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Boutet Flavie Germain Laura Bastos Vasques Roberta Cadoudal Marine Baconnais Marlne

L3 MACQ Anne 2010/2011 le 07/04/11

Travaux Pratiques de Biochimie


Introduction
Lors de ce TP, nous avons travaill sur lenzyme -galactosidase (E.C 3.2.1.23) faisant partie de la famille des hydrolases. Sa fonction est dhydrolyser des -galactosides en monosacharides comme par exemple le lactose quil hydrolyse en glucose et galactose. Dans notre cas, nous avons hydrolys lortho-nitrophnyl Dgalactopyranoside (o-NPGal) en o-nitrophnol et galactose, en coupant la liaison osidique.

La -galactosidase est une protine ttramrique (118kDa) avec un poids molculaire de 464 kDa. Son pH optimum est compris entre 6 et 8, sa temprature optimale est de 35C et son point isolectrique est de 4,6.

Chaque sous unit de la -galactosidase est compose de 5 domaines dont le troisime forme le site catalytique de lenzyme pouvant accueillir diffrents substrats spcifiques et danalogie structurale. Ce TP va donc nous permettre, dans un premier temps, de caractriser la -galactosidase en valuant son activit dans un extrait partiellement purifi et dans diffrentes conditions opratoires. Ensuite, nous avons purifier lenzyme laide diverses techniques chromatographiques et nous avons valuer sa stabilit diverses conditions de tempratures et de pH.

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Evaluation de lactivit dans un extrait partiellement purifi


a) Dtermination du coefficient dextinction molaire du produit de la raction:

Dans cette partie, nous avons fait varier la concentration do-NitroPhnol (oNP) afin de dterminer son coefficient dextinction molaire . Pour cela, 10 dilutions successives au demi ont t ralises dans un tampon phosphate (NaH2PO4 100mM pH=7.3). Pour toutes les dilutions on aura un volume final de 3mL. La DO 415 nm sera alors mesure pour chaque tube. Concentration oNP 0,0048 0,009 mM 8 76 DO 415nm 0,021 0,032 0,0195 3 0,054 0,0390 0,0781 0,1562 0,3125 0,625 6 3 5 0 00 0,103 0,199 0,379 0,749 1,503

En traant la droite de la DO en fonction de la concentration en oNP, on dtermine le coefficient dextinction molaire comme tant la pente de cette droite.

Do =2.4071 L/mmol/cm soit =2407 L/mol/cm

Dtermination du rapport x : Quantit oNP mol DO 415nm 0,029 0,0146 3 0,021 0,032 0,0586 0,054 1,875 0,1172 0,2344 0,4688 0,9375 0 0,103 0,199 0,379 0,749 1,503

De mme avec la droite de la DO en fonction de la quantit en oNP on dtermine le rapport x comme tant linverse de la pente.

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Do x=1/0.8024=1.25 mol/DO415nm

b) mesure de lactivit :

Conditions opratoires de rfrence :

2,7ml de tampon phosphate 100 mM 0,1 ml de MgCl2 30 mM 0,1ml dextrait

On fait ce mlange et on le met dans une cuve spectro pour faire le zro. Ensuite, nous avons ajout 0,1ml de substrat (o-NPGal) 20 mM. On relve alors les DO415nm pendant 3min toutes les 30 secondes.

temps (min) Do 415 nm

0 0,046

0,5 0,10 9

1,5

0,240 0,374

2 0,52 2

2,5 0,68 0

3 0,83 7

Pour calculer lactivit de lenzyme, on doit dterminer sa DO/min. C'est--dire quon fait la diffrence entre la DO 3min et la DO t0, DO = 0.791. Puis on divise par 3 pour lavoir pour 1min, on trouve 0.264 DO/min. On divise ce rsultat, par le coefficient dextinction molaire gale 2407.1 L/mol/cm et par l (paisseur de la cuve) gale 1cm. On trouve alors 1.098.10-4 mol/L/min. Le volume ractionnel est de 3mL, ce qui nous donne 3.29.10 -7 mol/min = 0.329 mol/min dans le milieu ractionnel. Lactivit de lenzyme est donc 0.329UEI.

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NB : Une UEI (unit enzymatique internationale) correspond la quantit denzymes qui va produire 1 mol de produit par min ou utiliser 1mol de substrat par min.

c) Cintique en fonction du temps :

Pour suivre la cintique de notre extrait en fonction du temps, nous avons prpar un tube contenant : 1.8 mL de tampon phosphate 100 mM 1 mL de oNPgal 1 mM (pralablement prpar partir de oNPgal 10 mM) 0.1 mL de MgCl2 30 mM

Ce mlange est incub 5 minutes et plac dans une cuve spectromtrique. On ajoute ensuite 50L de notre extrait tout en dmarrant le chronomtre. On relvera la DO 415 nm de ce mlange ractionnel certains temps pendant environ 2h. temps (min) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 15 20 25 30 40 100 DO 415nm 0,278 0,361 0,444 0,529 0,615 0,702 0,784 0,872 0,955 1,038 1,411 1,668 1,76 1,78 1,789 1,779

La courbe de la DO en fonction du temps obtenue nous permet de dterminer la vie de notre enzyme.

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DOmax = 1.789 T1/2 est dterminer partir de la courbe DOmax/2 = 0.894 , t1/2= 8.4 min. d) Cintique en fonction de la concentration en substrat :

Afin de suivre lvolution de la cintique de cette raction en fonction de la concentration en o-NPGAL nous allons prparer des solutions partir de 10 dilutions en srie et au partir dune solution de substrat 10mM dans du tampon phosphate 100mM. Dans chaque tube ractionnel on introduira 2,8 ml de ces diffrentes solutions, auxquelles on ajoutera 100 l dune solution de MgCl2 30mM. Ce suivi se fera par spectrophotomtrie, grce la coloration du produit, une longueur donde de 415nm. Aprs avoir fait le zro, nous ajouterons 100 l de -Galactosidase. Nous relverons la DO toutes les 30sec pendant 3 min, pour en dduire la vitesse initiale Vi de chaque concentration de substrat.

5mM substrat Temps (min) Do 415nm 2,5mM substrat Temps (min) Do 415nm 1,25mM substrat Temps (min) Do 415nm

0,5 0,73 0,691 4

2 1,14 0,869 1,013 6

1,5

2,5 1,29 7

3 1,44

0 0,65

0,5 0,75

2 1,16 0,908 1,022 2

1,5

2,5 1,33 1

3 1,486

0,5 0,68 0,647 8

2 1,13 0,839 0,978 8

1,5

2,5 1,26 9

3 1,432

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0,625mM substrat Temps (min) Do 415nm 0,312mM substrat Temps (min) Do 415nm 0,156mM substrat Temps (min) Do 415nm 0,078mM substrat Temps (min) Do 415nm 0,039mM substrat Temps (min) Do 415nm 0,019mM substrat Temps (min) Do 415nm 0,0097mM substrat Temps (min) Do 415nm

0,5 0,69 8

2 1,06 0,818 0,934 9

1,5

2,5 1,21 9

3 1,344

0,5 0,67 0,607 3

1 0,793

1,5 0,91

2 1,04 5

2,5 1,13 9

3 1,265

0,5 0,41 0,396 5

2 0,58 0,473 0,534 6

1,5

2,5 0,65 2

3 0,709

0,5 0,66 5

2 0,86 0,734 0,806 2

1,5

2,5 0,89 7

3 0,921

0,5 0,89 3

2 0,98 0,935 0,965 8

1,5

2,5 1,00 3

3 1,012

0,5 0,60 0,593 5

1,5

0,622 0,642 0,65

2,5 0,65 6

3 0,658

0,5 0,35 0,353 8

1 0,362

1,5 0,37

2 0,37 5

2,5 0,38 1

3 0,385

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Concentration substrat mM Vi

0,009 7 0,011 1 103,0 93 90,09 0

0,019 0 0,023 2 52,63 2 43,10 3

0,039 0,078 0,156 0 0 0 0,104 0,047 3 0,109 25,64 12,82 1 1 6,410 21,27 7 9,588 9,174

0,312 0 0,225 6

0,625 1,250 0 0 0,272 0,261 6

2,500 0 0,280 3

5,0000 0,2607

1/[S] 1/Vi

3,205 4,433

1,600 0,800 3,831 3,668

0,400 3,568

0,200 3,836

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Le trac de la vitesse initiale en fonction de la concentration en substrat, puis celui de linverse de la Vi en fonction de linverse de la concentration en substrat nous permettront de dterminer Vmax et Km de la -Galactosidase. 1/Vm = 2.0339, do Vm = 0.49 DO/min -1/Km = -2.44, do Km = 0.49 mM

Dosage des protines dans les extraits : Mthode de Bradford


Dans un premier temps nous raliserons une gamme dtalonnage par mesure de la densit optique 595 nm partir du ractif de Bradford et dune solution de BSA (Bovin Serum Albumin), car il sagit dune protine peu chre, relativement pure et dont on connat la concentration. Dans un 2e temps, nous mesurerons la DO de lchantillon dextrait et grce la gamme dtalonnage nous pourrons dterminer la quantit denzyme.

i. Gamme dtalonnage

Cette gamme sera faite partir dune solution de BSA 0,2 mg/ml entre 0 et 20 g. Lajout des produits devra imprativement se faire dans lordre indiqu dans le tableau suivant. De plus lajout du ractif de Bradford devra se faire en mme temps pour tous les tubes. Les solutions obtenues devront tre vortexs puis mesurs par spectrophotomtrie aprs 10 min dattente.

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Tube BSA L BSA g H2O L Ractif de Bradford l DO 595nm

1 0 0 800 200 0

2 20 4 780 200 0,30 4

3 30 6 770 200 0,42 6

4 40 8 760 200 0,43 3

5 50 10 750 200 0,49 9

6 60 12 740 200 0,58 4

7 70 14 730 200 0,63 3

8 80 16 720

9 100 20 700

200 200 0,71 1 0,857

Le point du tube 3 est retir pour la droite dtalonnage car il est aberrant.

ii. Dosage des protines dans lextrait

Le dosage des protines sera effectu partir d1mL dchantillon de -Galactosidase 20mM pralablement dilu au 1/10. Nous raliserons ensuite partir de cette solution de 2mM 5 dilutions successives au demi, dont la mesure de la densit optique permettra de dterminer la quantit de protine contenue dans lchantillon. La quantit relle de protines correspond la quantit de protines en prenant bien en compte les dilutions effectues. Dilution DO 595nm Quantit de protines (g) Quantit de protines (g) avant dilution 20m e 0,683 14,85 296,9 6 40me 0,463 10,07 80me 0,299 160me 0,19 320me 0,122

402,61

Les 3 dernires dilutions ne rentrent pas dans la gamme dtalonnage, elles ne seront donc pas prises en compte. En moyenne il y 349.78 g de protines dans 100L dextrait, donc 3497.83 g de protines dans 1mL. On trouve donc 3.5 mg/mL de protine dans lextrait.

Activit spcifique : L3 MACQ Annes 2010/2011 Page 9

(Quantit denzyme en UEI/Quantit de protines en mg)= 0.3285/3.5 = 0.0938 UEI/mg de protines.

Etude de lactivit en fonction de la concentration en enzyme


Cette tude sera effectue dans les conditions de rfrences dtermines lors de la mesure de lactivit de la -Galactosidase lexception prs que la concentration en enzyme variera.
80L denzyme t (min) 0,5 DO415nm 0,075 70L denzyme t (min) 0,5 DO415nm 0,073 60L denzyme t (min) 0,5 DO415nm 0,014 50L denzyme t (min) 0,5 DO415nm 0,04 40L denzyme t (min) 0,5 DO415nm 0,028 20L denzyme t (min) 0,5 DO415nm 0,028

1 0,156 1 0,147 1 0,067 1 0,08 1 0,054 1 0,042

1,5 0,251 1,5 0,237 1,5 0,113 1,5 0,111 1,5 0,076 1,5 0,055

2 0,336 2 0,316 2 0,167 2 0,152 2 0,102 2 0,068

2,5 0,425 2,5 0,398 2,5 0,224 2,5 0,195 2,5 0,125 2,5 0,081

3 0,52 3 0,49 3 0,272 3 0,234 3 0,149 3 0,095

volume d'enzyme (L) 20 40 50 Quantit d'enzyme 0,065 0,131 0,164 (UEI) 7 4 3

60 0,197 1

70 80 0,230 0,262 0 8

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Vi

0,026 0,048 0,077 6 2 5

0,103 7

0,166 0,178 7 1

Kcat est linverse de la pente : Kcat =1/0.5834, donc Kcat = 1.71 s-1

Etude de la thermosensibilit
Cette troisime phase portera sur la stabilit de lenzyme diffrentes tempratures de travail. Nous travaillerons avec 6 bain-marie diffrents : temprature ambiante, 30C, 40C, 50C, 60C et 75C. Une fois les extraits plongs dans les diffrents bains, des prlvements de 100l seront faits au bout d1, 3, 6, 10, 15 et 30 min et immdiatement plongs dans la glace pour bloquer toute raction qui aurait pu se produire sur lenzyme. A chaque prlvement seront ensuite ajout 100l de MgCl2 et 2,7 mL de tampon phosphate pour raliser le blanc du spectrophotomtre rgl 415 nm, puis partir de lajout du substrat nous relverons la DO toutes les 30 sec jusqu 3 min.

T ambiante 0 min 1min 3min 6min 10min 15min 30min

0 0,023 0,018 0,023 0,018 0,019 0,016 0,024

0,5 0,043 0,031 0,04 0,035 0,036 0,034 0,04

1 0,086 0,049 0,07 0,064 0,067 0,064 0,07

1,5 0,125 0,068 0,102 0,092 0,099 0,096 0,103

2 0,158 0,091 0,13 0,123 0,131 0,13 0,138

2,5 0,185 0,117 0,164 0,158 0,163 0,161 0,171

3 0,219 0,149 0,199 0,191 0,2 0,198 0,209

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30C 1min 3min 6min 10min 15min 30min

0 0,004 0 0,009 0,007 0,011 0,008

0,5 0,009 0,032 0,035 0,033 0,039 0,032

1 0,018 0,063 0,069 0,07 0,074 0,063

1,5 0,024 0,094 0,102 0,098 0,103 0,092

2 0,029 0,128 0,136 0,125 0,138 0,124

2,5 0,035 0,16 0,168 0,154 0,168 0,154

3 0,045 0,199 0,207 0,189 0,203 0,19

40C 1min 3min 6min 10min 15min 30min L3 MACQ

0 0,02 0,007 0,011 0,007 0,007 0,008

0,5 0,037 0,034 0,036 0,028 0,02 0,008

1 0,067 0,056 0,064 0,052 0,04 0,008

1,5 0,102 0,09 0,095 0,088 0,063 0,009

2 0,139 0,126 0,127 0,118 0,093 0,009

2,5 0,173 0,16 0,161 0,16 0,119 0,01

3 0,213 0,195 0,192 0,197 0,148 0,01 Page 12

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50C 1min 3min 6min 10min 15min 30min

0 0,013 0,014 0,011 0,007 0,006 0,008

0,5 0,033 0,029 0,022 0,012 0,006 0,008

1 0,064 0,054 0,032 0,016 0,009 0,008

1,5 0,092 0,077 0,05 0,021 0,011 0,009

2 0,127 0,111 0,063 0,026 0,013 0,009

2,5 0,16 0,134 0,081 0,032 0,017 0,01

3 0,197 0,161 0,098 0,039 0,019 0,01

60C 1min 3min 6min 10min 15min 30min

0 0,008 0,002 0,003 0,005 0,008 0,004

0,5 0,037 0,001 0,003 0,003 0,005 0,003

1 0,07 0,001 0,004 0,003 0,005 0,003

1,5 0,106 0,001 0,004 0,003 0,003 0,003

2 0,129 0,001 0,003 0,003 0,003 0,003

2,5 0,159 0,001 0,004 0,003 0,003 0,003

3 0,193 0,001 0,003 0,003 0,003 0,003

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75C 1min 3min 6min 10min 15min 30min

0 0,007 0,003 0,004 0,002 0,002 0,003

0,5 0,022 0,004 0,004 0,002 0,003 0,003

1 0,039 0,003 0,003 0,002 0,003 0,004

1,5 0,055 0,003 0,003 0,002 0,003 0,003

2 0,072 0,003 0,003 0,003 0,003 0,004

2,5 0,092 0,003 0,002 0,003 0,003 0,004

3 0,105 0,003 0,003 0,003 0,003 0,003

Daprs les rsultats ci-dessus, nous avons remarqu qu temprature ambiante et 30C lactivit de lenzyme augmente rgulirement mais en revanche partir de la 10e min 40C celle-ci diminue progressivement, ce qui signifie que la dnaturation est progressive cette temprature. Pour ce qui est de lactivit 50C elle diminue rapidement et est nulle pour les tempratures 60 et 75C La temprature la plus adapte la -Galactosidase semble donc tre 30C. Ce rsultat semble cohrent avec les donnes qui nous sont fournies au sujet de la temprature optimale de la -Galactosidase soit 35C. Grce au graphe reprsentant log(V/Vo)=f( temps), nous mesurerons lactivit rsiduelle de la -Galactosidase

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T ambiante 0 min 1min 3min 6min 10min 15min 30min

V 0,0674 0,0434 0,0597 0,0589 0,0615 0,0619 0,0632

V/Vo 1 0,64392 0,88576 0,87389 0,91246 0,91840 0,93769

log(V/Vo) 0 0,191170 17 0,052685 57 0,058544 6 0,039784 78 0,036969 25 0,027942 82

% activit rsiduelle 100,0 64,4 88,6 87,4 91,2 91,8 93,8 % activit rsiduelle 19,7 Page 15

30C 1min L3 MACQ

V 0,0133

V/Vo 0,19733

log(V/Vo) 0,704808 26

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3min 6min 10min 15min 30min

0,0656 0,0662 0,0653 0,0641 0,0608

0,97329 0,98220 0,96884 0,95104 0,90208

0,011756 06 0,007801 91 0,013746 72 0,021801 87 0,044756 32

97,3 98,2 96,9 95,1 90,2 % activit rsiduelle 97,8 93,9 90,7 95,4 71,4 1,2

40C 1min 3min 6min 10min 15min 30min

V 0,0659 0,0633 0,0611 0,0643 0,0481 0,0008

V/Vo 0,97774 0,93917 0,90653 0,95401 0,71365 0,01187

log(V/Vo) 0,009774 48 0,027256 19 0,042618 69 0,020448 92 0,146514 82 1,925569 91

50C 1min 3min L3 MACQ

V 0,0621 0,0506

V/Vo 0,92136 0,75074

log(V/Vo) 0,035568 3 0,124509 38

% activit rsiduelle 92,1 75,1 Page 16

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6min 10min 15min 30min

0,0293 0,0104 0,0046 0,0008

0,43472 0,15430 0,06825 0,01187

0,361792 28 0,811626 56 1,165902 06 1,925569 91

43,5 15,4 6,8 1,2

Pour les tempratures 60C et 75C, au bout dune minute lactivit rsiduelle est nulle.

Etude de leffet du pH sur lactivit et sur la stabilit du systme enzymatique tudi


1. Etude de leffet du pH sur lactivit

Dans cette partie nous allons tudier le comportement de la -Galactosidase dans des milieux de diffrents pH. Pour cela nous reprenons le protocole de la partie cintique de rfrence en remplaant le tampon phosphate par un tampon un pH donn (variant de pH=2 pH=11). Daprs les rsultats on dtermine le pH optimum o lactivit de lenzyme est maximum : pHop= 7-8

pH 2 3 4 5 6 7 8

0,5 0,012 0,007 0,004 0,005 0,008 0,025 0,016 0,011

1 0,012 0,007 0,004 0,005 0,009 0,037 0,026 0,019 0,013 0,004

1,5 0,012 0,007 0,003 0,005 0,01 0,05 0,038 0,022 0,017 0,004

2 0,012 0,007 0,003 0,005 0,012 0,063 0,05 0,028 0,02 0,004

2,5 0,012 0,007 0,003 0,005 0,013 0,077 0,062 0,035 0,023

3 0,012 0,007 0,003 0,005 0,014 0,09 0,074 0,041 0,027

V 0 0 0 0 0,002 5 0,026 2 0,023 4 0,011 7

log V

logV/km

9 0,01 10 11 0,004

0,006 7 0,004 0,004 0 10Km car conditions saturantes donc

2,60205999 1 1,58169870 9 1,63078414 3 1,93181413 8 2,17392519 7

3,214843 85 2,194482 57 2,243568 2,544597 99 2,786709 05

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4,1

D'aprs le graphe : log (Vm)=f(pH) et les quations des deux tangentes sur ce mme graphique, nous avons dtermin deux pH de valeurs respectives 2.58 et 8.55, correspondant aux pKa des chanes latrales des acides amins impliqus dans le site actif de la B-Galactosidase.

2. Etude de leffet du pH sur la stabilit

Daprs ltude de leffet du pH sur lactivit, nous avons dtermin que la -Galactosidase avait une activit maximum un pH plutt neutre. Ainsi nous allons tudier la stabilit de lenzyme sur la gamme de pH prcdente en prenant plus particulirement un chantillon chaque extrme et dautres autours du pHop. Protocole inspir de ltude de thermosensibilit: on prlve 700L dextrait et 700L de tampon aux pH respectifs de 3, 5, 7, 9 et 11. On effectue des prlvements diffrents temps (1, 3, 6, 10, 15 et 30 minutes) que lon place dans la glace pour pouvoir ensuite faire une tude dactivit. Les prlvements sont de 200L auquel on ajoute 2.6mL de tampon phosphate, 0.1mL de MgCl2 et 0.1mL de substrat pour le suivie de la DO pendant 3 minutes (dtermination de lactivit).

pH 3 1 min 3 min 6 min 10 min 15 min 30 min

0,5 0,003 0,005 0,003 0,009 0,006 0,004

1 0,003 0,006 0,004 0,009 0,006 0,004

1,5 0,003 0,006 0,004 0,008 0,006 0,004

2 0,004 0,006 0,004 0,008 0,006 0,003

2,5 0,004 0,006 0,004 0,008 0,006 0,003

3 0,005 0,006 0,004 0,008 0,006 0,003

V 0,000 8 0 0 0 0 0

activit rsiduelle (%) 2,53 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

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pH 5 1 min 3 min 6 min 10 min 15 min 30 min

0,5 0,025 0,03 0,026 0,027 0,021 0,028

1 0,048 0,051 0,049 0,049 0,041 0,047

1,5 0,071 0,077 0,073 0,072 0,062 0,068

2 0,095 0,104 0,097 0,096 0,083 0,091

2,5 0,12 0,131 0,122 0,119 0,105 0,113

3 0,144 0,158 0,147 0,144 0,126 0,136

V 0,048 5 0,051 8 0,048 5 0,046 8 0,042 2 0,043 5

activit rsiduelle (%) 153,48 163,92 153,48 148,10 133,54 137,66 activit rsiduelle (%) 179,43 179,43 179,43 179,43 200,32 179,43

pH 7 1 min 3 min 6 min 10 min 15 min 30 min

0,5 0,028 0,034 0,031 0,032 0,034 0,032

1 0,056 0,06 0,061 0,06 0,065 0,062

1,5 0,084 0,088 0,088 0,089 0,095 0,087

2 0,112 0,116 0,117 0,119 0,127 0,116

2,5 0,142 0,146 0,147 0,145 0,16 0,145

3 0,171 0,172 0,177 0,179 0,192 0,175

V 0,056 7 0,056 7 0,056 7 0,056 7 0,063 3 0,056 7

pH 9 1 min 3 min 6 min 10 min 15 min 30 min

0,5 0,034 0,032 0,032 0,027 0,032 0,033 0,5

1 0,062 0,06 0,06 0,055 0,06 0,06 1

1,5 0,092 0,088 0,089 0,084 0,082 0,088 1,5

2 0,122 0,117 0,117 0,11 0,108 0,116 2

2,5 0,15 0,148 0,147 0,139 0,136 0,145 2,5

3 0,18 0,157 0,175 0,168 0,162 0,174 3

V 0,058 5 0,056 5 0,056 5 0,051 7 0,051 7 0,056 5 V

activit rsiduelle (%) 185,13 178,80 178,80 163,61 163,61 178,80 activit rsiduelle Page 19

pH 11 L3 MACQ

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(%) 1 min 3 min 6 min 10 min 15 min 30 min 0,019 0,011 0,014 0,014 0,013 0,014 0,031 0,021 0,025 0,021 0,02 0,019 0,044 0,031 0,037 0,031 0,027 0,025 0,057 0,041 0,049 0,039 0,035 0,03 0,071 0,052 0,06 0,05 0,041 0,036 0,084 0,062 0,073 0,058 0,051 0,042 0,026 2 0,020 5 0,023 5 0,018 0,014 9 0,011 2 82,91 64,87 74,37 56,96 47,15 35,44

Evaluation de lactivit dans les aliquotes conservs diffrentes tempratures avec ou sans glycrol
Ds le dbut des manipulations nous avons prlevs quelques mL dextrait que nous avons mis incuber pendant 3 jours diffrentes tempratures et diffrentes conditions. Une premire partie des aliquotes ont t simplement plac -20C, 4C, Tamb et 30C. Deux autres aliquotes ont t plac -20C et 4C mais auxquelles nous avons ajout pralablement du glycrol. Les activits ont ensuite t mesures dans les conditions opratoires de rfrences. Toutes les mesures ont t doubles. 0 0 0,005 0,004 0,006 0,004 0 0,5 (-20C) SG (-20C) AG 4C SG 4C AG T amb 30C 0,06 0,088 0,0119 0,127 0,099 0,033 0,5 0,006 0,055 0,07 0,06 0,048 0,054 1 0,13 0,197 0,244 0,263 0,205 0,095 1 0,119 0,113 0,122 0,125 0,1 0,145 1,5 0,203 0,301 0,37 0,399 0,311 0,179 1,5 0,306 0,192 0,186 0,207 0,163 0,212 2 0,278 0,408 0,478 0,539 0,422 0,25 2 0,413 0,253 0,27 0,281 0,241 0,283 2,5 0,35 0,517 0,625 0,674 0,534 0,338 2,5 0,476 0,309 0,322 0,361 0,301 0,376 3 0,433 0,626 0,759 0,81 0,641 0,419 3 0,594 0,383 0,392 0,438 0,355 0,448

(-20C) SG (-20C) AG 4C SG 4C AG T amb 30C

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La reprsentation de la densit optique en fonction du temps dmontre que lenzyme est plus active lorsquelle est conserve basse temprature (par ordre croissant dactivit : -20C > 4C>Tamb>30C). Dautre part, nous pouvons remarquer que les extraits conservs dans le glycrol prsentent des activits dont laugmentation est plus rapide. Ce dernier serait donc favorable pour la conservation de lenzyme basse temprature. Conclusion : Daprs nos mesures, nous pouvons remarquer que plus la temprature de conservation est basse, plus lactivit de lenzyme est conserve. Dautre part, nous avons remarqu que le glycrol favorise la conservation de lactivit de lenzyme basse temprature. Cependant nous avons aussi relev que laugmentation de lactivit se trouvait plus lente au fur et mesure du temps.

Chromatographie sur rsine changeuse dions


a. Principe

Cette technique de chromatographie est adapte la sparation dions et de composs polaires. Pour cela les colonnes utilises contiennent des phases stationnaires comportant des sites ioniques pour quil se cre des interactions dipolaires avec les analytes sparer. Dans notre cas les analytes sont des protines contenues dans lchantillon et la phase stationnaire sera une phase DEAE-Spharose CL6B. Nous avons choisi cette phase car il sagit dun changeur danion dont la gamme de pH varie de 2 9. En effet nous avons vu prcdemment que le pI de la -Galactosidase est de 4,6 et nous disposons de solutions tampon pH 7,3 : ce pH lenzyme sera donc ngative et pourra donc se fixer sur la colonne charge positivement. Suite au dpt de lchantillon, la colonne devra subir 2 traitements : une phase de lavage afin dliminer les molcules non fixes la rsine puis une phase dlution afin de rcuprer les protines fixes la rsine. b. Protocole

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Dans un premier temps il sagira de prparer le gel. Le fabricant conditionne la DEAE-Spharose dans de lthanol 20% qui devra tre limin avant de couler la colonne. Une fois que notre colonne a t prte lemploi nous avons dtermin son dbit, de 1,4ml/min, afin den dduire le temps ncessaire pour rcuprer 2 ml par fraction soit 1min24. La capacit de la colonne tant de 2mg/ml de gel et la concentration de notre extrait tant de 3,5 mg de protine/ml le maximum dextrait pouvant tre dpos est de 5,7 ml. Afin de ne pas saturer notre colonne et dviter de trop fractionner les protines nous avons choisi de ne dposer que 2 ml dextrait dilu dans du tampon A (Tris-HCl 20mM, pH 7,3). La phase de lavage devant correspond au minimum 2 fois le volume de rsine, nous avons lav la colonne avec 20 ml de tampon A, soit 10 tubes de fractions. Afin de rcuprer toutes les protines fixes sur la colonne, celle-ci sera lave avec un gradient croissant de tampon B (Tris-HCl 20mM pH 7,3 + NaCl 0,5m) et dcroissant de tampon A pour lquivalent de 15 fractions.

c. Rsultats

Maintenant que nous avons rcuprs 10 fractions de lavage et 15 fractions dlution nous devons dterminer celles contenant des protines puis leur concentration. Dans un premier temps nous avons ralis une analyse rapide de lactivit. Pour cela nous avons prlev 200l de chaque fraction, 200l de tampon et 50l de substrat. Chaque fraction contenant des protines se colorera en jaune, ainsi nous pourrons rassembler les fractions qui nous intressent. Malheureusement, aucune coloration nest apparue. Nous avons donc choisi danalyser nos mesures par spectrophotomtrie 280nm. Nous attendions diffrents pics pour les fractions de lavage puis dlution qui correspondraient aux diffrentes protines contenues dans lchantillon, mais nous nobtenons que quelques pics pour certaines fractions de lavages. Nos rsultats ne correspondant pas ceux attendus, nous nous sommes poss plusieurs questions : lenzyme est-elle reste sur la rsine ?le tampon ou le sel (NaCl) auraient-ils une influence sur lactivit de lenzyme ? Afin de confirmer ou dinfirmer cette dernire hypothse nous avons choisi de mesurer la densit optique de plusieurs mlanges 415 nm : tampon phosphate + extrait, tampon A + extrait, tampon B + extrait.

Lavage

Elutions

Fractions 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

DO280n m 0,006 0,122 0,536 0,468 0,302 0,148 0,078 0,032 0,032 0,022 0,021 0,022 0,019 0,01 0,02 Annes 2010/2011 Page 22

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16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

0,02 0,016 0,015 0,015 0,014 0,013 0,012 0,012 0,017 0,014

Tampon phosphate 100mM t(min) 0,5 1 DO415nm 0,028 0,083 Tampon Tris-HCl mM t(min) 0,5 DO415nm 0,01

1,5 0,155

2 0,222

2,5 0,294

3 0,362

1 0,036

1,5 0,063

2 0,092

2,5 0,12

3 0,153

Tampon Tris 20mM + NaCl 0,5M t(min) 0,5 1 DO415nm 0,007 0,021

1,5 0,035

2 0,048

2,5 0,062

3 0,078

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Les rsultats que nous avons obtenus nous montrent quen prsence de NaCl 0,5M lenzyme ne prsente plus aucune activit. Il semblerait donc que ce dernier inhibe lactivit de la protine. Cette technique de chromatographie nest donc pas adapte au dosage des protines contenues dans cet chantillon.

Chromatographie dinteraction hydrophobe


Principe : La chromatographie hydrophobe est base sur la sparation de composs en fonction dinteractions avec un gel non charg, qui contient des groupements hydrophobes (chaines carbones variant de C2 C8) greffs sur la matrice par des liaisons ther. La sparation va donc dpendre des groupements hydrophobes de la matrice, du solvant et de lhydrophobicit de lenzyme. La premire tape consiste fixer la protine sparer sur le gel chromatographique en prsence d'une forte concentration en sel (ici le sulfate dammonium 1M). Ceci dans le but de crer un phnomne de "salting -out". Ensuite, les protines fixes sont lues en faisant passer un tampon avec un gradient dcroissant en sel (mlange de tampon C et A). Ainsi, les protines les plus hydrophobes sont lues en dernier.

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Appareillage et ractifs : Une colonne hydrophobe Octyl Sepharose CL-4B haute capacit (15-20mg/mL de gel) Une pompe Un collecteur automatique Tampon Tris 500mM, pH 7.3 Sulfate dammonium 2M Tampon A : Tris 20mM, pH 7.3 Tampon C : Tris 20mM, pH 7.3 + sulfate dammonium 1M

Prparation du gel : Initialement, le gel est conditionn dans de lthanol 20%. Or, lthanol rduisant les interactions hydrophobes il est indispensable de le reconditionner dans des conditions plus favorables. Environ 10mL de gel est dcant, puis le surplus dthanol limin et remplac par du tampon A. Ce gel est vers dans la colonne puis le tampon C dans le rservoir. Amener le tampon C affleurement du gel. Connecter la pompe faire passer le tampon a travers le gel. Conditions danalyse et dpt : Hauteur du gel de la colonne : 5 cm Diamtre interne de la colonne : 1,6 cm Vol total du gel tass dans la colonne : 8 mL Rglage pompe : 025 Rglage collecteur : fractions de 2 mL, 1.11 min Dbit : 1.9 mL/min Capacit : 15 mg/mL de gel (ici 8*15=120 mg) Volume dchantillon dpos : 2 mL dans 2 mL de tampon C Quantit de protine dpose : 7mg (2*3.5 mg) Quantit denzyme dpose : 6.57 UEI (0.3285UEI pour 0.1mL denzyme) Conditions de lavage : tampon C : 10 fractions de 2 mL soit un volume total de 20 mL Conditions dlution : tampon C + tampon A ([SA] dcroissante) : 18 fractions de 2 mL soit un volume total de 36 mL Pour dposer lchantillon, amener le fond de solvant affleurement du gel. Dposer lchantillon le long de la paroi de la colonne. Faire adsorber sur le gel, puis complter avec du tampon C. Ensuite, raliser le lavage avec le tampon C, ce qui permet de fixer lenzyme sur le gel. La deuxime tape consiste luer laide dun gradient dcroissant en sulfate dammonium. Pour cela on intgre peut peut du tampon A, ce qui permet de dcrocher les protines en fonction de leur hydrophobicit. Pour finir, un dernier lavage leau est effectu pour liminer tous les rsidus. Rsultats : Nous avons ralis une dtection UV 280 nm de chaque fraction pour dterminer dans lesquelles ce trouvent des protines.

Lavage

Fractions 1 2 3 4

DO280n m 0,022 0,012 0,057 0,248 Annes 2010/2011 Page 25

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Elutions

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34

0,307 0,187 0,135 0,117 0,085 0,075 0,05 0,044 0,015 0,011 0,019 0,009 0,008 0,009 0,013 0,016 0,028 0,013 0,009 0,007 0,04 0,009 0,014 0,005 0 0,024 0,037 0,015 0,008 0,032

Lavage eau

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Lvaluation rapide de lactivit na rien donne, aucune coloration na t dtecte. Hypothses : Lenzyme est reste accroche la colonne. Lenzyme est trop dilue dans diffrentes fractions pour que son activit soit visible. Le tampon utilis pour le lavage et llution, qui contient une forte concentration en sulfate dammonium inhibe lactivit enzymatique. Afin de vrifier notre dernire hypothse, nous avons ralis trois test dactivit avec trois tampons diffrents : le tampon Phosphate 100mM, le tampon Tris-HCL 100mM et le tampon C avec 1M de sulfate dammonium utilis lors de la chromatographie.

Tampon phosphate 100mM T(min) 0,5 1 DO415nm 0,08 0,148 Tampon Tris-HCl 100mM t(min) 0,5 DO415nm 0,026

1,5 0,217

2 0,285

2,5 0,354

3 0,42

1 0,06

1,5 0,093

2 0,135

2,5 0,169

3 0,205

Tampon Tris 20mM + sulfate d'ammonium 1M t(min) 0,5 1 DO415nm 0,016 0,019

1,5 0,023

2 0,027

2,5 0,031

3 0,038

Ce test nous a permis de vrifier que le tampon Tris-HCL et surtout le sulfate dammonium avaient une action inhibitrice sur notre -Galactosidase. Nous ne pouvons donc pas dterminer dans quelles fractions ce trouvent notre enzyme.

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Analyse Electrophortique
Nous avons effectu une analyse electrophortique sur gel de polyacrylamide pour sparer les diffrentes protines qui se trouvent dans lextrait initiale. Llectrophorse est base sur la migration de molcules ionises soumises un champ lectrique continu, dans un milieu lectrolytique tamponn, Nous avons fait cette lectrophorse en condition dnaturante et en systme continu : % dacrylamide : gel de migration : 7,5% et 12% Dure de polymrisation : 15 min Voltage : 150V Temps de migration : 1h30 pas de gel de concentration

Lautre paillasse on fait une lectrophorse en condition native et en systme continu : % dacrylamide : gel de migration : 7,5% et 12% Dure de polymrisation : 20 min Voltage : 150V Temps de migration : 1H30 pas de gel de concentration

Standard : Rf en cm (dnaturante) Myosine - galactosidase Phosphorylase Albumine Ovalbumine Anhydrase carbonique Inhibiteur de la Trypsine -lactalbumine 2,9 2,1 0,5 3,4

Dans les conditions natives, nous navons pas pu calculer les Rf car lautre binme de lautre paillasse navait pas de front de migration sur leur lectrophorse. Nous dterminerons donc la masse molaire de notre protine que dans les conditions dnaturantes. Dpots :

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Echantillon : - galactosidase Gel 0,75 mm/1,5mm Quantits correspondantes aux diffrents volumes (g/mL) 5L 10 L 15L 20L 25L 30L 13 26 39 52 65 79

Conditions Dnaturantes

Conditions Natives

N puits 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Volume (L) 12% Vide marqueur 5 10 15 20 Vide 25 30 vide

Volume (L) 7,5% Vide Marqueur 5 10 15 vide 20 25 30 vide

N puits 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Volume (L) 12% Vide marqueur 5 10 15 20 25 30 Vide vide

Volume (L) 7,5% Vide marqueur 5 10 15 20 25 30 vide vide

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Schma descriptif de la sparation par lectrophorse De la - Galactosidase par rapport aux marqueurs

Dtection Bleu de Coomassie Temps de coloration : toute une nuit Temps de dcoloration : toute une journe

(dans les deux conditions : native et dnaturante)

PM (kDa) Distance (cm) log PM

200 3,4 2,301

97,4 2,1 1,989

66,2 1,3 1,821

45 0,5 1,653

31 / 1,491

21,5 / 1,332

14,4 / 1,158

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Grce cette droite dtalonnage, nous allons pouvoir dterminer le poid molculaire de la -Galactosidase. En effet on trouve par rapport au front de migration (Rf=3,9cm) que la -Galactosidase se trouve 2,9cm. Donc log(PM)=2,9*0,223+1,533=0,647 => PM(-Galactosidase) = 151,25 kDa

Explication entre les deux diffrentes conditions de llectrophorse : En condition native, la migration se fait en fonction de la taille et de la charge. Alors que dans les conditions dnaturantes (dans notre cas), la migration se fait uniquement en fonction de la taille. Ceci permet de dterminer la masse molaire des protines dnatures.

Conclusion : Exprimentalement, nous pouvons tre satisfaits de notre lectrophorse car nous avons obtenu une masse de 151,25KDa alors que thoriquement, elle est de 164KDa. Il aurait fallu ajouter plus de marqueur pour que lon puisse voir les marques dune meilleure faon et sans doute attendre un peu plus longtemps la migration sur gel pour pouvoir voir tous les marqueurs.

L3 MACQ

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