CROMATOGRAFIA

Marilena Meira

1. Histrico
Em 1903, o botnico russo Mikhail Tswett conseguiu separar pigmentos vegetais passando, atravs de uma coluna contendo CaCO3, uma soluo de pigmentos dissolvidos em um hidrocarboneto.

Obteve um registro colorido do processo de separao cromatos: cor ; grafia: registro = CROMATOGRAFIA.

2. Definio de Cromatografia:
Mtodo fsico-qumico de separao baseado na migrao diferencial dos componentes de uma mistura devido a diferentes graus de interao entre duas fases imiscveis, uma mvel e outra fixa. Fase mvel: solvente (gs ou lquido) que se move atravs do sistema (coluna ou placa), carregando os solutos. Fase Estacionria: slido (ou lquido impregnado em um slido) que permanece fixo no sistema (coluna ou placa).

3. CLASSIFICAO
1. PELA FORMA FSICA DO SISTEMA CROMATOGRFICO:
CROMATOGRAFIA PLANAR CROMATOGRAFIA EM COLUNA

2. PELA FASE MVEL EMPREGADA:

LQUIDA GASOSA SUPERCRTICA

3. PELA FASE ESTACIONRIA UTILIZADA: SLIDA LQUIDA QUIMICAMENTE LIGADA 4. PELO MODO DE SEPARAO: ADSORO PARTIO TROCA INICA EXCLUSO

CROMATOGRAFIA

TCNICA

PLANAR

COLUNA

FASE MVEL

LQUIDA

LQUIDA

GASOSA

FASE ESTACIONRIA

LQUIDA

SLIDA

LQUIDA

SLIDA

LQUIDA

SLIDA

CP

CCD

CLL

CLS; CE

CGL

CGS

4. CROMATOGRAFIA LQUIDA
1. CROMATOGRAFIA POR PARTIO OU LQUIDOLQUIDO (CLL) 2. CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA (CTI) 3. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO (CE) 4. CROMATOGRAFIA POR ADSORO OU LQUIDO-SLIDO (CLS)
CL CLS CTI CE

CLL

4.1. CROMATOGRAFIA POR PARTIO OU LQUIDO-LQUIDO (CLL)

A separao baseada nos diferentes coeficientes de partio (solubilidade) dos componentes da mistura entre dois solventes imiscveis, um fixo (fase estacionria) imobilizado na superfcie de um suporte slido e o outro mvel.

FASE MVEL

F. ESTACIONRIA

EXEMPLO DE CROMATOGRAFIA LQUIDOLQUIDO: CROMATOGRAFIA EM PAPEL (CP) A celulose do papel forma pontes de hidrognio com a gua, que fica retida formando a fase estacionria. A separao da mistura baseada nas diferentes solubilidades relativas dos componentes na fase mvel e estacionria. A fase mvel sobe por ao capilar. Os componentes mais solveis na fase estacionria sero seletivamente retidos, tendo uma movimentao mais lenta.

FATOR DE RETENO (Rf)

Rf =
Distncia percorrida pela substncia Distncia percorrida pela fase mvel

dm
ds1 ds2

Rf = ds dm

SUBSTNCIAS SEPARADAS POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL

COMPOSTOS HIDRFILOS (HIDROSSOLVEIS) COMO CIDOS ORGNICOS E ONS METLICOS.

4.2.CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA (CTI)

Trocador catinico

+
+

Trocador aninico

+ -

A fase estacionria constituda por uma matriz com grupos funcionais ionizveis. Trocadores catinicos, tm stios carregados negativamente adsorvendo ctions. Trocadores aninicos tm stios ativos carregados positivamente adsorvendo nions.

TIPOS DE FASES ESTACIONRIAS NA CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA (CTI)

Derivados sulfnicos de copolmeros do estireno e divinilbenzeno. Fortemente catinica. Amina quaternria de copolmeros do estireno e divinilbenzeno. Fortemente aninica. Resinas com o grupo cido carboxlico. Fracamente catinicas. Resina com o grupo funcional amina primria. Fracamente aninicas. Derivada da celulose: por tratamento qumico, em geral sulfonao. Slica-gel impregnada com trocadores inicos lquidos (ex: triisoctilamina)

TROCADOR CATINICO: ESTIRENODIVINILBENZENO SULFONADO.

CH C CH C CH C H2 H2 H2

CH CH2

SO3-H+ SO3-H+ CH C CH C CH C H2 H2 H2

CH

SO3-H+ C CH C CH C CH C H2 H2 H2 H2

SO3-H+

CH

SO3-H+ CH

TROCADOR ANINICO: AMINA TERCIRIA ESTIRENO-DIVINILBENZENO.

CH C CH C CH C H2 H2 H2

CH2NR3+OH-

CH2NR3+OH-

CH CH2

CH C CH C CH H2 H2

C H2

CH2NR3+OH-

CH2NR3+OH-

CH

C CH C CH C CH C H2 H2 H2 H2

CH

CH2NR3+OH-

CH

TIPOS DE FASES MVEIS NA CROMATOGRAFIA POR TROCA INICA (CTI)

Solues tampes (pH 3,0 8,0): Tampo de Fosfato de pH = 8,0. Tampo de Fosfato de sdio de pH = 3,4. Solues de sal: 0,1 0,2 M de LiCl ou NaCl. gua destilada. Qualquer solvente orgnico.

4.3. CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO (CE): Cromatografia de permeao ou filtrao por gel Baseia-se em um processo puramente mecnico. A fase estacionria uma matriz de composio inerte, com partculas de forma, tamanho e porosidade uniformes. As molculas menores so capazes de penetrar em todos os poros da fase estacionria, ficando mais tempo retidas, enquanto as maiores so excludas de todos os poros, passando entre os grnulos, arrastadas pela fase mvel.

CROMATOGRAFIA POR EXCLUSO (CE):

A fase estacionria mais usada um gel de dextrano (um polissacardeo com unidades de glicose), conhecido comercialmente como Sephadex.

4.4. CROMATOGRAFIA LQUIDO-SLIDO: CROMATOGRAFIA POR ADSORO

Baseia-se na adsoro seletiva dos componentes da mistura pela fase estacionria por ao de foras eletrostticas e nas diferentes solubilidades que estes componentes tm na fase mvel. So exemplos: Cromatografia em coluna (CC) e Cromatografia em camada delgada comparativa e preparativa (CCDC e CCDP).

Adsoro e Absoro
Absoro: penetrao de um material na massa de outro por ao molecular ou qumica. A substncia absorvida infiltra-se na substncia que a absorve. Adsoro: adeso das molculas de um material sobre a superfcie de um slido ou lquido em que estas esto em contato. Quanto maior a superfcie do adsorventes mais forte a adsoro.

Escolha do adsorvente e eluente na Cromatografia por Adsoro

1. 2. 3. Pontos a considerar: Caractersticas da amostra O Adsorvente ou fase estacionria O eluente ou fase mvel

Caractersticas da amostra:
1. 2. Acidez, basicidade, carter inico, solubilidade, reatividade com o adsorvente e solventes, Constituio qumica: ligaes duplas, particularmente conjugadas aumentam adsoro. Compostos com pontes de H intramoleculares so menos adsorvidos que seus ismeros. Grupos funcionais aumentam afinidade de adsoro. Este efeito decresce na ordem: COOH, -CONH2, -OH, -NHCOCH3, -NH2, OCOCH3, -COCH3, -NO2, -OCH3, -H, -Cl.

Pontes de hidrognio intramoleculares fazem com que o composto seja menos adsorvido que seu ismero:
H O O OH COOH
2

OH

Com a formao das pontes de H intramoleculares, menos molculas do composto orto (1), relativamente ao para (2) , estaro formando pontes de H com a slica, da maior rapidez na eluio.

Escolha do Adsorvente
COMPOSTOS LIPOFLICOS ADSORVENTES XIDO DE ALUMNIO SLICA-GEL

HIDROFLICOS

CELULOSE CELULOSE COM TROCADORES DE ONS KIESELGUR POLIAMIDA

Principais adsorventes
Slica-gel: Separa bem aldedos, cetonas, alcalides, acares, fenis, esterides, terpenides, cidos graxos e aminocidos. Alumina ou xido de alumnio: til na separao de hidrocarbonetos policclicos, alcalides, aminas, vitaminas lipossolveis e algumas cetonas. Inadequado para flavonides e cetonas insaturadas. Kieselgur (Terras diatomceas ou diatomita). cido silcico de origem fssil. utilizado como suporte nas separaes por partio.

Principais adsorventes
xido de magnsio: Usado para compostos aromticos e substncias com vrias ligaes duplas conjugadas (Ex: carotenides). Celulose e celulose modificada: Para compostos hidroflicos (aminocidos, cidos nuclicos, acares, glicosdeos. Poliamida: Separa flavonides, fenis, nitroanilinas, benzofenonas e derivados de aminocidos.

Escolha da Fase mvel

Sua escolha depende do adsorvente utilizado, sua atividade e da classe de compostos da amostra. Misturas equieluotrpicas: Misturas de solventes distintas que originam iguais deslocamentos de uma mesma amostra.

Ordem crescente da capacidade eluotrpica do solvente

ter de petrleo Hexano Tetracloreto de carbono Dissulfeto de carbono Benzeno Diclorometano Clorofrmio ter dietlico Acetato de etila ter diproplico Propanol MeOH Piridina gua cido Orgnico diludo Fenol

4.4.1. CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD)

Aplicaes: 1. Para determinar o nmero de componentes de uma mistura. 2. Para determinar a identidade de duas substncias. 3. Para monitorar o progresso de uma reao 4. Para determinar a eficincia de uma purificao. 5. Para determinar o melhor sistema de solvente para uma separao em coluna cromatogrfica. 6. Para monitorar uma coluna cromatogrfica.

CCD

UV 254 nm: detecta compostos aromticos, compostos com duplas conjugadas e alguns compostos insaturados.

REVELADORES EM CCD
CLASSE Triterpenos e esterides Flavonides Alcalides Compostos insaturados REVELADOR Reagente de Liebermann-Burchard Soluo de cloreto de alumnio Reagente de Dragendorff Vapores de iodo

DETERMINAO DO MELHOR SISTEMA DE SOLVENTES PARA SEPARAO DE UMA MISTURA.

Deve-se fazer uma srie de placas por CCD em sistemas de diferentes polaridades com a mistura a ser separada. O melhor sistema aquele que d um valor de Rf na faixa de 0,25-0,35 para o componente mais rpido na placa.

CALCULANDO O Rf

solvente 1 solvente Mais lento (lcool) Mais rpido (cetona) Rf lcool Rf cetona 3.95 0.6 1.45 0.15 0.37

solvente 2 3.9 0.35 1.0 0.09 0.26

solvente3 4.0 0.35 1.0 0.088 0.25

solvente 4 4.1 0.25 0.8 0.061 0.20

solvente 5

solvente6 4.0 0.1 0.6 0.025 0.15

solvente 7

4.0 0.1 0.65 0.025 0.16

4.05 0.1 0.45 0.025 0.11

O Rf do componente mais rpido deve estar na faixa de 0.25-0.35. Os solventes 1, 2 e 3 esto nesta faixa. Para uma melhor resoluo a diferena de Rf de cada componente deve ser no mnimo 0,1: solvente 1: Rf cetone - Rf lcool = 0.37 - 0.15 = 0.22 solvente 2: Rf cetone - Rf lcool = 0.26 - 0.09 = 0.17 solvente 3: Rf cetone - Rf lcool = 0.25 - 0.088 = 0.16 Os sistemas 1, 2 e 3 do diferena de Rf superior a 0,1. Escolhe-se o sistema 3 por ser o menos polar.

CROMATOGRAFIA EM COLUNA (CC)

CROMATOGRAFIA EM COLUNA
Pr-eluio

Empacotamento

Carregamento

ELUIO: EXEMPLO DE MONITORAO POR CCD A amostra foi eluda com o sistema de solventes previamente escolhido por CCD. Recolheu-se 6 fraes que foram testadas por CCD.
Eluio

CCD DAS SEIS PRIMEIRA FRAES

Fraes 1 e 2 no tm nenhum componente. Nas Fraes 3, 4 e 5 saiu o primeiro componente, deve-se juntar estas fraes. Pode-se agora aumentar a polaridade do sistema de solvente para sair o segundo componente.

CCD DAS FRAES 7 a 12

Nas fraes 7, 8 e 9 saiu o segundo componente Nas fraes 10 a 12 no saiu mais nada Pode-se encerrar a coluna e juntar 7, 8 e 9.

BIBLIOGRAFIA
COLLINS, Carol H.; Braga, Gilberto L.; Bonato, Pierina S. Introduo a Mtodos Cromatogrficos. 7 ed. Editora da Unicamp. 1997. Degani, A. L. ; Cass, Quezia B; Vieira, P. C. Cromatografia, um breve ensaio. Qumica Nova na Escola, 07, 21-25, 1988.