Universit Abou Bekr Belkad Tlemcen

Enseignants : A.Bedrane & F.Lahfa

Isolement des lipoprotines sriques

1-isolement des lipoprotines srique : A dfaut dultracentrifugation qui est la mthode de rfrence, nous pouvons isoler les fractions lipoprotiques, par des mthodes de prcipitation slective. Ces mthodes permettent nanmoins disoler ltat pur les lipoprotines sriques. Ractif : Srum humain (animal), clair ou lactescent, spar aprs rtraction spontane du caillot ou centrifugation 4000/tmin pendant 5min. le srum est recueilli sur tube hmolyse aprs sacrifice de lanimal (rat ou souris) par dcapitation. Solution de phosphotungstate de soude 4% ; PH 7,5-7,6. A 4g dacide phosphotungstique (P2O5 24WO3+X H2O; P.M anhydre 5708) ; on ajoute environ 15 cmdune solution de soude normale et lon complte 100cm3 avec de leau distille ; ajuster le PH. Solution de Mg Cl2 2M ; 40,6g de Cl2 Mg 6 H2O dans leau distille ; volume 100 cm. Lacide phosphotungstique est un htropolyacide inorganique qui possde, comme les polysaccharides sulfats, des groupes polaire forte charge lectrongative, et exerce une activit de type hparinique. 2-mode opratoire : En prsence de Mg Cl2 0.1M, le phosphotungstate, la concentration de 2 environs (2 cm de srum+ 0.1cm dune solution de Mg Cl2 2M), flocule instantanment les B lipoprotines qui se dposent au fond aprs centrifugation (10min, 6000t/min). Le surnageant clair (PH 7.6 environ) est dpourvu de B- lipoprotines. Pour sparer les lipoprotines, il est ncessaire de centrifuger dans les minutes qui suivent ladjonction de phosphotungstate ; en cas de centrifugation plus tardive le prcipit ne se dpose pas. En prsence de Mg Cl2 0.1M, le phosphotungstate, la concentration de 0.05% (0.1ml de srum+5l de MgCl2 2M+ 1.2l de phosphotungstate 4%) (Tableau). Aprs centrifugation (10min, 6000t/min), le sous-nageant parfaitement clair renferme les et B lipoprotines. Les VLDL floculent la surface du tube. En cas de srum lipmique, les chylomicrons floculent galement. Tableau rcapitulatif Ractif Phosphotungstate 4% MgCl2 2M Chylomicrons+VLDL 0.05% 0.1M LDL 0.2% 0.1M HDL 2% 0.2M

Le prcipit spar spar partir dun volume donn du srum se dissout dans 1/10 de NaCl 4% de ce mme volume (1/20 doxalate de sodium 0,1M ; citrate de sodium 0.2M).

Electrophorse sur actate de cellulose 1-Principe : Llectrophorse est une mthode danalyse (identification et dosage) et de fractionnement, base par la migration diffrentielle de particules, charges lectriquement sous linfluence dun champs lectrique. Les particules charges peuvent tre des macro ions ou macromolcules (protines, lipoprotines etc.), qui peuvent tre spares par diffrence de vitesse de transport.

2-Accessoires ncessaires : Alimentation : chambre dlectrophorse, kit applicateur, micropipette, bacs de coloration et portoir Ractif et consommables : -plaques dactate de cellulose. -solution tampon Vronal-Vronal sodique (PH 8.4) et force ionique I=0.05 mol/l. -colorant lipidique O.R.O (oil-Red O). Dissoudre 7mg de colorant (ORO) dans 50cm3 de mthanol (Solution A) -solution B : environ 5min avant la fin de la migration, 35 cm de la solution A, on ajoute 10 cmde NaOH 1N. -papiers buvards. -ponts papier. 3-technique : Les bandes actate sont imprgnes de tampon par flottation, puis immersion pendant environ 20mn. La cuve est remplie en ajustant le tampon au mme niveau dans les deux compartiments. Le dpt est fait du cot cathodique. On dpose 2l de lchantillon sur une bande de 25mm de large, laide dun applicateur constitu de deux fils mtalliques. A dfaut on utilise une technique plus ancienne, laide dune micropipette par un mouvement de va et vient ou par une lame de microscope. Migration pendant 20min 180V. Rvlation : Aprs la migration la bande actate est imprgne pendant environ 35 40 min dans la solution B (colorant lipidique). Remarque : Organiser votre TP de faon synchroniser les diffrentes manipulations. Donc, au moment de la migration des fractions lipoprotiques, prparer le dosage des protines sriques .la lecture au colorimtre peut tre effectue au moment de la rvlation des lipoprotines au colorant O.R.O.

Dosage quantitatif Mthodes spectrophotometriques Dosage des protines par la mthode de biuret *Partie thorique : Les mthodes spectrophotometriques du dosage des substances se basent sur la loi de Beer-Lambert. Selon laquelle la concentration de la solution dune substance colore est proportionnelle sa densit optique. La densit optique cest la capacit dune solution dabsorber la lumire donde dtermine qui passe travers elle. La loi de Beer-Lambert sexprime sous forme intgre par la relation : E=log Io/I=.C.L O I0 est lintensit de la lumire incidente, I lintensit de la lumire transmise, le coefficient dabsorption molaire (en litre par mole-centimetre), C-la concentration molaire du solut absorbant, et L-la longueur du trajet option dans la solution (on la fixe arbitrairement 1 cm).lexpression log est appele absorbance ou extinction ou densit optique(E). Toutes choses gales par ailleurs en a dons une relation linaire entre la concentration, du chromophore et de la densit optique lue sur le spectrophotomtre ou colorimtre, pour raliser en pratique un dosage quantitatif spectrophomtrique dun chromophore il suffit de tracer la courbe de la densit optique en fonction de la concentration (E=f(C)) en effectuant plusieurs mesures de E au spectrophotomtres avec des solutions du chromophore diffrentes concentrations connues. Chaque lecture comprend un ajustage au zro en densit optique sur un tube tmoin, puis une mesure sur le tube de dosage .lajustage du zro a pour but dliminer labsorption aux composants qui accompagnent le chromophore dans la solution tudie. Les protines dans leur majorit ne sont pas colores cest pourquoi leurs solutions nabsorbent pas dans le spectre visible .les protine ont un maximum dabsorption 280 nm du a labsorption des acides amins possdant des noyaux aromatiques : Tyrosine, tryptophane et phnylalanine. La mesure de labsorption de la lumire 280 nm au spectrophotomtre est un moyen

extrmement rapide de mesure de la concentration protique dune solution .Parceque labsorption 280 nm dpend uniquement de la teneur des acides amins aromatiques il faut lemployer avec prcaution. En ragissant avec Cu en milieu basique les protines donnent un complexe color, (violet). Au moyen de cette raction (raction du biuret) on tablit une procdure de dosage spectrophotomtrique des protines. Dans cette partie on va dterminer la concentration des protines dans le srum sanguin en employant la mthode du biuret. On dispose. Dne solution du biuret :on dissout 1.5g de CU,5 H2Oet 6.0g de sel de seignette dans 500 ml de H2O .on ajoutant 300 ml de solution de soude 10% et 2g de KI en suite on ajoute H2O pour obtenir un volume final de 2 litres. Solution-mre dalbumine-10mg/ml Solution protique la concentration inconnue 15 tubes, 2pipettes 2 ml, 2 pipettes 10ml tablissement de la courbe dtalonnage. On prpare dabord une gamme de solution talons de concentration 2 mg/ml, 4mg/ml, 6mg/ml, 8 et 10 mg/ml partir de la solution mre dalbumine. Pour chaque dilution la raction de formation de complexe color du biuret sera conduite de la manire suivante : dans trois tubes essai mlanger 2ml de la solution protique tudie et 8ml de solution du biuret. Bien agiter, laisser les tubes pendant 30min la T ambiante. Faire ensuite les mesures de densit optique au spectrophotomtre 540nm contre un tube tmoin, qui contient au lieu de la solution protique un volume quivalent deau. Dtermination de la concentration des srums sanguins. Appliquer la mme procdure de manipulation que pour les solutions de concentrations connues, lire la densit optique et dtermine la concentration de protines en utilisant la courbe dtalonnage. Trouver le pourcentage des protines dans le srum sanguin.