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ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

PRÁCTICA Nº 02
Recuento total de microorganismo
Método de Breed
ASIGNATURA :

Microbiología de los Alimentos I

DOCENTE :

Dra. Graciela Albino Cornejo

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga

CICLO :

2007 - II

Lambayeque, 28 de enero de 2008.

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PRÁCTICA Nº 02
RECUENTO MICROSCOPICO DIRECTO POR
EL METODO DE BREED
I. Introducción:

Los recuentos microscópicos directos permiten determinar el número de células


microbianas, por observación directa en el microscopio. Presentan una gran ventaja ya
que la muestra puede utilizarse tal cual, (si es líquida como leche o cultivos puros en
medio líquido), o puede prepararse una dilución tal como se realiza para otros métodos
de recuento.
Se basa en contar m.o. en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis
coloreados, cámaras del tipo de las de contar glóbulos, o las especialmente diseñadas
para contar hongos en alimentos como la cámara de Howard.
Se determina el número TOTAL de células presentes (VIABLES Y NO VIABLES)
Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados
metabólicos de las células. Por ejemplo en un recuento en cámara de un cultivo de
levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las células VIABLES (no absorben
el colorante, se verán transparentes) de las NO VIABLES (absorben el colorante y se
verán azules).
El método de Breed es un método de recuento directo bastante simple, fácil y eficaz a
pesar de ser un método antiguo (1911). Este método de Conteo Directo al Microscopio
(CMD) es usado mayoritariamente para el diagnostico microbiológico de la leche y se
lo considera un método rápido para estimar el grado de contaminación bacteriano de la
leche pero que no está diseñado para el conteo rutinario de la leche cruda ya que el
conteo en placa es más preciso, más práctico y más barato que un conteo directo
ejecutado adecuadamente. Si el método se contemplara como un método para estimar la
calidad de la leche con propósito de pago, su uso sería limitado para pequeño número de
muestras con alto contenido bacteriano (2.3 x 106 ufc/mL) debido a la insensibilidad del
método.
El método de Breed también es usado para diagnóstico de mastitis bovina (diagnóstico
subclínico). En ésta, el coloreado con azul de metileno nos permite ver además
leucocitos y células somáticas, también se pueden usar coloraciones por los métodos de
Levowitz–Weber o Broadhurst–Paley que permiten observar específicamente células
somáticas en leche.

II. Objetivos:

 Hacer un recuento toral de microorganismos que hay en una muestra (leche).


 Emitir juicio de valor sobre la calidad de la leche.

III. Materiales:

 Microscopio calibrado
 Láminas portaobjeto
 Lámina patrón de Breed
 Pipeta de Breed o asa en anillo calibrado
 Colorante de Gram o Azul de metileno

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 Xilol
 Papel Tisú
 Muestra: leche

IV. Procedimiento:

1. - Estandarización del Equipo:


 Se coloca la lámina patrón que tiene una tabla macrométrica marcada, que
tiene divisiones de 0.1 a 0.01 µm; con el objetivo de inmersión, proceder así:
 Medir el campo en mm. hasta el tercer decimal.
 Determinar el área del campo en mm2; aplicando la fórmula de
superficie del círculo:
Ao = π r2

 Cálculo del factor microscópico:


 Se mide con exactitud el área del microscopio en mm2.
 Luego se divide 100 entre el área encontrada (X = 100 x Acampo).
 Luego, para hallar el factor microscópico se multiplica este valor
hallado por 100 (FM = X x 100)
 Se indica que los microscopios tiene un factor de microscopio de
300,000 a 600,000.

2. Preparación de la Película:
 Se lava la lámina, desengrasándola. Una vez hecho se coloca sobre la lámina
patrón, en este caso al carecer de ella se coloca una lámina de cartón que
tenga una cuadrado de 1 cm2.
 Enseguida colocar la muestra de leche previamente homogenizada (20
veces).
 Con el asa calibrada se coloca 0.01 ml. de la muestra en la lámina. Esta se
extiende por toda el área del cuadrado de la lámina patrón.
 Luego debe hacerse el secado lento para evitar el resquebrajamiento de la
película; en especial cuando la muestra se trata de leche.
 En algunas muestras es necesario desengrasar la película con Xilol.

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 Teñir la película por el Método de Gram o tinción simple con azul de
metileno.

3. Examen Microscópico:
 Contar en el microscopio los microorganismos por campo utilizando lente de
inmersión. Se cuenta a lo largo de toda la película.
 Se cuenta como mínimo 20 campos y un máximo 100 campos.
 Cuando se cuentan los microorganismos se deben de contar como uno solo:
aquellas bacterias que están solas, los agregados, los grupos, los cocos o
bacilos en cadenas.

4. Cómputo y cálculo del microorganismo:


 Cada alumno contará un mínimo de 20 campos.
 Luego se sacará un promedio del número de microorganismos por campo y
se multiplica por el factor microscópico.
 Luego, como la muestra usada fue de 0.01 mL, multiplicaremos el resultado
anterior obtenido por 100 para pasarlo a la misma unidad (mL).

RECUENTO = Nº X Factor X Recíproco


MICROSCÓPICO DE promedio microscópico de la
MICROORGANISMOS de m.o por dilución

4
campo

V. Cálculos y Resultados:

 Cálculo del promedio de microorganismos por campo:

# de # de
# de m.o # de m.o
campo campo
1. 9 11. 3
2. 2 12. 6
3. 4 13. 7
4. 9 14. 3
5. 8 15. 5
6. 9 16. 4
7. 5 17. 6
8. 6 18. 1
9. 3 19. 4
10. 5 20. 2

Promedio de m.o. por Σm.o.


=
campo Nº de campos

Promedio de m.o. por 101


campo = 20

Promedio de m.o. por


5.05
campo =

 Cálculo del área del microscopio (100X)


- Al medir el área del microscopio, primero se midió el diámetro del campo
visto con objetivo de inmersión (100X); se contó 17.5 líneas.
- Como cada línea equivale a 10 µm se pasó a convertir las líneas a µm:

17.5 x 10 µm = 175 µm

- Luego se pasó este valor de µm a mm dividiéndolo entre 1000:

1 mm
175 µm x = 0.175 mm
1000 µm

- Luego, con este valor podemos hallar el área del círculo o en este caso, del
campo microscópico (Acampo = π x r2), en este caso como tenemos el
diámetro y no el radio, lo único que se hace es dividirlo entre 2.

5
Acampo = 3.1416 x (0.175 mm/2)2

Acampo = 3.1416 x (0.0875)2

Acampo = 3.1416 x 0.00765625 mm2

Acampo = 0.02405 mm2

 Cálculo del factor microscópico (FM)


- Luego, con el área del campo (en mm2) hallado, podemos ahora hallar el
FM.
- Primero dividiremos 100 entre el campo hallado, este dato vendría a ser el
número de campos por frotis.

X = 100 ÷ 0.02405 mm2

X = 4158 mm-2

- Luego, a este valor se lo multiplica por 100 para hallar el FM (el factor
microscópico debe estar entre 300,000 y 600,000.

FM = 4158 mm-2 x 100

FM = 415 800 mm-2

- Este factor hallado se realizó con el microscopio Motic Nº 1, código


34223-03.
- La lámina patrón usada fue una lámina marca “Zeiss” de 5 + 100/100 mm.
- Luego, ya con estos datos se puede hallar el recuento de m.o. en muestra.

Nº promedio Recíproco
Nº de m.o. en Factor
= de m.o por X X de la
muestra microscópico
campo dilución

Nº de m.o. en
= 5.05 x 415 800 x 100
muestra

Nº de m.o. en
= 209’979,000 m.o/mL
muestra

- Entonces el recuento de m.o. en la muestra de leche traída nos dio un total


de 209’979,000 m.o/mL.

VI. Preguntas:

1) Buscar la Norma Técnica peruana o internacional por el Método de Breed para


leche.

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- La Norma Técnica Peruana para el Método de Bredd se puede conseguir con el sgte.
nombre: “Leche Cruda: Numeración de Células Somáticas. Método del
Microscopio”; con código NTP 202.173:1998, y tiene un costo de S/. 48.92. Esta
norma técnica será comprada en conjunto por los alumnos de práctica del curso en
los próximos días.

2) Con que otros colorantes se realiza tinción para el método.


- Se puede utilizar un microscopio de fluorescencia, en el cual se utilizará un tipo de
colorante distinto (fluorenscentes) como el azul de anilina modificado.
- Las células viables se pueden diferenciar de las no viables, para eso se puede usar la
naranja de acridina (0,01%), este es el método de recuento directo con naranja de
acridina (AODC).
- También se pueden usar coloraciones por los métodos de Levowitz–Weber o
Broadhurst–Paley que permiten observar específicamente células somáticas en
leche.

3) Para que otros alimentos se realiza el método.


- Se puede realizar para otros productos lácteos derivados y otros productos
alimenticios, siempre y cuando sean líquidos, como por ejemplo leches fermentadas
(leche acidófila), vino, sidra (para contar levaduras).

VII. Referencias:

- Autor desconocido (1982). Mastitis bovina con especial énfasis en la realidad


nacional (diagnóstico). Monografías de Medicina Veterinaria, Vol. 4, Nº 2, obtenido
el 19 de enero de 2008 en
http://www.monografiasveterinaria.uchile.cl/CDA/mon_vet_simple/0,1420,SCID%2
53D7819%2526ISID%253D414%2526PRT%253D7798,00.html
- AVILA TELLEZ, S. (2005). Mastitis: Diagnostico, tratamiento y control. Obtenido
el 19 de enero de 2008 en
http://www.fmvz.unam.mx/biblivir/BvS1Lb/BvS1Pdf/Avila/cap8.pdf
- COTRINO, V. (2005). Mastitis bovina. Obtenido el 19 de enero de 2008 en
http://lmvltda.com/programas/ar21.html
- DAVILA F., Nuria y J. E., HERNANDEZ G. (2006) Métodos de ensayos rápidos de
detección de microorganismos en la leche. Revista Electrónica de Veterinaria
REDVET, Vol. VII, Nº 07, obtenido el 19 de enero de 2008 en
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n070706/070603.pdf
- GUERRA RODRIGUEZ, V. (2005). La mastitis y sus pruebas diagnósticas.
Obtenido el 19 de enero de 2008 en
http://www.engornomix.com/la_mastitis_sus_pruebas_s_articulos_935_GDL.htm
- PRUEBAS BIOQUIMICAS. Obtenido el 19 de Enero de 2008 en
http://mail.fq.edu.uy/~microbio/MGral/practico/segundociclo.doc