Introduo

As bactrias anaerbias estritas no necessitam de oxignio para sua sobrevivncia, no tendo assim capacidade de multiplicar-se em presena de oxignio atmosfrico, sendo capazes de causar patologia no ser humano, ento no realizam fosforilao oxidativa, o oxignio inibe o crescimento, podendo levar a morte das bactrias. Para muitas destas bactrias o oxignio danoso. A bactria anaerbia estrita se diferencia da bactria anaerbia facultativos, que tem capacidade de desenvolver seus processos metablicos, como na presena quanto na ausncia de oxignio. Os anaerbios estritos esto constitudos por numerosas famlias, gneros e espcies com caracteres morfolgicos como H2O2 que se formam em presena de oxignio e que podem ser txicos, bioqumicos e antignicos muito diferentes. Existem vrias teorias que tentam explicar esta susceptibilidade dos anaerbios estritos ao oxignio:

Oxignio seria um txico direto para a bactria anaerbia. As bactrias anaerbias estritas no tm a enzima catalase que impede a formao de grandes quantidades de perxidos. Oxignio altera enzimas bacterianas importantes no metabolismo (oxida, por exemplo, enzimas que contm sh).
As bactrias anaerbias estritas no possuem a enzima superxido dismutase, capaz de transformar o radical, o que altamente txico para a bactria.

Os anaerbios estritos por apresentarem instabilidade ao oxignio, explica a dificuldade existente nos laboratrios para seu isolamento e estudo.

At a dcada de 1970 parte das infeces causadas por estes microorganismo no eram diagnosticado por este motivo, a partir dessa dcada foram desenvolvidos procedimentos prticos de laboratrios para cri-la atmosfera de anaerobiose, ou seja ambientes em que no apresentam oxignio, possibilitando assim a identificao dos microorganismos entre eles os mais diagnosticados os esporulados do gnero Clostridium, hoje em dia as infeces por esses gneros so menos frequentes que as infeces provocadas por outros gneros de bactrias anaerbias.

As bactrias anaerbias estritas se encontram na microbiota normal do tubo digestivo, pele, trato respiratrio superior e genital feminino numa freqncia bem maior que as bactrias anaerbias facultativas e aerbias.

Quando existem fatores predisponentes estas bactrias provocam processos patolgicos em diferentes rgos e sistemas. Por este motivo, a maior parte das infeces provocadas pelas bactrias anaerbias estritas so infeces chamadas endgenas. a prpria microbiota bacteriana do doente que em determinado momento provoca o processo infeccioso, sendo este tipo de infeco pouco ou no contagioso. As infeces provocadas pelo gnero Clostridium so fundamentalmente adquiridas a partir do meio ambiente externo e por este motivo so chamadas de infeces exgenas. Nas mucosas, onde os anaerbios estritos formam parte da flora normal, existem condies locais de anaerobiose. Estas condies so provocadas por compostos orgnicos, enzimas, restos celulares e bactrias anaerbias facultativas que baixam o potencial redox nestes locais. As mais estritas crescem em atmosferas com 0,5% de oxignio, muitas crescem em atmosferas ao redor de 3% e algumas podem crescer ainda em concentraes de at 8% de oxignio. Como as bactrias anaerbias facultativas e aerbias favorecem a multiplicao dos anaerbios estritos, por consumirem o oxignio existente no local e talvez por produzirem alguns fatores de crescimento como substncias secundrias do seu metabolismo, a maior parte das infeces por bactrias anaerbias estritas so infeces mistas. Assim, so freqentes as infeces conjuntas com Enterobactrias, Pseudomonas e Staphylococcus aureus. Os anaerbios estritos no apresentam certas enzimas, como a catalase (que responsvel pela quebra do perxido de hidrognio em gua e oxignio), a peroxidase (na qual NADH + H2O de so convertidos em NAD e O2) e a superxido dismutase( na qual o superxido, O2, convertido a perxido de hidrognio). Estas enzimas detoxificam os radicais livres de perxido de hidrognio e de oxignio durante o metabolismo na presena de oxignio. Uma variedade de condies predispe um indivduo a desenvolver infeco por anaerbios. Podemos generalizar dizendo que todos os fatores que fazem diminuir a quantidade de oxignio nos tecidos, e, portanto, o potencial de oxi-reduo dos mesmos, favorece a infeco por anaerbios estritos. Um baixo potencial de oxi-reduo facilita o crescimento de bactrias anaerbias e a causa clnica mais comum de diminuio do potencial redox a anxia dos tecidos resultante de leso vascular, compresso, hipotermia, choque, edema e outras condies levando m perfuso.

Coleta do material
Para a obteno e manuteno de material confivel at a chegada ao Laboratrio recomendado utilizao de ferramentas apropriadas amostra clnica desejada. As amostras devem ser colhidas de forma que no entrem em contato com oxignio e no se contaminem com bactrias anaerbias da flora normal. Por este motivo devem ser aspiradas com seringa, da qual eliminado o ar imediatamente aps a obteno da amostra. O material no pode ser colhido com zaragatoa (swab) ou evitado, porque esto susceptveis de serem contaminados, mais expostas ao O2 e dessecao. Elas devem ser evitadas porque, no permite a preparao de um bom esfregao, colheita de pequeno volume de produto para amostra, alm disso, a zaragatoa no consegue penetra

num abcesso, logo h que drenar o abcesso, o que expe no ar e, alm disso, se o exsudado purulento escorrer sobre outros tecidos, a amostra est a ser contaminada por microorganismo desse local. Ao ser mergulhado no exsudado, a zaragatoa vai absorver uma quantidade menor do que o que seria aspirado por uma seringa, no permitindo assim a preparao de um bom esfregao. Para evitar a contaminao pelos anaerbios da flora normal, no devem ser semeados escarro, secreo farngea ou nasal, secrees vaginais, fezes ou material de colostomia, pois estes materiais sempre tm bactrias anaerbias. Idealmente, as bactrias anaerbias estritas so pesquisadas em lquidos aspirados de cavidades fechadas, material obtido por aspirao profunda de feridas, puno de traquia ou pulmonar e sangue para hemocultura. Em resumo, serve qualquer material que no esteja normalmente contaminado com as bactrias anaerbias da flora normal.

Transporte da Amostra
O tempo entre a coleta e o processamento do material de fundamental importncia para a rapidez e a confiabilidade dos resultados. Em geral, amostras clnicas destinadas bacteriologia devem ser encaminhadas imediatamente ao laboratrio, sempre conservadas segundo as caractersticas prprias. O transporte deve ser rpido e adequado de forma a preservar a viabilidade das bactrias e propores relativas das populaes bacterianas nos produtos, pois destes depende o sucesso do isolamento correto dos anaerbios estritos presente na amostra. Deve seguir as seguintes regras: As amostras devem ser mantidas a uma temperatura de 37C, durante o transporte ate o laboratrio. Evitar refrigerao das amostras, pois leva diminuio do nmero de microorganismos viveis. Velocidade de transporte deve ser mais rpido quanto menor for quantidade de amostra. Em caso de atraso de 15-20 minutos entre colheita e o processamento recorre-se a um dispositivo ou a um meio de transporte

Tubos fechados ou frascos com uma atmosfera anaerbica e base de agar isotonica que mantm ambiente hmido Port-A-Cul system, Anaerobic Transport Mdium, Anaport e Anatube

O transporte pode ser feito com a mesma seringa com que foi colhido o material. O melhor que a mesmo profissional que colheu leve imediatamente a seringa ao laboratrio. Tambm pode ser empregado, com este fim, um vidro do tipo de penicilina, que contm meio de tioglicolato de sdio ( 7 ml). O tioglicolato um sal redutor, de forma que no interior do meio existem condies de anaerobiose. A este meio liquido pode acrescentar uma pequena quantidade de gar (0,5%) para transform-lo em um meio mais espesso, o que dificulta a difuso de oxignio. O meio tem um indicador de oxigenao que a rezarsurina, de modo que se por algum motivo existe oxigenao do mesmo, o indicador adquire cor rosa. O material aspirado inoculado no interior do meio de cultura, atravs da tampa de borracha. Especial cuidado deve ter-se para no agitar o meio, antes e depois da inoculao, para evitar sua oxigenao.

Exame da amostra
1) Exame macroscpico O exame macroscpico pode ser feito pela inspeco visual ou com exame com luz ultravioleta Inspeo visual sugerem a presena de bactrias anaerbias: - Purulncia - Odor ptrido - Tecidos necrosados - Pus com gros de enxofre Exame com luz U.V. (360 nm) pesquisa de fluorescncia vermelho tijolo: anaerbios pigmentados Porphyromonas e Prevotella. 2)Exame microscpico Esfregao corado pelo Gram observao de morfologia tpica de muitas bactrias - Bacteroides bacilo Gram- pouco corado, pleomrfico -Fusobacterium bacilo Gram- fusiforme e fino - Veillonella coco Gram- pequeno - Actinomyces bacilo Gram+ ramificado - Clostridium perfringens bacilo Gram+ largo e retangular - Mtodo de Gram - funciona como um controlo de qualidade - Se espcimen transportada corretamente - Se meio de isolamento foi apropriado - Se sistema de incubao anaerbico foi apropriado - Se subcultura anaerbica foi feita corretamente - Se crescimento foi inibido pela presena de outras bactrias ou antibiticos Microscopia de campo escuro e contraste de fase demonstrao de espiroquetas Imunoflourescncia com anticorpos monoclonais rpida identificao de muitas espcies anaerbias, so muito caros pode ter muito falso positivo e falso negativo, no substitui cultura. 3) Outros procedimentos

Procedimentos que tambm podem ser feitos a cromatografia gasosa, teste sorolgico. Cromatografia gs-liquida (GLC) analise direta dos AG de cadeia curta - Culturas de sangue com algum valor - Analise directa de material purulento pouco sensvel e especifico Testes serolgicos uso limitado, teste de antigenio do ltex para Clostridium difficile

Processamento do material
Sempre feita uma colorao de Gram e de esporos, quando necessrio, da amostra recebida, o que pode orientar o clnico para o diagnstico e a teraputica precoce. Por exemplo, a observao num processo com aspecto de gangrena gasosa de bacilos gram positivos, grandes esporulados, quase confirmao do diagnstico de Clostridium e de gangrena gasosa. A existncia de poucas ou muitas bactrias na amostra permite orientar o bacteriologista se ele deve enriquecer previamente a amostra em um caldo ou fazer diretamente a semeadura em placa. Quando o material vem numa seringa, a semeadura feita em tioglicolato e em placa. Quando o material j vem no meio de tioglicolato, feita, a partir deste, a semeadura em placa, e incubados ambos os meios.

Identificao das bactrias anaerbicas

Identificao das bactrias anaerbias estritas e realizado da seguinte maneira: Presuntivo - TSA colistina, vancomicina, kanamicina - Provas bioqumicas - catalase, produo de indol, reduo de nitratos, polianetolsulfonato dcrescimento em 20% bile, alanina peptidase, discos verdes brilhantes, urease, licitinase e lipase - Testes cromognios kits de identificao rpida (4-24h) -glicosidase, galactosidase, glicosidase, -fucosidase Definitivo - Cromatografia gs-liquida (GLC) analise direta dos acido gordos de cadeia curta - Testes bioqumicos PRAS determinar atividade sacaroltica - Placas Presempto testes diferenciais nos quadrantes das placas I, II e III - Sistemas rpidos de identificao API 20 A, Minitek system, API-ZYM system

Produo de anaerobiose
Existem vrios procedimentos para conseguir no laboratrio uma atmosfera de anaerobiose adequada multiplicao das bactrias anaerbias produtoras de patologia no ser humano. Por exemplo: - Uso de tubos com meios slidos pr-reduzidos. - Cmaras anaerbias (glove box), nas quais o manipulador introduz somente as mos, sendo o ar eliminado, colocando-se uma mistura de gazes (H2, CO2, N2); nestas

cmaras existem todos os elementos necessrios para o trabalho bacteriolgico, incluindo estufas de incubao. - Sistema mais empregado o sistema das jarras de anaerobiose com geradores qumicos que permitem obter uma atmosfera adequada para a multiplicao destas bactrias. Existem diversos tipos de geradores. Os mais utilizados so os que provocam um consumo do oxignio com substncias redutoras como ferro reduzido ou cido ascrbico. Dentro da jarra colocado, alm dos geradores qumicos, uma fita de papel filtro impregnada de azul de metileno, que um indicador de anaerobiose. Quando a atmosfera do interior da jarra tem condies adequadas de anaerobiose, o azul de metileno altera para uma cor branca. Numa jarra de tamanho mdio 2,5 litros, coloca-se aproximadamente 10 placas e muitos tubos. Com estes sistemas o contedo de O2 da jarra cai a 0.4%, em aproximadamente 1 hora e meia, de forma que as condies anaerbias esto presentes bem antes da transformao do azul de metileno, que acontece por volta de 4-6 horas. Observar uma jarra com placas semeadas, um gerador de anaerobiose sobre a ltima placa, e o indicador de anaerobiose reduzido de cor branca. Comparar esta cor com a cor azul do indicador nos geradores localizados fora da jarra em sua parte inferior. Os mtodos citados acima do resultados semelhantes quanto eficcia do isolamento de bactrias anaerbias em amostras clnicas, porm, o sistema das jarras o mais prtico e menos complicado.

Semeadura em placa
As amostras so semeadas em trs placas de gar sangue preparadas com gar Brucella, adicionadas com 10% de sangue de carneiro. Uma das placas incubada a 37C em atmosfera aerbia, e uma segunda incubada a 37C em uma atmosfera com 5% de CO2 para bactrias microaerfilas. Para este fim colocamos a placa em uma jarra com um gerador de CO2, produzindo aproximadamente 5% de CO2. A terceira placa a que se inocula em atmosfera de anaerobiose. O meio de cultura desta terceira placa enriquecido com hemina (5mg/ml), vitamina K (10 mg/ml) e extrato de levedura (0,5%). Neste meio acrescenta-se tambm um antibitico aminoglicosdeo (geralmente amicacina, 100 mcg/ml). A adio do antibitico cria um meio seletivo porque os anaerbios estritos so resistentes a estes antimicrobianos e a maior parte das cepas de aerbios e anaerbios facultativos sensvel. Como a maior parte das infeces provocadas pelos anaerbios estritos so infeces mistas, este meio seletivo ajuda o isolamento bacteriano. No se justifica o uso de mais uma placa sem antibitico porque aumentam os custos sem aumentar o isolamento de anaerbios. Estas placas so incubadas dentro da jarra a 37C de temperatura durante 48 horas. Quando se suspeita, pelo quadro clnico ou pela colorao de Gram da amostra, que estamos em presena de uma infeco por Clostridium, que so de crescimento mais rpido, as jarras podem ser abertas aps 18 a 24 horas de incubao. Por outro lado, bactrias de crescimento mais lento, como os actinomices, podem demorar sete dias ou mais para formar colnias visveis.

Incubao em anaerobiose

Jarra anaerobiose: Fica fechada e apresenta um gerador, extrai a atmosfera normal ( com 21% de oxignio), e introduz a mistura gasosa livre de oxignio, quando fecha a jarra, o gerador comea a produzir atmosfera sem oxignio, mas algum oxignio pode ficar retido, o hidrognio produzido pelo gerador combina com o oxignio e forma a gua que se deposita no fundo da jarra, logo empilha varias placas de petri na jarra, mas a placa do fundo fica vazia, para evitar a contaminao por bactrias que podem ser arrastadas pela gua. Apresenta como desvantagem anaerobiose relativamente lenta, principalmente se for feita com um gerador. Saco de anaerobiose: Formado por um plstico impermevel ao ar e com gerador da mistura gasosa sem oxignio. pequeno e mais barato que a jarra sendo assim mais utilizados pelo laboratrios. Apresenta desvantagens por poder utilizar apenas duas placas de petri de cada vez. Cmara de anaerobiose: neste tipo tudo se processa em anaerobiose, uma cmera fechada , onde existe uma porta por onde se introduz os meios de cultuta, ou seja, todo o processamento da amostra e feito em anaerobiose. Funciona segundo sistema de evacuao/substituio> tendo como desvantagens o custo muito elevado e ocupa muito espao.

COMPROVAO DE ANAEROBIOSE ESTRITA

Aps a incubao, as placas so examinadas e agora o passo mais importante a comprovao de que as bactrias desenvolvidas nas placas de anaerobiose so anaerbios estritos. Para este fim, so feitas coloraes de Gram, de todos os diferentes tipos de colnias observadas nas trs placas e comparada a morfologia bacteriana. Ao mesmo tempo, semea-se as diversas bactrias obtidas, novamente em anaerobiose e aerobiose. S feito o diagnstico de anaerbio estrito quando, aps 24 a 48 horas da nova incubao, a bactria apenas crescer na placa de anaerobiose. O Gram das colnias j orienta para uma identificao preliminar do grupo de anaerbio isolado. Agrupamento das bactrias anaerbias estritas, de importncia em patologia humana de acordo com sua morfologia na colorao de Gram: - Cocos Gram positivos: Staphylococcus Peptostreptococcus, Streptococcus - Bacilos positivos no esporulados: Gram Propionibacterium, Bifidobacterium, Actinomyces, Eubacterium, Lactobacillus - Bacilos gram negativos: Bacterides, Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas. - Cocos gram negativos: veillonella, acidaminoccocus, megasphaera - Bacilos gram positivos esporulados:clostridium.