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LA STRUCTURE DES PROTINES

I) Introduction

Les peptides et les protines sont forms par des enchanements d'acides amins lis entre eux par des liaisons peptidiques. Cette liaison lieu entre le groupement acide carboxylique -COOH d'un acide amin et la fonction amine -NH2 d'un autre acide amin. Par convention, chez une protine on place toujours gauche l'acide amin qui a son - NH2 libre et droite l'acide amin qui a son -COOH libre. En gnral on distingue, lorsque plusieurs acides amins sont assembls : - les oligopeptides (les dipeptides : 2 acides amins, et les tripeptides : 3 acides amins). Ils ne permettent pas la raction du biuret. - les polypeptides (4 100 acides amins) - les protines (plus de 100 acides amins) Lorsque l'on isole une nouvelle protine il faut en dterminer la structure. En effet ces molcules ont une structure dans l'espace qui va tre due a plusieurs niveaux d'organisation. On va parler de structure primaire et de structure spatiale. La structure spatiale est divise en 3 niveaux d'organisation : - structure secondaire - structure tertiaire - structure quaternaire

II) La structure primaire


1) La composition en acides amins
La structure primaire des protines est reprsent par la squence en acides amins. La premire tape de la dtermination de cette structure passe par l'identification des diffrents acides amins et la dtermination de leur nombre. Pour cela on va rompre les liaisons peptidiques changes entre les acides amins. On va effectuer une hydrolyse acide en utilisant du HCl 6 mol/L 110 C pendant 2 3 jours sous atmosphre d'azote. Attention ce traitement dtruit le tryptophane et transforme l'asparagine et la glutamine en acide aspartique et en acide glutamique. L'identification du mlange obtenu peut se faire par lectrophorse ou par chromatographie en utilisant une coloration.

2) La squence en acides amins


a) Les groupements terminaux libres Forme de la protine Nombre d'extrmit Forme 0 Cyclique 1 Semi-cyclique 2 Linaire 4 2 chanes linaires relies par un pont dissulfure

L'existence et le nombre des extrmits permet d'avoir une ide de la forme de la molcules. Dtermination des groupements amins terminaux libres - La mthode de Sanger

Pour identifier le premier acide amin d'une chane on va utiliser un colorant des acides amins, le DNFB. La liaison covalente entre cette molcule et le premier acide amin est plus rsistante que la liaison peptidique. En ralisant une hydrolyse acide les acides amins sont spars et seul le premier est color. On peut l'identifier par chromatographie, par exemple. 2

- La mthode d'Edmann

Cette mthode l'avantage de permettre une analyse par rcurrence. Elle t automatise dans un appareil appel Sequenator permettant de squencer les petits polypeptides. La molcule utilis est le phnylthiocyanate. Il se fixe sur le premier acide amin puis par une variation de pH on est capable de dcrocher le premier acide amin color tout en respectant le reste de la protines. Par chromatographie, par exemple, on peut identifier ce premier acide amin et rappliqu la mthode au reste de la protine. Exemple : soit un tripeptide H2N-Asp-Lys-Val-COOH

Aprs raction avec la PTH, un prlvement est ralis et on regarde quel est l'acide amin marqu. Ce sera le premier de la chane. En rptant cette opration on va pouvoir dterminer l'ordre des premiers acides amins mais comme les ractions ne sont pas totales on aura un phnomne de dsynchronisation qui brouille les rsultats ce qui empche de dterminer plus de 20 30 acides amins successifs. 4

Il faut donc pralablement fragmenter les protines pour analyser chaque morceau. - Dgradation enzymatique l'aide d'aminopeptidase Le rle de cette enzyme est d'hydrolyser la liaison peptidique dans laquelle est engag l'acide amin en position N-terminal. Cette enzyme va travailler galement par rcurrence. Dtermination des groupements carboxyliques terminaux libres - Hydrazinolyse Si l'on traite une protine avec de l'hydrazine ( H2N-NH2) 100 C, toutes les liaisons peptidiques sont dtruites et tout les acides amins sont modifi sous forme d'hydrazides sauf un, celui dont la fonction -COOH n'est pas utilis dans une liaison peptidique. C'est donc l'acide amin en C-terminal qui sera l'tat libre et identifiable. - Dgradation enzymatique l'aide d'une carboxypeptidase C'est une enzyme du pancras qui hydrolyse la liaison peptidique o est engag l'acide amin de l'extrmit C-terminal de la protine. Une fois le premier acide amin couper c'est au tour du second, etc. On dispose donc d'une mthode rcurrente, tant donn que toutes les liaisons peptidiques n'ont pas la mme rsistance on va observer un phnomne de dsynchronisation. b) Problme du nombre de chanes peptidiques et de la dsynchronisation des mthodes rcurrente Pour rsoudre ce type de problme on est oblig de sparer les diffrentes chanes constituant une protines pour les analyser sparment. Cette analyse passera galement par leur fragmentation. Sparation des chanes Si les liaisons casser sont des liaisons de faibles nergies (liaisons hydrognes, liaisons ioniques, liaisons de Van der Waals) elles peuvent tre rompues par une modification du pH ou par une modification de la force ionique du milieu. Si l'on doit casser des ponts disulfures (liaisons covalentes) changs entre 2 cystines on va utiliser du -mercaptothanol ou du DTT (dithiotritol). Fragmentation d'une chane polypeptidiques La fragmentation des chanes peut tre ralise par des hydrolyses partielles utilisant un acide concentr mais en le laissant agir peu de temps. Le risque est de gnrer des coupures de manires alatoires. On va prfrer des hydrolyses partielles en utilisant la voie chimique ou enzymatique. En effet l'utilisation de bromure de cyanogne (BrCN) va permettre de couper toutes les liaisons peptidiques d'une protine aprs la mthionine. Une fois que la protines t trait par le BrCN il faut visualiser et isoler les morceaux gnrs. Pour cela on fait une lectrophorse. Si dans la protine on avait n mthionine on aura gnr n+1 fragments de protine. 5

BrCN : il coupe aprs la mthionine La pepsine : elle coupe avant les acides amins aromatiques (Tyr, Trp, Phe) La trypsine : elle coupe aprs l'arginine et la lysine La chymotrypsine : elle coupe aprs les acides amins aromatiques

X Met Y X Phe Y X Arg Y X Tyr Y

L'hydrolyse de site spcifique peut se faire en utilisant des enzymes : les endopeptidases. Par exemple la trypsine va couper les liaisons peptidiques aprs l'Arg et la Lys.

III) La structure spatiale


La structure primaire d'une protine est insuffisante pour rendre compte de sa forme dans l'espace. En effet sa forme tridimensionnelle va tre spcifique de la protine. Cette forme dans l'espace va faire intervenir un type de liaison autre que la liaison peptidique. La protine va prsenter une structure secondaire, tertiaire et quaternaire.

1) Liaisons intervenant dans la structure spatiale des protines


a) Les liaisons disulfures Le pont disulfure est une liaison covalente qui va s'tablir entre 2 cystines appartenant soit la mme chane soit 2 chanes diffrentes ===> contribue la grande stabilit de la structure spatiale. b) Les liaisons ioniques C'est une liaison de faible nergie, elle va s'tablir entre un radical charg positivement (-NH3+) et un radical charg ngativement (-COO-). Cette liaison peut avoir lieu au sein d'une mme chane ou entre 2 chanes diffrentes. c) Les liaisons hydrognes Ce sont des liaisons de trs faible nergie qui vont apparatre lorsque l'on a proximit l'un de l'autre un atome d'hydrogne li un oxygne ou un azote et un doublet lectronique non-partag d'un autre azote ou d'un autre oxygne. Ces liaisons peuvent s'tablir entre les fonctions -C==O et -N H que l'on trouve au niveau de la liaison peptidique ainsi qu'avec les radicaux de certains acides amins. Ces liaisons peuvent tre interchanes ou intrachanes. d) Les liaisons hydrophobes Un certains nombre d'acides amins vont porter sur leur radical des zones hydrophobes (exemple : alanine, valine, leucine, etc.). Ces chanes latrales vont interagir entre elles pour faire des liaisons hydrophobes dites de Van der Waals. Lorsque 2 atomes non-chargs sont proches l'un de l'autre leur nuages lectroniques vont s'influencer ce qui va crer un dsquilibre transitoire et la formation de diples qui vont s'attirer.

2) Structure secondaire des protines


La liaison peptidique peut en fait s'crire de 2 faons extrmes :

on appelle ces 2 formes des formes msomres. En effet elles prsentent un caractre de double liaison ce qui ce traduit par le fait que les 3 carbones, l'azote, l'oxygne et l'hydrogne sont dans le mme plan. Cette proprit va se traduire par 3 organisations possibles : - les plans successifs vont alterner l'un par rapport l'autre : structure en feuilles plisss (feuillet ) - les plans successifs vont tourner rgulirement dans le mme sens : structure hlicodale (hlice ) - les plans se succdent de faon alatoires : la structure est dite en pelote statistique a) La structure en feuillets plisss (feuillet ) Cette structure se rencontre essentiellement dans les protines dites de structure comme la fibrone de soie. Sur cette reprsentation (Cf doc) on voit que l'on 2 chanes anti-parallles qui change entre elles des liaisons hydrognes. C'est comme cela que se constituent les protines fibreuses. b) tat hlicodal (hlice ) Lorsque l'on a faire une hlice on voit qu'il y a formation de trs nombreuses liaisons hydrognes intrachanes. Les structures les plus rpandus sont les hlices droite. Dans ce cas elle tourne dans le sens des aiguilles d'une montre quand on va de l'extrmit N-terminal vers l'extrmit C-terminal. Pour dfinir une telle hlice il faut calculer combien de rsidus on va trouver par spire. On doit galement dterminer le degr d'angle entre 2 plans successifs. L'hlice sera galement caractrise par son diamtre. Dans cette structure les chanes latrales R sont tournes vers l'extrieur et peuvent interagir entre elles et avec le milieu extrieur. Plusieurs hlice peuvent s'enrouler les unes autour des autres la manire d'un cble torsad. Il y aura formation de fibres trs rsistantes et volumineuses qui seront stabilises par des liaisons hydrognes, des ponts disulfures, etc. Les protines de type kratine, que l'on rencontre en particulier dans la laine, sont essentiellement constitu d'hlice . c) La pelote statistique Cette structure n'est pas une structure ordonne contrairement au 2 tats prcdents, ceci donne une forme dans l'espace qui n'est pas rgulire. 9

3) Structure tertiaire des protines


Chez une protine globulaire, la chane peptidique va prendre une conformation dans l'espace avec des zones densment organises (hlice et feuillet ) = zones de reploiement et des zones plus lches o ont lieu les changements de direction. Cette structure dans l'espace va tre plus stable que la structure secondaire. Elle est possible grce des liaisons covalentes quand ce sont des ponts disulfures ou grce des liaisons de faible nergie (liaisons hydrognes, liaisons de Van der Waals, liaisons ioniques). Le respect de cette structure tertiaire est capital pour l'activit biologique de la molcule. En effet les acides amins placs trs loin les uns des autres dans la structure primaire vont pouvoir tre trs proches dans l'espace et travailler ensemble pour catalyser une raction. Certaines molcules vont pouvoir se fixer sur la protine ce qui modifiera sa forme et permettra de rguler l'activit enzymatique. Dans cette structure tridimensionnelle les chanes latrales polaires sont souvent regroupes en surface et les radicaux hydrophobes sont souvent rejets l'intrieur de la structure. Ceci a permettre la protine de ragir avec diffrents composs par l'intermdiaire des radicaux exposs conditions qu'il y ait une complmentarit de forme.

4) Structure quaternaire des protines


La structure quaternaire des protines correspond l'association spcifique de plusieurs chanes peptidiques en une unit d'ordre suprieur seule capable d'assurer la fonction biologique. C'est l'exemple de l'hmoglobine. Une telle protine est dite oligomrique et les sous-units qui la composent sont appels protomres. Ces sous-units peuvent tre de mme nature ou de nature diffrente, l'assemblage est assur par les liaisons de faibles nergie vu prcdemment. L'hmoglobine est constitu de 2 chanes et de 2 chanes .

IV) La dnaturation des protines


C'est une dsorganisation de la structure tridimensionnelle des difices protiques sans cassure des liaisons peptidiques. Ce n'est donc pas une hydrolyse. Cette dnaturation peut tre provoque par diffrents agents physiques ou chimiques. Chacun d'eux va agir selon un mode qui lui est propre : - les acides et les bases vont changer la charge de certains radicaux des acides amins et faire disparatre certaines liaisons ioniques - l'ure, lorsqu'elle est ajout une solution protique, dtruit les liaisons hydrognes - une augmentation de la temprature se traduit par une augmentation de l'agitation molculaire et donc par une rupture des liaisons de plus faible nergie Tout cela entrane une modification de la forme de la molcule, et de son activit si c'est une enzyme, sans modification de la composition chimique.

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