Activation of Estrogen-Responsive Genes Does Not Require Their Nuclear Co-Localization

Organisasi spasial dari genom dalam inti memainkan peran dalam regulasi ekspresi gen. apakah coregulated gen tunduk pada reposisi terkoordinasi untuk berbagi ruang nuklir adalah masalah yang cukup menarik dan debat. Kami menyelidiki organisasi nuklir reseptor estrogen alfa (ERa) menargetkan gen pada payudara manusia epitel dan baris sel kanker, sebelum dan setelah aktivasi transkripsi diinduksi dengan estradiol. Kami menemukan bahwa, bertentangan dengan yang lain laporan, gen target ERa TFF1 dan GREB1 didistribusikan di nucleoplasm dengan tidak ada hubungan khusus dengan masing-masing lain. Pemisahan nuklir antara gen ini, serta antara target gen ERa PGR dan CTSD, tidak berubah dengan penambahan hormon dan aktivasi transkripsi dengan tidak ada bukti untuk co-lokalisasi antara alel. Demikian pula, sedangkan volume yang ditempati oleh kromosom meningkat, posisi nuklir relatif dari masing-masing wilayah kromosom adalah Selain tidak terpengaruh oleh hormon. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa gen ERa estradiolinduced target tidak diharuskan untuk colocalize dalam nukleus. Organisasi dalam kromatin inti vertebrata adalah non acak: kromosom mengadopsi posisi preferensial dengan memperhatikan ke pusat atau tepi inti dan gen mengadopsi preferensial posisi berkenaan dengan wilayah kromosom mereka sendiri [1]. Selain itu, preferensial jarak asosiasi telah ditemukan antara lokus, terutama dalam cis [2,3], tetapi juga di trans [4-9]. Banyak asosiasi ini telah diusulkan untuk menjadi fungsional signifikansi untuk ekspresi gen, baik melalui transinteraction yang gen dan unsur-unsur peraturan [4,8], melalui trans-alel homolog penginderaan sebelum kromosom X inaktivasi [5,9] atau dengan lokalisasi co-gen pada saat yang sama pabrik transkripsi [7]. Sebuah instance dari cepat dan diarahkan interaksi antar-kromosom baru-baru ini dilaporkan untuk reseptor estrogen a (ERa) Target utama gen dalam sel manusia epitel susu (HMEC) dan dalam baris sel kanker payudara (MCF-7) [10]. ERa adalah nuklir reseptor yang, dalam menanggapi rangsangan oleh estradiol 17b (E2), mengatur ekspresi gen dengan mengikat kedua promotor dan lebih situs distal yang mungkin jarak enhancer [2,11-15]. E2 terikat ERa terakumulasi dalam berbagai fokus nuklir [16,17] yang menimbulkan kemungkinan bahwa mungkin ada asosiasi di dalam nukleus antara situs ERa beberapa mengikat, di cis dan trans. Pengaktifan

ekspresi gen dengan ERa melibatkan kromatin yang luas renovasi dimediasi oleh perekrutan memodifikasi histon enzim dan kompleks remodeling nukleosom [18]. Selain itu, motor molekuler seperti rantai cahaya dynein (DLC1) telah dilaporkan untuk mengikat ERa dan promotor dari ERa-responsif transkripsi gen untuk mempotensiasi mereka [19], sebuah komponen dynactin mengikat dan memodifikasi fungsi ERa [20] dan mikrotubulus jaringan juga telah terlibat dalam aksi ERa [21]. Ini pengamatan meningkatkan kemungkinan bahwa diarahkan panjang rentang gerak dalam inti mungkin terlibat dalam fungsi ERa. Memang, jarak jauh yang cepat (dalam waktu 1 jam) dan diarahkan pergerakan gen estrogen responsif dilaporkan setelah E2 paparan, dilaporkan tergantung pada aktin nuklir / miosin [10]. Secara khusus, interaksi antar-kromosom terdeteksi oleh kromosom konformasi menangkap (3C), dan nuklir co-lokalisasi diungkapkan oleh fluoresensi dalam hibridisasi in situ (IKAN), yang digambarkan antara alel dari beberapa gen diinduksi estrogen. Lebih mengherankan, gerakan ini terbatas pada lokus gen memperhatikan dan terlibat cepat reposisi dari gen ' wilayah kromosom dalam inti. Estrogen-inducible gen yang tampaknya menunjukkan ini''antar-kromosom mencium'' [22] adalah TFF1 (juga dikenal sebagai pS2) pada kromosom 21 dan GREB1 pada 2 kromosom manusia. Dalam waktu 60 menit E2 Selain sel yang telah tumbuh dalam ketiadaan steroid, gen ini diaktifkan pada ERa-positif sel MCF-7 dan ''''Dan''monoallelic biallelic''heterolog asosiasi antara Ringkasan penulis Apakah co-gen relocalize diatur dalam terkoordinasi fashion untuk ruang nuklir bersama adalah masalah cukup minat dan debat. Kami menyelidiki organisasi spasial reseptor estrogen alfa (ERa) target gen dalam tiga baris sel manusia epitel payudara, manusia sel epitel (HMEC), yang MCF10A normal seperti diploid cell line, dan garis sel tumor MCF-7 aneuploid. Nuklir posisi subset dari gen dalam ketiadaan hormon dan setelah penambahan estradiol dinilai kuantitatif dengan menggunakan 2D dan 3D hibridisasi in situ teknik. Dalam dua kami laboratorium, kami menemukan bahwa TFF1 dan GREB1 didistribusikan di nucleoplasm dengan tanpa khususnya hubungan satu sama lain. jarak antara homolog dan heterolog alel gen ini dan posisi nuklir relatif kromosom masing-masing wilayah 2 dan 21 itu, bertentangan dengan sebelumnya laporan, tidak terpengaruh oleh aktivasi transkripsi dan hormon Selain itu. Hasil yang sama diperoleh dengan target ERa PGR dan CTSD gen pada kromosom 11. Bahkan di antiestrogen yang

LCC9 tahan sel line, TFF1 dan GREB1 dan dua TFF1 alel tetap dipisahkan setelah terpapar estradiol. Hasil penelitian kami menunjukkan bahwa dengan demikian estradiolinduced gen tidak diharuskan untuk bekerja pelokalan atau berinteraksi di trans atau cis. GREB1 dan TFF1 dan antara cat kromosom untuk kromosom 2 dan 21 yang dilaporkan, baik di HMEC dan Sel MCF-7 [10]. Yang penting, ERa mengaktifkan ekspresi dari gen melalui perekrutan de novo RNA polimerase II (RNAPII), bukan, seperti yang ternyata kasus yang paling ERa-responsif gen, melalui peraturan negara fosforilasi RNAPII pra-dimuat pada promotor [23]. Oleh karena itu, adalah mungkin bahwa melaporkan rekan-nuklir lokalisasi ini ERa-gen responsif mewakili perekrutan mereka ke kompartemen nuklir bersama yang memfasilitasi ekspresi gen, seperti pabrik transkripsi atau Faktor-diperkaya splicing Speckles nuklir [24]. Sementara ada beberapa contoh lain dari gen dilaporkan cepat dan lokus gerak dalam inti [1], termasuk contoh di mana nuklir aktin / miosin yang terlibat [25], pandangan cepat dan ekstensif nuklir reorganisasi diinduksi oleh estrogen kontras dengan studi lain dari dinamika lokus tertentu atau dari keseluruhan wilayah kromosom. Ini telah menunjukkan bahwa kromatin umumnya memiliki mobilitas terbatas dalam sel mamalia. Dengan pengecualian tahap awal G1 [26] gerak, kromatin tampaknya terjadi dengan difusi dibatasi dan terbatas pada kisaran sekitar 0,5 mikron [27] selama periode yang panjang (puluhan menit hingga berjam-jam) dari interfase [27,28]. Mengingat ini perbedaan potensial, kami berusaha untuk kembali memeriksa nuklir organisasi TFF1 dan GREB1 pada stimulasi E2 di normal seperti MCF10A dan kanker sel kanker payudara MCF-7 baris dan dalam HMECs primer. Kami tidak menemukan bukti untuk nuklir co-lokalisasi TFF1 dan GREB1 pada stimulasi E2 baik situasi dan tidak melihat apapun, diarahkan penyusunan ulang terkoordinasi dari kromosom 2 dan 21 wilayah. Hasil Nuklir organisasi ERa-responsif gen pada manusia sel epitel mammae Antar-kromosom cepat co-lokalisasi estrogen responsif gen yang diaktifkan dengan penambahan E2, dan nuklir reposisi wilayah kromosom mereka, adalah dilaporkan dalam sel primer manusia epitel susu (HMECs) [10]. Untuk mereproduksi data ini, kita siap probe yang sesuai ke GREB1 dan TFF1 lokus dan diverifikasi mereka, bersama dengan cat untuk kromosom 2 dan 21, oleh IKAN ke metafase kromosom dari HT1080 dan MCF10A sel, yang keduanya memiliki dekat

kariotipe normal, [29,30]. Para GREB1 dan TFF1 probe dipetakan hanya untuk posisi yang diharapkan pada 2p25.1, dan masing-masing 21q22.3 (Gambar S1A dan S1C), dan masing-masing memberi dua sinyal yang berbeda dalam interfase inti sel diploid (Gambar S1B dan S1D). Probe ini kemudian digunakan pada inti dari dua independen budaya HMECs tumbuh baik di arang habis dilucuti media, yaitu dalam ketiadaan E2 (-E2), atau setelah 60 menit dari stimulasi oleh 100 nM E2 (+ E2). Posisi Nuklir dianalisis oleh kedua IKAN 2D dan 3D. IKAN 2D memberi analisis citra lebih cepat dan meskipun sedikit melebih-lebihkan jarak interfase dibandingkan ke 3D [31] itu memberikan hasil yang sangat serupa di TFF1GREB1 jarak dibandingkan dengan analisis 3D. Visual inspeksi IKAN gambar 3D mengungkapkan empat hibridisasi yang berbeda dan terpisah sinyal (dua per gen) dan tidak menunjukkan adanya colocalisation jelas, baik antara alel homolog TFF1 atau GREB1, atau antara alel dari gen heterolog (Gambar 1A). Kami mengukur jarak interfase antara semua kombinasi dari sinyal hibridisasi, dan kami juga dinormalisasi setiap jarak antar-probe (d) dengan jari-jari (r) dari sebuah lingkaran yang sama daerah dengan yang inti untuk memperhitungkan setiap perubahan dalam nuklir ukuran sebagai konsekuensi penambahan E2 (Gambar 1B). Dalam analisis 3D, tidak ada perbedaan yang signifikan dalam normalisasi antar-probe jarak sebelum dan setelah penambahan E2, baik untuk homolog alel p $ 0,2, atau untuk TFF1-GREB1 pasangan heterolog penyelidikan (P $ 0,5). Pemisahan rata-rata antara TFF1-GREB1 alel setelah Selain E2 adalah 11 mm, dengan hanya 0,5% dari pengukuran # 1 mm. Jarak terdekat dalam inti HMEC, pada kenyataannya, dicatat antara alel homolog TFF1 dalam ketiadaan E2 (P $ 0,004). Kami menganggap ini kemungkinan karena fakta bahwa TFF1 terletak pada kromosom akrosentrik, kecil 21 yang terkait dengan nukleolus dan dibatasi untuk posisi dalam volume kecil pusat inti. Sebaliknya, kromosom 2, di mana GREB1 berada, memiliki lebih perifer lokasi nuklir, affording kemungkinan jauh lebih besar jarak nuklir antara homolog [32]. Memang, analisis posisi nuklir radial dari kedua gen menegaskan posisi sentral nuklir lebih TFF1 alel, dengan .50% dari sinyal yang ditemukan di zona terdalam 5 dari nukleus (Gambar 1C). Tidak adanya nuklir co-lokalisasi ERa-gen responsif setelah penambahan E2 untuk budaya sel HMECs tidak terlalu mengejutkan, karena ini jenis sel umumnya dianggap memiliki rendah atau tingkat tidak terdeteksi ERa [33,34]. Memang, imunohistokimia pewarnaan mengungkapkan adanya ERa terdeteksi dalam inti

sel-sel (Gambar 2B) dan tidak adanya ERa dalam sel adalah dikonfirmasi oleh blot Barat (Gambar 2A). Demikian pula, sel MCF10A, yang secara spontan diabadikan payudara manusia epitel sel [35], dan yang memiliki pelengkap diploid normal TFF1 dan GREB1 alel (Gambar S1C), juga tidak memiliki ERa terdeteksi tingkat protein (Gambar 2A). Seperti di HMECs, tidak ada co-lokalisasi homolog atau heterolog TFF1 dan GREB1 alel terlihat pada sel-sel (Gambar 1A). Antar-probe berarti jarak diukur setelah IKAN 3D antara alel heterolog itu, 7 mm, dengan tidak ada perubahan setelah penambahan E2 (kurang dari 1% pada, 1 mm sebelum dan sesudah E2 stimulasi) (Gambar 1D). Demikian pula, terkecil antar-probe jarak yang ditemukan dalam sel MCF10A antara homolog TFF1 alel, dengan, 3% pada kurang dari 1 mm, baik tidak adanya E2 atau setelah 1 jam induksi E2. Penyusunan ulang kromosom daerah membawa ERa-responsif gen dalam sel MCF-7 Oleh karena itu kami menguji TFF1 dan GREB1 probe yang sama pada ERa-positif (Gambar 2A) MCF-7 sel kanker payudara, yang telah juga telah dilaporkan untuk menunjukkan colocalisation nuklir cepat TFF1 dan GREB1 pada penambahan E2 [10]. Dalam baris ini sel antara 4-6 sinyal hibridisasi terlihat untuk masing-masing probe gen pada baik metafase dan interfase MCF-7 persiapan (Gambar 2C). Demikian pula, cat kromosom ditunjukkan penataan ulang yang ekstensif dan mendapatkan materi dari kromosom 2 dan 21 di mandiri isolat sel-sel ini. Tampaknya ada dua salinan normal kromosom 2 yang membawa GREB1 dan satu GREB1-membawa salinan dengan bahan tambahan translokasi ke lengan panjang kromosom 2. Salinan keempat GREB1 adalah pada sebagian kecil translokasi kromosom 2p ke kromosom lain. Demikian pula, dua salinan dari TFF1 berada pada tampak normal kromosom 21, dengan dua atau empat salinan tambahan translokasi ke tak dikenal besar kromosom. Kariotipe variabel telah dijelaskan, oleh kedua metode sitogenetika dan molekul, dari MCF-7 sel tumbuh di laboratorium yang berbeda pada waktu yang berbeda, tetapi dalam semua dari mereka garis sel sangat aneuploid [36-41]. Ini ketidakstabilan genomik baru-baru ini dikonfirmasi dengan mendalam-sekuensing [42] dan analisis kami adalah kompatibel dengan ini. Menggunakan RT-PCR kuantitatif (QRT-PCR) kami mengkonfirmasi bahwa TFF1 dan GREB1 ekspresi diaktifkan pada penambahan E2 untuk MCF-7 sel. Aktivasi E2-responsif gen telah dilaporkan setelah penambahan 10nm baik [17,18] dan 100 nM [10,23,43] E2. Memang, TFF1 relatif dan tingkat mRNA GREB1 MCF-7 dalam sel kita meningkat 3 dan 8 kali lipat, masing-masing, setelah 16 jam paparan 10 nM E2 dan 4 dan 3 kali lipat, masing-masing, dengan menggunakan 100 nM E2 (Gambar 2D). Selain itu, kondisi mapan tingkat GREB1 dan mRNA meningkat 2 kali lipat TFF1 dalam 1 jam dari 100 nM E2

Selain itu, jangka waktu selama co-lokalisasi ini lokus gen telah dilaporkan [10]. Beberapa studi sebelumnya telah juga menggunakan perawatan pra-dengan RNA polimerase II inhibitor sebuah amanitin-sebelum penambahan E2, dalam rangka untuk menghapus aktif sedang berlangsung transkripsi dari gen sebelum induksi mereka [10,18]. Dalam analisis kami, a-amanitin tidak berubah awal respon sel untuk E2, tetapi tingkat steady state TFF1 dan GREB1 mRNA setelah paparan E2 16 jam lebih tinggi pada aamanitin yang pra-diperlakukan sel, dibandingkan dengan sel yang tidak diobati (Gambar 2D).