CATEDRA: VIROLOGIA

TEMA:EXTRACCION DE ADN Y PCR

CONTENIDO
Generalidades sobre el ADN Muestras para extraccin del ADN

Condiciones sobre la remisin de muestras.

Mtodos de extraccin del ADN

EL MATERIAL GENTICO

CROMOSOMAS
46 CROMOSOMAS 23 PARES DIPLOIDES
UN INDIVIDUO TIENE 23 CROMOSOMAS HEREDADOS DE LA MADRE Y 23 HEREDADOS DEL PADRE

EL MATERIAL GENTICO
Es el responsable de transmitir caracteres heredados de una generacin a otra. los

Est conformado por millones de unidades de nucletidos

Cada nucletido esta a su vez formado por: Base nitrogenada, Azcar y grupo fosfato

EL MATERIAL GENETICO
BASES NITROGENADAS
BN BN BN ADENINA GUANINA P
A

BN

BN

CITOSINA
TIMINA P

BN

BN

MUESTRAS EXTRACCION DEL ADN

Sangre Semen Saliva Cabello Hueso Diente Tejido

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN

PROTECCION DEL PERSONAL

Prevenir contacto directo Condiciones de asepsia Vacunacin

MATERIAL
HUMANO.

PROTECCION DE LA MUESTR A CONTAMINACION POR

BIOLOGICO
CAUSADA POR

MICROORGANISMOS

CONTAMINACION MICROBIOLOGICA

LA TEMPERATURA LA HUMEDAD

Factores que afectan el rendimiento, calidad y pureza del ADN

CONTAMINACIN QUMICA
TECNICA PRODUCTOS QUIMICOS QUE PUEDEN ALTERAL LA DEL PCR

TRANSFERENCIA DE INDICIOS BIOLOGICOS

PUEDE OCUSACIONAR LA PERDIDA DE LA MUESTRA FENMENOS

DEGRADACION DE LAS MUESTRAS

INSECTOS

METEOROLGICOS

HUMEDAD AMBIENTAL ACCIN DE

 Deteccin de mutaciones

Mtodo de diagnstico rutinario (relacin entre enfermedad y mutacin puntual)

Secuenciacin de ADNs fsiles

Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayora estn daadas o degradadas)

Diagnstico de enfermedades genticas

Diagnstico prenatal / Diagnstico preimplantacin de enfermedades hereditarias o determinacin del sexo del feto previamente a su implantacin en procesos de fecundacin in vitro

Identificacin de especies y control de cruces entre animales

Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie ms barata a los precios de otra ms cara, o el comercio ilegal de especies en peligro

Secuenciacin de genomas

Conocimiento bsico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

Obtencin de protenas de inters mdico, comercial, etc...

(insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulacin antes se obtenan a partir de los tejidos que las producen o fluidos corporales)

Obtencin de vacunas recombinantes

Extraccin del ADN del virus

(aternativa al uso de organismos patgenos inactivos)

ADN plsmido bacteriano

Integracin del plsmido hbrido en el ncleo de una clula de levadura

La levadura fabrica las protenas vricas con poder inmunolgico

Inyeccin de protenas vricas en un chimpanc

Diagnstico de enfermedades de origen gentico

ADN sano ADN enfermo Conocimiento previo de la secuencia de ADN enfermo

Mediante ingeniera gentica se construye una sonda de ADN, marcada (marcaje fluorescente), con la secuencia complementaria del ADN enfermo

ADN complementario del ADN enfermo

DIAGNSTICO

Biochip Microarray DNAchip

Si aparecen bandas fluorescentes demuestra que la persona presenta la anomala Hibridacin? Renaturalizacin No hibridacin? del ADN con la sonda fluorescente Desnatura lizacin del ADN ADN de la persona que se quiere diagnosticar

EXTRACCION DE ADN
ORGANICA CHELEX PAPEL FTA SALTING OUT Pueden depender en
Protocolos de LAB Tipo de muestra

Preparacin de Muestra
Extraccin de ADN Orgnica

Extraccin por Chelex

Extraccin de ADN utilizando papel FTA

EXTRACCION ORGANICA DE ADN

PHENOL / CHLOROFORM / ISOAMYL ALCOHOL (PCI)
PRODUCE ADN DE ALTO PESO MOLECULAR CONSUME MUCHO TIEMPO QUIMICOS PELIGROSOS MULTIPLES TRANSFENCIAS (posibles errores)

EXTRACCION ORGANICA DE ADN

COLOCAR MUESTRA EN EL TUBO AADA SDS (detergente) Y PROTEINASE K
ROMPE LAS CELULAS (SDS) ROMPE LAS PROTEINAS (Proteinase K)

AADA FCI => Fenol disuelve protenas y lpidos

Particiona macromolculas basado en propiedades hidrofbicas e hidroflicas Cloroformo aumenta la densidad de fase del fenol Alcohol Isoamyl disminuye la espuma

ADN MAS SOLUBLE => EN FASE ACUOSA

FENOL CLOROFORMO

VENTAJAS Tcnica Orgnica (Solventes) ADN de muy buena calidad y cantidad. Peptidos y proteinas son extraidas en la fase organica (Fenol), despus se realiza digestin con proteinasa K. El cloroformo permite que todo el fenol pueda ser lavado. DESVENTAJAS: Reactivos altamente txicos Perdidas significativas de ADN y mucho mas si esta degradado.

EXTRACCION POR CHELEX

RESINA QUELANTE

REMUEVE MAGNESIO
(INACTIVA NUCLEASAS DE ADN)

ENLAZA LOS DESPERDICIOS DE LA

CELULA UTILIZE SOLO CON PCR (cadena sencilla)

EXTRACCION POR CHELEX

AADA MUESTRA AL TUBO AADA AGUA Y SOLUCION AL 5% DE CHELEX 100C PARA ROMPER CELULAS
DESTRUIR PROTEINAS

ADN ES DESNATURALIZADO A CADENAS SENCILLAS UTILIZE SOBRENADANTE DIRECTAMENTE EN PCR

CHELEX
VENTAJAS Tcnica inorgnica Previene la degradacin del ADN por quelacin de los iones metlicos durante la ebullicin al 5%. Tiene copolimeros de estireno dibenzeno- inones iminodiacetato. los reactivos no son txicos y no se pierde ADN. DESVENTAJAS: El ADN aislado es de cadena sencilla, utilizado en PCR pero no en RFLPS.

Podemos obtener diferentes muestras de ADN humano para su extraccin, aislamiento y purificacin, con el objetivo de ser empleado en diferentes estudios de carcter gentico, biolgico. y/o bioqumico.

EXTRACCION CON PAPEL FTA

PAPEL ALMACENAJE A BASE DE CELULOSA CONTIENE QUIMICOS
PREVIENE ACTIVIDAD DE NUCLEASA E INHIBE CRECIMIENTO BACTERIANO

ESTABLE A TEMP AMBIENTE POR AOS UTILIZE PARA MUESTRAS DE SANGRE O SALIVA DE VICTIMAS O SOSPECHOSOS

Tecnologa FTA
Rompe clulas y membranas de organelos
-Fsicamente Atrapa Acidos Nucleicos (ADN & ARN)

Preserva y Proteje Acidos Nucleicos

-Previene Dao por radicales libres/UV -Previene Dao Enzimtico -Inhibe crecimiento de hongos y bacterias

Provee Seguridad al Usuario

-Inactiva Potenciales Viruses Peligrosos

CARACTERISTICAS Y VENTAJAS

EXTRACCIN DE PAPEL FTA

CUANTIFICACIN NO es necesaria
Cantidad de muestra consistente Resultados consistentes

Posible AUTOMATIZACIN

SALTING-OUT
Tcnica de tipo inorgnica Utiliza reactivos bajos en toxicidad Permite visualizar la malla del ADN.

Toma de muestra Colectar 0,5 mL de sangre perifrica en un tubo de 1,5 mL estril conteniendo 20 l de EDTA 5.6 %.Agitar bien por inversin fuerte para garantizar homogenizacin. Conservar en refrigeracin hasta su procesamiento, el cual deber realizarse en un plazo no mayor de 48 horas despus de haberse realizado la toma de muestra. No congelar en este estado, pues se produce la lisis de las clulas nucleadas.

SALTING OUT
1. Lisis Celular 2. Extraccin 3. Precipitacin 4. Resuspensin

LISIS CELULAR
Buffer de lisis I: (lisis glbulos rojos). Sucrosa MgCl2 1M Triton x 100 Buffer de lisis II: (lisis glbulos blancos) EDTA de Na NaCL.

EXTRACCION
Lauril sulfato de sodio al 10%: despolariza las proteinas Perclorato de sodio 5M NaCl 6M

PRECIPITACION
Isopropanol

Etanol al 70% lava el exceso de sales.

RESUSPENSION
Se realiza en Buffer T. E. ( Tris EDTA) o tambin se puede realizar en agua.

CONCLUSIONES
El ADN es el material gentico a travs del cual se transmite la informacin contenida en los genes de generacin en generacin. El ADN esta presente en los indicios biolgicos como sangre, semen saliva, tejido, hueso, pelo etc. Es muy importante conocer las condiciones para la remision adecuada de las muestras. El Salting-out es uno de los mtodos de extraccin de ADN mas utilizados por su fcil implementacion, baja toxicidad de los reactivos y permite la visualizacion del ADN.

TIPOS DE PCR

TIPOS DE PCR

Anidada

In situ

Transcriptasa inversa

Tiempo real

Multiplex

PCR anidada
Comprende dos rondas de amplificacin con distintos pares de iniciadores o primers en cada una, con el fin de incrementar la sensibilidad de deteccin. Primero se realiza una reaccin con los iniciadores externos para amplificar una regin de ADN mas extensa, que contiene el segmento diana. Despus, con este producto de amplificacin, se ejecuta una segunda PCR con los iniciadores internos para amplificar la regin especfica. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La desventaja de sta tcnica es que no nos permite cuantificar la muestra.

PCR in situ
para la PCR in situ incluyen la fijacin y la permeabilizacin durante la preparacin de la muestra, un mecanismo para ciclacin y el material celular en la solucin o en laminillas de cristal Antes de llevar a cabo la PCR in situ, las clulas o las muestras del tejido fino son fijadas y permeabilizadas para preservar la morfologa y permitir el acceso de los reactivos de PCR a las secuencias intracelulares que se quieren amplificar. La amplificacin de PCR de las secuencias blanco se realiza despus en las clulas intactas en tubos microEppendorf o directamente en preparaciones citocentrifugadas o secciones del tejido fino en laminillas de cristal

RT-PCR
Es un mtodo sensible para la deteccin de los niveles de expresin del ARNm. Tradicionalmente la RT-PCR de dos pasos: la reaccin de RT y la amplificacin por PCR.

ARN es la primera transcripcin inversa en cDNA utilizando una transcriptasa inversa El cDNA resultante se usa como plantillas para su posterior amplificacin por PCR utilizando primers especficos para uno o ms genes.

 Es una variante de (PCR) utilizada para amplificar y cuantificar el producto de la amplificacin de ADN. Para ello emplea, del mismo modo que la PCR convencional, un molde de ADN, al menos un par de cebadores especficos, dNTPs, un tampn de reaccin adecuado, y una ADN polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluorforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluorforo, permita medir la tasa de generacin de uno o ms productos especficos.

PCR en tiempo real

Dicha medicin, se realiza luego de cada ciclo de amplificacin y es por esto que tambin se le denomina PCR en tiempo real.

PCR multiplex
PCR en la cual se amplifica ms de una secuencia en una misma reaccin. Emplea dos o ms pares de cebadores en un nico tubo con el fin de amplificar simultneamente mltiples segmentos de ADN. Consiste en combinar en una nica reaccin todos pares de cebadores de los sistemas que queremos amplificar simultneamente, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes.

 Se amplifica mas de una secuencia blanco, que se logra agregando en la reaacion mas de un par de primers. Ahorra tiempo y esfuerzo