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Fascicule_TP_BM_BC_BIOC

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1

Initiation à la Recherche Atelier Sécrétion
Master 1 de Microbiologie, Biologie Végétale et Biotechnologies
Sophie Bleves et Amel Latifi, enseignantes responsables. Thibault Sana, moniteur.

Introduction
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram-négatif, pathogène opportuniste de l’homme. Elle est notamment redoutée dans le milieu hospitalier (infections nosocomiales) chez les malades immunodéprimés et les grands brûlés. Cette bactérie est aussi connue pour les complications, souvent fatales, qu’elle entraîne chez les patients atteints de mucoviscidose. Sa virulence est multifactorielle: elle est liée d’une part à des facteurs associés aux bactéries, tels que le flagelle, les pili ou l’alginate (un exopolysacharide muqueux), ou à la sécrétion de diverses toxines et enzymes dégradatives dans le milieu extracellulaire (figure 1). Figure 1 : Des facteurs de virulence de P. aeruginosa

* résistance AB

pompes efflux*

Exopolysaccharide (biofilm*, adhésine, antiphagocytose anticomplément)

*

*
Sécrétion / Injection d'enzymes dégradatives et de toxines

pigments fluorescents Séquestration du fer Pili Flagelle (mobilité, (mobilité, adhérence,biofilm) biofilm)

2 La sécrétion chez les bactéries à Gram négatif implique pour les protéines à sécréter (exoprotéines) la traversée de deux membranes (interne et externe) et d’un compartiment aqueux contenant un réseau de peptidoglycane, le périplasme. Six voies de sécrétion sont conservées au sein des bactéries à Gram négatif et vous seront détaillées en cours. Cinq d’entre elles sont présentes chez P. aeruginosa (figure 2), cette caractéristique en faisant un modèle particulièrement intéressant pour l’étude des mécanismes de sécrétion.

Figure 2 : Schéma des 5 voies de sécrétion présentes chez P. aeruginosa.

Au cours de cet atelier, nous nous intéresserons plus particulièrement à 2 voies de sécrétion présentes chez P. aeruginosa. La machinerie de sécrétion de type I ou voie des ABC transporteurs est la plus simple et comprend 3 protéines Apr (alkaline protease). Elle permet notamment la sécrétion en une étape de la protéase alcaline. Le gène structural de celle-ci (aprA) appartient à l’opéron arpADEF qui code aussi pour les composants de la machinerie de sécrétion : AprD est le transporteur ABC (ATPase de la membrane interne), AprE (une protéine adaptatrice de la membrane interne) et AprF le composant de membrane externe. La machinerie de sécrétion de type II est composée de 12 protéines Xcp (extracellular protein deficient) qui s’associeraient en un complexe multiprotéique reliant les deux membranes (figure 3). Elle est nécessaire entre autre à la sécrétion de l’élastase qui se déroule en deux étapes : adressage via le peptide signal à la machinerie d’export Sec pour la traversée de la membrane interne, puis traversée de la membrane externe via la machinerie de sécrétion

et s’assemblent pour former un pseudopilus transmembranaire. alors que les gènes codant les protéines sécrétées sont localisés à différents loci du chromosome. xcpPQ. W et X sont appelées pseudopilines. V.3 Xcp. Les 12 gènes xcp sont organisés sur un même locus. en deux opérons divergents. Les protéines XcpT. . Figure 3: Modèle de la machinerie Xcp (T2SS). U. de par leur homologie avec la piline des pili de type IV. et xcpR-Z.

C’est une métalloprotéase à Zinc. vous obtiendrez toutes les prédictions de topologie la présentant comme une protéine de membrane interne : nombre de segments transmembranaires (certains et putatifs). Nous avons choisi de vous limiter aux machineries de type I et II. et purifiée par chromatographie d’affinité sur colonne de Nickel (Partie C).4 Quels sont les objectifs de cet atelier? Partie A Nous allons chercher à déterminer s’il existe un quelconque lien. Pour vous aider. Différentes publications (dont deux que vous travaillerez) rapportent que l’activité enzymatique de l’élastase est activée au cours de son transport depuis le cytoplasme vers le milieu extracellulaire. Par une analyse bio-informatique de sa séquence (in silico). mais quelques exemples sont décrits dans la littérature chez d’autres bactéries. . et des anticorps dont vous disposez. orientations possibles du polypeptide (extrémité Nterminale dans le cytoplasme ou dans le périplasme). En vous servant des annexes. mais aussi une très forte activité protéase envers divers substrats. aeruginosa. aeruginosa. l’élastase. ou « cross-talk ». ainsi qu’un tableau récapitulatif des souches bactériennes (sauvage et mutantes). aeruginosa. vous trouverez dans les annexes un panel de techniques. Pour se faire. présente notamment dans la matrice extracellulaire du tissu pulmonaire. un composant de la membrane interne de la machinerie de sécrétion de type II. coli et celle sécrétée dans le milieu extracellulaire par P. préparez le schéma expérimental que vous suivrez. qui possède une activité élastolytique sur l’élastine. nous nous intéresserons à la topologie de la protéine XcpY. aeruginosa. Vous mesurerez et comparerez l’activité de l’élastase recombinante produite dans le cytoplasme d’E. L’élastase codée par le gène lasB est une des exoprotéines les plus présentes dans le milieu extracellulaire de P. Est-ce qu’une mutation dans un des composants d’une machinerie a des répercussions sur l’efficacité d’une autre machinerie alors que celles-ci sont indépendantes? Aucune donnée n’a jamais été publiée à ce sujet chez P. Parties B & C Nous étudierons plus particulièrement une des exoprotéines sécrétées par la machinerie de type II. Celle-ci sera produite dans l’hôte hétérologue Escherichia coli. Nous nous proposons de vérifier la maturation et l’activation de l’élastase au cours de sa sécrétion. aeruginosa. et souhaitons aborder cette question : une voie de sécrétion influence-t-elle la sécrétion des exoprotéines transitant par une autre voie de sécrétion ? Nous vous demandons d’envisager les manipulations que vous entreprendrez pour y répondre. entre les différentes machineries de sécrétion présentes chez P. C’est d’ailleurs la protéase la plus active sécrétée par P. Ces prédictions de topologie seront confirmées par une approche in vivo qui consiste à étudier le phénotype sur boîte de différentes fusions traductionnelles de XcpY avec des enzymes rapporteurs (voir le principe en annexe). vous allez construire une forme étiquetée His6 de l’élastase (clonage -Partie B-). En parallèle.

coli ou sécrétée Présentation Article Bilan Partie C Examen écrit (10-12h. Préparation de protéines sécrétées.fr) TS : Thibault Sana (tsana@ifr88.cnrs-mrs.fr) AL : Amel Latifi (latifi@ifr88. Montage SDS-PAGE Fin préparation échantillons protéiques.5 Programme Lun10/10 M SB AM Mar11/10 M+AM Mer12/10 M+AM Jeu13/10 M AM Ven14/10 M SB Lun17/10 M+AM TS Mar18/10 M+AM TS TS SB SB SB SB Introduction à l’Unité (9h salle de TP de l’ESIL) et à l’atelier (10 h.cnrs-mrs. bâtiment A) Bio-Informatique -Prédiction topologie XcpY. Ligation Bactéries compétentes et Transformation Comparaison des protocoles d’extraction d’ADN plasmidique par «lyse alcaline» et «semi-boiling» Screening PCR sur transformants.fr) . Western-blot Immunodétection Bilan Partie A Bio-Informatique –Analyse de séquences. Electrophorèse. amphi 7) Oral (SB-AM) Mar25/10 M AL Me26/10 M Ven28/10 M SB : Sophie Bleves (bleves@ifr88. tampons et autres solutions) Croissance.(salle Consortium. Electrophorèse ADN Préparation de plasmides Carte restriction « théorique » Analyse restriction. coli) Vérification de la production (SDS-PAGE& Coloration Coomassie) Mer19/10 M TS AM SB Jeu20/10 M TS AM AL Ven21/10 M+AM AL Lun24/10 M+AM AL Purification de l’élastase recombinante par chromatographie d’affinité Fin purification Dosage de protéines selon le protocole de Bradford Mesure activité protéase de l’élastase produite chez E .cnrs-mrs. Electrophorèse ADN Bilan Partie B Croissance (Surproduction élastase étiquetée His6 chez E. salle 400) Lire les 4 pages d’introduction Préparations (milieux.(salle Info TP 4ème) +Travail Personnel (Articles à préparer) Préparation insert & vecteur.

CATATG GCC GAC CTG ATC GAC GTG T -3’ (Tm : 62°) 5’. hsdΔR. étiquetage His6 Ap Clonage d’un fragment PCR (lasBUP-lasBDown) du gène lasB sans séquence signal et codon STOP Ap Fusion traductionnelle XcpY avec la phosphatase alcaline au résidu 232 Ap Fusion traductionnelle XcpY avec la phosphatase alcaline au résidu 278 Km Fusion traductionnelle XcpY avec la β-lactamase au résidu 363 Anticorps polyclonaux (de lapins) Oligonucléotides lasBUP lasBDown Anti élastase. lambda. thiΔ(lac-proAB). aeruginosa PAO1 PAO1 ΔxcpY PAO1 aprE Caractéristiques Sauvage ΔDélétion du gène xcpY dans la souche PAO1 Insertion d’un Tn (Hg R) dans le gène aprE de la souche PAO1 Δ supE. lacUV5-T7 gene) AB Ap Plasmide d’expression. Anti protéase alcaline 5’. proAB+ .6 Annexes Souches bactériennes P. coli TG1 BL21(DE3) Plasmides pET-22b(+) plasB pSB4 pSB52 pSB3 F– ompT hsdSB(rB–. lacZΔM15)) E.CTC GAG CAA CGC GCT CGG GCA GG -3’ (Tm : 62°) . lacIq . mB–) gal dcm lon (DE3 : lacIq. F' (traD36.

contenant de la caséine (boîte au lait ou skim-milk) ou de l’élastine.7 Protocoles expérimentaux Croissances bactériennes On considère qu’une unité DO à 600nm (DO600) correspond à 5. Milieux d’identification: A/ L’élastase et la protéase alcaline sont deux protéases.109 bactéries/ml. Ces activités se traduisent par un halot d’hydrolyse autour des colonies de Pseudomonas après 24 à 48h de croissance à 37°C. B/ Boîtes activité phosphatase alcaline Milieu LB supplémenté de BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate) à 0. . et leur activité enzymatique peut être mise en évidence sur deux types de boîtes.108 à 1. coli est cultivée en milieu riche LB supplémenté en cas de besoin par les antibiotiques suivants : ampicilline (Ap) 50µg /ml. aeruginosa est cultivé sur milieu PAB (Pseudomonas Agar Base) ou milieu riche LB (Luria broth). L’élastase utilise comme substrats l’élastine et la caséine alors que la protéase alcaline n’utilise que la caséine. E. Milieux de culture: P.4mg/ml et IPTG à 0.1mM.

Agiter légèrement et étaler les bactéries (étaler 100µl. .t = 112 minutes. 5 . 4 . 3 .t = 0. Ils doivent être maintenus dans de la glace. agiter le tube. Transférer dans des falcons de 50ml. Transférer à 37°C durant 60 minutes. 2.8 Techniques de génétique Préparation cellules compétentes 1 – Ensemencer 50 ml de milieu liquide LB au 1/100 avec culture de la nuit de la souche DH5α. Protocole : 1 .t = 52 minutes. Transformation Préparer des tubes de bactéries compétentes contenant 100µl d'une suspension de cellules d'Escherichia coli. Compléter à 1. 9 . Les bactéries restent dans la glace.Centrifuger 15 minutes à 2500 rpm à 4°C. centrifuger les 400µl restant. les reprendre dans 100µl et étaler).45 bloquer la croissance dans la glace pendant 15 minutes. 4 .Jeter le surnageant en égouttant au maximum et reprendre très délicatement le culot dans un petit volume de CaCl2 100mM glacé. agiter légèrement. Compléter à 20 ml avec la même solution.Laisser dans la glace 15 minutes au moins. 2 . Ajouter stérilement 0. 5 . Agiter légèrement et transférer les tubes dans un bain-marie à 42°C pendant 2 minutes. 6.Quand DO600 ≅ 0. 7 .Jeter le surnageant et reprendre le culot dans un petit volume de CaCl2 100mM -15% glycérol glacé avec agitation douce. Les manipulations devront se faire stérilement près d'un bec Bunsen allumé.5 ml de milieu liquide Luria Broth (LB) préchauffé à 37°C .25 ml.Incuber à 37°C avec agitation. Agiter légèrement et laisser les tubes 5 minutes dans la glace. 3 .Centrifuger 15 minutes à 2500 rpm à 4°C. Ajouter l'ADN dans les tubes.Conserver 15 minutes dans la glace (ou plus). 8 .t = 47 minutes.t = 45 minutes.

9 Techniques de biologie moléculaire Minipréparation d’ADN plasmidique NucleoSpin Plasmid QuickPure (Macherey-Nagel) .

a été cloné dans le pGEM-T pour donner le plasB : .lasBUP s’hybride en 3’ de la région codant le peptide signal de l’élastase et crée un site NdeI en 5’ de cette région du gène lasB. Un fragment NdeI-XhoI de 1. dépourvu de sa séquence signal et de son codon STOP.lasBDOWN s’hybride sur la fin du gène lasB.4 kb du plasB sera cloné dans le pET-22b(+) ouvert par NdeIXhoI de sorte à placer le gène lasB sous le promoteur T7 et à l’étiqueter.10 Construction d’une forme recombinante de l’élastase Stratégie Le gène lasB amplifié par les oligonucléotides lasBUP et lasBDown. supprimant son codon STOP et créant un site XhoI en phase avec la région codant l’étiquette His6 du pET-22b(+). . .

Vérifier les quantités sur gel 5.8M Acide Borique .25% bleu de bromophénol. Electrophorèse d’ADN . Roche) Tampon de charge ADN: 30% glycérol.5 kb du plasB du gel d’agarose et extraire l’ADN (NucleoSpin Extract II) Purifier le pET-22b(+) linéarisé (NucleoSpin Extract II) 4.  porter des gants: le Sight DNA stain est un intercalant de l’ADN. Le tampon de la ligase doit donc rester tout le temps de la manipulation dans la glace. vous devez tenir compte pour ce calcul de la différence de taille entre le vecteur et l’insert).Ligation ON à 16°C Ligation La ligation de fragments d’ADN à extrémité cohésive nécessite une concentration d’ADN dans le mélange réactionnel entre 10 et 30 ng/µl. 0. * Pour réaliser des liaisons phosphodiesters entre les fragments d’ADN à liguer.5X faire bouillir au micro-ondes (salle de pesée) Laisser refroidir et ajouter 1 µl de Sight DNA stain (EUROMEDEX) pour 200 ml d'agarose. Le volume du mélange réactionnel ne doit idéalement pas dépasser les 20 µl.7% en TBE 0. 0.Digérer le plasB et le pET-22b(+) par NdeI et XhoI 2.Découper le fragment de 1. 40mM EDTA.Vérifier les digestions par éléctrophorèse sur gel d’agarose 3.25% β-mercaptoéthanol TBE 20x 1.rajouter 5µl de tampon de charge ADN dans chaque tube et charger 15µl de chaque échantillon sur le gel d'agarose Déposer 5µl de marqueur de taille (Molecular Weight Marker X. .préparer un gel d'agarose 0.Mettre les peignes et couler dans le support . Composition d’un mélange réactionnel de 10 µl : ADN Tampon ligase : 1X Ligase : 1µl H2O : QSP 10 µl Remarques : * La ligation de fragments d’ADN à bouts francs nécessite une concentration d’ADN dans le mélange réactionnel largement supérieure à 30 ng/µl et un rapport molaire de 1/6.11 En pratique 1.8M Tris. 1. la ligase utilise de l’ATP. Le rapport molaire vecteur/insert doit être de 1/3 (Attention : le rapport étant molaire.

12 _________________________________________________ Extraction d’un fragment d’ADN d’un gel d’agarose NucleoSpin Extract II (Macherey-Nagel) .

préparer les mélanges réactionnels suivants dans des eppendorfs PCR sur la glace en ajoutant l'enzyme quand tous les groupes sont prêts à lancer la PCR 5 µl d'ADN (bactéries lysées.centrifuger 1’ les échantillons PCR .2µl ADN polymérase thermostable (Taq polymérase.reprendre une colonie dans100 µl d'H2O et lyser les bactéries 10' à 95°C (attention à ce que l'eau ne pénètre pas dans les tubes! Cap-locks) .13 ______________________________________________________ Screening par PCR Lyse des bactéries . PAOI ou PAO1 xcpY ) + oligo lasBUp (20 pmol à partir solution à10pmol/µl) + oligo lasBDown (20 pmol à partir solution à 10pmol/µl) + dNTP (1mM final à partir solution 10mM) + tampon ADN polymérase (1X final) + MgCl2 (1X final) + 1µl DMSO (limiter les structures secondaires ADN) H2O qsp 20µl +0. 5U/µl) programmation de l'appareil PCR (≅ 3h) 95°C 7' _______________ 95°C 1' 55°C 1' 30 cycles 72°C 1'30 ________________ 72°C 10' - .

.le culot est repris à 1 U DO600 par 10 µl de tampon de charge SDS-PAGE (= SN) ___________________________________________________________________________ SDS-PAGE (Mini Protean III –Biorad-) . 8000RPM) inutile de manipuler stérilement * le surnageant de culture contenant les protéines sécrétées est soigneusement transvasé dans un nouvel eppendorf. à quoi faut-il penser? . puis suivre la croissance toutes les 30 minutes pendant la phase exponentielle de croissance puis toutes les heures jusqu’à DO600= 4 Prélever et transvaser dans un eppendorf de 1.préparer dans 2 béchers (volume pour 2 gels) gel de séparation (10%) 6.monter le système (présenté dans le fascicule de principes techniques) .5 ml de culture à DO600≅1 1 ml de culture à DO600≅2 et 4  tracer au fur et à mesure sur papier semi-logarithmique la DO600 en fonction du temps pour chaque souche .incuber à 37°C sous agitation (180 RPM) . .5 ml.8 ml 2 ml Acrylamide 30% H2 0 Lower Tris Upper Tris .6 ml 8.1 .14 Techniques de biochimie Préparation de protéines sécrétées . le surnageant est éliminé et le culot est lavé par 1 ml d’acétone 90% . il est toxique : MANIPULER AVEC DES GANTS ...centrifugation de chaque prélèvement (10’.prendre la DO à 600 nm (DO600) des cultures de nuit (« overnigth ». O/N)  DO600 inoculum de nuit ≅ 5-6 .centrifugation (10’.ensemencer 50 ml de milieu LB à une DO600 initiale de 0.. éliminer tout l’acétone et évaporer le reste d’acétone en laissant les eppendorfs ouverts 5 min à 37°C.4 ml 5 ml gel de séparation (12%) 8 ml 7 ml 5 ml gel de concentration 0.prendre la DO600 de chaque culture après une heure.8 ml 4. 1.délimiter par un trait de marqueur la hauteur du gel de séparation (≅ 5 cm)  vérifier que le système ne fuit pas en réalisant un essai avec de l’eau Tant que l’acrylamide n’a pas polymérisé.. 13000RPM).centrifuger les surnageants de culture que vous avez précipité ON à 4°C (30’. 13000RPM). placé dans la glace puis 225µl (T1) ou 150µl de TCA 75% (acide trichloroacétique) sont ajoutés pour précipiter les protéines toute la nuit (ON) à 4°C * le culot cellulaire est repris à 1 U DO600 par 50 µl de tampon de charge SDS-PAGE puis conservé à –20°C (= C) .

pH 6.monter la chambre d’électrophorèse.5 ml. faire bouillir pendant 5 min. éliminer l’eau en retournant le système .8 Tampon d’électrophorèse (10X): 250mM Tris. bout de spatule de BBP (Bromophénol Blue) Lower Tris : 1. pH 6.5mM Tris-HCl.dénaturer tous vos échantillons (C et SN) pendant 8’ au bain marie bouillant  fermer soigneusement vos eppendorfs (Cap-locks) et veiller à ce qu’ils ne se remplissent pas d’eau du Bain Marie ! NB les centrifuger 5 secondes avant de les charger . Ajouter 7. centrifuger quelques secondes pour rassembler l’échantillon dans le fond du tube. 62. Pour cela mettre en route une bouilloire et fermer les tubes à l’aide de capuchons colorés. 1. Proméga).appliquer 80V par système pour le gel de concentration.8. Après incubation.2 U DO600 de cellules (C) et de 1 U DO600 surnageant (SN) . pH 8.QUAND VOUS ETES PRETS A COULER LE GEL de séparation ajouter 800 µl d’APS 1% et 25 µl de TEMED dans le bécher correspondant. . 0. mélanger doucement et couler le gel au « pipetman ». 5% β-mercapthoéthanol. Ajouter 10 µl de tampon de charge -Dans le cas des électrophorèses dénaturantes. ainsi que l’équivalent de 0. puis migrer à 150V . 10% glycérol. mélanger doucement et couler le gel au « pipetman » jusqu’au trait et vérifier le niveau (la surface doit être horizontale). Mettre immédiatement les peignes en évitant autant que possible de faire des bulles. . compléter à 15 µl avec de l’eau). placer l’échantillon contenu dans un volume total de 15 µl (si le volume d’échantillon protéique à traiter est inférieur à 15 µl.8 Upper Tris : 0. .15 . la placer dans la cuve et remplir les 2 compartiments de tampon d’électrophorèse . 35mM SDS ___________________________________________________________________________ SDS-PAGE en PhastSystem (Pharmacia Biotech) A/ Préparation des échantillons : -Pour les échantillons de culture resuspendre l’équivalent de 0. la protéase alcaline et l’élastase pures. Déposer délicatement de l’eau distillée à l’aide de la pissette à la surface du gel.9M Glycine.suivre la migration par l’avancée du front du bleu et l’arrêter avant qu’il ne sorte (≅ 1h30) Tampon de charge SDS-PAGE : 2% SDS.4% SDS.charger la gamme étalon protéine (Molecular Weight Marker. 0.4% SDS.quand le gel a polymérisé (vérifier avec ce qu’il reste dans le bécher).enlever délicatement le peigne . .Pour les échantillons solubles : dans un tube Eppendorf de 1.5µl de tampon de charge SDS-PAGE.5M Tris-HCl.5M Tris-HCl.2 UDO600 de cellules dans 20 µl d’eau.ajouter 400 µl d’APS 1% et 8 µl de TEMED dans le bécher du gel de concentration.

Laisser incuber jusqu’à décoloration du fond du gel et apparition des bandes de protéines sur fond clair. Le gel est placé dans une boite plastique. Verser dans l’évier. H2O QSP 1 litre. 4 µl d’échantillon protéique sont introduits dans chaque dent d’un peigne à 6 dents OU BIEN 1 µl dans chaque dent d’un peigne à 8 dents. Tampon de coloration (20’) Bleu de Coomassie 0. Différents gels sont à votre disposition (12% dans votre cas). . Le peigne est placé dans les encoches. Ajouter un petit tampon de mousse dans le bain afin de fixer le colorant et donc d’accélérer la décoloration. . Arrêter avant que le bleu n’ait atteint le niveau de la deuxième mèche.25% Ethanol Acide acétique H2O QSP 1g 125ml 40ml 500ml Tampon de Décoloration (accélération en passant aux micro-ondes) 250ml d’éthanol et 80ml d’acide acétique. Elle contient également les encoches permettant de placer le peigne chargé avec les échantillons. et laisser incuber 20 minutes. Contrôler l’avancement de l’électrophorèse en suivant la migration du bleu. Puis soulever les différents éléments posés sur le gel afin de pouvoir récupérer celui-ci. C/ Fixation et coloration du gel après migration : Recouvrir le gel d’un peu de solution de bleu de Coomassie.16 B/ Mise en route de l’électrophorèse : Le Phast system Pharmacia permet d’effectuer des séparations de protéines sur gel d’électrophorèse dans des conditions standardisées. Celle-ci appuie légèrement sur les mèches et permet d’assurer le contact avec le gel. Ajouter du décolorant. le capot de l’appareil refermé et l’électrophorèse programmée. pour l’une avec le haut du gel. . Il sera posé dans l’appareil au niveau d’un des cadres rouges : . 2 mèches adéquates auront été préalablement placées dans le support de façon à venir en contact.le support de mèches sera calé sur les plots prévus à cet effet.un gel de polyacrylamide précoulé sur un film plastique. pour l’autre avec le bas.rabattre la cale noire sur le dispositif. Ouvrir le capot. Retirer délicatement le peigne. Changer de temps en temps la solution de décoloration.

et enfin la deuxième éponge « Scotch-Brite® ». le gel. puis venir me voir pour découper la membrane. placer la feuille de .17 Western-blot NB Penser à mettre le système réfrigérant au congélateur . repasser au stylo à bille les différentes bandes. faire un point au niveau de la protéase alcaline (48 kDa) ou de l’élastase (30 kDa) purifiée. MW Promega . Agiter doucement.-transférer 1h en se plaçant à 100 V (1l de tampon de transfert par système) nitrocellulose dans un bain de rouge ponceau (coloration temporaire des protéines). la membrane de nitrocellulose.mettre dans l’ordre sur la face grise de la cassette de l’appareil à blot en prenant soin d’éliminer les bulles (en faisant rouler une pipette) : l’éponge « Scotch-Brite® ». Quand la gamme étalon se détecte bien. 1 feuille de papier Whatman. les protéines apparaissent en rouge. puis la transférer immédiatement dans un bain d’eau. 1 feuille de papier Whatman.placer le gel dans du tampon de transfert ainsi qu’un feuille de nitrocellulose et 2 feuilles de papier Whatman . (voir schéma)  ne jamais toucher la feuille de nitrocellulose avec ses doigts --> porter des gants et des pinces métalliques sont à votre disposition quand le transfert est terminé. Conserver les 2 morceaux de nitrocellulose dans du papier d’aluminium à -20°C après décoloration totale dans de l’eau.

(5) a f1 and a ColE1 origins of replication. Conserver à 4°C.5 .poursuivre la croissance x heures .vider le surnageant et resuspendre la totalité des cellules dans 20 ml de tampon Tris-HCl 30 mM.1% . et rajouter de l’IPTG (1 mM final) quand DO600= 0.18 .centrifuger à 14000 rpm pendant 30 min à 4°C dans un rotor SS34 et dans la centrifugeuse Sorvall.3 lavages de 5 min en TBS Tween 20 0. . (2) a T7 promoter which is specific to only T7 RNA polymerase (not bacterial RNA polymerase). Tampon de transfert (1X): 48mM Tris. .récupérer le surnageant (extrait soluble) à la pipette et propipette. (3) a lac operator which can block transcription.incuber à 37°C sous agitation .ensemencer 50 ml de milieu LB à une DO600 initiale de 0.5M NaCl.1% contenant Ac secondaire anti IgG de lapins marqué à la phosphatase alcaline (1/7500) . . .centrifuger les cultures bactériennes dans des pots de centrifugation de 250 ml et à 8 000 rpm pendant 15min à 4°C (centrifugeuse Sorvall équipée du rotor GSA ou centrifugeuse Sigma) . and (6) an ampicillin resistance gene.prendre la DO600 des cultures de nuit recombinante chez E. 20% Et-OH TBS (10x) : 0.les cellules seront cassées par sonication en présence de Lysosyme à une concentration finale de 1mg/ml.placer la suspension homogène dans un bécher propre de 50 ml.30 min en TBS lait 5% Tween 20 0.immunodétection : incuber la membrane de nitrocellulose sous agitation .1% . Producing Proteins with the pET Expression System A pET vector is a bacterial plasmid designed to enable the quick production of a large quantity of any desired protein when activated. 1.1h en TBS lait 5% Tween 20 0. La sécher dans du papier absorbant.Placer la membrane dans 5 ml du kit de détection de l’activité phosphatase alcaline (Western Blue Stabilized substrate for alkaline phophatase –Promega-). soit α protéase alcaline (1/1000).1h30 en TBS lait 5% Tween 20 0.1% . .3 lavages de 5 min en TBS Tween 20 0. .prendre la DO600 après 90 min. 40mM Glycine.coli (système . froid.1% contenant soit Ac α élastase (1/500). Agiter et laisser la coloration se développer et l’arrêter en plaçant la membrane dans de l’eau. Le placer dans un bécher propre de 50 ml. pH 8.1 . .5M Tris-HCl. pH8 Production de protéine d’expression T7) . (4) a polylinker. This plasmid (pictured below) contains several important elements : (1) a lacI gene which codes for the lac repressor protein.

displaces the repressor from the lac operator. The expression of your favorite protein (YFP) increases rapidly as the amount of mRNA transcribed from yfg increases. when IPTG is added to the cell. Within a few hours. Typically. the T7 polymerase is expressed. it transcribes rapidly and profusely for as long as the T7 RNA polymerase is present. Prokaryotic cells do not produce the T7 RNA polymerase that must be added. Since there are lac operators on both the gene encoding T7 polymerase and YFG. and quickly begins to transcribe yfg which is then translated as YFP. When lactose or a molecule similar to lactose is present inside the cell. The gene on the host cell chromosome usually has an inducible promoter which is activated by IPTG. IPTG. the lac promoter and the lac operator in it's genome. Macherey-Nagel) Attention les différentes étapes de ce protocole doivent être réalisées à 4°C. T7 polymerase must be present. This molecule. Control of the pET expression system is accomplished through the lac promoter and operator.19 To start the process. the transcription of yfg proceeds rapidly. Therefore. . The diagram below shows the genome of the host cell. ___________________________________________________________________________ Purification de protéine recombinante par chromatographie d’affinité (Kit Protino. Both the T7 promoter and the lac operator are located 5' to yfg. Usually. the host cell for this expression system is a bacteria which has been genetically engineered to incorporate the gene for T7 RNA polymerase. Because T7 is a viral promoter. the host cell used is E. transcription of the T7 RNA polymerase is activated. YFP is one of the most prevalent components of the cell. coli strain BL21(DE3). When the T7 RNA polymerase is present and the lac operator is not repressed. IPTG activates both genes. your favorite gene (yfg) is cloned into a pET plasmid at the polylinker site. Before YFG can be transcribed.

Contrôler le niveau du liquide dans le corps supérieur de l’unité de filtration. Pour cela pipeter dans le réservoir d’échantillon et placer le dans un tube propre.20 ___________________________________________________________________________ Concentration/dilution/concentration des solutions protéiques Principe: La centrifugation est utilisée comme force de filtration à travers une membrane. il convient de choisir une taille d’exclusion 3 à 5 fois inférieure à la taille de la molécule à concentrer . dans le corps supérieur du réservoir car il est important d'éliminer l'imidazole. * Placer votre échantillon à concentrer dans le réservoir du haut. les solvants et les molécules de faible Mr passant à travers la membrane vers le réservoir de filtrat. la taille d’exclusion d’une membrane d’ultrafiltration étant définie par sa capacité à retenir 90% d’une molécule globulaire idéale dont la Mr est la taille d’exclusion. * Ajouter du tampon Tris-HCl 30 mM. Centrifuger à 9000g 30 min à 4°C. Cette étape devra être réalisée plusieurs fois. Afin d’obtenir un rendement de récupération optimum. Le système que vous utiliserez a une taille d’exclusion de10 000 Da. * Vider le tampon passé dans la partie inférieure et remettre à centrifuger. remettre à centrifuger si nécessaire. * Recueillir en fin de protocole la solution protéique concentrée. Les molécules plus grosses que les pores de la membrane seront retenues dans le réservoir d’échantillon (réservoir supérieur). ___________________________________________________________________________ Dosage des protéines totales Méthode Lowry: voir Fascicule de Principes Techniques Méthode Bradford: . pH 8.

Lire la densité optique à 595.21 Gamme étalon : Diluer 40µl d’albumine bovine (BSA) 10mg/ml dans 960µl d’H2O soit solution à 400µg/ml Faire la gamme (5 à 6 points) dans les cuvettes : 200µl de BSA. et la lecture de DO430 effectuée. La réaction est arrêtée par l’ajout de 2 ml d’acide perchlorique 10% (précipitation de l’azocaséine non hydrolysée). Les unités d’activité sont définies comme l’absorbance à 430 nm par heure et par ml : Unités Protéase/h/ml = DO430/(t x v) x60 T : temps d’incubation v : volume d’extrait .37°C entre 15 et 90 minutes.5 ml d’azocaseine 2% et 0.1 ml d’H2O.3 ml de NaOH 10 M. L’absorbance à 430 nm est linéaire jusqu’à une valeur de 0. ___________________________________________________ Mesure d’activité protéase: L’hydrolyse de l’azocaséine est mesurée dans un mélange de réaction contenant : 0.3ml d’extrait.1 ml de Tris-HCl 1M.6. Le surnageant est prélevé et ensuite neutralisé par l’ajout de 0. Incuber 5minutes à température ambiante. 0. 600µl d’H2O et 200µl de réactif Bradford Mélanger 800µl d’échantillon et 200µl de réactif Bradford. 0. pH8. Le mélange est incubé à. Penser à réaliser une courbe étalon avec la BSA (albumine bovine).

et exposant l’enzyme rapporteur vers le périplasme Colonne 4: fusion traductionnelle avec un polypeptide ne possédant pas de segments transmembranaires. ou possédant un ou plusieurs segments transmembranaires.pseudomonas.org/) La topologie de XcpY est confirmée in vivo par la réalisation de fusions traductionelles avec un gène rapporteur. Les informations déterminant la topologie d’une protéine sont contenues dans sa séquence en acides aminés. L’analyse des hybrides repose sur une propriété particulière de l’enzyme rapporteur. * prédiction de la topologie d’une protéine membranaire (http://www.22 Autres protocoles Prédiction de la topologie d’une protéine transmembranaire. mais exposant l’enzyme rapporteur vers le cytoplasme . qui a une activité différentielle selon que la protéine est dans le cytoplasme ou dans le périplasme. Une protéine possédant plusieurs segments transmembranaires est dite polytopique. Une protéine possédant un segment transmembranaire est dite bitopique. La translocation de l’hybride à travers la membrane interne est alors dépendante de la présence dans le gène à étudier d’une région codant pour un segment hydrophobe servant de signal d’exportation.com/). La β-lactamase et la phosphatase alcaline sont 2 enzymes périplasmiques qui sont classiquement utilisées.expasy. dont la structure secondaire correspond à des hélices α hydrophobes. XcpY Les protéines intégrales de la membrane interne sont ancrées dans celle-ci par des segments d’une vingtaine de résidus. et les paramètres étudiés sont : L’hydrophobicité --> identification des segments transmembranaires potentiels La répartition des charges --> orientation de la protéine dans la membrane qui est déterminée par la distribution des résidus chargés aux extrémités des segments hydrophobes (« positive inside rule ») La topologie protéique est prédite in silico : * recherche de séquence dans une banque de donnée (http://www. Colonne 1 : enzyme rapporteur mature transloquée dans le prériplasme Colonne 2: enzyme rapporteur privée de sa séquence signal. Le principe est de générer des fusions en phase dans différentes régions du gène à étudier avec la partie du gène rapporteur codant pour la forme mature de l’enzyme (privée de sa séquence signal). non transloquée Colonne3: fusion traductionnelle avec un polypeptide possédant un ou plusieurs segments transmembranaires.

puis procéder à des dilutions en cascade jusqu’à 10-4. Ohman DE. . qui dégradera alors l’antibiotique présent dans le milieu et autorisera la croissance à ce niveau des bactéries suivantes dans la colonie. il est possible de différencier les fusions exposant la β-lactamase vers le cytoplasme ou le périplasme. Filloux A. Déposer 15 µl de chaque dilution et de la solution-mère sur Ap50. ce qui libérera leur β-lactamase. Les bactéries portant une fusion exposant la β-lactamase vers le cytoplasme seront uniquement résistantes à l’ampicilline après croissance en patch (gros amas de plusieurse colonies): les premières bactéries qui essayeront de pousser seront lysées par l’antibiotique. Des bactéries portant une fusion exposant la β-lactamase vers le périplasme seront toujours résistantes à l’ampicilline (même en colonies isoléees). (1995) The elastase propeptide functions as an intramolecular chaperone required for elastase activity and secretion in Pseudomonas aeruginosa. 18(5):877-89. Kessler E. Mol Microbiol. Olson JC. un substrat chromogène qui donne une coloration bleue à la bactérie lorsqu’il est hydrolysé. Braun P. 19(2):297-306. Tommassen J. En jouant sur la densité cellulaire de la culture bactérienne (colonie isolée ou patch) et la concentration d’ampicilline. Mol Microbiol. ___________________________________________________________________________ Références bibliographiques McIver KS. (1996) Role of the propeptide in folding and secretion of elastase of Pseudomonas aeruginosa.23 L’activité phosphatase alcaline est détectée sur milieu contenant du BCIP (5-bromo-4-chloro3-indolyl phosphate). Patch test Faire un trait de bactéries à l’oeuse sur boîte LB Ap200 Spot test Resuspendre une oeuse de bactéries dans 100 µl de LB.

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