ENSAIO DE FOTOMICROBIOLGICO Os extratos secos das duas espcies foram suspensos em etanol 98C na concentrao de 14 mg mL-1 para B.

gaudichaudii e 3 mg mL-1 para D. brasiliensis (p/v). As solues de 8-metoxipsoraleno (8-MOP), 5-metoxipsoraleno (5-MOP) e psoraleno 0,1% foram usadas como controles positivos. Cepas selvagens de Saccharomyces cerevisiae (D273-10B) e Candida albicans (ATCC 10231) sero utilizadas para o ensaio microbiolgico da atividade fototxica. Meios de crescimento: S. cerevisiae: 1% de extrato de levedo, 2% de glicose, 2% de peptona e 1,5% de agar; C. albicans: 0,3% extrato de levedo, 0,2% extrato de malte, 1% glicose, 0,5% peptona e 1,5% de agar. 10 ml de cada amostra em discos de papel de filtro n 1, estreis, de 6 mm de dimetro, fixados na superfcie das placas distncia de 22 cm de uma lmpada de luz negra 300-390nm (UVA), radiao de 10,36 kJ m-2. Placas controle guardadas no escuro. Resultados anlise de varincia ANOVA, seguida do teste de Student com nvel de significncia de p< 0,05. Fototoxicidade: aparecimento de uma zona clara ao redor da amostra, quando as placas so submetidas radiao ultravioleta. Zona clara: indica inibio de crescimento. Normalmente ausente na placas incubadas na ausncia de luz.

ATIVIDADE FOTOTXICA IN VIVO A pele das cobaias muito semelhante pele humana, e por isso, so freqentemente utilizadas para testar cremes e loes. A variedade Dunkin - Hartley ou Inglesa, a mais utilizada em laboratrios. uma variedade Albina, com pelo curto, liso e macio. Nvel de Biossegurana Animal 1 (NBA-1); temperatura entre 18 C e 22 C; umidade relativa do ar entre 55 e 75% e ciclos dirios de 12 h de luz e 12 h de escurido; gaiolas especficas para Cavia porcellus, forradas com maravalha autoclavada e;

alimentao composta de rao comercial para cobaias e gua autoclavada complementada com cido ascrbico (vitamina C) 1g/L de gua, a cada trs dias. Doze cobaias albinas Dunkin-Hartley de 300-450g foram utilizadas, sendo

quatro para cada amostra. Os animais foram anestesiados com xilazina 0,1-5,0 mg.kg-1 + quetamina 30-44 mg.kg-1 atravs de injeo IM no quadrceps (face posterior da coxa), com agulha 25x6; cuja durao de cerca de 77 minutos. Os pelos do dorso dos animais foram raspados e depilados. Aps 18-20h, a anestesia foi reaplicada, a pele do dorso dos animais foram divididas em quatro reas de cerca de 2,5 cm2 com uma fita adesiva de 12 mm. Em duas destas reas foi aplicado 0,1 mL de amostra (extrato) na concentrao de 14 mg mL-1 para B. gaudichaudii e 3 mg mL-1 para D. brasiliensis (p/v) e nas outras duas reas aplicar 0,1 ml de soluo 0,1% de 8-MOP (padro positivo). Uma das reas contendo a amostra e 8-MOP foi coberta com uma folha de alumnio e fixada com fita adesiva. A cabea dos animais foram cobertas e os animais colocados a 10 cm (regio dorsal) de distncia de uma lmpada de luz negra fluorescente de 15 Watts, sendo submetidos a 2 h de incidncia de radiao. Os animais foram mantidos com analgesia com buprenorfina (opiide) 0,5-0,8 mg.kg-1, SC regio nucal, com agulha 25x7, de 12h em 12h horas. Aps 24 e 48 h da exposio, os animais foram observados sendo a intensidade dos eritemas avaliada segundo a escala: 0 = nenhuma reao, 1 = eritema fraco, 2 = eritema moderado e 3 = eritema severo. Aps os experimentos, os animais foram sedados previamente com xilazina 5 40 mg.kg-1 IP no quadrante lateral inferior direito, com agulha 25x6 e sendo a eutansia realizada com superdosagem de tiopental sdico 45-90 mg.kg-1 tambm IP. ENSAIO DE MELANOGENICIDADE IN VITRO As clulas B16F10 foram mantidas a 37C e 5% de CO2, em meio de cultura RPMI (acrescido de Hepes 3,268 g L -1; NaHCO3 - 2 g L-1; piruvato de sdio 0,0125 g L-1), suplementado com 10% de soro fetal bovino e garamicina 80 mg mL-1 a 0,1%, pH 7,4. O meio de cultura foi renovado a cada 48-72 h e as clulas subcultivadas, a partir de culturas prximas confluncia, pelo tratamento com soluo de Tyrode/EDTA (cido etilenodiaminotetraactico; soluo, em g L-1: NaCl 8; KCl 0,2;

MgCl2.6H2O 0,213; NaH2PO4 0,05; EDTA 1,86; NaHCO3 1; pH 7,4) e transferncia para novos frascos com meio de cultura. Foram semeadas 9 x 105 clulas em frascos de 25 cm2. Aps 24 h da semeadura foram adicionados os extratos secos suspensos em DMSO na concentrao de 14 mg mL-1 para B. gaudichaudii e 3 mg mL-1 para D. brasiliensis (p/v). As solues de 8-metoxipsoraleno (8-MOP), 5-metoxipsoraleno (5-MOP) e psoraleno 0,1%, o hormnio -MSH na concentrao de 10-8 M e forscolina 10 g mL-1 foram usados como controles positivos. Os extratos (metade das replicatas), assim como metade dos controles de psoralenos foram expostos a uma distncia de 22 cm de uma lmpada de luz negra 300-390nm (UVA), radiao de 10,36 kJ m-2 por 1 hora. Em seguida, todos foram incubados por mais 24h e ento, realizada a dosagem do contedo de melanina. Em tubos de ensaio de 15 mL foram adicionados Triton-X 1% em cada pellet celular contendo 2,5 x 106 clulas. Os pellets foram fotografados com cmera. As amostras foram homogeneizadas em vortex e transferidas para tubos eppendorfs de 1,5 mL, ficando sob gelo por 10 minutos. Em seguida, as amostras resultantes foram centrifugadas a 13.000 rpm por 20 minutos a 4C. O sobrenadante foi removido e descartado. Em capela, foram adicionados 500 L de etanol/ter (1:1) para cada pellet de melanina. As amostras foram, ento, homogeinizadas em vortex e deixadas em repouso por cerca de 10 minutos temperatura ambiente, ou at que a protena precipitada ficasse visvel no solvente. Os tubos foram invertidos cuidadosamente algumas vezes e o sobrenadante solvente/protena removido, de forma a restar somente o pellet de melanina. Os pellets ficaram secando em capela at todo etanol/ter evaporar (cerca de meia hora). Em seguida, foram adicionados 100L de NaOH 0,2N em cada pellet. As amostras resultantes foram, ento, aquecidas em banho-maria a 60C at que a melanina estivesse completamente dissolvida. Foram preparadas, simultaneamente, amostras de melanina sinttica para uma curva-padro nas concentraes de 1, 17, 25, 50, 67, 100 e 1000g mL-1. A leitura destas e das amostras experimentais, em duplicata, foi efetuada em espectrofotmetro/ELISA a 490 nm. Dessa forma, os dados obtidos como absorbncia para cada amostra, foram convertidos e expressos graficamente como o contedo de melanina (% do controle). Este foi determinado aps diviso pelo nmero de clulas (x106), equivalentes ao total de um dado tratamento e transferidas para tubos cnicos de 15 mL antes do incio da dosagem de melanina; em seguida, foi calculada a porcentagem de resposta em relao ao controle branco.