PROPIEDADES CATALTICAS DE LA CATALASA, DESNATURALIZACIN DE LA LECHE Y CUANTIFICACIN DE PROTENAS. John Haiver1, Vanessa Abello2, Andrs Rios2 y David Mora2.

(1) Estudiante enfermera Universidad del Quindo (2) Estudiantes Biologa Universidad del Quindo

RESUMEN La desnaturalizacin es un cambio estructural de las protenas o cidos nucledos, en el cual pierden su estructura normal, y de esta forma su optimo funcionamiento, en ocasiones cambian sus propiedades fsico-qumicas. Las protenas se desnaturalizan cuando pierden su estructura tridimensional; estas protenas son filamentos largos de aminocidos unidos en una secuencia especfica. Son creadas por los ribosomas que leen los codones de los genes y ensamblan la combinacin requerida de aminocidos por la instruccin gentica. Las protenas pueden ser alteradas por factores externos como el calor o los cidos, este proceso se llama desnaturalizacin, lo cual fue observado en el laboratorio, en donde las protenas fueron expuestas a diferentes cambios de temperatura y sometidas a diferentes cidos. Para la cuantificacin de protenas se utiliz el mtodo de Biuret, la intensidad de la coloracin fue directamente proporcional a la cantidad de protenas presentes y la reaccin es bastante especfica. La susceptibilidad del mtodo es muy baja y solo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy concentrados. Palabras clave: Catalasa, desnaturalizacin, accin enzimtica, aminocidos INTRODUCCIN Cuando la protena no ha sufrido ningn cambio en su interaccin con el disolvente, se dice que presenta una estructura nativa. Se llama desnaturalizacin de las protenas a la perdida de estructuras de orden superior ya sea por el calor o los cidos, quedando la cadena polipeptidica reducida a un polmero estadstico sin ninguna estructura tridimensional fija. Los agentes que provocan la desnaturalizacin de una protena se llaman agentes desnaturalizadores, se distinguen agentes fsicos (calor) y qumicos (detergentes, disolventes orgnicos, pH, fuerza inica). Como en algunos casos el fenmeno de la desnaturalizacin es reversible, es posible precipitar protenas de una manera selectiva mediante cambios en: la polaridad del disolvente, la fuerza inica, el pH, la temperatura; la polaridad del disolvente disminuye cuando se le aaden sustancias menos polares que el agua como el etanol o la cetona, con esto disminuye el grado de hidratacin de los grupos inicos superficiales de la molcula proteica, provocando la agregacin y precipitacin, los disolventes orgnicos interaccionan con el interior hidrfobo de las protenas y desorganizan la estructura terciaria, provocando su desnaturalizacin y precipitacin. La accin de los detergentes es similar a la de los disolventes orgnicos.

Cualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente disminuir su estabilidad en la disolucin y provocar la precipitacin. As la desaparicin total o parcial de la envoltura acuosa, la neutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los puentes de hidrgeno facilitarn la agregacin intermolecular y provocar la precipitacin. La precipitacin suele ser consecuencia del fenmeno llamado desnaturalizacin y se dice entonces que la protena se encuentra desnaturalizada. Cuando la temperatura es elevada aumenta le energa cintica de las molculas con lo que se desorganiza la envoltura acuosa de la protena y se desnaturaliza. De esta misma forma un aumento en la temperatura disminuye las interacciones dbiles y desorganiza la estructura de las protenas, por lo tanto el interior hidrfobo interacciona con el medio acuoso y se produce la agregacin y precipitacin de la protena desnaturalizada; en el laboratorio se busca corroborar esta informacin, sometiendo a cambios de temperatura y acidez ciertas protenas y observar que pasa con estas. Por tal razn nuestro objetivo principal con esta practica es determinar los ndices de desnaturalizacin de las protenas mediante los factores que influyen en dicho proceso y cmo afectan en menor o mayor medida sobre los aminocidos. METODOLOGA En un vaso de precipitados de 100 mls se colocaron 20 mls de leche lquida y 20 mls de agua destilada. Posteriormente se le agregaron con una pipeta gotas de HCl al 10% hasta que adquiriera un pH ligeramente ms cido que su punto isoelctrico y para

controlar el exceso de cido se adicion NaOH al 1% gota a gota agitando suavemente el vaso de precipitado, todo esto se superviso con el papel indicador y se continuo con el procedimiento hasta que formara un precipitado y se consiguiera un sobrenadante claro. Despus se paso por papel filtro. Este filtrado luego se utilizara para las diferentes pruebas de caracterizacin. La reaccin de Biuret se inici con 2 mls del filtrado en un tubo de ensayo, posteriormente se agregaron 1.5 mls de una solucin de hidrxido de sodio al 20% para luego adicionar 5 gotas de una solucin de sulfato cprico preparada al 1% y se dejo reposar. Para la determinacin de la lactosa se coloc en un tubo de ensayo 1 ml del filtrado y se le adicion 1 ml de reactivo de Benedict; se mezcl y se dej el tubo de ensayo en bao de Mara durante 5 minutos. Para determinar el calcio, en otro tubo de ensayo se deposit 1 ml de suero filtrado, se le aadieron 3 gotas de solucin de oxalato de amonio al 4% y se espero hasta que formara un precipitado. Para la determinacin de la rivoflabina se tomo un tubo de ensayo pequeo y se coloc 1 ml del filtrado transparente, se observ a la luz ultravioleta, se revis la fluorescencia que es el indicador de la presencia de rivoflabina. Para un buen desarrollo de esta practica se deben tener en cuenta que los tubos deben estar perfectamente limpios para evitar algn tipo de interferencia, la temperatura del bao de hielo debe ser de cuatro grados

centgrados, por lo tanto los reactivos que se van a utilizar y los tubos deben estar a esa temperatura, es necesaria esta temperatura debido a la alta velocidad de accin de la enzima. 1. Preparacin de la enzima (catalasa) a partir de la habichuela: Se tom la habichuela, se despedaz y se extrajo 2 gramos de ella en un Erlenmeyer al cual se le adicionaron 8 mls de buffer fosfato frio (bao frio) luego se macer con la ayuda de un mortero, despus se filtr, el filtrado obtenido es el que contena el extracto enzimtico. 2. Medida de la actividad enzimtica: Se colocaron 6 tubos de ensayo previamente rotulados en el bao frio y se les agreg algunos reactivos (tabla 1) el tubo 7 se dejo a temperatura ambiente. Luego de adicionar cada reactivo se agit suavemente y se dejo reaccionar durante 5 minutos; cada una de las muestras se titulo con KMnO4, el punto final de la titulacin es la aparicin de una tonalidad rosada permanente, se tom el tiempo y la cantidad de KMnO4 necesarios para lograr la titulacin. RESULTADOS Y DISCUSIN La casena es un grupo de protenas que se producen por precipitado cuando la leche se acidifica que fue lo que se realiz en el primer procedimiento. La casena constituye casi el 80% del total de las protenas presentes en la leche de vaca, y el 3% de su peso. Es el ingrediente principal del queso. Si se deseca, es un polvo amorfo de color blanco, inodoro e inspido. La casena se disuelve mal en el agua y muy bien en los cidos fuertes, esta es la razn por la que se necesita la obtencin de un punto

isoelctrico o cercano a el (como pH de 4) para la correcta obtencin de la casena, ya que si este proceso se realiza mal el resto de la practica arrojara malos resultados. La lactosa es el azcar presente en la leche, de formula C12H22O11. Se obtiene de la leche en forma de cristales arenosos duros de composicin C12H22O11 H2O mediante la evaporacin de suero residual una vez extrada la grasa, y por la precipitacin de la casena. Los cristales pierden agua al calentarse a 140 grados centgrados y se funden y descomponen a 202 grados centgrados. En la hidrlisis la lactosa produce glucosa y galactosa. En presencia de las enzimas adecuadas fermenta a cido lctico y a cido butrico. La lactosa es menos dulce que la sacarosa. Al observar la precipitacin obtenida en el tubo 2 se vio la presencia normal de lactosa en la leche analizada. La riboflavina (vitamina B2) acta como coenzima, es decir, debe combinarse con otra porcin de otra enzima para ser efectiva en el metabolismo de los hidratos de carbono, grasas y especialmente en el metabolismo de las protenas que participan en el transporte de oxigeno, tambin acta en el mantenimiento de las membranas mucosas. La insuficiencia de riboflavina puede complicarse si hay carencia de otras vitaminas del grupo B. al exponerse el tubo de ensayo 1 a la luz ultravioleta que era el que contena la prueba de riboflavina, se pudo observar un cambio en la coloracin de la sustancia lo que quiere decir que la concentracin de riboflavina en la muestra de leche analizada provoca efectividad en el metabolismo de los hidratos de

carbono, en comparacin leches que presentan presencia de esta enzima.

con otras menos

0.000009 m KMnO4 X X= 0.0000225 m H2O2 = 22.5 Mn residuales Con 1.3 ml KMnO4 0.0013 L KMnO4 m= M*L 0.005M * 0.0013L = 0.0000065 m 2m KMnO4 5mH2O2 0.0000065 m KMnO4 X X= 0.00002 m H2O2 0.00001625 m H2O2 = 16.25 Mm H2O2 residuales Con 0.9 mL KMnO4 0.0009 L KMnO4 m= M*L 0.005 M * 0.0009 L=0.0000045 m 2m KMnO4 5m H2O2 0.0000045 m KMnO4 X X= 0.00001125m H2O2 = 11.25 Mn H2O2 residuales Con 0.8 ml KMnO4 0.0008 L KMnO4 m= M*L 0.005 M* 0.0008L = 0.000004 m 2m KMnO4 5m H2O2 0.000004 m KMnO4 X X= 0.00001. m H2O2 0.00001 H2O2 = 10 Mn H2O2 residuales Con 1.2 mL KMnO4 0.0012 L KMnO4 m= M*L 0.005 M * 0.0012 L = 0.000006 m 2m KMnO4 5m KMnO4 0.00006 m KMnO4 X X= 0.000015m H2O2 0.000015m H2O2 = 15 Mn H2O2 residuales Micromoles H2O2 descompuestas 1. 34 Mm 25 Mm = 9 Mm 2. 34 Mm 22.5 Mm = 11.5 Mm 3. 34 Mm 16.25 Mm = 17.75 Mm

La leche es una fuente excelente para la mayora de minerales requeridos para el crecimiento. La digestibilidad del calcio y fosforo es generalmente alta, en parte porque se encuentra en asociacin con la casena de la leche. Como resultado, la leche es la mayor fuente de calcio para el crecimiento del esqueleto y mantenimiento de la integridad de los huesos. En la observacin del tercer tubo se observo la presencia normal de calcio, esto se vio debido a que el precipitado presento unos grumos diminutos blancos lo cual arroj la prueba de manera positiva. Catalizacin de la catalasa. Micromoles H2O2 inciales []H2O2 = 0.017 M M = M* L m= 0.017 M* 0.002 L = 0.000034m = 34 Mm Micromoles H2O2 residuales 2MnO4 + 5H2O2 + 6H O2 + Mn + 8H2O

Con 2 mls KMnO4 0.00020 L KMnO4 M= M*L 0.005 M * 0.00020 L = 0.000001m 2m KMnO4 5m H2O2 0.000001 m KMnO4 X X= 0.00001 m H2O2 0.000025 m H2O2 = 25 Mm H2O2 residuales Con 1.8 ml KMnO4 0.00018 L KMnO4 m= M*L 0.005 M * 0.00018 L = 0.000009 m 2m KMnO4 5m H2O2

Mm 18.75 Mm = 15.25 Mm 5. 34 Mm 11.25 Mm = 22.75 Mm 6. 34 Mm 10 Mm = 24 Mm 7. 34 Mm 15 Mm = 19 Mm 4. 34

ANEXOS Cuestionario 1: Desnaturalizacin de las protenas. 1. Investigar la composicin qumica de la leche materna, de cabra y compararla con la leche de vaca. Ver tabla composicin qumica de la leche en diferentes mamferos. 2. Indique la reaccin utilizada para determinar la presencia de un aminocido y cual para una protena. Reaccin de Biuret: el reactivo de Biuret est formado por una disolucin de sulfato de cobre en medio alcalino, este reconoce el enlace peptidico de las protenas mediante la formacin de un complejo de coordinacin entre iones Cu y los pares de electrones no compartidos del nitrgenos que forman parte de los enlaces peptidicos, lo que produce una coloracin rojo-violeta. Reaccin de los aminocidos azufrados: se pone de manifiesto por la formacin de un precipitado negruzco de sulfato de plomo. Esta reaccin se basa en la separacin del azufre de los aminocidos, el cual al reaccionar con una solucin de acetato de plomo, forma el sulfato de plomo. Reaccin de milln: reconoce residuos fenolicos, o sea aquellas protenas que contengan tirosina. Las protenas se precipitan por accin de los cidos inorgnicos fuertes del reactivo, dando un precipitado blanco que se vuelve gradualmente rojo al calentar. Reaccin xantoproteica: reconoce grupos aromticos, o sea aquellas protenas que contengan tirosina o fenilalanina, con las cuales el cido ntrico forma compuestos nitrados amarillos. sus constituyentes y cmo puede

3. Siendo la lactosa un disacrido, cules son hidrolizarse?

La lactosa es un disacrido formado por la unin de una molcula de glucosa y otra de galactosa. Al formarse el enlace entre los dos monosacridos se desprende una molcula de agua. Adems, este compuesto posee el hidroxilohemiacetalico, por lo que da la reaccin de Benedict. La lactosa se deshidroliza a glucosa y galactosa, puede presentarse en la orina durante el embarazo, un azcar reductor.

Cuestionario 2: Desnaturalizacin de protenas. 1. Cul es la principal funcin de los aminocidos en los organismos vivientes? Dirigen y regulan el metabolismo, transportan molculas esenciales para la vida, combaten virus y bacterias. 2. Cul es la parte de la clula dnde se sintetizan los aminocidos que forman las protenas? En los ribosomas o concentrado en la superficie del retculo endoplasmatico rugoso. 3. Mencione las principales funciones de las protenas para la clula y los organismos vivos Determinar la forma y estructura de las clulas, adems dirigen casi todos los procesos vitales, reparan daos estructurales, controlan y regulan las funciones biolgicas. 4. Por qu se utiliza la albumina como modelo para las determinaciones de la prctica? La albumina es una de las protenas de ms fcil desnaturalizacin y obtencin, ya que la desnaturalizacin se puede llevar a cabo con solo aplicar calor directamente. Cuestionario 3: Propiedades catalticas de la catalasa. 1. Factores que influyen en la velocidad de la reaccin enzimtica. Temperatura: un aumento en la temperatura determina un aumento en la velocidad de la reaccin hasta cierta temperatura ptima, ya que despus de 45 grados centgrados se empieza a producir la desnaturalizacin trmica. La temperatura optima en muchos mamferos es de 37 grados centgrados. Sin embargo existen especies de bacterias y algas que habitan en fuentes de aguas termales y en otro extremo ciertas bacterias rticas tienen temperaturas ptimas cerca de los 0 grados centgrados. El pH: La intensidad mxima de la actividad de la enzima, ocurre en el pH ptimo, con rpida disminucin de la actividad a cada lado de este valor de pH. La actividad ptima generalmente se observa entre los valores de 5 y 9. El pH ptimo de una enzima puede guardar relacin con cierta carga elctrica de la superficie, o con condiciones

optimas para la fijacin de la enzima a su sustrato. Cuando hay un exceso de iones hidrogeno, las enzimas los unen a sus molculas y ante un dficit los ceden. 2- Durante los procesos biolgicos y el constante intercambio con el medio, se generan especies qumicas conocidas como radicales libres, que se caracterizan por presentar un electro desapareado y por ser muy reactivas. De todos los radicales resultantes de gran inters las especies reactivas derivadas del oxigeno (EROS) debido a la estructura birradicalica de esta molcula y el gran numero de procesos que las generan y en los que puede versen involucradas. Las principales EROS son: el anin superoxido (O2), el radical hidroxilo (OH+), el oxigeno singlete y el perxido de hidrogeno (H2O2). Estas especies radicales estn implicadas en el dao celular de forma tal que las agresiones oxidantes pueden dirigirse hacia la carcinognesis, enfermedades inflamatorias, senectud celular y enfermedades neurodegenerativas, entre otros procesos patolgicos. En el organismo existe un sistema de proteccin antioxidante formado por enzimas y compuestos de bajo peso molecular, una de las enzimas que interviene en la proteccin, y en consecuencia, en el mantenimientos del balance oxidante/antioxidante es la catalasa (CAT). La catalasa es una de las enzimas mas abundantes en la naturaleza y se encuentra ampliamente distribuida en el organismo humano, aunque su actividad varia en dependencia del tejido, esta resulta mas elevada en el hgado y en los riones, mas baja en el tejido conectivo y los epitelios y prcticamente nula en el tejido nervioso. A nivel celular se encuentra en las mitocondrias y los peroxisomas, excepto en los eritrocitos, donde se encuentra en el citosol. La catalasa como parte del sistema antioxidante esta involucrada en la destruccin del H2O2 generado durante el metabolismo celular. La actividad de la catalasa puede ser inhibida por el cianuro, la azida, el sulfuro, la hidroxilamina, el paracetamol, entre otros. La catalasa ha sido estudiada en relacin con su participacin en numerosos procesos patolgicos de gran importancia y esta involucrada tanto en la gnesis como en las consecuencias de dichos procesos. En estudios realizados en rin, la repercusin que sigui al dao isqumico provoco una perdida de protenas de la matriz de los peroxisomas, con drstico compromiso de las funciones de estos y descenso significativo de la actividad de la catalasa. En pacientes con insuficiencia renal crnica, especialmente en aquellos que recibieron tratamiento con dilisis peritoneal y hemodilisis, se encontr una disminucin de las enzimas antioxidantes, entre ellas la catalasa, nivel eritrocitario. El desarrollo de lesiones hemorrgicas en la mucosa intestinal es causado por radicales de oxigeno. Enzimas antioxidantes como la catalasa pueden prevenir los daos causados por la reperfusion intestinal, siempre que el tratamiento se aplique durante la isquemia, pero antes de la reperfusion. La accin de la catalasa puede suprimir el incremento de Ca++ intracelular que se produce a travs del aumento de H2O2 provocado por el dao isqumico a nivel miocardico.

Se ha encontrado que despus de quemaduras severas existe un incremento del catabolismo proteico con la consiguiente disfuncin heptica, lo cual puede reducirse administrando enzimas antioxidantes como la catalasa. Estos hallazgos permiten considerar que la participacin de los sistemas antioxidantes en el mantenimiento del balance oxidante/antioxidante constituya un elemento esencial para numerosos procesos biolgicos cuyas alteraciones pueden originar o ser consecuencia de trastornos somticos en el individuo.

Tubo 1 2 3 4 5 6 7

ml KMnO4 gastados 2.0 1.8 1.3 1.5 0.9 0.8 1.2

Micromoles Micromoles Micromoles Micromoles H2O2 H2O2 H2O2 descompuestas inciales residuales descompuestas min/ml enzima 34 34 34 34 34 34 34 25 22.5 16.25 18.75 11.25 10 15 9 11.5 17.75 15.25 11.75 24 19 0.9 1.15 1.775 1.525 1.175 2.4 1.9

Tabla 1: comparacin de los datos obtenidos en la desnaturalizacin proteica en relacin a las diferentes concentraciones en cada tubo.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS ALAIS C. ciencias de la leche. Editorial Revert, S.A. Espaa 1985. Pag. 2126, 182, 275, 311. BOWMAN B A, RUSELL R M, (Ed).: Presente Kowledge in Nutrition. (8 Ed.)., Ed. ILSI Press, 2001 BRODY T.: Nutritrional Biochemistry. (2 Ed). Academic Press, San Diego, 1999 CHOW CHING KUANG. Fatty acid in foods and their health implications. Dekker, New York. 1992 FLETA L.: oligoelementos y vitaminas en la alimentacion infantil. Ed. Prensas univarsitarias, Zaragoza. 1997 PACHECO, Daniel. Bioqumica. Colombia. 2001 RODRIGUEZ-SOTRES, Rogelio. La estructura de las protenas. Consultado en: http://es.scribd.com/doc/2309987/proteinas-y-sus-reacciones