1.

INTRODUO
As lipases pertencentes ao grupo das serino hidrolases (E.C. 3.1.1.3) so definidas como enzimas que catalisam a hidrlise total ou parcial de triacilglicerol (TAG) fornecendo diacilglicerol (DAG), monoacilglicerol (MAG), glicerol e cidos graxos livres (Carvalho et al., 2003). Seu modo de ao se assemelha ao das esterases, porm sua atividade muito aumentada quando situada na interface polar/apolar e apresentam maior afinidade por cidos graxos de cadeia longa (Pastore et al., 2003). Segundo Macrae & Hammond (1985), as lipases microbianas tm sido classificadas em funo de sua especificidade em relao ao substrato, em trs grupos: (1) lipases 1,3 especficas - que catalisam a liberao de cidos graxos especificamente nas posies 1 e 3 dos acilgliceris, como por exemplos as lipases de Rhizopus delemar, Aspergillus niger e Mucor miehei; (2) lipases no especficas - que catalisam a hidrlise dos TAGs para cido graxos livres e glicerol de modo aleatrio. No mostram especificidade com relao a natureza do grupo acil ou em relao a posio em que este grupo est esterificado no glicerol, sendo as lipases de Pseudomonas fluorescens, Staphylococcus aureus, Penicilium cyclospium, Corynebacterium acnes e Candida cylindracea exemplos desse grupo; (3) lipases de cidos graxos especficas - que catalisam a hidrlise dos tipos especficos de grupos acilas nas molculas de TAGs. Um representante tpico desse grupo cis na posio 9. Com a tcnica empregada de difrao de raios-X, foi possvel obter a estrutura tridimensional de algumas lipases (Figura 1), sendo possvel assim, compreender melhor os fatores que determinam sua regioespecificidade, enantioseletividade e o mecanismo de ao. Fatores esses, que tornam as lipases uma das classes de enzimas mais atraentes e utilizadas em aplicaes biotecnolgicas especficas. A primeira estrutura elucidada de uma lipase fngica foi da espcie Rhizomucor miehei (Brady et al.,1990) citado por Jaerger et al., (1998). Posteriormente, outras lipases produzidas por fungos tambm tiveram suas a lipase de Geotrichum candidum que hidrolisa preferencialmente grupos acila de cadeia longa e que contenham dupla ligao

estruturas determinadas, como a de Geotrichum candidum (Schrag et al., 1997).

Figura 1. Estrutura tridimensional da lipase de Pseudomonas aeuruginosa, (Brady et al.; 1990); citado por Jaerger et al, (1998). A partir das informaes estruturais, foi possvel determinar o stio cataltico da lipase, o qual consiste de trs resduos de aminocidos, (Ollis et al., 1992). Esses resduos so: a) resduo nucleoflico da serina; b) resduo de stios cidos (aspartato ou glutamato) e, c) resduo de histidina. Sendo importante ressaltar que esses resduos ocorrem sempre nessa ordem de seqncia de aminocidos e crucial para todas as reaes catalisadas por lipases, sendo, portanto, estas enzimas classificadas como serino hidrolases (Jaeger et al., 1999; Reetz, 2002). Como mecanismo de ao, a lipase hidrolisa a ligao ster presente em acilgliceris, liberando o cido graxo e glicerol. A hidrlise do substrato ocorre em quatro etapas, como descritos por Jaeger et al., (1999). 1) etapa inicial (1) - ocorre um ataque do par de eltrons do tomo de oxignio (do grupo hidroxila do resduo nucleoflico da serina), no carbono da carbonila que forma a ligao ster do substrato. A nucleofilicidade apresentada pelo tomo de oxignio, do grupo hidroxila da serina aumentada pela presena do aminocido histidina, pois o prton do grupo hidroxila da

serina transferido para a histidina, que possui um anel imidazol, que estabiliza a carga formada. 2) etapa intermediria (2) - ocorre formao de uma estrutura tetradrica transitria, a qual caracterizada pela carga negativa do tomo de oxignio da carbonila, que por sua vez, estabilizada pela interao de ligaes de hidrognios de dois peptdeos atravs dos grupos NH. 3) etapa intermediria (3) - o prton do grupo imidazol da histidina forma ligao com o oxignio do ster presente no tetraedro intermedirio, que por sua vez sofre clivagem, liberando um lcool. A molcula da gua presente no meio reacionrio ativada pelo aminocido histidina que libera o grupo OH, no qual ataca o carbono da carbonila do grupo acil ligado ao aminocido da serina. 4) etapa final (4) - A histidina doa um prton do grupo imidazol para o tomo de oxignio da serina, que libera o grupo acil do cido carboxlico formado. Aps a difuso do cido carboxlico, inicia-se novamente o ciclo cataltico. As lipases possuem uma atividade pronunciada na interface leo-agua, fenmeno este, que ocorre por caractersticas estruturais especificas pertencentes a este grupo de enzimas (Jaeger et al., 1999). A teoria atualmente mais aceita para este fenmeno diz que uma parte da superfcie da enzima se encontra em melhor equilbrio termodinmico quando inserida na interface polar/apolar e que esta conformao coloca o stio ativo da enzima em posio favorvel para a catlise (Borgston, 1984). Este fenmeno comumente denominado de ativao interfacial (Reetz, 2002; citada por Castro 2003). As lipases possuem um oligopeptdeo helicide, uma espcie de tampa que protege o stio ativo. Ao interagir com uma superfcie hidrofbica (leo), o seu sitio ativo se torna acessvel e, portanto, ativo permitindo livre acesso ao substrato; processo este, caracterstico das verdadeiras lipases. Estudos demonstram que na ausncia dessa interface lipdio-gua, o stio ativo da lipase se torna obstrudo. A ala que obstrui o stio ativo formado por uma simples cadeia de aminocidos na forma de hlice (Schrag et al., 1997).

Figura 2. Esquema da desobstruo do stio ativo da lipase de Humicola lanuginosa. Novas tecnologias alternativas tem gradualmente surgido frente importncia das lipases nos processos industriais, determinando estratgias de purificao que so de baixo custo, rpidas e que permitam operao em larga escala. Estas enzimas geralmente no requerem cofatores e no realizam reaes paralelas. No caso mais geral, lipdeos ou mesmo molculas sintticas, podem sofrer vrios tipos de transformaes catalticas por lipases e associando a estas transformaes a seletividade das reaes, vislumbra-se um enorme escopo de aplicaes constituindo o grupo de biocatalisadores mais importantes para aplicaes biotecnolgicas (Jaeger & Eggert, 2002), tendo em vista a comprovao de lipases permanecerem ativas em solventes orgnicos (Zaks & Klibanov, 1984) apresentando uma ferramenta ideal para a qumica orgnica. Nos eucariontes, lipases esto envolvidas em vrias etapas do metabolismo de lipdeos, incluindo digesto, absoro e reconstituio de gorduras e metabolismo de lipoprotenas e nas plantas, lipases so encontradas em tecidos de reserva de energia. Devido a importncia significativa destas enzimas, elas so objeto de estudo intensivo e sua pesquisa est focada em caracterizao estrutural, elucidao do mecanismo de ao, cintica, seqenciamento e clonagem dos genes de lipases, assim como, caracterizao geral e desempenho (Bornscheuer et al., 2000). A maioria das enzimas comerciais est disponvel em grande quantidade, pois, encontram-se largamente distribudas na natureza em animais, vegetais e microrganismos, porm, as lipases provenientes de

microrganismos so as mais utilizadas industrialmente, porque alm de apresentarem procedimentos mais simples de isolamento a partir do carbono fermentativo so geralmente, mais estveis e com propriedades bem mais diversificadas que as lipases de outras fontes. Atualmente, lipases microbianas so produzidas por diversas indstrias, como Novozymes, Amano, Gist Brocades, entre outras. Jaeger & Reetz, 1998, relata sobre a disponibilidade comercial de lipases e cita enzimas de 34 diferentes fontes, incluindo 18 a partir de fungos e 7 de bactrias. Dependendo da fonte, as lipases podem ter massa molecular variando entre 20 a 75 KDa, (Vulfson et al., 1994), atividade em pH na faixa entre 4 a 9 e em temperaturas variando desde a ambiente at 70C. Lipases so usualmente estveis em solues aquosas neutras a temperatura ambiente apresentando, em sua maioria, uma atividade tima na faixa de temperatura entre 30 e 40C. Contudo, sua termoestabilidade varia consideravelmente em funo da origem, sendo as lipases microbianas as que possuem maior estabilidade trmica (Heizeir et al., 2003). Microrganismos produtores de lipases so encontrados em diversos habitats, como resduos industriais, indstrias de leos vegetais, laticneos, solo contaminado com leo, sementes oleaginosas, alimentos em decomposio, entre outros. Sharma et al., (2001) apresentaram uma tabela de microorganismos produtores de lipase, includo bactrias, fungos, leveduras e actinomicetos, contudo, destacam-se na produo da mesma, alguns fungos filamentosos devido ao baixo custo de extrao de lipases, estabilidade trmica e de pH, especificidade a substratos e atividade em solventes orgnicos (Saxena et al., 1999). O principal mtodo de produo de lipases atravs de fermentao por cultura submersa (Ito et al., 2001) evidenciando assim, lipases produzidas por fungos. No caso de cultura submersa, a produo de lipases influenciada por parmetros como tipo e concentrao da fonte de carbono e nitrognio, presena de ons metlicos, pH do meio, temperatura de crescimento e concentrao de oxignio dissolvido (Elibol, 2000). A influncia dos trs primeiros parmetros foi revisada por Sharma et al., (2001) e de acordo com dados da literatura fontes de carbono lipdicas parecem ser essenciais para se alcanar bons rendimentos em sntese de lipase, embora j se tenha 5

conseguido bons resultados na ausncia de leos e gorduras no meio. De modo geral, o uso de nitrognio orgnico favorece altos rendimentos, ressaltando-se o uso de peptona (Comeau et al., 1999), farinha de soja e em menor extenso, de extrato de levedura (Ohnishi et al., 1994); A tabela 1 apresenta exemplos de alguns fungos produtores de lipases. Tabela 1 Exemplo de lipases produzidas por microrganismos Microrganismos Massa Molecular Ophistoma piliferum Mucor hiemalis Rhizopus chinensis Rhizopus oryzae Mucor sp (kDa) 52 e 60 49 28,4 32 42 39 28 Brush et al., 1998 Comeau et al., 1999 Yasuda et al., 1999 Hiol et al., 2000 Comeau et al., 2002 Omar et al, 1987 Huang et al., 2005 Referncias

Humicola lanuginosa
Penicilium expansum

As lipases so em sua maioria, extracelulares, favorecendo sua extrao, isolamento e purificao (Saxena et al., 2003) por remoo de clulas, centrifugao ou filtrao. O interesse em utilizar estes biocatalizadores na modificao estrutural de leos e gorduras tem recebido considervel ateno, devido, em especial, sua especificidade em relao ao substrato (Macrae & Hammond, 1985), citado por Carvalho et al., (2003), podendo ser amplamente usadas no processamento de leos e gorduras, detergentes e formulaes desengraxantes, processamento de alimentos, sntese de produtos para a qumica fina (sntese orgnica) e frmacos, manufatura de papel e produo de cosmticos (Sharma et al., 2001), bem como na degradao de efluentes gordurosos (Masse et al., 2001) e polurietano (Takamoto et al., 2001). As lipases so capazes de catalisar diferentes reaes, tais como: hidrlise, esterifizao, transesterificao (acidlise, interesterificao e alcolise), aminlise e tiotransesterificao. Todas com especificidade quiral, (Villeneuve et al., 2000). Alm disto, est comprovado ser possvel reverter a hidrlise de TAG no sentido da reao de esterificao, pelo controle do teor de gua no meio (Tsujisaka, 1977). Quando h pouco ou nenhuma gua no meio,

apenas reaes de esterificao e transesterificao so favorecidas (Klibanov, 1997). Com base nisto, tornou-se possvel tambm a utilizao de lipases como biocatalisadores da interesterificao de leos e gorduras (Quinlan, 1993, citado por Carvalho et al., 2003). Esta reao traz alteraes na composio e distribuio dos cidos graxos da molcula de triacilglicerol. Esta flexibilidade aliada a diferentes possibilidades de especificidade do substrato existentes entre as diferentes lipases confere a estas enzimas um potencial enorme de aplicaes (Gandhi, 1997). A reao de hidrlise utilizada quando se deseja obter cidos graxos de triacilgliceris, utilizando a lipase como catalisador. O uso dessa enzima como biocatalisador mais atraente, pois a reao se processa em condies brandas de temperatura e presso, bem como, baixa produo de resduos. Assim, esta reao muito aplicada na produo de cidos graxos, diacilgliceris, monoacilgliceris, agentes flavorizantes e detergentes, (Villeneuve et al., 2000). As reaes de esterificao ocorrem entre lcoois e cidos carboxlicos na presena de lipase em solventes orgnicos. O emprego dessa enzima como biocatalisador nestas reaes, tambm oferecem grandes vantagens de se processarem em condies brandas de temperatura e presso, com baixa produo de resduos e alta especificidade (Villeneuve et al., 2000). Como por exemplo, na produo do cido olico. O termo transesterificao refere-se quando ocorre uma reao de troca de um radical acil de um ster e de um cido, processo chamado de acidlise. Quando essa troca ocorre entre um ster e outro ster, de um ster e de um lcool d-se o nome de interesterificao e alcolise, respectivamente. Estas reaes ocorrem industrialmente sobre altas temperaturas e presses, quando na presena de um catalisador qumico. Com a utilizao do biocatalisador (lipases) neste processo de transesterificao, as reaes podem ser realizadas sob condies brandas de temperatura e presso, reduzindo assim, os custos de produo e de formao de resduos e aumentando a sua especificidade (Villeneuve et al., 2000). Como visto anteriormente, as lipases no se limitam somente hidrlise e a sntese de steres de cido carboxlicos. Mas tambm, so capazes de catalisar outras reaes como a aminlise e tioesterificao em solventes 7

orgnicos. Como exemplo tpico destas reaes, podemos citar as snteses de peptdeos, polmeros, surfactantes e novos detergentes (Villeneuve et al., 2000). As vantagens de se utilizar a enzima lipase devem-se principalmente, a sua disponibilidade comercial, baixo custo de produo, versatilidade cataltica, por no requererem cofatores, por serem quimio e enantiosseletiva, regioespecficas para a posio 1,3 de TAGs e atuarem em uma faixa ampla de pH e temperatura. As lipases podem tambm ser usadas para acelerar a degradao de resduos de gorduras, (Masse et al., 2001) e poliuretano (Takamoto et al., 2001). Devido esta capacidade de hidrolisar gorduras, as lipases so muito utilizadas como aditivos na indstria de detergente. Os requisitos que devem ser considerados para que ela seja aplicada na formulao so: (1) baixa especificidade pelo substrato e que possa hidrolisar gorduras de diferentes composies; (2) apresentar capacidade cataltica em condies adversas nas faixas de pH 10 -11 e de temperaturas de 30-60C; (3) no interagir com outros componentes presentes na formulao do detergente (Sharma et al., 2001) e possuir estabilidade na presena de surfactantes e enzimas, especialmente proteases. Em 1994, a Novo Nordisk introduziu a primeira lipase recombinante (Lipolase), originada do fungo Thermomyces lanuginosus e expressa em Aspergilus oryzae. A figura 3 apresenta reaes catalisadas por lipases.

a) Hidrlise:

R1

C O

OR2

H2O

R1

C O

OH

R2

OH

b) Sntese de steres:

R1

C O

OH

R2

OH

R1

C O

OR2

H2O

c) Acidlise:
R1 C O OR2
+

R3

C O

OH

R3

C O

OR2

R1

C O

OH

d) Interesterificao:

R1

C O

OR2 + R3

C O

OR4

R3

C O

OR2 + R1

C O

OR4

e) Alcolise:

R1

C O

OR2 + R3

OH

R1

C O

OR3

R2

OH

f) Aminlise:
R1 C O OR2 + R3 NH2 R1 C O NHR3 + R2 OH

Figura 3. Representao esquemtica de reaes catalisadas por lipases. A maioria das gorduras naturais provenientes dos leos vegetais e de gorduras animais, so misturas complexas de triacilgliceris. Elas contm uma grande variedade de cidos graxos que diferem no comprimento da cadeia carbnica e no grau de saturao, determinando assim, diferentes valores nutricionais e propriedades fsicas. Neste aspecto, as lipase possuem a capacidade de modificar as propriedades dos lipdios atravs das diferentes

reaes, ou seja, trocando uma cadeia de cido graxo de posio no glicerol ou at por uma outra classe de cido graxo mais insaturada, como por exemplo, ma preparao de substitutos para manteiga de cacau aumentando o valor nutricional com baixo custo de produo, (Undurraga et al., 2001). Para produzir agentes flavolizantes (aditivos), as indstrias tambm utilizam as enzimas lipases, visando suas aplicaes em produtos de padarias, queijos e bebidas (Kazlauskas & Bornscheuer, 1998). Alguns componentes hidrofbicos (como triacilgliceris e ceras) presentes nas madeiras causam srios problemas (originando manchas) na preparao do papel (Jaeger & Reetz, 1998). As indstrias Nippon Paper no Japo desenvolveram um mtodo para o controle dessas manchas com a utilizao da lipase de Candida rugosa, que possui a capacidade de hidrolisar mais de 90% dos triacilgliceris de madeira, (Jaeger et al., 1998; Sharma et al., 2001). Como as lipases possuem uma quimio-regio e esterioseletividade, seu uso como catalisadores em snteses orgnicas, especificamente na produo de medicamentos tm crescido enormemente nos ltimos anos, (Rubin & Dennis, 1997; Berglund & Hutt, 2000). Nas indstrias farmacuticas, os cidos graxos poliinsaturados obtidos atravs das lipases so utilizadas na produo de anticolesterolmicos, antiinflamatrios e trombolticos (Gill & Valivety, 1997; Berlabi et al., 2000). As condies para hidrlise e glicerlise comercial envolvem temperaturas de 240-260C e altas presses. O uso de lipases em processamento de leo economiza energia e minimizam degradao durante alcolise, acidlise, hidrlise e glicerlise (Bornscheuer, 2000; Vulfson, 1994). A introduo de uma nova gerao de enzimas de menor custo e termoestveis pode mudar o balano econmico em favor das lipases na indstria oleoqumica reduzindo o nmero de solventes orgnicos e a aplicao de emulsificantes nas reaes. Alm das possibilidades de aplicao na indstria, as lipases esto ligadas deteriorao de alguns produtos, principalmente de laticnios e de leos comestveis e a identificao e estudo de seu modo de ao podem auxiliar grandemente na soluo destes problemas (Hiol, 2000).

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A lipase tem sido tambm muito atraente sob o ponto de vista ambiental. Com a adoo de um maior rigor nos padres de descarte de guas residurias a realizao de pesquisas tem sido motivada, com o objetivo de reduzir o impacto ambiental em efluentes contendo elevados teores de lipdeos, como provenientes de laticneos, matadouros e avcolas, enlatados, extrao de leos, entre outros. A poltica Nacional de Recursos Hdricos, instituda pela Lei Federal n 9.433 de 8 de janeiro de 1997 trata da cobrana pelo uso de corpos d`gua para o lanamento de despejos lquidos. Os lipdeos contidos nestes efluentes, alm de representarem uma perda industrial importante, interferem negativamente nos Sistemas de Tratamento de Efluentes. Dentro deste contexto, processos alternativos por meio de ao de enzimas, particularmente lipases vem sendo utilizados. A sua utilizao reduz os nveis slidos suspensos e lipdeos, o que possibilita melhores condies de operao no tratamento anaerbio e desobstrui filmes de leos em tubulaes, resultando no aumento de vida til dos equipamentos, alm do aumento do rendimento pela no gerao de subprodutos txicos, tornando este processo atrativo em relao aos impactos ambientais (Mendes et al., 2005). A aplicao de enzimas em processos industriais em vrios produtos uma realidade e o uso de enzimas dentre vrias outras utilidades, em raes para animais monogstricos, tambm tm mostrado seus benefcios por vrios autores, tanto na melhora da digestibilidade de nutrientes, quanto na melhora do desempenho dos animais. Marsman et al., (1995) fazendo uso de enzimas em raes a base de farelo de soja e de soja integral extrusada para frangos de corte, observaram que a presena de enzimas melhorava a digestibilidade da protena bruta de forma significativa quando comparada a no adio de enzimas. A tabela 2 ilustra o resumo de algumas das possibilidades de uso, em escala industrial.

Tabela 2. Aplicaes industriais da lipase: Indstria Aplicao 11

Laticnio

Hidrlise da gordura do leite; Aumento do aroma, da qualidade e de vida de prateleira; Aumento do aroma e acelerao do processo fermentativo; Aumento de propriedades funcionais da gema do ovo; Desenvolvimento de aromas e reduo no contedo de gorduras; Transesterificao de oleos-introduo de cidos graxos de interesse em leos e gorduras naturais; Sntese de steres e resoluo de racematos Hidrlise de gorduras; Auxiliares de digesto; Determinao de lipdeos no sangue

Cervejaria Molhos e Condimentos Processamento de Carnes Oleos e gorduras

Qumica fina Detergentes Farmacutica Mdica

(biossensores); Couro Remoo de gordura da matria-prima; Tratamento de resduos Decomposio de lipdeos em efluentes. Fonte: Gandhi, 1997 A suplementao enzimtica pode ser usada para incrementar a utilizao de nutrientes pelos animais melhorando a utilizao de energia metabolizvel (Garcia et al., 1998), ento, as indstrias produtoras de enzimas comercializam complexos multienzimticos para serem adicionados em matrias primas especficas ou para serem suplementadas nas dietas, buscando melhor valor nutritivo para dietas de baixa viscosidade, a base de milho, ou sorgo e soja. Os suplementos enzimticos geralmente contem amilase, protease, lipase e xilanase (Zanella, 1998). O fungo Trichoderma harzianum tem se destacado como um potente produtor de uma gama de enzimas hidrolticas como: -amilase, celulase, lipase, -glicosidase, -1,3-glucanase, fosfatases cida e alcalina (Stendorff, 2006). Alm de um excelente produtor de enzimas, este gnero se destaca pela sua importncia no controle biolgico representando muito interesse para fins biotecnolgicos. Assim sendo, tornou-se de nosso interesse estudar a produo e caracterizao de lipases produzidas por fungos da espcie T.

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harzianum uma vez que no h relatos dessa utilizao na comunidade cientfica. O Trichoderma spp um Deuteromiceto, pertencente subclasse Hifomiceto, ordem Monilialles. So fungos que se reproduzem assexuadamente, atravs dos conidiforos, originados nas hifas, que produzem condios e so extraordinrios pelo seu rpido crescimento, capacidade de utilizar diversos substratos e resistncia a produtos qumicos. So filamentosos, heterotrficos e saprfitas predominando na microflora de vrios solos e na rizosfera de plantas em toda zona climtica e alm de significantes decompositores, algumas espcies estudadas so tambm economicamente importantes porque produzem enzimas e antibiticos ou so utilizadas como agentes de biocontrole (Kubicek, 2003) e mais recentemente em processos biotecnolgicos em indstria txtil, indstria de papel e alimentcia (Kubicek e Harman, 1998). Caracterizam-se por utilizar uma grande variedade de compostos como fontes de carbono e nitrognio (Melo, 1996), ocorrendo sobre todos os tipos de solos, embora se desenvolvam melhor em condies cidas. So mesfilos, sensveis a altas temperaturas e pHs extremos, so resistentes a alguns inibidores produzidos por outros organismos e tolerantes a vrios tipos de fungicidas. Produzem uma grande variedade de enzimas hidrolticas, que apresentam importante papel na degradao e liberao do carbono e nitrognio a partir de macromolculas insolveis (Bara, 2002). Fatores como pH, tipo de solo, umidade e temperatura influenciam na ocorrncia diferencial das mais de 30 espcies j conhecidas deste gnero (Bara, 2002). O mecanismo de controle biolgico realizado pelo gnero Trichoderma se deve principalmente ao seu potencial em produzir enzimas hidrolticas tais como, celulases, quitinases, -1,3-glucanases e proteases (Ulhoa & Peberdy, 1992; Lorito et al., 1993; Haran et al., 1996) e devido a esta capacidade, estas espcies despertam um grande interesse econmico. As mais comuns espcies estudadas so T. virens, T. harzianum e T. viride (Hermosa, 2000).

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2. OBJETIVOS

1) Avaliar a produo de lipase pelo fungo T. harzianum em diferentes meios de cultivo;

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2) Caracterizao da lipase parcialmente purificada de T. harzianum.

3. MATERIAL E MTODOS
3.1. Origem e manuteno dos fungos A cepa do fungo utilizado neste trabalho foi isolado de T. harzianum (ALL 52) da coleo do Laboratrio de Enzimologia ICB/UFG. Esses fungos

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foram mantidos por repiques mensais em meio MYG (0.5% de extrato de malte; 0.25 % extrato de levedura; 1.0 % glicose; 2.0% de gar), armazenados a temperatura ambiente por aproximadamente 15 dias. O fungo T. harzianum foi isolado de amostras de solo do cerrado e caracterizado por Lima (2002). 3.2. Produo de lipase Para avaliar o perfil da produo de lipases por T. harzianum, vinte e cinco discos de meio MYG com 1mm de dimetro, contendo esporos do fungo foram inoculados em frascos Erlenmeyer contendo 250 mL de meio de cultura TLE {CaCl2 0.3 g.L-1; KH2PO4 2.0 g.L-1; (NH4)2SO4 1.4 g.L-1; MgSO4.7 H2O 0.3 g.L-1; glicose 2.5 g.L-1; uria 0.3 g.L-1; 1.0 g.L-1 de bactopeptona, 1.0 mL de soluo de elementos traos {(0.25% CuSO4. 5H2O, 5% Fe(NH4)2SO4.6H2O, 0.05% MnSO4. 4H2O, 0.05% NaNO3. 2H2O e 0.05% de H3BO4)}, em pH 5.0, testados com diferentes fontes de carbono, dentre elas: farelo de soja (0.5%), farelo de milho (0.5%), leo de soja (0.5%), rao animal para frangos (0.5%), farelo de sorgo (0.5%) e amido (0.5%), e como controle o fungo foi cultivado tambm na ausncia destas fontes de carbono. As culturas foram incubadas a 28C no tempo de 72 horas para avaliar a melhor cintica de produo. Aps ensaio e dosagem de protenas o meio TLE suplementado com 2.5 g/L de rao animal para frangos {(Calcrio 0.93 g%; DL-MET 99 0.21 g%; Farelo de Soja 29.8 g%; Farelo Biclcico 1.63 g%; Inerte 0.10 g%; L-LIS HCl 0.21 g%; Milho 63.22 g%; leo vegetal 3.12 g%; Vit-cres-aves 0.4 g%)}, foi utilizado como indutor da lipase produzida pelo T harzianum. Os fracos foram incubados em agitador rotatrio a 28C com velocidade de 140 rpm por 12-120 horas. Aps este tempo, a cultura foi filtrada em papel de filtro, e as amostras enzimticas foram centifugadas a 4C e 10000 rpm durante 10 minutos e posteriormente, estocadas no freezer a 20C. 3.3. Ensaio enzimtico da lipase A atividade de lipase foi determinada usando um mtodo de Heinoen e Lahti (1981). Foram acrescentados 100 l de substrato {-nitrofenol-palmitato(-NPP) (Sigma Chemical Company)} em 700 l de soluo tampo Tris HCl, pH 8.0 e 100 L de enzimas. O substrato utilizado para os ensaios foram

16

preparados em concentrao de 5.0 mM com 1% de Triton X-100. As amostras foram incubadas por 60 minutos a 40C. A reao foi interrompida com a adio de 100 L de carbonato de sdio (100 mmol.L-1). A quantidade de nitrofenil (-NP) liberada foi determinada por espectrofotometria a 410nm. Uma unidade de enzima (U) foi definida como a quantidade de enzima necessria para produzir 1 mol de -NP por minuto e cidos graxos. 3.4. Dosagem de protenas totais As concentraes de protenas foram determinadas pelo mtodo de Bradford et al. (1976), utilizando albumina srica bovina (BSASigma) como padro. Amostras de 100 L do sobrenadante de cultura foram adicionados a 1 mL da soluo de Bradford. Aps incubao por 15 minutos, a temperatura ambiente foi realizada a leitura de absorbncia das amostras a 595 nm. 3.5. Eletroforese Desnaturante (SDS-PAGE) Para a anlise do perfil de protenas secretadas pelo isolado de T. harzianum e o grau de pureza da enzima estudada nas etapas de purificao, foram utilizados o sistema de eletroforese (Hoefler mini VE system Amersham Biosciences) em gel de poliacrilamida a 12%, em condies desnaturantes (SDS-PAGE), conforme descrito por Laemmli (1970). Amostras de protenas foram concentradas por liofilizao, ressuspendidas em tampo de amostra desnaturante 1x (25 L de tampo Tris-HCl 50 mmol.L-1 pH 6.8; 2 L de -mercaptoetanol; 100 L SDS 10%; 100 L glicerol; 0.0005 mg de azul de bromofenol e gua destilada suficiente para 1 mL), fervidas por 5 minutos e aplicadas no gel. A eletroforese procedeu utilizando-se uma voltagem inicial de 80 V, posteriormente aumentada para 100 V. Os marcadores utilizados para a determinao da massa molecular foram: -galgactosidase (116 kDa), serina albumina bovina (66.2 kDa), ovoalbumina (45 kDa), lactase desidrogenase (35 kDa), Rease Bsp98I (25 kDa), -lactoglobulina (18.4 kDa), lisozima (14.4 kDa). 3.6. Colorao com nitrato de prata

17

Aps a eletroforese o gel foi corado para protenas utilizando-se o mtodo descrito por Blum et al. (1987). O gel foi transferido para a soluo fixadora (metanol 50% e cido actico 12%) por 12 horas, o gel foi lavado com uma soluo de etanol 50% (v/v) por trs vezes com intervalos de 20 minutos. Aps as lavagens o gel foi incubado em uma soluo de tiossulfato de sdio (0.02%) por 1 minuto, lavado trs vezes com gua destilada durante 30 segundos cada uma e em seguida incubada por 20 minutos em uma soluo de nitrato de prata (0.2%), contendo 75l de formaldedo (37%). Novamente o gel foi lavado gua destilada por trs vezes e a revelao foi feita com carbonato de sdio (6%), contendo 50 l de formaldedo (37%) e 2 ml de tiosulfato de sdio (0.02%). Aps a revelao o gel foi lavado com gua destilada duas vezes por 2 minutos e a reao foi ento, interrompida com a transferncia do gel para soluo descorante (metanol 50% e cido actico 12%). 3.7. Purificao parcial da lipase As condies de cultura de T. harzianum para a purificao da lipase so as mesmas descritas no item 3.2. tendo como fonte de carbono a rao animal (0.5%). Amostras de 20 mL do sobrenadante foram concentrados por liofilizao e ressuspendidas em 20 mL de tampo acetato de sdio 50 mmol.L1

e pH 5.0. A amostra foi aplicada em uma coluna de troca inica Q-Sepharose A coluna foi lavada com 100 mL de

High Performance (1.5 cm x 16.0 cm), previamente equilibrada com o tampo acetato, com um fluxo de 60 mL.h-1. tampo acetato; 100 mL de gradiente variando a concentrao do tampo de 0 a 1.0 mol.L-1 de cloreto de sdio, e posteriormente lavada novamente com 50 mL de tampo acetato de sdio 50 mmol.L-1, 1 mol.L-1 de cloreto de sdio e pH 5.0. Fraes de 3 mL foram coletadas e usadas para determinao de protenas a 280 nm e atividade da lipase a 410 nm. O pico das fraes que apresentaram atividade de lipase foram reunidas (12 mL), dialisadas contra tampo 4C, e concentradas por liofilizao. O material liofilizado foi diludo em 1 mL de tampo acetato de sdio 50 mmol.L-1 pH 5,0 contendo 0,1 mol.L-1 de cloreto de sdio e aplicado numa coluna de gel filtrao, Sephacryl S-200 (44.3 x 2.6 cm). O fluxo utilizado foi de 18 mL.h -1 e

18

fraes de 1 mL foram coletadas e utilizadas para determinao de protenas a 280 nm e atividade lipase. 3.8. Determinao da massa molecular A determinao da massa molecular da enzima foi realizada com a coluna de gel filtrao Sephacryl S-200, previamente equilibrada com tampo acetato de sdio 50 mmol.L-1 pH 5.0, contendo 0.1 mol.L-1 de cloreto de sdio. O fluxo utilizado foi de 18 mL.h-1, sendo coletadas fraes de 1 mL. A coluna foi calibrada com as seguintes protenas padres (Sigma Chemical Company): -amilase (200 kDa), albumina bovina (66 kDa) e tripsinognio (24 kDa). O volume vazio foi determinado utilizando o blue dextran (2000 kDa). A massa molecular foi calculada a partir da mobilidade versus massa molecular dos marcadores de protena utilizados.

3.9. Determinao do pH timo O efeito do pH na atividade da lipase foi determinado incubando a enzima com diferentes valores de pH variando de 3.0 a 6.5 em tampo acetato 50mmol.L-1 e 7.0 a 9.0 em tampo Tris-HCl 50mmol.L-1 realizados em triplicata nas condies descritas no item 3. 3. 3.10. Determinao da temperatura tima O efeito da temperatura na atividade da lipase foi determinado incubando a enzima em tampo Tris-HCl pH 8.0 em diferentes temperaturas, variando de 25 a 60C, com intervalo de 5C. Os ensaios foram realizados em triplicata, conforme as condies descritas no item 3.3. Os ensaios foram

3.11. Determinao da termoestabilidade Para a determinao da termoestabilidade na atividade da lipase, a enzima foi pr-incubada nas temperaturas de 40 e 50 C por 30, 60, 90, 120 e 180 minutos e a atividade relativa foi determinada em triplicata seguindo as condies descritas no item 3.3.

19

3.12. Efeito de ons metlicos e alguns compostos na atividade da lipase O efeito de ons, inibidores e agentes desnaturantes foram determinados aps pr-incubao por 10 min, da enzima parcialmente pura com os seguintes compostos: FeCl2, HgCl2, -2-mercaptoetanol, CuSO4, EDTA, NaCl, CaCl2, MnCl2 com a concentrao de 2 e 5 mmol.L-1. O ensaio sem a adio desses, foi considerado o controle e sua atividade definida como tendo um valor de 100%. Os ensaios foram realizados em duplicata e a dosagem da atividade de lipase segue as condies de ensaio descritas no item 3.3. 3.13. Estabilidade da lipase em solventes orgnicos A estabilidade da lipase em solventes orgnicos foi determinada incubando a enzima parcialmente purificada na presena dos seguintes compostos: metanol, etanol, propanol, butanol, acetona e benzeno. Os ensaios foram realizados em duplicata e a dosagem de lipase segue as condies de ensaio descritas no item 3.3. com a adio de cada solvente na concentrao final de 5% (v/v). 3.14. Determinao da constante de Michaelis-Menten (Km) e Velocidade mxima da reao (Vmx) Com o objetivo de determinar as propriedades cinticas da lipase, os ensaios de atividade enzimtica foram realizados incubando a enzima em concentrao crescente de -NPP (100 a 1500 mol.mL-1) e a atividade foi realizada conforme descrito no item 3.3. Os clculos dos valores das constantes foram feitos atravs do mtodo de Michaelis-Menten, utilizando-se o programa Curve Expert 1.3. Os ensaios foram realizados em triplicata.

3.15. Anlise Cromatogrfica da reao de lipase com leo de soja Para avaliar o efeito da lipase de T. harzianum em leo de soja foram incubados 100 l da enzima com 100 l de tampo Tris HCl pH 8.0 e 50l de leo de cozinha (leo de soja) de 24 a 72 horas a 37 C e 140 rpm. Como controle foram utilizados 150l de tampo Tris HCl pH 8.0 com 50l de leo e 100l da enzima com 100l de tampo Tris HCl pH 8.0. 20

As anlises foram realizadas no LAMES-Laboratrio de Mtodos de Extrao e Separao IQ-UFG, em Cromatgrafo a gs Agilent 6890 acoplado ao um Detector de Ionizao em Chama (FID) e equipado com injetor split/splitless. As temperaturas do detector e do injetor foram 380C e 360C, respectivamente. Empregou-se hidrognio 5.0 como gs de arraste a uma velocidade linear de 77cm/s e vazo de 40 mL/min e nitrognio 5.0 como gs auxiliar a uma vazo de 60mL/min. O injetor foi operado no modo split pulsado com pulso de presso de 7psi durante 0,1 minutos. A razo de split foi de 1: 50, para o volume de injeo de 1L. A separao cromatogrfica ocorreu em coluna capilar LM 169 CROMA-5HT de fase estacionria 5% fenil 95% polimetilsiloxano com 8m de comprimento, 250m de dimetro interno e 0.08 m de espessura de filme. Programou-se o forno para trabalhar a uma temperatura inicial de 50C com rampa de aquecimento de 30C/min at a temperatura final de 370C na qual permaneceu por 7 minutos.

4. RESULTADOS

4.1. Produo de lipase por T. harzianum em diferentes fontes de carbono Os resultados mostram que o sobrenadante do meio TLE suplementado com farelo de soja apresentou a maior atividade enzimtica, quando

21

comparado com os demais meios. Entretanto, a atividade enzimtica encontrada no meio contendo rao animal, foi maior do que aquelas encontradas nos meios contendo leo de soja, farelo de milho, farelo de sorgo e amido (Figura 4) e foi ento utilizada para a produo da lipase.
1- Lipase 2- Protenas

60 55 50 45 40 35

U/mL

-1

30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 7

Fontes de carbono

Figura 4. Produo de lipase por T. harzianum, em meio TLE suplementado com 0.5% de diferentes fontes de carbono (1) controle, (2) farelo de soja, (3) rao animal, (4) leo de soja, (5) farelo de sorgo, (6) amido e (7) farelo de milho, incubados por 72 h a 28C. Com objetivo de avaliar o perfil de protenas secretadas nestes meios, amostras de sobrenadante contendo aproximadamente 5 g de protena, foram liofilizadas e aplicadas em um gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Aps colorao do gel com nitrato de prata, observamos que as amostras do meio contendo sorgo, amido e milho (0.5%) apresentaram o maior nmero de bandas seguido pelo meio contendo farelo de soja, rao e leo de soja (0.5%), como mostrado na figura 6. 4.2. Cintica de produo de lipase por T. harzianum ALL 52 O fungo apresentou uma atividade mxima de lipase em 72 horas de incubao, sendo que a partir deste tempo a atividade sofre um decrscimo at 120 horas (Figura 5). A quantidade de protena no sobrenadante de cultura atinge um valor mximo em 72 horas a partir do qual inicia-se um decrscimo significativo at 96 horas. 22

20

Protenas Lipase

20

Atividade Lipase (U/mL )

16 14 12 10 8 6 4 2 0 0 12 24 36 48 60 72 84 96 108 120

16 14 12 10 8 6 4 2 0

Tempo (horas)

Figura 5. Cintica de produo de lipase por T. harzianum cultivado em meio TLE suplementado com 0.5% de rao animal contendo farelo de soja e de milho.

kDa

Protenas (mg. mL)

18

18

-1

23

166 66.2 45 35

25

Figura 6. Perfil de protenas em eletroforese em gel de poliacrilamida 12% em condies desnaturantes corado com nitrato de prata: 1) marcadores; 2) controle; 3) farelo de soja; 4) rao animal; 5) leo de soja; 6) farelo de sorgo; 7) amido e (8) farelo de milho, incubados por 72 h, 28C e 140 rpm. 4.3. Purificao parcial da lipase produzida por T. harzianum Na purificao parcial da lipase produzida por T. harzianum, o fungo foi inoculado em meio de cultura TLE contendo rao animal e incubado por 72 horas a 28C. 20 ml do sobrenadante da cultura liofilizado e ressuspedido em tampo acetato de sdio e 50 mmol.L-1 pH 5.0, foi aplicado em coluna de troca inica Q-Sepharose (Figura 7) resultando em dois picos de protenas e dois picos de atividade de lipase (fraes 11 a 19 e 81 a 89, respectivamente). As fraes foram coletadas em 3 ml por tubo com um fluxo de 60 mL.h-1. O extrato bruto foi tambm aplicado coluna de cromatografia de gel filtrao Sephacryl S-200 onde se obteve tambm dois picos de atividade enzimtica, porm apenas um pico de protenas. A anlise das fraes com a atividade de lipase obtida nas duas colunas foi realizada atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida. Podemos observar pela figura 9 que a quantidade de protenas menor para o segundo pico de atividade da lipase para a coluna de troca inica Q-Sepharose, coincidindo tambm com uma maior atividade da lipase. O pool de amostras com atividade do segundo pico (20 ml) foi submetido dilise contra tampo por 3 horas e posteriormente, concentradas por liofilizao, ressuspendido em 1 mL de tampo acetato de

24

sdio 50 mmol.L-1 pH 5.0 com 0.1 mol.L-1 de NaCl e aplicada na coluna de gel filtrao Sephacryl S-200. A cromatografia resultou em um pico com atividade de lipase (frao 143) como mostrado na figura 10, porm, a enzima no foi totalmente purificada.

3,0

Protenas Lipase ------(NaCl)

NaCl

0,5 1,0

Atividade de Lipase (U/mL )

-1

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 0 20 40 60 80

0,4 0,8

Absorbncia (280 nm)

0,3 0,6

0,2 0,4

0,1 0,2

0,0 0,0 100 120

Fraes (n)

Figura 7. Perfil cromatogrfico do sobrenadante da cultura de T. harzianum aplicado em coluna de interao hidrofbica, Q-Sepharose -- Protena (A280nm); --Atividade de lipase; ----- gradiente de NaCl (0 1.0 mol.L-1).
70 65 60 4,0

Atividade lipase (U/mL )

-1

50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260

2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0

Vo

Fraes (n)

-1

3,0

Protenas (ug/mL )

55

Lipase Protenas

3,5

NaCl

25

Figura 8. Perfil cromatogrfico do sobrenadante da cultura de T. harzianum aplicado em Sephacryl S-200 -- Protena (A280 nm); --Atividade de lipase; V0 = volume vazio.

kDa

3a

3b

4a

4b

97 45

29

Figura 9. Eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE 12%), corada pela metodologia da prata, de amostras da lipase de T. harzianum. Amostras 1) marcadores; 2)- extrato bruto; 3a) eluato da coluna de troca inica (1 pico); 3b) eluato da coluna de troca inica (2 pico) ; 4a) eluato da coluna de gel filtrao (1 pico); 4b) eluato da coluna de gel filtrao (2 pico).

30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

Lipase Protenas

20 18

Atividade Lipase (U/mL )

-1

14 12 10

Vo

8 6 4 2 0

100

120

140

160

180

200

Fraes (n)

Protenas (mg/mL )

-1

16

26

Figura 10. Perfil cromatogrfico do pool de enzimas (2 pico) de T. harzianum em Q-Sepharose aplicado em Sephacryl S-200 -- Protena (A280 Atividade de lipase V0 = volume vazio. 4.4. Determinao da massa molecular da lipase A massa molecular da lipase produzida por T. harzianum e parcialmente purificada neste trabalho, foi determinada por cromatografia de filtrao em gel (Sephacryl S-200) e o valor encontrado foi de aproximadamente de 78 kDa (Figura 11).
nm

); --

2,4
Beta-amylase (200 kDa)

log massa molecular

2,2

2,0
Albumina bovina (66 kDa)

1,8

Lipase (78 kDa)

1,6

1,4 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7

Tripsinognio (24 kDa)

Ve/Vo

Figura 11. Determinao da massa molecular da lipase produzida por T. harzianum em cromatografia de gel filtrao. 4.5. Efeito do pH na atividade de lipase O efeito do pH na atividade da lipase apresentado na figura 12. De acordo com o grfico observa-se que a enzima apresenta dois picos de atividade, respectivamente em pH 5.0 e 8.0. Porm, apresenta uma atividade relativa maior que 85% na faixa de pH entre 7.0 e 8.0 e com o valor mximo em pH 8.0. Para o pH estudado, a lipase foi incubada durante 60 min a 40C na presena de tampo 50 mmol.L-1: 3.0 a 6.5, tampo acetato; 7.0 a 9.0 tampo Tris HCl.

27

tampo Tris HCl

110 100

Atividade relativa (%)

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 3 4 5 6 7 8 9

tampo acetato de sdio

pH

Figura 12. Efeito do pH na atividade da lipase de T. harzianum. A atividade foi expressa em porcentagem em relao atividade encontrada no pH 8,0. 4.6. Efeito da temperatura na atividade de lipase O efeito da temperatura na atividade da lipase apresentado na Figura 13. Conforme demonstrado no grfico a enzima apresentou uma maior atividade na faixa de 35 a 40C, com atividade relativa maior que 85% e valor mximo obtido a 40C.

100

Atividade Relativa (%)

80

60

40

20

0 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Temperatura (C)

28

Figura 13. Efeito da temperatura na atividade lipase de T. harzianum. A atividade foi expressa em porcentagem a partir da atividade encontrada na temperatura de 40C. 4.7. Efeito da temperatura na termoestabilidade da lipase Para analisar o efeito da temperatura na estabilidade da enzima parcialmente purificada, as amostras enzimticas foram pr-incubadas nas temperaturas de 40 e 50C, em tempos variados (0 a 180 minutos). A enzima relativamente estvel a 40C, por apresentar atividade relativa de 80%, mesmo aps 30 minutos de pr-incubao (Figura 14). Aps este perodo a enzima apresenta apenas 50% de sua estabilidade. Entretanto, quando incubada a 50C, neste mesmo tempo, observa-se um decrscimo na atividade relativa para 33% e aps este perodo a enzima perde sua atividade.
110

Atividade relativa %

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 30 60 90 120 150

40C 50C

180

Tempo (min)

Figura 14. Efeito da temperatura na termoestabilidade da lipase de T. harzianum. 4.8. Determinao da constante de Michaelis-Menten (Km) e Velocidade mxima da reao (Vmx) A fim de determinar as propriedades cinticas da lipase, os ensaios de atividade enzimtica foram realizados incubando a enzima em concentrao crescente de -NPP (50 a 1500 mol.mL-1) em pH 8.0 e

29

temperatura 40C. O Km encontrado foi de 660.4 mol.mL-1 e Vmx de 33.64 U.min-1 ( Figura 15).

30

V (umol p-NP liberado.min )

25

-1

20

15

10

0 0 200 400 600 800 1000

p-NPP(umol)

Figura 15. Efeito da concentrao de -NPP na velocidade da reao da lipase produzida por T. harzianum. 4.9. Efeito de alguns ons metlicos e outros compostos na atividade da lipase O efeito de ons metlicos e outros compostos sobre a atividade da lipase foi determinado pr-incubando a enzima por 10 minutos com FeCl2, HgCl2, -2-mercaptoetanol, CuSO4, EDTA, CaCl2, NaCl e MnCl2 nas concentraes de 2 e 5 mmol.L-1 (Tabela 3). Podemos observar que a enzima apresenta estabilidade em relao aos ons e outros compostos, porm ativada por CuSO4 na concentrao 5mmol. L-1. Tabela 3. Influncia dos vrios compostos sobre a atividade de lipase produzida por T. harzianum Compostos Controle CuSO4 2 mMol. L-1 CaCl2 HgCl2 5 mMol. L-1 2 mMol. L-1 5 mMol. L-1 2 mMol. L-1 5 mMol. L-1 -2-mercaptoetanol 2 mMol. L-1 5 mMol. L-1 FeCl2 2 mMol. L
-1

Atividade relativa (%) 100 79 106 97 94 94 89 88 87 94

30

MnCl2; EDTA NaCl

5 mMol. L-1 2 mMol. L-1 5 mMol. L-1 2 mMol. L-1 5 mMol. L-1 2 mMol. L-1 5 mMol. L-1

82 89 82 93 80 88 59

4.10. Efeito de solventes orgnicos na atividade de lipase Para avaliar o efeito de solventes orgnicos foram utilizados 5% de acetona, benzeno, metanol, etanol, isopropanol, isobutanol e heptano. Pode observar atravs dos resultados que a lipase manteve 60% de sua atividade relativa em presena de metanol, porm foi fortemente inibida pelos demais solventes.

Atividade Relativa (%)

100

80

60

Legenda 1- Tris HCL(controle) 2- Acetona 3- Benzeno 4- Metanol 5- Etanol 6- Iso-propanol 7- Iso-butanol 8- heptano

40

20

Solventes (5%)

Figura 16. Efeito de solventes orgnicos na atividade da lipase de T. harzianum. 4.11. Efeito do metanol e heptano na atividade de lipase

31

A ao do metanol na atividade de lipase foi avaliada submetendo-se a enzima a concentraes crescentes (1 a 5%) de metanol e em seguida realizado ensaio como descrito no item 3.3., utilizando-se como controle ensaio na ausncia de metanol. Como pode observar (Figura 17), a atividade da lipase foi ativada na concentrao de 1% de metanol e manteve atividade acima de 74% para as demais concentraes. Para avaliar a ao do heptano tambm foram testadas diferentes concentraes (1 a 5%) do solvente e em seguida realizado ensaio como descrito no item 3.3, onde tambm foi utilizado como controle o ensaio na ausncia de heptano. Como pode se observar (Figura 18), na concentrao de 1% de heptano a enzima mantm 91% de sua atividade, entretanto, nas demais concentraes a enzima tem decrscimo significativo de sua atividade.

Atividade Relativa (%)

100

80

60

40

20

Metanol (%)

Figura 17. Efeito de diferentes concentraes de metanol (1 a 5%) na atividade de lipase.

32

Atividade Realativa (%)

100

80

60

40

20

Heptano (%)

Figura 18. Efeito de diferentes concentraes de heptano (1 a 5% v/v) na atividade de lipase. 4.12. Efeito da ao da lipase em leo de soja De acordo com o resultado houve uma pequena degradao de leo em 24 horas, entretanto em 48 e 72 horas o leo foi totalmente degradado.

pA

T52 T50 T48

1200

1000

800

600

400

T58
14

200

T56
0 2 4 6 8 10 12

T54 T60
min

Figura 19a. Anlise cromatogrfica do leo de soja na ausncia de lipase (Controle 01)

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Figura 19b. Efeito da ao da lipase em leo de soja em 24, 48 e 72 horas.

5. DISCUSSO
evidente a importncia das lipases devido ao fato de serem obtidas a partir de diferentes fontes, serem seletivas em relao aos seus substratos e tambm catalisadores muito eficientes mesmo sob condies brandas de operao. Dentre tantas vantagens para aplicaes industriais, esta enzima tem despertando grande interesse para suplementao enzimtica de raes, podendo ser usada para incrementar a utilizao de nutrientes pelos animais melhorando a utilizao de energia metabolizvel. Neste trabalho utilizamos o isolado de T. harzianum ALL 52 para a produo de lipase. Este fungo foi isolado de amostras de solo do cerrado por Lima (2002) e demonstrou um grande potencial para a produo enzimas hidrolticas, dentre elas as -1,3glucanases (Bara et al., 2002), -amilase, celulase, lipase, -glicosidase, fosfatases cida e alcalina (Stindorf & Ulhoa, 2006). Na literatura ainda no

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existem relatos de lipase purificada produzida pelo T. harzianum, por isto, o nosso interesse na produo, purificao e caracterizao de lipase produzida por este fungo. Considerando o potencial deste isolado para a produo de lipase foi de nosso interesse avaliar a produo de lipase em diferentes fontes de carbono. Para tanto, o T. harzianum foi cultivado durante 72 horas de incubao a 28 C e 140 rpm, no meio TLE suplementado com 0.5% de farelo de soja, rao contendo soja e milho (TLE-RAFSM), leo de soja, milho, amido e sorgo como principal fonte de carbono e nitrognio. Observamos que o fungo foi capaz de produzir e secretar no sobrenadante da cultura a enzima lipase: 21 mg/mL-1 em meio contendo farelo de soja, 9.0 mg/ mL -1 mg/ mL-1 em meio contendo rao, 7.0 em meio contendo em meio contendo leo de soja, 0.5 mg/ mL-1

farelo de sorgo, 0.18 mg/ mL-1 em meio contendo amido e 0.8 mg/ mL-1 em meio na ausncia de qualquer indutor. Diante dos resultados pode se observar que a cintica de produo da lipase pelo T. harzianum extremamente influenciada pela fonte de carbono de origem lipdicas, ou seja, a produo foi aumentada 116 vezes em relao ao amido e 26 vezes em relao ausncia de indutor. Foram observados tambm que os meios de cultura da levedura Rhodotorula glutinis em frutose e, em leo de palmeira, foram ambos notados como sendo as melhores fontes de carboidratos e de lipdios na produo da lipase. Quando comparada essas duas fontes de carbono, percebeu-se que o leo de palmeira induz uma produo doze vezes maior de lipase do que a induzida pela frutose, (Papaparaskeras et al., 1992). Outros estudos foram feitos na produo de lipase utilizando como substrato o leo de oliva como fonte de carbono. Desse modo, Sztjajer et al., (1993) verificaram que quando se utilizou o fungo Penicillium expansum em meio de cultura contendo leo de oliva 0.1% e pH 8.3, obteve uma mxima atividade enzimtica da lipase. Algumas lipases termoestveis foram produzidas por Gao & Breuil (1995), utilizando a espcie de fungo Ophiostoma piceae com diferentes leos de plantas (como por exemplo: oliva, soja, girassol, semente de algodo, milho e palmito). Uma produo mxima da lipase ocorreu quando se utilizou leo de oliva. Neste trabalho, optou-se pela produo de lipase induzida por rao contendo milho e soja, por no existirem

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dados na literatura em que rao animal suplementado com soja e milho tivesse sido usado para a produo de lipases em T. harzianum. Amostras do sobrenadante de cultura em meio TLE com 0.5% de rao animal (RAFSM) foram coletadas nos tempos de 24, 48, 72, 96 e 120 horas a 28C. Observamos que aps 48 horas de incubao a atividade enzimtica cresce apresentando um valor mximo em 72 horas (Figura 1). Aps este tempo ocorre um decrscimo significativo na atividade da lipase. As tentativas de purificao da lipase foram feitas utilizando-se cromatografia de troca inica (Q-Sepharose e S-Sepharose) e filtrao em gel (Sephacryl S-200). Os melhores resultados foram obtidos quando utilizamos as colunas de Q-Sepharose seguida de filtrao em Sephacryl S-200 (Figura 7 e 9). Aps utilizar as trs colunas de cromatografia, possvel observar que a SSepharose no foi um mtodo adequado para a purificao da lipase do T. Harzianum, pois a enzima foi facilmente eluda no incio das fraes. Quanto coluna de gel filtrao S-200, obteve- se dois picos de atividade considervel, sugerindo duas lipases com massas moleculares bem diferentes (77 kDa e 9 kDa), entretanto, a enzima diluda de tal forma que a atividade s detectvel aps incubao por 12 horas. O melhor resultado foi obtido pela coluna Q-Sepharose, onde pode se obter dois picos de atividades sugerindo tambm a existncia de duas lipases. Brush et al., (1998) relata a purificao de duas lipases produzidas por Ophiostoma piliferum, uma lipase com massa molecular de 60 kDa e uma outra menor de 52 kDa. Comeau et al., (1999) tambm relata que um filtrado de cultura de Mucor hiemalis aplicado em coluna de Q-Sepharose, obtiveram duas fraes com atividade de lipase. As fraes de maior atividade eludas na presena de 1.0 a 0 M de NaCl foram coletadas, dialisadas em tampo acetato 50 mmol.L-1 pH 5.0, liofilizadas, ressuspendida em 1 ml de tampo acetato 50 mmol.L-1 pH 5,0 0,1 M de NaCl e aplicadas na coluna de gel filtrao S-200. O resultado foi apenas um pico com atividade obtida aps 12 horas de incubao. Entretanto, a enzima no foi totalmente purificada. Amostras do segundo pico de atividade foram coletadas e separadas para a etapa de caracterizao bioqumica. A massa molecular da lipase de T. harzianum parcialmente purificada foi determinada pela coluna de cromatografia de gel filtrao S-200 com aproximadamente 77 kDa. 36

Os valores encontrados e descritos na literatura para massa molecular de lipases produzidas por microrganismos em geral, so bem variveis, com massas moleculares, variando de 11 a 86 kDa (Saxena et al., 2002). Algumas particularidades de massas moleculares podem ocorrer devido as lipases poderem ser glicosiladas ou possurem mais de uma subunidade, apesar da maioria das lipases descritas possurem apenas uma subunidade. Brush et al., (1998) descreve a purificao de duas lipases do fungo Ophiostoma piliferum de 60 kDa (glicosilada) e 52 kDa (deglicosilada). A deglicosilao da lipase maior produziu uma lipase de 55 kDa. Kundu et al., (1987), relata a purificao de lipase de Neurospora crassa que revelou ter massa molecular 54 kDa determinada em gel filtrao, porm em SDS-PAGE apareceu uma banda de 27 kDa, sugerindo duas subunidades. Mozaffar & Weete, (1993), purificaram uma lipase de Pythium ultimum com massa molecular de 270 kDa, sugerindo que esta enzima possua um tetrmero. Chahianian et a.l, (2000) relatam um tipo II de lipase de Penicillium cyclopium de 40 a 43 kDa com vrias formas de glicosilao que pode ser convertida em uma simples protena de 37 kDa por deglicosilao. De acordo com os dados observados na Figura 12, observa-se que o extrato parcialmente purificado apresentou duas faixas de pH timo, 5.0 e 8.0. Entretanto, de acordo com o grfico observa-se que a enzima apresenta uma atividade relativa maior que 85% na faixa de pH entre 7.0 e 8.0, com o valor mximo em pH 8.0. A maioria das lipases produzidas por fungos possuem pH que variam na faixa de 7.0 a 8.5. Uma lipase purificada de Mucor hiemalis (Comeau et al., 1999), e de Mucor sp (Comeau et al., 2002) apresentaram pH timo 7.0. A lipase do fungo termoflico Rhizopus oryzae (Comeau et al., 1999) apresenta pH timo 7.5, enquanto, que a lipase de Aspergilus carneus (Saxena et a.l, 2003) apresentou um pH timo 9.0, bem como a lipase de Pseudomonas sp variedade S5 (Rahman et al., 2005). Pode se observar atravs da literatura que a maioria das enzimas purificadas ou parcialmente purificadas tem propriedades alcalinas, apesar de estar descrito na literatura enzimas com atividade em pH cidos, como a lipase de Rhizopus chinensis (Yasuda et al., 1999) que apresentou pH timo 5.5. Sugere-se diante destes resultados que o extrato com a lipase parcialmente purificada de T. harzianum tenha presena de isoenzima no detectada pelas colunas de cromatografia aplicadas. Casa et 37

al., (2005) relata a purificao de uma lipase de Candida rugosa que uma mistura Lip2 (43%) e Lip3 (57%) e mostrou diferentes composies de isoenzimas que proporcionou diferentes propriedades catalticas. A lipase de T. harzianum apresentou uma maior atividade na faixa de 37 a 40C e temperatura tima de 40C (Figura 13). Esses valores foram prximos quando comparados com outras lipases de Rhizopus chinensis (Yasuda et al., 1999), Aspergillus carneus (Saxena et al., 2003) a 37C, e Mucor hiemalis f. hiemalis (Comeau et al., 1999) a 40C, dentre outras, que apresentaram atividades mximas nesta faixa de temperaturas. No entanto, valores de temperatura tima maiores que as descritas acima, foram encontradas para as lipases isoladas de Ophiostoma piliferum (Brush et al., 1998), com 45C. A lipase estvel a 40C e apresenta atividade residual relativa de 85% aps 30 minutos de pr-incubao, mantendo uma atividade residual relativa de 56% mesmo aps 90 minutos de reao (Figura 14). Entretanto, quando pr-incubada a 50C a atividade relativa caiu para 36% aps 30 minutos de incubao, sendo que a partir de 60 minutos de incubao a atividade praticamente perdida. Comparando com os dados da literatura constata-se que a lipase parcialmente purificada de T. harzianum possui estabilidade similar com outras j estudadas. Para a frao parcialmente purificada foram obtidos os valores de 660,4 mol.mL-1 de parafenil palmitato para Km e 33,64 U.min-1 de enzima para Vmx. Entretanto, fica difcil a comparao deste resultado com outros dados da literatura porque os mesmos no relatam resultados em relao a K m e Vmx para as enzimas purificadas ou parcialmente purificadas. Para este resultado foi apenas encontrado na literatura duas lipases purificadas de Rhizopus sp. (Pastore et al., 2003), porm, utilizando como substrato o p-nitrofenillaurato. Neste trabalho, para a frao purificada I foram obtidos os valores de 5.5 . 10 -2 mM de p-fenillaurato para Km e 1.99 M de p-nitrofenol/mim/mg de enzima para Vmax, para as fraes II, nas mesmas condies, de experimento foram encontrados os valores 7.6 . 10-2 mM de p-fenillaurato para Km e 1.19 M de pnitrofenol/mim/mg de enzima para Vmax. O efeito de alguns ons metlicos e compostos inorgnicos na atividade da lipase foram avaliados (Tabela 3). A atividade da enzima em geral,

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praticamente no foi afetada pela ao dos ons Ca2+, Hg2+, Fe2+, na concentrao de 2 mmol. L-1, mantendo sua atividade relativa acima de 90%. Para concentraes de 5 mmol. L-1 os ons Hg2+, Fe2+ e EDTA a lipase teve uma pequena reduo de sua atividade, contudo, mantendo sua atividade relativa acima de 80%. Para o on Mn2-, tanto a concentrao de 2 mMol. L-1, quanto a concentrao de 5 mmol. L-1 a enzima manteve sua atividade acima 80%. Na concentrao de 5 mmol. L-1 Na+ a lipase teve uma reduo significativa em sua atividade. Este resultado sugere que nesta concentrao o Na+ inibe a atividade enzimtica devido a concentrao de NaCl j existente nas fraes caracterizadas, eludas no gradiente da coluna de cromatografia QSheparose. Para o on Cu2+ na concentrao de 5 mmol. L-1 a lipase teve um aumento significativo em sua atividade, como tambm observado por Nakanishi et al., (2000) para lipase produzida por Pseudomonas sp.. Comeau et al., (1999) observaram que Ca+2, Mg+2, Mn+2 e Na+ foram importantes para aumento da atividade relativa da lipase produzida por Mucor hiemalis, enquanto, que Fe+2 reduziu a atividade da enzima. Isto sugere que a presena de ons metlicos possui diferentes modos de ao cataltica na atividade de diferentes lipases. Para ambas as concentraes a enzima praticamente no foi afetada por EDTA, indicando que a lipase de T. harzianum no uma metaloenzima, ou seja, no requer ons metlicos como cofatores. Rahman et al., (2005) mostrou que lipase de Pseudomonas sp. variedade S5 no foi afetada por EDTA. Este resultado tambm foi observado por Comeau et al., (1999) na purificao de lipase produzida por M. hiemalis. A enzima parcialmente purificada na presena de 5% solventes orgnicos (Figura 16) mostrou que na presena de metanol a lipase manteve mais de 60% de sua atividade relativa, enquanto, que para os demais solventes houve decrscimo significante em sua atividade, sendo totalmente inibida por benzeno e heptano, resultado diferente foi encontrado para a lipase produzida por Pseudomona sp. (Rahman et al, 2005), onde a lipase foi ativada por benzeno e hexano aps 30 minutos de incubao, entretanto, quando incubada por 2 horas, a enzima foi drasticamente inativada comparada com 30 minutos de incubao, indicando inibio do solvente orgnico para a enzima. Resultados similares foram obtidos para a lipase de Aspergillus carneus que permaneceu com atividade relativa de 100% para o benzeno aps 30 minutos 39

de incubao e manteve 99% de atividade aps 24 horas de incubao. Neste mesmo trabalho, observa-se que na presena de 2-propanol (30%) a lipase mantm 97,5% de sua atividade, ao mesmo passo que 2-propanol (60%) provoca efeito drstico na atividade da enzima. Isto sugere que o efeito de solventes orgnicos na atividade da enzima difere de lipase para lipase. Para o solvente metanol e heptano foram avaliadas concentraes crescentes (1 a 5%) na atividade da lipase tampo Tris-HCl 50mmol. L-1 pH 8.0 (Figura 17 e 18). Como observado, o uso de 1%(v/v) de etanol teve um efeito muito significativo na atividade relativa da enzima. Resultados diferentes foram encontrados para lipases em presena deste solvente (Comeau et al., 1999; Saxena et al., 2003). O uso de 1% (v/v) de heptano tambm demonstrou ser significativo para a atividade da lipase, mantendo 92% de sua atividade relativa. Comeau et al., (1999) observou resultado similar para a lipase produzida por Rhizopus oryzae, onde sua atividade relativa foi ainda maior, 101% para o heptano (30% v/v). O uso de solventes no meio reacional tambm tem sido descrito como um fator responsvel das taxas de hidrlise dos triacilgliceris. O diesel constitudo de hidrocarbonetos com nmero mdio de carbonos em torno de quatorze. Os leos de vegetais so tristeres da glicerina, ou seja, produtos naturais da condensao da glicerina com cidos graxos, cujas cadeias laterais tm numero de carbonos variando entre dez e dezoito. Alm da presena do grupamento funcional do grupo ster, os leos vegetais possuem massa molecular cerca de trs vezes maiores que o diesel. Visando reduzir a alta viscosidade dos leos vegetais, diferentes alternativas tm sido consideradas, tais como diluio; microemulso com metanol ou etanol; decomposio trmica; craqueamento cataltico e reao de interesterificao com metanol ou etanol. Entre essas alternativas, a interesterificao a melhor particularmente com monoalcois (alcolise), especificamente metanol ou etanol, promovendo a quebra de triglicerdeos, gerando misturas steres metlicos ou etlicos dos cidos graxos correspondentes, liberando glicerina como subproduto. A massa molecular desses monosteres prximo ao do diesel. Os steres graxos obtidos so conhecidos como biodiesel e apresentam caractersiticas semelhantes ao do

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leo diesel, podendo ser utilizados em motores do ciclo diesel sem nenhuma adaptao (Neto et al., 2000). A versatilidade de lipases tem sido explorada ou para substituir processos existentes, ou para produzir uma srie de compostos considerados praticamente inviveis de serem obtidos por via qumica convencional. Esta habilidade cataltica tem sido aplicada na hidrlise de leos e gorduras para produo de cidos graxos, esterificao ou interesterificao de gorduras e outros lipdeos para preparao de produtos alimentcios ou no alimentceos (Vulfson et al, 1994). Na indstria oleoqumica, enzimas hidrolticas de leos e gorduras so energeticamente econmicas quando comparados aos processos convencionais de altas temperaturas e altas presses. Para avaliar o perfil cromatogrfico da ao da lipase de T. harzianum no leo de soja (leo de cozinha), foram incubadas lipase com leo de soja de 24 a 72 horas.O resultado obtido com a degradao total dos triacilgliceris do leo de soja foram verificados partir de 48 horas de incubao (figura 19b). Pode se observar atravs dos resultados que a anlise cromatogrfica do leo de soja revelou a presena dos seguintes triacilgliceris: T48, T50, T52, T54, T56, T58 e T60 (Figura 19a). Atravs dos resultados obtidos a enzima mostrou alto nvel de atividade da lipase em leo de soja. Resultado similar foi obtido por lipase de Aspergillus carneus (Saxena et al., 2003). A hidrlise de leo de soja com diferentes tipos de lipase tambm foi estudada por Park et al., (1998), tendo como objetivo a comparao da atividade dessas enzimas em sistemas isolados e combinados.

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6. CONCLUSO
No foi possvel purificar a lipase de T. harzianum pelos mtodos de cromatografia utilizados, devendo para tanto, propor uma nova metodologia de purificao a ser utilizada para esta enzima, entretanto, um mtodo de purificao parcial da lipase pode ser descrito utilizando a coluna de cromatografia de troca inica Q-Sepharose. Aps anlise dos resultados referentes caracterizao bioqumica da lipase, observou-se que a lipase parcialmente purificada demonstrou ter estabilidade em solventes orgnicos, principalmente em metanol e praticamente no houve reduo de sua atividade frente a alguns ons e outros compostos. A enzima apresentou atividade hidroltica em leo de soja.

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7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
BARA, M. T. F.; Lima, A. L.; Ulhoa, C. J. Purification and characterization of an exo--1,3-Glucanase produced by Trichoderma asperellum. FEMS Microbiology Letters, 2002. BERGLUND P. Hutt K. Biocatalytic synthesis of enantiopure compounds using lipases. In: Patel RN, editer. Stereoseletive biocatalysis. New York: Marcel Deckker, 2000. BERLABI E. H; Molina E, Chisti Y. A process for hight yield and scaleable recovery of hight purity eicosapentaenoic acid esters from mocroalgae and fish oil. Enzyme Microb Technol 2000. BLUM, H.; Beier, H. & Groos, H. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Eletrophoresis, 8: 93 99, 1987. BORNSCHEUER, Uwe. T. Enzymes in Lipid Modification. 1 ed. Weinheim: Wiley- John & sons, p. 444, 2000. 43

BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry, 1976. BRUSH, T. S, Chapman R, Kurzman R, Williams DP. Purification and characterization of extracellular lipase from Ophiostoma piliferum. Bioorg Med Chem 1998. CARVALHO, P. O.; Campos, P. R. B; Noffs M. D'Addio; Oliveira, J. G.; Shimizu, M. T.; Silva, D. M. Aplicao de lipases microbianas na obteno de cidos graxos poliinsaturados. Qum. Nova vol.26 no.1 So Paulo, 2003. CASTRO, H. F. Mendes, A. A.; Santos J. C. Modificao de leos e gorduras por biotransformao. Qumica Nova. Vol. 27, n 1, 2004 CHAHIANIAN, H, Vanot G, Ibrik A, Rugani N, Sarda L, Comeau LC.; Production of extracelular lipase by Cyclopium purification and characterization or a partial acyllglycerol lipase, 2000. COMEAU L., Abbas H.; Hiol A.; Deyris V. Isolation and characterization of na extracellular lipase from Mucor sp strain isolated from palm fruit. Enzyme and Microbial Technology, 2002. COMEAU L.; hiol A.; Jonzo M. D.; Druet D. Production, purification and characterization of a extracellular lipase from Mucor hiemalis f. hiemalis. Enzyme and Microbial Technologic, 1999. COMEAU et al., Purification and characterization of an extracellular lipase from a thermophilic Rhizopus oryzae strain isolated from palm fruit. Enzyme and Microbal Technology, 2000. ELIBOL, M. Ozer, D. Infuence of oxygen transfer on lipase production by Rhizopus arrhizus. Process Biochem, 2000. GAO, Y. Breuil C. Extracellular lipase production by a sapwood- stainig fungus Ophiostoma piceae. World J Microbiol Biotechnol, 1995. GANDHI, N. N.; J. Am. Oil Chem. Soc. 1997. GARCIA, E. R. Murakami, A. E, Furlan A. C. et al. Suplementao enzimtica em raes contendo farelo de soja e soja integral extrusada e o desempenho de frangos de corte. Anais XXXV Reunio Anual da SBZ Botucatu-SP, 1998. GILL I, Valivety R. Polyunsaturated fatty acids: Part 1. Occurrence, biological activities and applications. Trends Biotechnol 1997a. GILL I, Valivety R. Polyunsaturated fatty acids: Part 2. Biotransformations and biotechnological apllications. Trends Biotechnol 1997b.

44

HARAN, S.; Schickeker, H, Chet I. Molecular mechanisms of lytic enzymes involved in the biocontrol activity of Trichoderma harzianum. Microbiology, 1996. HEINOEN, J. K., and R. J. Lahti. A new and convenient colorimetric determination of inorganic orthophosphate and its application to the assay of inorganic pyrophosphate. Anal. Biochem. 133:313317, 1981. HERMOSA, M. R.; Grondona, I.; Iturriaga, E. A.; Diaz-Minguez, J. M.; Castro, S.; Monte, E.; Garcia-Acha, I. (2000). Molecular Characterization and Identification of Biocontrol Isolates of Trichoderma spp. Applied and Environmental Microbiology 66 (5) 1890-1898. HUANG M. H.; Bian C. B.; Yuan C.; Lin L.; Lin J.; Shi X.; Ye X.; Huang Z. Purification and preliminary crystallographic analysis of a Penicillium spansum lipase. Biochimica et biofhysica Acta , 2005. ITO T, Kikuta H, Nagamori E, Honda H, Ogino H, Ishikawa H, Kobayashy T. Lipase production in two-step fed batch culture of organic solvents-tolerant Pseudomonas aeruginosa LST-03. J. Biosci Bioeng 2001. JAEGER, K.E., and Reetz M. T. Microbial lipases form versatile for biotechnology. Trends Biotechnol, Eservier Science. Vol. 16.p. 399-403, 1998. JAERGER, K. E., Dijkstra, B. W., Hertz, M. T. Bacterial Biocatalist: Molecular biologi, three dimensional structures and biotechnological applications of lipase. Ammu. Rev. Microbiol., 1999. JAERGER, K-E.; Eggert, T.; Lipases for biotechnology. In: Current Opinium in Biotechnology. V.13, n. 4. p. 390-397, 2002. KAZLAUSKAS, R. J, BornscheuerUT. Biotransformations with lipases. In: rehm HJ, Pihler G, Stadler A, Kelly PJW, editors. Biotechnology. Vol. 8. New York: VCH, 1998. KLIBANOV, A.M. Why enzymes less active in organic solvents than in water? Rewiel. Departament of Chemistry , Massachusetts Institute of Technology.Trends Biotechnol, p. 97-101,1997. KUBICEK, C. P., Penttil, M. E. Regulation of production of plant polysaccharide degrading enzymes by Trichoderma. In: Harman, G. E., Kubicek, C. P. (Eds.), Trichoderma and Gliocadium. Enzymes, Biological control and Commercial applications. Taylor & Francis, London, UK, p. 49-71, 1998. KUBICEK, C. P.; Bissett, J.; Druzhinina, I.; Kulling-Gradinger C.; Szakacs, G. Genetic and metabolic diversity of Trichoderma: a case study on South-East Asian isolates. Fungal Genetics and Biology, 2003.

45

KUNDU, M., Basu, J., Guchhait, M., Chakrabarti, P. Isolation and characterization of an extracellular lipase from the conidia of Neurospora crassa. J. Gen. Microbiol. 133, 149-153, 1987. LAEMMLI, U. K.Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T4. Nature 227: 680-685, 1970. LIMA, A. L. Caracterizao morfolgica, molecular e bioqumica de Trichoderma spp isolados de solo do cerrado brasileiro. Braslia DF. UnB. ICB /Departamento de Fitopatologia. Imprensa Universitria. 73p. (Tese de Doutorado), 2002. LORITO, M.; Di Pietro, A.; Hayes, C. K.; Woo, S. L.; Harman, G. E. Antifungal, synergistic interaction between chitinolytic enzymes from Trichoderma harzianum and Enterobacter cloacae. Phytopathology., 1993a. LORITO, M.; Harman, G. E.; Hayes, C. K.; Broadaway, R. M.; Trosmo, A.; Woo, S. L.; Di Pietro, A. Chitinolytic enzymes produced by Trichoderma harzianum: antifungal activity of purified endochitinase and chitobiosidase. Phytopathology, 1993b. MACRAE, A. R.; Hammond, R. C.; Biotechnol. Genetic Eng. Rev. 3, 193.1985. MARSMAN, G. J. P. et al. The effect of shear forces and addition of a mixture of a protease and hemicelulose on chemicar, physical and physiological parameters during extrusion of soybean meal. Anim. Feed Sci Technol, v. 56, p. 21-35,1995. MASSE, et al., The effect on an enzymatic pretreatment on the hydrolysis and size reduction of fat particles, in slaughterhouse wastewater. In: journal of Chemical Technology an Biotechnology. V. 76, n. 6, p. 629-635, 2001. MELO, I.S. Trichoderma e Gliocladium como Bioprotetores de Plantas. In: LUZ, W.C. (ed.). Reviso Anual de Patologia de Plantas. Passo Fundo R.S., Embrapa, V.4. p. 261 295, 1996. MENDES, A. A. Avaliao da Biodegradabilidade de Efluentes com Alto Teor de Lipdeos Previamente Tratados com Enzimas Hidrolticas, Qumica Nova, vol. 28, n 2, 2005. MOZAFFAR, Z.; Weete J. D. ; American Oil Chemists' Society. Purification and properties of an extracellular lipase from Pythium ultimum, 1993. NETO et al., Projeto biocombustvel: Processamento de leos e gorduras vegetais in natura e residuais em combustveis tipo diesel. Universidade Estadual de Santa Cruz-BA, 2000. OHNISHI, K. Yoshida Y, Toita J, Sekiguchi J. Purification and characterization of a novel lipolyc enzyme from Aspergillus oryzae. J. Ferment bioeng 1994.

46

OLLIS, D. L. et al. Engenering Protein. 5, 197-211, 1992. OMAR, I. C;Hayashi, M; Nagai, S Agricultural and Biological Chemistry [AGRIC. BIOL. CHEM.]. Vol. 51, no. 1, pp. 37-45. 1987. PAPARARASKEVAS, D. Christakopoulos P, Kekos D, Macris BJ. Optimizing production of extracellular lipase from Rhodotorulla glutinis, biotechnol Lett 1992. PARK, Y. K.: Pastore. G. M.; De Almeida M.M.; J.Am Oil Chem. Soc, 1998. PASTORE, G. M; Vinicius dos Santos R. da Costa; Maria Gabriela B. Koblitz. Purificao parcial e caracterizao bioqumica de lipase extracelular produzida por nova linhagem de Rhizopus sp.,Cincia e Tecnologia de Alimentos, 2003. RAHMAN R. N. Z. R. A.; Baharum S. N.; Basri M.; Salleh A. B. Hight-Yeld purification of an organic solvente-tolerant lipase from Pseudomonas sp. Strain S5. Analytical Biochemistry 341, 2005. REETZ, M. T.:Lipases com pratical biocatalysts. Curr Opin Chen Biol, p. 145150, 2002. RUBIN, B. Dennis EA, editors. Lipases: Part A. Biotechnology Methods in enzymology. Vol. 284. New York: Academic Press, 1997a.Rubin B, Dennis EA, editors. Lipases: Part B. Enzyme characterization and utilization Methods in enzymology. Vol. 286. New York: Academic Press, 1997b. SAXENA et al., Microbial lipases: potential biocatalysts for the future industry. Curr. Sci. 77:101-115, 1999. SAXENA, R.K.; Sheoran, A.; Giri, B.; Davidson, W.S. Purification Strategies for Microbial Lipases. Journal of Microbiological Methods. v. 52, p. 1-18, 2003. SCHARAG, J. D. et al. The open conformation of a Pseudomonas lipase. Research article, Curr Biology. Vol. 5, n. 2. p. 187-202, 1997. SHARMA, R.; Chisti, Y.; Banerjee, U.C. Production,Purification, Characterization, and Applications of Lipases. Biotechnology Advances. v. 19, n. 8, p. 627-662, 2001. STEINDORFF A. S.; Ulhoa C. J. Produo de enzimas hidrolticas pelo fungo Thichoderma harzianum e sua aplicao biotecnolgica em rao animal. VII seminrio Brasileiro de Tecnologia Enzimtica. Caxias do Sul/RS, 21 a 24 de maio de 2006. TAKAMOTO, T. Shirasaka, H. Uyama, H Kobaysho, S. Lipase-catalyzed hydrolytic degradation of polyurethane in organic solvent. In: Chemistru Letters. N. 6, p. 492-493, 2001. TSUJISAKA, Y.; Okumura, S.; Iwai, M.; Biochim. Biophys. Acta 1977. 47

ULHOA, C.J.; Peberdy, J.F. Purification and Some Properties of the Extracellular Chitinase Produced by Trichoderma harzianum. Enzyme and Microbial Technology, 14: 236 -240, 1992. UNDURRAGA, D.; Markovits, A.; Erazo, S. Cocoa butter equivalent through enzyme interesterification of pal oil midfractionIn: Process Biochemistry, v. 36, n. 10, p. 933-939, 2001. VILLENEUVE, P.; Muderhwa, J.M.; Graille, J.; Haas, M.M. Customizing Lipases for Biocatalysis: a Survey of Chemical, Physical and Molecular Biological Approches. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic. v. 9, p. 113-148, 2000. VULFSON, E. N. Em Lipases: Their Structure, Biochemistry and Application; Woolley, P.; Petersen, S. B., eds.; Cambridge University Press: Great Britain, 1994. YASUDA, M. K; Ogino Hiroyasu.; Kigushi T.; Kotani T. Takakura S.; Ishibashi T.; Effect of additives on transesterification activity of Rhizopus chinensis lipase. Journal of Biosciense and Bioengeneering, p. 681-683, 2000. ZAKS, A. & klibanov, A.M. Enzimatic catalisys in organic media at 100C. In: Sciense. V. 224, n. 4654, p. 1249-1251, 1984. ZANELA, I. Suplementao enzimtica em dietas a base de milho e sojas processadas sobre a digestibilidade de nutrientes e desempenho de frangos de corte. Jaboticabal, 179p. Tese-Faculdade de Cincias Agrrias e Veterinrias, Universidade Estadual Paulista, 1998.

48