TCNICAS DE AISLAMIENTO Y MEDIOS DE CULTIVO PARA HONGOS

MI COLOGA GENERAL Y MDICA

Gonzlez Judd Pablo Miguel

Introduccin: Un hongo es en general, un organismo eucarionte hetertrofo unicelular, pluricelular o multicelular cuyas clulas se distinguen por tener una pared celular con el polisacrido quitina. Los hongos constituyen un grupo muy amplio de organismos y suelen clasificarse en 2 reinos. Los llamados hongos verdaderos son aquellos que constituyen el reino Fungi y que tienen las caractersticas antes descritas, otros hongos se clasifican entre los protoctistas y tienen caractersticas especiales. Entre los hongos verdaderos podemos distinguir tres grandes grupos segn su morfologa; a saber: -Hongos filamentosos -Levaduras -Setas

Aunque esta clasificacin no tiene valor taxonmico resulta prctica para agrupar distintos tipos de hongos por sus caractersticas afines. Los hongos filamentosos estn ampliamente distribuidos en la naturaleza y se caracterizan por presentar como unidad estructural unos filamentos formados por una o ms clulas llamados hifas, que al reunirse dan lugar a un conglomerado de nombre micelio. Por su parte las levaduras son hongos unicelulares de clulas ovales o cilndricas normalmente. Tanto los hongos filamentosos como las levaduras son microscpicos, pero al formar colonias grandes (las cuales en un cultivo descienden de una sola clula) pueden apreciarse la simple vista. Las setas por su parte son hongos filamentosos que forman cuerpos fructferos macroscpicos. Los hongos filamentosos, setas incluidas, se consideran organismos talofticos por que tienen un nivel de organizacin ms sencillo que los tejidos, pero ms complejo que las colonias, en la que sus clulas se agrupan sin diferenciarse, pero algunas de ellas si se diferencian, especializndose para la reproduccin, otros organismos talofticos son las algas. Los hongos revisten gran inters cientfico puesto que muchos de ellos producen o participan en la produccin de muchas substancias y bienes tiles al hombre aunque muchos son tambin importantes agentes infecciosos del hombre.

Aislamiento de hongos filamentosos y levaduras: Medios de cultivo: Existen muchos medios de cultivo que propician el crecimiento de los hongos. En general su pH oscila alrededor de 5,4. Este pH es muy adecuado una vez que se ha aislado el hongo, sin embargo, para los aislamientos primarios deben utilizarse medios de cultivo con un pH menor para favorecer el crecimiento de los hongos por sobre el de las bacterias, un pH de 3,5 resulta en general adecuado. Algunos medios propicios para el desarrollo de hongos son: Cuadro 1: Composicin de algunos medios de cultivo usados con frecuencia para cultivar hongos
Agar Czapek Agar Dox NaNO 3 2g KCl 0,5 g Fe 2(SO 4)3 0,05 g K2HPO 4 1g Sacarosa 30 g MgSO 4.7H2O 0,5 g CuSO 4 1 mL. de una solucin al 10% en agua ZnSO 4 1 mL. de una solucin al 10% en agua Agar 15 g H2O destilada 1 L pH 5,6 Esterilizar a 1 atmsfera por 15 minutos. Czapek Agar Papa Dextrosa Infusin de papa 200 g Dextrosa 20g Agar 15 g X X X X Agar Extracto de LevaduraMalta Extracto de malta 20 g Extracto de levadura 2 g Agar X X X X 15 g Agar Extracto de Malta Extracto de Malta 30 g Peptona Micolgica 5 g Agar 15 g X X X X Agar Sabouraud Dextrosa Peptona micolgica g Dextrosa 40g Agar 15 g X X X X 10

NaNO 3 2g KCl 0,5 g Fe 2(SO 4)3 0,05 g K2HPO 4 1g Sacarosa 30 g MgSO 4.7H2O 0,5 g Agar 15 g

X H2O destilada 1 L pH 5,6 Esterilizar a 1 atmsfera por 15 minutos.

X H2O destilada 1L pH 5,6 Esterilizar a 1 atmsfera por 15 minutos.

X H2O destilada 1L pH 5,6 Esterilizar a 1 atmsfera por 15 minutos

X H2O destilada 1L pH 5,4 Esterilizar a 1 atmsfera por 15 minutos.

X H2O destilada 1L pH 5,6 Esterilizar a 1 atmsfera por 15 minutos.

b) Las muestras:

Para los estudios de hongos se toman muestras que se preparan para su estudio segn diversos mtodos por lo general el material blando se agita de forma continua, durante 2 minutos, o ms, en un matraz con perlas de vidrio, o en una licuadora durante 30 segundos, o en un homogeneizador durante 1 minuto, empleando como diluyente una solucin de peptona al 0,1% p/v. El material duro se muele en un molinillo de granos u otros dispositivos adecuados; es comn usar solucin fisiolgica, solucin reguladora de fosfatos o agua destilada para permitir la homogenizacin de la muestra. En los productos secos, o concentrados, debe evitarse el choque osmtico. Para lo cual fin, se diluyen con una solucin de sacarosa o glucosa al 20% p/v. Si se trata de productos salados se emplea un diluyente con 5% p/v de NaCl. Cuando la muestra tiene gran cantidad de azcares y es muy cida, debe diluirse (1+1) con solucin de peptona al 0,1% p/v y ajustar el pH a 3,5 - 4,0, aunque el tratamiento especfico de la muestra depender nicamente de los ensayos a realizar. c) Aislamiento: Cuando lo que se busca es aislar hongos filamentosos , el pH de los medios comerciales (5,4) se puede reducir adicionando cido tartrico al 10% (1 mL por cada 100 mL de medio de cultivo ya estril y a 50 C). Los medios no deben calentarse luego de esta acidificacin pues provocara la hidrlisis del aga r y por lo tanto la prdida de su capacidad para gelificar. Muchos medios adems estn diseados para inhibir el crecimiento de bacterias por lo que estn adicionados de substancias como el rosa de Bengala (2,6 Dicloro 4-Nitroanilina) o antibiticos como Penicilina (50 UI/mL) y Estreptomicina (100 UI/mL). Si se desea favorecer el aislamiento de levaduras se debe alcanzar el pH ptimo mediante adicin de cido clorhdrico o cido fosfrico, no con cidos orgnicos pues muchos inhiben el crecimiento de las levaduras. Se procede de igual forma a como se explic para los hongos filamentosos. Para favorecer el aislamiento de levaduras sobre el de las bacterias se recurre a las mismas substancias que se usan con el mismo fin, en el cultivo de hongos filamentosos, aunque no se utiliza la estreptomicina. Sea cual sea el microorganismo que se desea cultivar se suelen hacer diluciones decimales en agua (a veces en otros agentes como solucin salina) de la muestra de inters para luego tomar un mL. de la dilucin correspondiente y mezclarlo con el medio de cultivo elegido. Para luego incubarlo a 28 C durante 5 das. Aunque tales condiciones de incubacin son las ms comnmente sugeridas, de acuerdo a las condiciones del medio, a las caractersticas ambientales del lugar de origen del

hongo y la tcnica utilizada, se pueden seguir otras recomendaciones, como el colocar las placas dentro de una bolsa de plstico acompaada de un recipiente con agua para evitar la desecacin, durante 3 a 7 das a 28 C en las regiones subtropicales; a 30 C en las tropicales, y a 22 C en las templadas. Diluciones Siembra por puntos (toques) Siembra por estra cruzada (muestra con asa o con hisopo) Siembra masiva EN TUBO O EN PLACA Las placas de medio de cultivo con hongos, a diferencia de aquellas donde se siembran bacterias, no se invierten (salvo en contadas excepciones). Tras el tiempo de incubacin las placas se observan y se analizan los hongos y levaduras que han crecido en las mismas para luego tomar muestras aisladas de una sola colonia que pueden resembrarse en nuevas placas con medio de cultivo. Se deben de descartar para su estudio aquellas placas que tengan ms de 200 colonias, puesto que de estas placas el aislamiento se hace muy difcil y poco certero. Tras incubar las placas con las diluciones de hongos y habiendo contado el nmero de colonias en estas se puede proceder a establecer cultivos puros como se seal ya resembrndolas en nuevas placas con medios de cultivo. Un cultivo puro de levaduras se obtiene dispersando el material tomado de la colonia a estudiar, mediante estras sucesivas sobre la placa de medio. En cambio, un cultivo puro de hongos filamentosos se obtiene por repique de un pequeo manojo de hifas o grumo de esporas en varios puntos de una placa de medio selectivo. En algunos casos esta tcnica no es satisfactoria y entonces conviene hacer una dispersin de esporas sobre la superficie de agar estril. Se toman las esporas del hongo en el cultivo primario y luego se ponen sobre la placa de agar estril. Por lo general es necesario resembrar sucesivamente los hongos de un cultivo puro, para garantizar que efectivamente solo haya un tipo de hongos en este. Tcnicas de enriquecimiento: En ocasiones es preciso potenciar, o amplificar, la presencia de hongos en una muestra, previo a su aislamiento. En esos casos resultan adecuadas las tcnicas de enriquecimiento. El primer paso consiste en incorporar la muestra en un medio lquido que contenga extracto de carne o extracto de levadura y su pH sea 3,7. A continuacin se incuba de 24 a 72 horas a temperaturas entre 25 y 30 C, y del crecimiento obtenido se hacen siembras en medios slidos. Este mtodo sin

embargo no permite a diferencia de la siembra directa en medios slidos, conocer la proporcin real en que se encuentra lo buscado en la muestra. Si se desea aislar levaduras, a partir de muestras muy contaminadas con hongos filamentosos, el desarrollo de estos ltimos se puede restringir por varios mtodos como la exclusin de aire que se logra aadiendo una capa de parafina lquida estril sobre la superficie del medio de cultivo, una vez realizada la adicin de la muestra. Esta capa debe tener un grosor de 1 cm. Se incuba como s e explic previamente, hasta obtener un crecimiento adecuado. Tambin puede aadirse la muestra al medio en un matraz Erlenmeyer de 250 mL. (ej. 10 g de muestra en 90 mL. de medio). Tras lo cual, los matraces se agitan durante un tiempo adecuado (24-72 horas) a las temperaturas ya sealadas. Los hongos filamentosos, en estas condiciones, no generan esporar, sus micelios se agregan en forma de esferas y se ven superados en multiplicacin por las levaduras presentes, que se distribuyen de forma homognea en el medio de cultivo. En general se prefieren los medios de cultivos slidos ya que posibilitan la observacin de las colonias (caracteres macroscpicos). Sin embargo, para el estudio de hongos acuticos el aislamiento debe iniciarse en medios lquidos para lograr una aproximacin a su hbitat.
Referencias : 1. Madigan M.T., Martinko J.A. y Parker J.: Brock Biologa de los microorganismos. Editorial Pearson. Espaa 2009. 2. Harrigan, W.F. y and McCance M.E.: Mtodos de Laboratorio en Microbiologa. Editorial Academia. Len, Espaa. 1968. 3. King A.D.: Methodology for routine mycological examination of food. In Modern Methods in Food Mycology. Samson R.A. et al. Elsevier, Amsterdam. 1992. 4. J.G. y N. Sherman.: Microbiology a Laboratory Manual. Cappuccino Benjamin/Cummings Inc. U.S.A. 1992. 5. http://www.unsa.edu.ar/matbib/hongos/03htextotecnicas.pdf 6. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?Db=pubmed&term=filamentous%20fungus