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Technologies CPGE TB - Travaux Pratiques

TP n1 Initiation aux dosages spectrophotomtriques

RACHEDI Raphal raphael.rachedi@gmail.com

2011/2012

Technologies CPGE TB - Travaux Pratiques

Objectifs : On cherche dterminer les spectres d'absorbance du PNP (paranitrophnol) et du PNPP (para-nitrophnyl phosphate) dans diffrentes conditions physico-chimiques afin de comprendre comment celles ci influencent les proprits spectrales des diffrents composants tudis, ceci sera trait dans la premire partie du TP. Dans la deuxime partie du TP, on apprhende la loi de Beer-Lambert et ses limites, en effectuant le dosage d'une solution de PNP l'aide d'une gamme d'talonnage.

Partie 1 : Spectres d'absorbance du PNPP et du PNP Principe


Les nitrophnols sont des composes ayant des proprits spectrales intressantes en biochimie, c'est dire qu'ils sont capables d'absorber des photons dans l'UV et/ou le visible On tudie les proprits spectrales de ces composs par spectrophotomtrie. Les molcules sont capables d'absorber de plus grandes gammes de longueurs d'onde que les atomes seuls, la ralisation d'un spectre d'absorbance permet de dterminer les longueurs d'onde pour lesquelles ces composs absorbent, et galement de dterminer max ou maximum d'absorbance qui correspond la longueur d'onde laquelle d'absorbance de la solution est la plus grande.

Mode opratoire
-Prparation de la solution fille de PNP On dispose d'une solution mre Sm de PNP de concentration initiale Ci = 10mmol/L pour prparer une solution fille Sf de concentration finale 0,2mmol/L : T= Cf/Ci = 0.2/10 = 1/50 Donc 2ml de Sm dans une fiole jauge de 100mL. -Prparation des tubes Essai et du tmoin
Essai 1 - 1 mL de PNPP 0,2mmol/L - 1 mL de HCl 0,2mol/L - ED qsp 10 mL. Essai 2 - 1 mL de Sf de PNP 0,2mmol/L - 1 mL de HCl 0,2mol/L - ED qsp 10 mL. Temoin - 1 mL de HCl - ED qsp 10 mL.

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Rsultats exprimentaux
A PNP (nm) A PNPP 200 0,036 210 0,013 220 0,042 230 0,026 240 0,028 250 0 260 0,033 270 0,113 272 0,127 274 0,136 276 0,146 278 0,155 280 0,161 282 0,166 284 0,171 286 0,174 288 0,175 290 0,176 292 0,175 294 0,175 296 0,172 298 0,168

A PNP
(nm) A PNPP 300 0,164 310 0,128 320 0,084 330 0,05 340 0,028 350 0,014 360 0,007 370 0,001 380 0 390 0 400 0 410 0 420 0 430 0 440 0 450 0 460 0 470 0 480 0 490 0 500 0

A PNP

A PNP

(HCl) (NaOH) 0,041 0,039 0,038 0,022 0,048 0,039 0,058 0,032 0,055 0,019 0,005 0 0,037 0 0,072 0,005 0,107 0,006 0,147 0,01 0,18 0,012 0,187 0,017 0,192 0,029 0,196 0,046 0,199 0,071 0,202 0,105 0,203 0,148 0,203 0,199 0,203 0,251 0,201 0,261 0,198 0,268 0,195 0,276

(HCl) (NaOH) 0,19 0,282 0,184 0,286 0,177 0,291 0,171 0,294 0,13 0,296 0,091 0,296 0,056 0,295 0,029 0,293 0,013 0,29 0,005 0,283 0,001 0,277 0 0,269 0 0,212 0 0,147 0 0,088 0 0,044 0 0,018 0 0,004 0 0 0 0 0 0

^ Fig.1 Tableau de valeurs

Dtermination graphique des max Le graphique a t ralis l'aide du logiciel Regressi, de plus le spectre d'absorbance du PNP en solution d'hydroxyde de sodium n'a pas t trait en TP mais sera tout de mme abord dans cette partie du compte rendu. < Fig.2 Spectres d'absorption du PNP et de ses drivs

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Interprtation des rsultats :


On remarque sur le graphique qu'a max(PNP forme phnol), le PNPP absorbe galement, si par exemple on dsire tudier la raction que catalyse la phosphatase alcaline (PAL) : PNPP + H2O PNP + Pi en dosant la quantit de produit apparu en fonction du temps, on ne doserais pas seulement le PNP apparu mais galement le PNPP restant en solution. La charge ngative porte par l'oxygne Le couple PNPP/PNP forme phnol ne peut se dlocaliser et modifier la semble pas acceptable pour tudier des polarisation statistique (c'est dire conduire un systme dlocalis) de la ractions enzymatiques. molcule et donc en modifier les proprits spectrales. En revanche, sous forme phnate, le max du PNP est assez loign de celui du PNPP pour faire du couple PNPP/PNP forme Conclusion : phnate un bon candidat l'tude des Les conditions physico-chimiques telles ractions enzymatiques ; que le pH peuvent grandement influencer Cependant pour valider cette hypothse, il les proprits spectrales des molcules en aurait fallu dresser le spectre particulier les molcules dont l'tat d'ionisation dpend du pH. d'absorbance du PNPP en milieu alcalin. On remarque galement que le PNP forme phnol donne une solution incolore contre une solution de couleur jaune pour le PNP forme phnate dans la partie 2. < Fig.4 Structure du PNP forme phnate

Fig.3 > Structure du PNP forme phnol

D'aprs la structure du PNP forme phnol, on peu imaginer qu'en milieu alcalin, l'hydrogne port par la fonction hydroxyle est arrach de faon former PNP- dtaille en Fig.4 . -3-

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Partie 2 : Limite de linarit et loi de Beer-Lambert ; Dosage dune solution de PNP de concentration inconnue. Principe
Le dosage spectrophotomtrique d'une substance x (ici le PNP forme phnate) repose sur la loi de Beer-Lambert dclarant que l'absorbance d'un compos en solution une longueur d'onde donne, est proportionnelle sa concentration et lpaisseur de solution traverse (trajet optique). A= .d.C
avec A: Absorbance de la solution : coefficient d'absorbance linique molaire en m.mol-1 d : trajet optique en m C : concentration du (des) solut(s) en mol.m-3

Cependant il y a des conditions la validit de cette loi : lumire monochromatique ; solution limpide et homogne ; concentration faible en solut , laquelle nous intresse ici. On dtermine alors la concentration laquelle la validit de la loi n'est plus vrifie l'aide d'une gamme d'talonnage de solutions de PNP. On dosera ensuite une solution inconnue de PNP, en utilisant cette gamme dtalonnage.

Mode opratoire
Prparation de la gamme dtalonnage du spectrophotomtre : Solution ED qsp Qtt PNP Solution de Tube fille de PNP NaOH A 410nm 10mL en PNP doser 0,2mol/L en mL mol/tube en mL 200mol/L en mL T 1 2 3 4 5 6 7 8 9 E1 E2 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 / / 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 7 7 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 0,315 0,315 0,000 0,354 0,699 0,989 1,420 1,760 2,024 2,375 2,684 2,934 0,558 0,564 / / / / / / / / / / 2 2

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Rsultats exprimentaux

mol Graphiquement la quantit de PNP de E 1 et de E2 sont trs rapprochs on a donc nPNP(E) = 0,315mol / tube C = n/V C = 0,315/2x10-3 C = 157,5 mol.L-1 Calcul de la concentration massique Cmass en mg.L-1 :

Interprtation des rsultats

Cmass = Cmol x M On observe sur le graphique que pour une valeur de nPNP suprieure Cmol : concentration molaire en mol approximativement 1mol/tube soit M : masse molculaire du PNP- en g.mol-1 1/10x10-3 mol/L = 100mol/L, la courbe -1 cesse dtre linaire et la loi de Beer- et MPNP = 138 g.mol Lambert pour ces quantits n'est plus Cmass = 157,5 x 10-6 x 138 vrifie ; = 21,74 x 10-3 g.L-1 On ne peu donc plus utiliser le graphique = 21,74 mg.L-1 pour dterminer la concentration d'une solution inconnue au del de cette limite. Conclusion En revanche pour nos essais : C = n/V avec C : concentration molaire en mol.L-1 n : nombre de mol en mol V : Volume de prise d'essai en L La loi de Beer-Lambert est une relation linaire dont la proportionnalit entre l'absorbance et la concentration n'est plus vraie lorsque la concentration en solut est trop leve, ici la limite de linarit se trouve environ 1mol/tube. Il faut donc travailler avec des solutions assez dilues de faon se trouver dans la partie linaire de la relation. -5-