BACULOVRUS COMO VETOR PARA

EXPRESSO DA GLICOPROTENA DO VRUS DA RAIVA EM CLULAS DE INSETO E DE MAMFERO E ANLISE TRANSCRICIONAL DE CLULAS INFECTADAS COM VRUS DA DENGUE

Greice Kelly Menezes Martins Defesa de dissertao de mestrado em Patologia Molecular Orientador: Prof. Dr. Bergmann Morais Ribeiro

INTRODUO GERAL

OMS: Doenas tropicais negligenciadas.

frica subsaariana, sia e Amrica Latina. y 1 bilho de pessoas no mundo.
y

Dengue Malria Chagas Leishmaniose Esquistossomose Hansenase Oncocercose Filariose Tuberculose + Raiva

Brasil,2009.

CAPTULO 1
Construo de um vetor viral para a expresso da glicoprotena da raiva em clulas de inseto e de mamfero

BACULOVRUS

Vrus de artrpodes:
y

Lepidoptera, Diptera, Hymenoptera.

Controle biolgico. Genoma: dsDNA, 80-180kb. Espcie tipo: AcMNPV Famlia: Baculoviridae Gneros:
y

Alphabaculovrus: NPV de lepidpteros.

Poliedros (PIB): 0,15-15m. SNPV x MNPV Grnulo: 0,3-0,5m.

Betabaculovrus: granulovrus de lepidptera.

y y

Gammabaculovrus: SNPV de himenpteros. Deltabaculovrus: NPV de dpteros.

FENTIPOS VIRAIS
Budded virus Oclusion derived virus

http://www.cheque.uq.edu.au/reaserch/bioengi neering/research/Baculovirus/Baculo2

Ribeiro et al, 2008.

INFECO IN VIVO

Slack & Arif, 2007.

INFECO IN VIVO

Slack & Arif, 2007.

REGULAO DA EXPRESSO GNICA

Fase precoce imediata: 20 min.

y

Fatores de transcrio. Rearranjo do citoesqueleto e cromatina dispersa. Incio da replicao do DNA viral; Protenas de BV; Desligamento da expresso das protenas do hospedeiro. Poliedrina.

Fase precoce: at 8hpi

y

Fase tardia: at 24hpi

y y y

Fase muito tardia incio:18hpi

y

BACULOVRUS COMO SISTEMA DE EXPRESSO

Expresso de protenas heterlogas. Lcus da poliedrina. Obteno do vrus recombinante:

Recombinao homloga. y Transposio: Bac to bac.

y

Manual Baculogold, BD Biosciences.

BACULOVRUS E CLULAS DE MAMFEROS

Controle biolgico e expresso heterloga. Biossegurana; Efeitos citopticos; Replicao; Transduo em clulas de mamferos: expresso de protenas heterlogas; Expresso de genes virais:
y

Fatores de transcrio.

Produo de Ab anti-baculovrus; Vacina e terapia gnica.

Kost & Condreauy, 2002.

VERSATILIDADE DOS BACULOVRUS

Kost et al, 2007.

RAIVA
Encefalite aguda. bito em quase todos os casos. Transmisso: saliva de animal infectado.

Brasil, 2008.

EPIDEMIOLOGIA

Setenta mil mortes por ano.

OMS, 2010.

RAIVA HUMANA NO BRASIL

1980- 2011: 157 casos

y y y y

39% regio norte; 54% regio nordeste; 6% regio sudeste; 1% regio centro-oeste.

Um caso de cura em 2008:

y

Jovem de 15 anos, em Recife.

RABIES VIRUS

Classificao:
Famlia: Rhabdoviridae; y Gnero; Lyssavirus.
y

Vrion: 130-200nm.

Rupretch, 1996.

RABIES VIRUS

ssRNA (-)

y y

RNA polimerase

Modificaes ps-transcricionais.

Nucleoprotena: encapsidao do genoma viral; y Fosfoprotena: co-fator da RNA polimerase viral; y Matriz: reveste o ribonucleocapsdeo; y Glicoprotena (GPV)
CDC, 2011.

GLICOPROTENA

PS

Ec

TD

CD

60kDa (524aa), trmeros Protena viral imunognica:

y y

Gerao de anticorpos neutralizantes; Alvo de clulas T auxiliares e T citotxicas. Ligao dos virions superfcie celular; Entrega do nucleocapsdeo:

Adsoro entre vrus e clula:

y y

Fuso do envelope viral com a vescula ensossomal.

Brotamento viral Disseminao transinptica do vrus

PATOLOGIA

Replicao viral:
Local: clulas musculares e subepiteliais y Terminaes nervosas perifricas:
y

Receptor nicotnico de acetilcolina Transporte clula a clula

y y

Sistema nervoso central:

Replicao em diversos rgos e glndulas salivares. Regio atingida X sintomas.

Manifestaes clnicas:
y

Perodo de incubao: at 50 dias.

Concentrao do inculo viral; y Local do ferimento.
y

PROFILAXIA E TRATAMENTO

Pr-exposio: vacinao
y

Fuenzalida & Palcios:

Vrus inoculado em crobro de camundongos neonatos e inativado por betapropiolactona. Reaes adversas: cefalia e dores locais (humanos), anorexia, choque anafiltico e hemorragia (animais).

PVCV (Puried Vero Cell Rabies Vaccine):

Cultura de clulas Vero; Utilizada no Brasil apenas em humanos.

Ps-exposio:
y y

Imunizao ativa: vacina.

Cinco doses, vacina produzida em cultura de clula. Local e profundidade da leso.

Imunizao passiva: soro.

IMPACTO ECONMICO

Gastos mundiais com profilaxia e tratamento:

y

> 1 bilho de dlares.

Raiva em herbvoros rurais:

50.000 mortes/ano na Amrica do Sul. y Prejuzo econmico no Brasil: > 2 milhes de reais/ano.
y

Brasil, 2010.

OBJETIVOS
Expresso da GPV sob o comando do promotor immediately early do citomegalovrus (CMV) em clulas de insetos (Sf21 e TN5B), e clulas de mamferos (HepG2, HuH7 e HeLa).

METODOLOGIA E RESULTADOS

TN7L SV40
NotI (6762)

F1 ori

BglII 0,7kb

NdeI (6373)

NotI Amp (R)

pCMV
1127bp

GPV
NdeI (5654)

GPV
1575
7447 bp

pFastBac1CMV GPV

pUC ori

pCMV/GPV
1,2kb
CMV
NdeI (4425)

5,5kb
TN7R Genta (R) pPolh

SISTEMA BAC-TO-BAC

Manual Bac to Bac, Invitrogen.

OBTENO DO BACMDEO

2230bp

OBTENO DO VRUS

3kb

pCMV 1127bp

GPV 1575

EXPRESSO DA

GPV EM CLULAS SF21

M: Benchmark 1: Sf21 mock 2: Sf21 + AcCMVGPV 3: Sf21 + AcMNPV

TRANSDUO DE CLULAS HELA

AcCMV-GPV :
y y

Sf21. Titulao: diluio seriada. MOI = 100. Incubao com o vrus: 8h. Coleta das clulas: 48h. Clulas tripsinizadas, lisadas e sonicadas.

105 clulas foram transduzidas com o vrus.

y y y y

EXPRESSO DA

GPV EM CLULAS HELA

M: Benchmark 1: HeLa mock 2: HeLa+ AcMNPV 3: HeLa + AcCMVGPV

ANLISE TRANSCRICIONAL

Clulas HeLa transduzidas com o vrus AcCMVGPV ou com o vrus selvagem:

Extrao RNA total; y RT-PCR (T1, T2 e RT-GPVF); y Restrio XhoI
y
XhoI
GPV_RT 1162 172 262

GPV
1575

SV 40

M: 100bp DNA ladder 1: HeLa+ AcCMVGPV 2: HeLa+ AcCMVGPV + XhoI 3: HeLa+ AcMNPV 4: HeLa+ AcMNPV + XhoI 5: HeLa mock 6: HeLa mock+ XhoI

MICROSCOPIA DE FLUORESCNCIA

Clulas HepG2 transduzidas com o vrus AcCMVGPV

Coletadas 48 h ps transduo y Marcadas: anti-RV, anti-coelho-Alexa 488
y

Zeiss Axiovert 200, 100X. A. HepG2 + AcCMVGPV B. HepG2 + AcMNPV C. HepG2 mock

QUANTIFICAO POR ELISA

Clulas HuH-7 transduzidas;

y

60 h ps transduo: tripsinizadas e lisadas.

25 20 15 10 5 0
C N PV A cM N A cC M VG PV

Concentrao de GPV (ng/mL)

DISCUSSO

Vacinas atuais:
y y y y

Fuenzalida-Palcios; PDEV (embrio de pato); PVCV (clula Vero); Raboral V-RG: vacnia virus recombinante expressando GPV.

Expresso eficiente da GPV em clulas de inseto e mamfero:

y

Atividade do pCMV em clulas de inseto (Sinclair, 1987);

Expresso heterloga de GPV:

E. coli (Yelverto et al, 1987); Levedura (Klepfer et al, 1993); Tomate (McGarvey et al, 1995); Tabaco (Ashraf et al, 2005); Sf21 (Prehaud et al, 2004); Drosophila (Lemos et al, 2009).

GLICOSILAO N-LIGADA

Kost, Condreauy & Jarvis, 2005.

GLICOPROTENAS EM CLULAS DE INSETO

Glicoprotena E2 do vrus da peste suna clssica

y

Bayovac CSF E2 (Depner et al, 2001).

Hemaglutinina de H1N1, H3N2 e influenza B

y

FluBlok (Cox, 2008).

Glicoprotena do corona vrus (Bisht et al, 2005). Glicoprotena B do pseudorabies virus (Xhuan et al, 1995).

BACULOVRUS COMO VETOR DE

EXPRESSO EM CLULAS DE MAMFERO

Glicoprotena do corona vrus (Bai et al, 2007):

y y y

Promotor CMV; Clulas BHK; Resposta humoral e celular.

Glicoprotena B do pseudorabies virus (Aoki et al, 1999):

y y y

Promotor CAG; Clulas BHK e CPK; Produo de anticorpos neutralizantes

CONCLUSES E PERSPECTIVAS

Produo eficiente da glicoprotena heterloga; Testes in vivo; Desenvolvimento de uma potencial vacina contra raiva:
y y

Segurana: cultura de clulas. Custos:

Cultura de clula de insetos Sem purificao proteica

Uso animal x uso humano.

Immunological effects of budded virus (BV) and polyhedra inclusion boodies (PIB) of two baculoviruses (AcMNPV and AgMNPV) by stimulation of mice in vivo and in vitro

Baculovrus selvagens inoculados por via IN:

A influncia dos baculovrus na fisiologia normal do pulmo; y A influncia dos baculovrus na ativao de clulas imunolgicas in vitro.
y

Resultados:
Leve reao inflamatria sem produo de citocinas no pulmo de camundongos; y Sem alteraes na estrutura do pulmo; y Pouco aumento de migrao celular; y Sem ativao de fagocitose.
y

CAPTULO 2
Estudo da transcrio gnica em clulas de mosquito C6/36 infectadas por um arbovrus (Dengue)

DENGUE
Dengue vrus Picada da fmea de mosquitos do gnero Aedes.
y

Intestino Mdio

Ae. aegypti e Ae. albopictus.

Perodo de incubao extrnseco: 7-15 dias

/

Hemolinfa

Hemcitos

Tecidos diversos

Glndula Salivar

EPIDEMIOLOGIA

Amrica do Sul em 2010: 957.093 casos clnicos e 382 mortes. Brasil em 2010: 940.013 casos clnicos e 367 mortes

2,5 bi de pessoas vivem em reas de risco.

OMS, 2010.

DENGUE VRUS

Dengue virus (DENV):

Flaviviridae, Flavivirus y Icosadrico, 30-40nm
y

Genoma ssRNA(+) ~11kb

Protenas estruturais y Protenas no estruturais
y

4 sorotipos
DENV-1 y DENV-2 y DENV-3 y DENV-4
y

Van Regenmotel et al, 2000.

MANIFESTAES CLNICAS

Dengue clssica

Dengue hemorrgica

O VRUS NO INSETO
Infeco persistente; Efeitos deletrios; No um vrus de inseto; Sistema imune de insetos:
y

DENV no mosquito:
y

Disperso do vrus no corpo do mosquito:

Sistema traqueal.

Ligao do vrus clula C6/36:

Imunidade inata:
Tecido adiposo Hemcitos Peptdeos antimicrobianos; Fagocitose e encapsulao; RNAi

Protena de 48kDa.

Movimento do vrus clula-clula:

Protena C189.

LACEN-DF

OBJETIVOS
Analisar a expresso gnica de clulas C6/36, TN5B e UFL-AG antes e depois de uma infeco por dengue vrus, sorotipo 1.

HIBRIDIZAO SUBTRATIVA

Genes diferencialmente expressos sob diferentes condies; Isolamento, sequenciamento e compreenso da resposta biolgica; Tcnica:
y

Enriquecimento e deteco de uma populao de mRNA; Conhecimento prvio das seqncias.

Anlise representativa diferencial (RDA).