar que es el sexo masculino el ms afectado, con un rango de edad de 20 a 50 aos, obviamente, siendo estas edades de mayor actividad laboral, donde tienen mayor contacto con factores que benefician la infeccin con Leptospiras, ya que muchas veces estas personas dedicadas a las actividades agrcolas no toman las medidas de precaucin al realizar sus labores en el campo. De acuerdo a la procedencia de los pacientes positivos a la Leptospirosis, la provincia de Panam presenta un mayor nmero de casos, haciendo nfasis que estos proceden de las afuera de la ciudad, de lugares como Arraijn, Burunga, Chilibre, Tocumen; tomando en consideracin que estas reas presentan problemas de agua potable, inundaciones, viviendas precarias, servicio ineficiente de recoleccin de basura, entre otros, que son

factores que benefician

la proliferacin de la enfermedad. Seguido de la

provincia de Los Santos, Veraguas y Herrera, que son provincias donde las personas han de tener una mayor exposicin con el ambiente y con los animales, tanto silvestres como domsticos, que son portadores de Leptospirosis. En los pacientes positivos, los sntomas ms predominantes fueron la fiebre mayor de 38 o C, la cefalea, la diarrea y el dolor muscular. Todos estos sntomas estn presentes al inicio de la enfermedad en la fase sptica, en donde la Leptospirosis cursa con una forma leve. Sin embargo, hay un alto predominio de la ictericia en estos pacientes, lo que nos lleva a pensar que ya la enfermedad estaba en una fase ms avanzada. Todos estos sntomas no son especficos de la Leptospirosis, ya que hay una gran variedad de enfermedades que cursan de igual forma, siendo esta una de las causas, de que sea mal diagnosticada, por lo que se debe investigar en todo paciente que presente estos sntomas, un diagnostico por Leptospirosis, mas aun si hay factores de riesgo que correlacionen con la enfermedad, tales como el contacto con perro, rata, vaca, entre otros; ya que estos animales pueden excretar grandes cantidades de leptospiras por la orina si se encuentran infectados y de esta forma contaminar el agua y el suelo.

CONCLUSIONES

Mediante este estudio, se observ que la Seropositividad a la Leptospirosis en Panam tiene un valor representativo, mostrando un 26.56% del total de pacientes estudiados, lo que indica que la infeccin en Panam es de consideracin, tomando en cuenta que muchas veces se obvia el diagnstico de Leptospirosis en pacientes que presentan la sintomatologa, la cual puede correlacionar con la infeccin.

Los valores indeterminados en este estudio son de importancia debido a que pueden aumentar la Seropositividad a la Leptospirosis, ya que muchas veces, con una sola muestra no es posible llegar a un resultado confiable de que el paciente presente la infeccin.

La Tcnica de Microaglutinacion nos permite identificar el serovar infectante para el paciente, ya que es una prueba donde se estudia cada serovar por separado con el suero, dando resultados ms especficos y confiables de la reactividad al serovar.

Importante solicitar una segunda muestra, para poder deducir con exactitud cual serovar presenta mayor grado de aglutinacin con el suero, ya que muchas veces sueros nicos tienden a presentar igual ttulo para ms de un serovar, esto dificulta la correcta identificacin del serovar infectante.

La seropositividad a la Leptospira se relaciona mucho con la ocupacin del paciente o a factores externos que se vinculan con su actividad ocupacional, como es el caso del serovar grypotypho que se vincula con el ganado vacuno, y teniendo una mayor relacin con los agricultores o ganaderos.

Nuestro pas como muchos otros de clima tropical, presenta un amplio margen de factores que permiten que la infeccin de la Leptospirosis afecte la poblacin, aunque la frecuencia es baja, no podemos decir que no representa un problema.

En nuestro pas no se cuenta con la informacin suficiente que nos permita comprender mejor el comportamiento de esta enfermedad en Panam.

RECOMENDACIONES

Educar a la poblacin de nuestro pas sobre la existencia de la Leptospirosis, ya que es poco lo que se conoce acerca de los modos de transmisin, los reservorios, factores ambientales (lluvias,

inundaciones, otros) y condiciones insalubres que promueven la proliferacin de vectores que tienden a propagar la infeccin; adems, dar a conocer las ocupaciones de mayor riesgo de contagio y as reducir el nmeros de casos.

Incentivar a la capacitacin de un mayor nmero de personal de salud a la realizacin de pruebas preliminares para la Leptospirosis a nivel nacional, porque actualmente el diagnostico, tanto preliminar como confirmatorio, solo se realiza en el LCRSP/ICGES, lo cual facilitara as una mayor captacin de pacientes que cursen con la sintomatologa sospechosa de Leptospirosis.

Mantener actualizados los registros de los pacientes positivos para Leptospirosis, esto ayudara al reporte epidemiolgico de esta enfermedad en nuestro pas, ya que actualmente, solo se cuentan con datos preliminares de estudios en el LCRSP.

Dar a conocer a las distintas instituciones de salud de nuestro pas acerca de las condiciones de toma y envo de muestras para el

diagnostico Bacteriolgico y Serolgico de la Leptospirosis, lo que ayudara a reducir el nmeros de casos indeterminados que se tienen actualmente.

Un diagnstico de Leptospirosis realizado en un momento oportuno evita complicaciones que pueden poner en peligro la vida del paciente, al verse comprometidos rganos, como el rin y el hgado. La administracin del tratamiento a tiempo para la enfermedad por parte del personal mdico al conocerse los resultados de las pruebas de laboratorio, como el MAT, ayudan a reducir estas complicaciones.

BIBLIOGRAFA

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Tabla n 10. Cantidad de Pacientes. Enero Junio 2009 Resultado del MAT
Indeterminado Indeterminado Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Indeterminado Negativo Negativo Negativo Indeterminado Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Indeterminado Positivo Positivo Indeterminado Indeterminado Indeterminado Negativo Indeterminado Negativo Indeterminado Positivo Negativo Negativo Negativo

N Cd
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 1 8 9 10 11 15 19 21 24 27 36 44 48 51 52 53 55 64 66 67 68 78 80 85 87 88 90 91 92 93 95 97

Elisa IgM
Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo no tiene Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Indeterminado Indeterminado

N Cd
33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 101 103 104 106 108 109 110 112 113 116 126 128 130 131 133 142 143 144 145 147 151 154 155 156 157 158 159 160 161 162 165 166

Elisa IgM
Positivo Positivo Negativo Negativo Indeterminado Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Indeterminado Positivo Negativo Indeterminado Positivo Negativo Indeterminado Indeterminado Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Negativo

Resultado del MAT


Indeterminado Positivo Negativo Negativo Positivo Positivo Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Positivo Negativo Indeterminado Negativo Indeterminada Negativo Negativo Negativo Positivo Negativo Indeterminado Positivo Negativo Indeterminado Positivo Negativo Negativo Indeterminado Positivo Negativo Negativo

Total de muestras 64 17 Muestras positivas; 34 Muestras negativas 13 Muestras indeterminadas

Tabla n 11. Sueros Pareados Positivos

Cd 19 46 82 51 57

Fecha 23/01/09 02/02/09 18/02/09 03/02/09 06/02/09

Edad 44 44 44 33 33

Sexo M M M F F

Elisa IgM Positivo Positivo Positivo Positivo Positivo

Dilucin (2+) 12(80)

Cepas

2 - andamana, 2,11,12(80) 11 - Sjroe M84, 12 - Tarasovi 2, 11,12(80) 13 - Shermani 14 - biflexa

13, 14(80)

67 69 89 68 134

13/02/09 14/02//09 19/02/09 14/02/09 08/04/09

23 23 23 23 23

F F F M M

Positivo Positivo Positivo

5, 8, 11(80) 5, 11(80) 5(160); 8 y 11(80) 5 - grypotypho

Negativo 1, 15(80) Positivo 15(80)

15 - semaranga patoc

147 153

15/05/09 04/06/09

16 16 F

Positivo Positivo

12(80)

12 - Tarasovi

Total sueros pareados 16 5 Positivos 11 Negativos

Tabla n 12. Sueros nicos Positivos

Cd

Fecha

Edad

Sexo

Elisa IgM

16/01/09

53

Positivo

Dilucin (2+) 3(160); 5(320); 10(80); 11 y 12(160)

15 64 92 103 108 109

21/01/09 13/02/09 27/02/09 03/02/09 03/03/09 03/03/09

66 50 21 31 18 45

M M M M F M

Positivo Positivo Positivo Positivo


Indeterminado

1,13,14 (160); 15 (320) 3(80); 4(160); 5, 12y 13(80) 2, 3, 4(80); 5, 8(160 ); 15(80) 5(80) 1(160); 15(80) 2(80)

Cepas 5 - grypotypho, 3 - ballom, 12 - Tarasovi 1 - Automnalis, 13 - Shermani, 14 - biflexa, 15 - semaranga patoc 4 - canicola 5 - grypotypho 8 - pomona 5 - grypotypho 1 - automnalis 2 - andamana 3 - ballom 5 - grypotypho 7 - icterohaemo 9 - pirogenes 3 - ballon 5 - grypotypho 8 - pomona 9 - pirogenes 10 - Sejroe hardjo 11 - Sejroe M84 12 - Tarasovi 15 - semaranga patoc 5 - grypotypho, 2 - andamana, 11 - Sejroe M84 5 - grypotypho, 12 - Tarasovi, 14 - biflexa

Positivo

116

12/03/09

S/D

Positivo

3, 5, 7, 9(80) 2 y 13(80); 4 y 7(160); 3, 5, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15(320)

128

26/03/09

46

Positivo

155 158

04/06/09 04/06/09

44 14

F F

Positivo
Indeterminado

5, 11 (80) 2 y 11(80)

162

08/06/09

40

Positivo

5, 12, 14(80)

Total sueros nicos 48 12 Positivos; 23 Negativos; 13 Indeterminados

Tabla n 13. Sueros Indeterminados

Cd 1 8 24 66 78 80 85 88 131 161 154 157 48

Fecha 08/01/09 15/01/09 23/01/09 13/02/09 17/02/09 17/02/09 19/02/09 19/02/09 30/03/09 08/06/09 04/06/09 04/06/09 02/02/09

Edad 30 38 37 1 40 43 39 63 22 46 21 49 11

Sexo F M M M F M M F F F M M F

Elisa Ig M Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Indeterminado Indeterminado Negativo

Cepas reactivas para MAT 4, 13 3, 4, 8, 9,10, 11, 13 ,14.15. 2,3,5,11,12 3,5 2,3,4,5,8, 9,10,11,12,13,14,15 1,2,4,5,7,9,10,11,13, 14,15 2,3,4,5,8,12 2,3,4,5,8,9,11,12 2,3 4,15 5 11 2,3,5,11,12,15

Total sueros indeterminados 13

Tabla n 14. Interpretacin de los resultados serolgicos en humanos para el diagnostico de la Leptospira. LCRSP/ICGES RESULTADOS SEROLOGICOS Muestra de suero Suero I Suero II ELISA IgM Negativo MAT Interpretacin Caso negativo

Suero I Suero II

Suero I Sueros Suero II pareados.

Suero I Suero II

Suero nico (fase aguda)

Negativo ( titulo menor 80) Negativo o Negativo indeterminado ( titulo menor Positivo 80) Positivo (titulo igual o mayor que 80) Positivo Positivo ( titulo Positivo mayor 80) Positivo (aumento de 4 veces el titulo con respecto a la primera muestra) Negativo Positivo (titulo Negativo mayor 80) Positivo (titulo iguales a la primera muestra) Negativo o Negativo o positivo positivo

Infeccin reciente

Infeccin reciente

Infeccin pasada

Sueros nicos

Suero nico. Negativo Fase convaleciente menos de un mes. Suero nico Positivo ( fase convaleciente)

Negativos ( ttulos menor 80)

Negativo o positivo. Solicitar segunda muestra Caso negativo

Positivo(ttulos Infeccin mayor de 80 a reciente. diferentes serovares)

Tabla n 15. Lista de Cepas.

Fuente: LCRSP/ICGES Especie Serogrupo L. interrogans L. interrogans Australis Autumnalis

Serovar Australis Autumnalis Castellonis Bataviae Canicola Cynopteri Grippothyphosa Hedbomadis Copenhageni

Cepa Ballico Akiyami A Castrellon 3 Swart H. Utrecht IV 3522 C Moskva V Hebdomadis M 20

L. Ballum borgpetersenii L. interrrogans Bataviae L. interrogans L. kirschneri L. kirschneri L. interrogans L. interrogans L. interrogans L. borgpetersenii L. noguchii L. interrogans L. interrogans L. biflexa L. interrogans L. interrogans Canicola Cynopteri Grippothyphosa Hebdomadis Icterohaemorrhagie

Icterohaemorrhagie Icterohaemorrhagie RGA Javanica Panama Pomona Pyrogenes Semaranga Sejroe Sejroe Javanica Panam Pomona Pyrogenes Patoc Hardjo Wolffi Sejroe Tarossovi V Batavia 46 CZ 214k Pomona Salinem Patoc 1 Hardjoprajitno 3705 M 84 Perepelitsin

L. Sejroe borgpetersenii L. Tarossovi borgpetersenii

Tabla n 16. Condiciones de toma y envo de muestras para el diagnostico Bacteriolgico y Serolgico de la Leptospirosis.

Tipo de Muestra Serologa (Suero agudo)

Periodo de Toma 4 a 7 das del inicio de los sntomas 10-30 das despus de la primera toma Entre el primer y sptimo da ( periodo agudo febril de la fase septicmica)

Cantidad 3 ml

Condicin Estril. Enviar congelado o en cadena de frio 4 C. Evitar hemolisis. Igual al suero agudo.

Suero convaleciente Aislamiento sangre completa.

3 ml

5 ml

Liquido Cefalorraqudeo Orina

5-10 das desde el inicio de los sntomas 14-28 das despus del inicio del la enfermedad. 4-6 das del inicio de los sntomas. 5 das hasta los 7 del inicio de la enfermedad

0.5-1 ml

Para cultivar: estril con anticoagulante EDTA. Heparina 2 gotas u oxalato de sodio 0.5 ml de una solucin al 1% a temperatura ambiente. No usar citrato. Evitar hemolisis. Estril. Enviar a temperatura ambiente Para cultivar: enviar a temperatura ambiente, antes de las 2 horas de su obtencin. No meterla a temperatura superior a 30 C.

40 ml

40 ml

Fallecimiento. Tejidos: rin, hgado, pulmn bazo, corazn.

Al practicar la necropsia

Aproximadamente 25 gramos

Para PCR: congelar de inmediato y enviarla congelada a LCRSP. Para cultivar: estril. Enviar a 4 C en recipiente estril y bien cerrado en un plazo mximo de 6 horas. No congelar. Para PCR: enviar las muestras congeladas.

Tabla n 17. Naturaleza bifsica e investigacin de Leptospira dentro de sus diferentes estados de enfermedad. Desde inicio de sintomatologa.

Fuente: Manuel Cspedes Z. Laboratorio de Leptospiras, Centro Nacional de Salud Pblica, Instituto Nacional de Salud. Lima, Per

Figura n 10. Diluciones utilizadas en la Tcnica d e Microaglutinacin MAT. Fuente: Leptospirosis humana: gua para el diagnstico, vigilancia y control / Organizacin Mundial de la Salud; VP/OPS/OMS, 2008.

Foto no 3. Cultivos de Leptospiras en medio EMJH

Cultivo recin inoculado

Cultivo de 10 das

Foto no 4. Serovares de Leptospiras utilizados para la realizacin del MAT

Serovares para la realizacin del MAT

Foto no 5. Microscopio de Campo oscuro

Foto no 6. Solucin Tampn y Medio para Aislamiento de Leptospiras

Ficha para solicitud de examen de Leptospirosis. LCRSP Nombre del Centro: Nombre del Medico: Fecha:

Datos del Paciente:

Nombre: Domicilio: Prov. Sexo: M_______ Edad:_____

Apellido Paterno Distrito

Apellido Materno Corregimiento

de casada (o)

F_______ Fecha de Nacimiento:___________________

Ocupacin:_________________ Lugar de Trabajo Escuela:_______________ Expediente #:___________________ Seguro Social:__________________ Cdula:______________

Nacionalidad (Pas) Panameo Pas____________________ Condicin Migratoria: Turista

Extranjero

Residente

Indocumentado

Fecha ltimo ingreso al pas (DD-MM-AAAA)________________________ Ha viajado en el ltimo mes? Dentro del Pas. Fuera del Pas, No S

Lugar:__________________________________ Pas____________________________________

Fecha de inicios de sntomas_________________ (Importante tomar estos datos) Colocar ganchos o cruz para cada respuesta Si Sntomas - signos Fiebre > 38 C Fiebre Cefalea de sbita aparicin Dolor retroorbital bilateral Dolor muscular Esplenomegalia Tratamiento con antibiticos: ( )NO SI ( ) Cul?_________ No Sntomas -signos Erupcin Rash Rigidez de nuca Ictericia Insuficiencia renal aguda Hemorragia ocular Albuminuria Otros especifique: Si No

Tuvo contacto en el ltimo mes con materiales o productos (agua; alimentos, otros) potencialmente contaminados con orina de animal? No Si Especifique: ___________________________________________________ Presencia de animales en la residencia o alrededor ( ) Rata ( ) Perro ( ) Cerdo ( ) Caballo ( ) Vaca Animales silvestre ( ) Cul? ______________________________________ Contacto con ( ) Resumidero ( ) colecta de agua ( ) inundaciones ( ) Servicio de hueco ( ) agua estancada Tipo de vivienda: ( ) Casa ( ) Apartamento ( ) Barraca ( ) Rancho

MUESTRAS COLECTADAS: FECHA____________ Sangre estado agudo No ( ) Si ( ) LCR No ( ) Si ( ) Sangre estado convaleciente No ( ) Si ( ) (10 das despus) Sangre con heparina: No ( ) Si ( ) Orina No ( ) Si ( ) Material post mortem: No ( ) Si () Cul?

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