LxL8ClCL 6

2 urlflcaLlon sur colonne d'afflnlLe

une fols que nous avons lsole le surnageanL nous l'a[ouLons la soluLlon
de bllles d'agarose prealablemenL resuspendues avec du lysls buffer Les
bllles d'agarose sonL couplees avec le gluLaLhlon qul esL le subsLraL de la CS1
Alnsl la proLelne de fuslon (CS1Lv8CSnCx3Ll)conLenanL l'enzyme eL
les bllles vonL Lre llees par l'lnLeracLlon subsLraL enzyme resulLanL une fols
que ceLLe nouvelle soluLlon a blen prls nous la plaons dans une colonne que
nous lalssons s'ecouler Les bllles avec les proLelnes de fuslons resLenL dans la
colonne Landls que le resLe de la soluLlon conLenanL les auLres elemenL solubles
sorLenL de la colonne
une fols que le flow Lhrough esL blen sorLl on lave la colonne avec du
lysls buffer puls avec du 8S buffer pour blen ellmlner LouLes proLelnes
n'ayanL pas eLe correcLemenL ellmlnees 8apporL Lxerclce 4 naoml Anderegg ALsushl kamada
3
nous effecLuons un Lrolsleme lavage avec du Lhromblne buffer CeLLe
soluLlon en plus de laver les bllles donne l'enzyme Lhromblne un mllleu
opLlmal pour foncLlonner blen qu'll fallle noLer qu' ceLLe eLape l'enzyme n'a
pas encore eLe a[ouLe
une fols que ceLLe dernlere operaLlon a eLe effecLuee on melange les bllles
avec l'enzyme Lhromblne CeL enzyme reconnaiL alors le slLe Lv8CS se
LrouvanL enLre la CS1 eL le domalne nCx3Ll eL le cllve [usLe apres
l'arglnlne Alnsl on obLlenL d'un cLe les bllles d'agarose Lou[ours llees avec la
CS1 plus une parLle du domalne de cllvage eL de l'auLre la proLelne nCx3
Ll


EIectrophorse sur geI de poIyacryIamide ou PAGE (PoIy-AcryIamide GeI
EIectrophoresis):

Cette technique est trs utilise en immunologie et dans l'tude des protines car elle
permet, aprs la sparation des diffrentes protines, leur transfert sur une membrane de
nitrocellulose ou de polyfluorure de vinylidne afin d'tre identifier par le biais d'anticorps
spcifiques.

Cette technique est galement utilise pour le squenage de l'ADN (les mthodes
traditionnelles de Maxam et Gilbert ou de Sanger permettent de squencer la paire de
bases prs).

La matrice de cette lectrophorse:
Le gel de polyacrylamide est constitu d'acryIamide (extrmement neurotoxique par
ingestion ou contact avec la peau) qui est l'unit de base et de bisacryIamide qui est l'agent
portant. En faisant varier les taux de ces 2 substances on obtient diffrents maillages et donc
diffrentes densits de gel.
La polymrisation est ralise grace l'ajout de 2 ractifs: le TEMED (N,N,N',N' tetra-mthyl-
thylnediamine) et l'ammonium persuIfate qui deviennent des anions hyperactifs en
prsence de lumire.

La densit typique d'un geI de sparation peut tre 6%; 8%; 10%; 12% ou 15%.
Plus le gel est dense meilleure sera la sparation des protines.
Des niveaux de densit plus faibles du gel permettent de sparer des protines de poids
molculaires proches.

La densit d'un geI de concentration (stacking gel) est 5%. Ce gel est coul en haut du
gel de sparation. l permet l'chantillon une entre homogne dans le gel de sparation.
On utilise un "peigne" afin de crer des "puits" individuels pouvant accueillir chaque
chantillon.

Le SDS-PAGE:
Une variante de cette technique consiste utiliser du SDS (Sodium DodcyIsuIfate)qui est
un dtergent anionique fort. l a la proprit de dfaire la structure spatiale en se fixant sur
les protines et de les charger de la mme faon permettant ainsi de les sparer uniquement
en fonction de leur masse molculaire.
Les protines sont dites dnatures: elles ont perdu leur structure tridimentionnelle native.

Avant de procder la dnaturation des protines avec du SDS, on utilise un agent
rducteur, le b mercaptothanoI qui rduit les ponts disulfures des proteines les rendant
ainsi sous forme monomrique.