MTODO DO CIDO DINITROSALICLICO (DNS) MILLER (1959) Utilizado para a quantificao de acares redutores (AR) 1) Reagentes cido dinitrosaliclico

co (DNS); NaOH 2N; Tartarato duplo de Sdio e Potssio (Sal de Rochelle); Glicose ou uma mistura de frutose e glicose (10mM). 2) Metodologia Preparao do reagente DNS Adicionar 50 mL de hidrxido de sdio (NaOH) 2N a 2,5 g de DNS e aproximadamente 125 mL de gua destilada e agitar at dissoluo. Posteriormente, adicionar 75g do sal de Rochelle e completar o volume da soluo para 250 mL. Este reagente instvel na presena de luz e CO2. Obteno da curva padro Conforme Tabela 1, aps adicionar o reagente de DNS, agitar a mistura e levar os tubos ao banho-maria a 100 C durante 5 minutos. Deixar esfriar a temperatura ambiente e completar o volume para 5 mL com gua destilada. Fazer a leitura em =540nm no espectrofotmetro U.V. Tabela 1. Procedimento para obteno da curva padro de acares redutores.
Tubos 1 2 3 4 5 * Volume reacional = 5 mL. Glicose (10 mM) (mL) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 gua (mL) 0,75 0,65 0,55 0,45 0,35 DNS (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 mol de AR 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0

Obs.: Para quantificar AR de um extrato de tecidos convenientemente preparado, pode-se usar at 0,75 mL de alquota e seguir as mesmas recomendaes para a obteno da curva padro.

MTODO DA ANTRONA - YEMM & WILLIS (1954) Utilizado para quantificao de acares solveis totais (AST) 1) Reagentes Reagente Antrona; H2SO4 concentrado; Glicose 60 g/mL ou 0,333 mM. 2) Metodologia Preparao do reagente antrona: Adicionar 40 mg de antrona a 1 mL de gua destilada e aps, 20mL de H2SO4 concentrado. (Este reagente deve ser preparado na hora do uso e sob resfriamento). Obteno da curva padro Conforme Tabela 2, adicionar primeiramente a soluo de glicose e depois o reagente Antrona. Este sistema deve ser mantido em gelo. Agitar os tubos e lev-los ao banho-maria 100C por 3 minutos. Resfriar a temperatura ambiente ou no gelo e fazer a leitura em = 620nm em espectrofotmetro U.V. Tabela 2. Procedimento para obteno da curva padro de acares solveis totais.
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 Glicose (60 g / mL) (mL) 0,0 0,1 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 gua (mL) 1,0 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Antrona (mL) 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 g de AST 0 6 12 24 36 48 60

* Volume reacional = 3 mL.

Obs.: Para quantificao de AST em tecidos vegetais pode-se usar alquotas de at 1,0 mL.

ENSAIO DA NINHIDRINA - YEMM & COCCKING (1955) Utilizado para quantificao de aminocidos 1) Reagentes Tampo citrato de sdio 0,2M, pH = 5,0; Ninhidrina 5% em Metil Celosolve KCN 2% em Metil Celosolve* (2 mL de KCN 0,01M em 100 mL de metilcelosolve); Etanol 60% (v/v); Glicina ou qualquer outro aminocido em concentrao 0,1mol/mL. 2) Metodologia Conforme Tabela 3, aps a adio do padro de aminocidos e dos reagentes A, B e C, agitar e levar ao banho-maria 100C por 20 minutos para desenvolver a colorao. Posteriormente, completar com etanol 60% e agitar novamente. Aps o resfriamento, fazer a leitura em = 570nm no espectrofotmetro U.V. Tabela 3. Procedimento para obteno da curva padro de aminocidos.
Tubos 1 2 3 4 5 6 Glicina (0,1 mol / mL) (mL) 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 gua (mL) 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Reagentes A+B+C (mL)* 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 Etanol 60 % (mL) 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 mol de aa 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10

* A = 0,5 mL; B = 0,2 mL; C = 1,0 mL. ** Volume reacional = 4,0 mL

Obs1.: Em tecidos vegetais seguir o procedimento de extrao mais indicado para cada tecido e, posteriormente, usar alquotas de at 1,0 mL de extrato. Obs2.: Os reagentes, quando guardados separadamente e de modo adequado, podem ser armazenados por at 30 dias.
* Metil celosolve = Etileno glicol monometil ter

MTODO DE BRADFORD (1976) Utilizado para quantificao de protenas totais 1) Reagentes: Comassie Blue G-250, H3PO4 e etanol; Soro Albumina Bovina (BSA) (1mg/mL ou 10 g/0,1mL). 2) Metodologia Preparao do reagente Comassie-blue G-250 Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95%. Adicionar 100 mL de H3PO4 85% e completar para 1 L. Deixar 12 horas agitando em overnight e filtrar. Dessa forma, as concentraes finais sero: 0,01% de Comassie, 8,5% de cido fosfrico e 4,7% de etanol. (cido fosfrico deve ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol e nunca o contrrio). Procedimento para obteno da curva padro Proceder conforme Tabela 4. Aps, agitar os tubos em vrtex e fazer a leitura no espectrofotmetro U.V. em = 595 nm. Tabela 4. Procedimento para obteno da curva padro de protenas utilizando-se como padro BSA 1 mg/mL.
Tubos 1 2 3 4 5 6 BSA (1 mg / mL) (mL) 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 gua (mL) 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 Comassie Blue G-250 (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 g de protena 0 20 40 60 80 100

* Volume reacional = 5,1 mL

Erros de pipetagem podem ser minimizados utilizando-se alquotas de 0,1mL retiradas de solues de 20, 40, 60, 80 e 100 g de BSA/0,1mL. Se assim for, a curva seguir o padro mostrado na Tabela 5.

Tabela 5. Procedimento para obteno da curva padro de protenas utilizando-se como padro solues diludas de BSA.
Tubos 1 2 3 4 5 6 * Volume reacional = 5,1 mL BSA (X g / 0,1 mL) (mL) 0,1 de H2O 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 Comassie Blue G-250 (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 g de protena 0 20 40 60 80 100

Obs 1: A quantificao de protenas em extratos vegetais pode ser feita usando-se volumes iguais do extrato e de TCA (10%) que posteriormente deve ser centrifugado e o pellet ressuspendido com NaOH 0,1N. Aps, retirar uma alquota de 0,1mL e proceder conforme recomendaes da curva padro.