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Empleo de anticoagulantes La heparina no es aconsejable en la extraccin de la muestra para hemograma ni confeccin del frotis EDTA: Anticoagulante Sangre 50l

5ml 20l 2,5ml 10l 1-2ml Recuentos celulares manuales Cmara de Neubauer Para leucocitos y plaquetas: Recuento en cmara (mtodo de referencia) Para eritrocitos no se utiliza porque el CV >20% Esta compuesta por dos superficies elevadas, cada una de ellas de forma cuadrada, de 3 x 3mm separada por una hendidura en forma de H. Este cuadrado grande presenta 9 cuadrados de 1 x 1mm, los de las esquinas se encuentra dividido en 16 y el central en 25.Encima de la superficie de recuento se coloca un cubreobjetos. La distancia entre casa superficie de recuento y el cubre objetos es 0,1mm (volumen total 0,9mm3). Procedimiento para cargar la cmara de Neubauer 1. Limpiar la camara y el cubre objetos con alcohol 2. Hacer la dilucin correspondiente 3. Despus de cargar la pipeta dejar en reposo 10 minutos para asegurar la lisis de los eritrocitos (recuento de leucocitos) 4. Desechar unas gotas de la pipeta. Cargar ambos lados de la camara sosteniendo la pipeta en una angulo de 45 y tocar con la punta de la pipeta el borde del donde se junta con el piso de la camara. A menudo en este lugar hay una muesca en forma de V. la camara se llena por capilaridad 5. Despus de cargar la camara contadora, colocarla en una camara humeda durante 1 a 2 minutos para permitir que sedimenten las celulas 6. Colocar la camara en el microscopio y enfocar usando el objetivo de bajo aumento (10x) 7. En el caso de los leucocitos contar todas las celulas que se encuentran dentro de los cuadrados grandes. La variacin en el recuento de cada cuadrado no debe diferir en ms de 10 celulas. Las clulas que tocan las lineas superior e izquierda deben contarse, las que tocan las lineas inferior y derecha se ignoran. las plaquetas se cuentan con objetivo de 40x. Contar los 25 cuadrados pequeos del cuadrado del centro. Deben contase ambos lados de la camara y los recuentos no deben diferir en ms del 10%. 8. Hacer un promedio de los lados y calcular el nmero de celulas Recuento total = cl. contadas x factor de dilucin x 10 rea (en mm2)

Clulas Liquido contadas diluyente Leucocitos cido acetico Eritrocitos Plaquetas

Dilucin Objetivo 1:20 10x 40x

rea contada 4mm2 0,2mm2

Rango de referencia 5,010,0 103/mm3 M:3,8-5,8 106/mm3 H:4,5-6,6 106/mm3 150-350 103/mm3

Solucin salina 1:200 isotonica Oxalato de amonio 1:100

40x micro 1mm2 cotraste de fase

Recuento de plaquetas Directo: recuento en cmara (mtodo de Brecher) Indirecto: recuento en frotis. Si el Hto es normal: contar 5 campos de 200 eritrocitos. Si el Hto es bajo: contar 10 campos de 100 eritrocitos. En el frotis, estimativamente un valor normal de plaquetas es de 7 - 20 por campo de 200 eritrocitos, cuando presenta un valor normal de glbulos rojos. Estimacin de leucocitos 10x: contar 3 campos (diferencia <5 clulas) Ncl./mm3 = n x 1000/3 40x: contar 10 campos (diferencia <1 o 2 clulas) Ncl./mm3 = n x 2000 Tincin May Grunwald - Giemsa Fundamento Previo al proceso de tincin hay una fijacin con metanol cuya accin desnaturalizante sobre las protenas celulares produce una precipitacin y adherencia de estas al portaobjetos. La solucin de May Grunwald est formada por eosinato de azul de metileno en metanol. La combinacin del alcohol metlico y el colorante permite que la fijacin y la coloracin se produzcan a la vez. La tincin efectiva se inicia con la adicin del estabilizador al colorante lo que da lugar a su ionizacin. El estabilizador es un buffer fosfatos (pH 6.5) que asegura la tincin salmn de los hemates, descartndose los accidentes de las tonalidades rojo fucsia, que dificultan la tincin de los leucocitos, y de las azuladas, que entorpecen la metacromasia. La solucin de Giemsa es una solucin de metanol con azur, eosina y azul de metileno. La solucin de May Grunwald colorea el citoplasma de linfocitos, monolitos y clulas inmaduras. La solucin de Giemsa colorea la cromatina, grnulos y azurofilos La dilucin de Giemsa debe prepararse en el momento de realizarse la coloracin. Procedimiento 1. Preparar la solucin estabilizadora (30 mL de estabilizador en 1000mL de agua). 2. Preparar la dilucin de Giemsa con agua corriente (dilucin 1/3 aprox). 3. Cubrir completamente los extendidos con May Grunwald y dejar actuar no ms de 1 minuto. 4. Cortar rpidamente la reaccin y lavar con estabilizador. 5. Cubrir completamente los extendidos con la solucin de Giemsa recin preparada y dejar actuar 15 minutos. 6. Lavar con agua corriente (varias veces).

Confeccin y observacin microscpica del extendido de sangre Confeccin Material de vidrio escrupulosamente limpio. Se recomienda usar sin anticoagulante. En caso de no poder, confeccionarlos antes de las 2hs. Se debe realizar con las primeras gotas de sangre, para no producir errores en la distribucin de las clulas. Observacin A menor aumento 10x o 40x. Se debe observar: Distribucin celular de leucocitos, eritrocitos y plaquetas Tamao, utilizar como referencia el hemate normal semejante a un linfocito pequeo. Estimacin de los leucocitos El recuento diferencial de leucocitos se puede realizar en 40x o en 100x, las plaquetas en 100x. Reticulocitos El reticulocito es la ltima fase del erotrocito inmaduro. En condiciones normales, un reticulocito pasa dos das en la mdula sea y un da en sangre perifrica antes de transformarse en un eritrocito maduro. El reticulocito contiene remanentes citoplasmticos de ARN y organelas como mitocondrias y ribosomas. El recuento de reticulocitos se usa para evaluar la actividad eritropoyetica de la mdula sea. La sangre entera, anticoagulada con EDTA, se tie con azul de cresilo. Todo eritrocito no nucleado que contenga dos o ms particulas de material granulofilamentoso de color azul se define como un reticulocito. Procedimiento 1. Mezclar una gota de sangre con dos de colorante 2. Incubar 15 minutos en estufa de 37C 3. Preparar el extendido Origen de errores y comentarios 1. Otras inclusiones de los eritrocitos que se tien con colorantes son los cuerpos de Heinz, de Howell-Jolly y de Pappenheimer. Los cuerpos Heinz representan Hb precipitada, por lo general son redondos u ovalados, y tienden a adherirse a la membrana celular. Los cuerpos de Howell-Jolly son fragmentos nucleares redondos y por lo general nicos. Los cuerpos de Pappenheimer son fragmentos frricos de las mitocondrias. ndices eritrocitarios Volumen corpuscular medio (VCM) Es el volumen medio de los eritocitos, expresado en femtolitros VCM = Hto x 10 Eritrocitos Hemoglobina corpuscular media (HCM) Es el peso medio de la Hb en un eritocito, espresada en picogramos HCM = Hb x 10 Eritrocitos

Concentracin de hemoglobina corpuscular media (CHCM) CHCM = Hb x 100 Hto Contador hematolgico Determinacin de Hemoglobina La medicin de Hemoglobina se realiza utilizando un reactivo biodegradable, libre de cianuro llamado sulfolyser que brinda excelentes resultados sin contaminar el ambiente. Se utiliza un detergente (Lauril Sulfato de Sodio) que permite una rpida conversin de hemoglobina a un complejo que se lee a 550 nm. Una ventaja adicional de este reactivo es que, al ser un detergente, la cmara de hemoglobina no debe ser limpiada especialmente. Determinacin de hematocrito El hematocrito es medido electrnicamente por los equipos Sysmex, a diferencia de otros contadores en los cuales se obtiene por clculo. El principio en el que se basa es el siguiente: "el pulso que se genera cuando los eritrocitos pasan a travs de la abertura de la cmara de medicin es proporcional a su volumen". El hematocrito se expresa como un porcentaje y es determinado comparando el volumen total o acumulado de clulas rojas y el volumen total de sangre. Medicin de Glbulos Rojos y Plaquetas Los glbulos rojos y las plaquetas son analizados utilizando el mtodo de resistencia electrnica a la corriente directa (o impedancia) obtenindose los histogramas de glbulos rojos y plaquetas. La impedancia es la mediada de la capacidad que tiene un objeto de oponerse al movimiento de una carga elctrica. Se basa en la determinacin de los cambios de la corriente elctrica producidos por partculas suspendidas en un liquido conductor que atraviesa una abertura de dimensiones conocidas (la abertura para el recuento de glbulos blancos es de mayor tamao que la de los rojos). Cada una de las clulas atraviesa la apertura, impidiendo el flujo de corriente, el voltaje debe aumentar para mantener la corriente constante. Este cambio genera un pulso elctrico. El nmero de pulsos elctricos indica el nmero de partculas que atraviesa la apertura. Adems el volumen de cada clula puede determinarse midiendo la amplitud del pulso, ya que son magnitudes directamente proporcionales. El nmero de pulsos elctricos es directamente proporcional al nmero de clulas. Los pequeos cambios son amplificados y la posible interferencia elctrica es eliminada por un filtro electrnico. Generacin de histogramas y discriminadores Los contadores hematolgicos que aplican metodologa DC, utilizan discriminadores para separar una poblacin celular de otra y para eliminar posibles interferencias. Para cada tipo celular examinado por el contador, existe un volumen mnimo llamado discriminador bajo que permite eliminar interferencias tales como ruidos elctricos. Los pulsos elctricos mayores que el discriminador son tomados en cuenta para el clculo, y de esa forma se construyen los diferentes histogramas para los glbulos rojos y plaquetas. Determinacin de Glbulos Blancos En el SYSMEX K-4500 la medicin de glbulos blancos se realiza utilizando la misma metodologa que para glbulos rojos y plaquetas. De esta forma se obtiene un histograma donde se diferencian tres poblaciones: linfocitos, clulas mixtas( monocitos, eosinfilos , basfilos), y neutrfilos .

Histogramas
Neutrfilos Mixtas

Linfocitos

Lin%: porcentaje de linfocitos Lin#: N de linfocitos Mix% (eos, baso y mono): porcentaje de clulas medianas Mix#: N de clulas medianas Neu%: porcentaje de neutrfilos Neu#: N de neutrfilos

RDW (Red Cell distribution Width): medida de la amplitud de la distribucin del volumen de los eritrocitos. RDW-CV: es el coeficiente de variacin alrededor de la media (X). El analizador localiza la posicin donde el 50% del rea bajo la curva cae a cada lado de la media. DW-SD: medida (en fL) directa del ancho de la curva de la curva de los glbulos rojos (RBC). Toma el 20% arriba de la lnea de base. A esta altura es donde se encuentra la mayor variacin de tamao de las clulas. PDW: ancho de distribucin plaquetaria. Es la medida del ancho de la distribucin tomada al 20% de la altura de la curva de frecuencias. VPM (volumen plaquetario medio) P-LCR (porcentaje de plaquetas grandes)

Velocidad de sedimentacin globular (VSG) o Eritrosedimentacin Cuando se deja sangre anticoagulada en reposo a temperatura ambiente, los eritrocitos sedimentan hacia el fondo del tubo. La VSG es la cantidad de mm que los eritrocitos sedimentan en una hora, es afectada por el plasma, tamao de los eritrocitos, factores tcnicos y mecnicos. Los eritrocitos tienen una carga superficial neta negativa. Las fuerzas repulsivas se neutralizan en forma parcial o total si hay un aumento se protenas plasmticas con carga positiva (fibringeno, -globulinas e Igs). La albmina plasmtica produce un efecto inverso. La sedimentacin globular se realiza en tres etapas: 1) hemoaglutinacin o tendencia de los hemates a formar pilas de monedas, 2) sedimentacin o desplazamiento de los

hemates hacia el fondo del recipiente a velocidad constante y 3) acmulo de los hemates en el fondo del recipiente. De estas etapas la ms importante es la primera ya que de la primera depender la velocidad de todo el proceso. Mtodo de Westergreen La sangre se mezcla con anticoagulate (citrato de sodio al 3,8%) en la proporcin de cuatro volmenes de sangre por volumen de anticoagulante. Una vez realizada la mezcla, la determinacin se realiza dentro de las 2hs (si la muestra se conserva a temperatura ambiente) o dentro de las 6hs (a 4C). Se homogeiniza la sangre y se llena la pipeta de Westergreen hasta la marca de 0mm. Se coloca la pipeta sobre el soporte, se deja durante 60 minutos y luego se lee la distancia en mm. Origen de errores 1. Si se aumenta la concentracin de anticoagulante, la VSG tendr valores bajos falsos 2. Los anticoagulantes oxalato de sodio o potasio y la heparina hacen que los eritrocitos se contraigan y producen valores de VSG elevados falsos. 3. las burbujas de aire en la columna invalidan los resultados de la prueba Determinacin de hemoglobina El mtodo de referencia para la terminacin de Hb es el de la cianmetahemoglobina (mtodo de Drabkin). Hb (Fe2+)K3Fe(CN)6 metahemoglobina (Fe3+)KCN cianmetahemoglobina

La absorbancia de la cienmetahemoglobina a 540nm es directamente proporcional a la concentracin de Hb. Hematocrito El hematocrito es la cantidad de eritrocitos centrifugados que ocupa un volumen determinado de sangre entera, expresado como porcentaje. Origen de errores y comentarios 1. Una cantidad excesiva de anticoagulante disminuye el Hto. 2. Si la muestra no se mezcla en forma adecuada puede obtenerse un resultado erroneo 3. La centrifugacin insuficiente o una demora en la observacin de los resultados despus de la centrifugacin aumenta la lectura del Hto. 4. Algunas enfermedades, como la anemia de celulas falciformes, anemia microcitica, anemia hipocromica, esferocitosis y talasemia, pueden hacer que quede plasma atrapado entre los aun cuando el procedimiento se realice de forma adecuada. El atropamiento del plasma hace que el Hto sea ms alto que el obtenido con instrumentos automatizados que calculan el Hto. 5. la perdida de liquido en un cuadro de deshidratacin disminuye el volumen plasmatico y aumenta la lectura del Hto.

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