MIKROBIOLOGIA OGLNA

WICZENIA DLA STUDENTW II ROKU

WERSJA DUA

INSTYTUT MIKROBIOLOGII
WYDZIA BIOLOGII UNIWERSYTET WARSZAWSKI

2006

SPIS TRECI

I. REGULAMIN PRACOWNI II. WICZENIA wiczenie 1. Przygotowanie i jaowienie szka i podoy Podstawowe techniki mikrobiologiczne wiczenie 2. Izolowanie drobnoustrojw z rnych rodowisk naturalnych Izolowanie czystych kultur wiczenie 3. Wzrost hodowli bakteryjnej wiczenie 4. Formy morfologiczne bakterii wiczenie 5. Budowa komrki bakteryjnej wiczenie 6. Metabolizm bakterii rda wgla, azotu i energii wiczenie 7. Metabolizm bakterii procesy oddechowe wiczenie 8. Koniugacja u bakterii wiczenie 9. Podstawowe techniki pracy z bakteriofagami wiczenie 10. Analiza mikrobiologiczna wody III. KRTKA CHARAKTERYSTYKA BAKTERII STOSOWANYCH NA WICZENIACH IV. ADDENDUM Opis kolonii bakteryjnych V. ZALECANA LITERATURA

2 3

3 7 11 13 15 17 21 24 27 30 32 36 36

I. Regulamin pracowni

1. W pracowni obowizuje noszenie fartucha ochronnego (najlepiej biaego). 2. Na stoach laboratoryjnych mog znajdowa si wycznie materiay potrzebne do wykonywania wiczenia. 3. W pracowni zabronione jest spoywanie posikw oraz palenie tytoniu. 4. Naley zachowa daleko idc ostrono przy pracy z materiaem mikrobiologicznym: a) stosowa si do zasad pracy jaowej (zachowa szczegln ostrono przy pracy w bezporednim ssiedztwie pomienia palnika); b) hodowle bakteryjne w probwkach wstawia do statyww (nie wolno ich ka na stole); c) kad posian prb dokadnie opisywa (rodzaj posiewu, inicjay osoby wykonujcej posiew, data itp.); d) po skoczeniu posieww wyarza ezy, opala gaszczki, a pipety wkada do specjalnych pojemnikw. 5. Po zakoczeniu pracy naley posprzta st laboratoryjny, niepotrzebny ju sprzt odoy na miejsce, pozostawi w porzdku mikroskop. 6. Niepotrzebne hodowle drobnoustrojw oraz szko uywane w trakcie pracy naley odoy do specjalnie przygotowanych pojemnikw, po uprzednim usuniciu wszelkich napisw, i zanie do zmywalni. 7. Nie wolno wynosi z pracowni adnych hodowli bakteryjnych i preparatw bez pozwolenia. 8. Po zakoczeniu pracy naley sprawdzi, czy zosta wyczony gaz oraz uywana aparatura nie przeznaczona do pracy cigej. 9. Przed wyjciem z sali naley umy rce. 10. W razie jakichkolwiek problemw naley niezwocznie zgosi si do osoby prowadzcej zajcia.

wiczenie 1 Temat: Przygotowanie i jaowienie szka i podoy Podstawowe techniki mikrobiologiczne I. Wprowadzenie Obiektem bada w mikrobiologii s mikroskopijnej wielkoci organizmy wystpujce powszechnie we wszystkich rodowiskach naturalnych. Badanie tych organizmw w naturalnych warunkach bytowania jest jednak z wielu wzgldw bardzo trudne, a czsto niemoliwe. Poznanie morfologii, fizjologii, wymaga pokarmowych i rodowiskowych drobnoustrojw stao si realne dziki stworzeniu sztucznych rodowisk do ich hodowli - tzw. podoy (poywek) mikrobiologicznych. Umoliwiy one hodowanie drobnoustrojw w warunkach laboratoryjnych i uzyskanie czystych kultur - tzn. hodowli stanowicych potomstwo jednego osobnika i bdcych materiaem do bada mikrobiologicznych. Podoa mikrobiologiczne s to mieszaniny odpowiednio dobranych skadnikw odywczych, dostarczajcych hodowanym na nich organizmom niezbdnych pierwiastkw chemicznych oraz rda energii. Kade podoe musi mie odpowiedni dla danego gatunku warto odywcz, odpowiednie pH i rH oraz odpowiedni warto osmotyczn. Wane jest rwnie okrelenie do jakiego celu ma suy dane podoe - czy chodzi nam tylko o uzyskanie hodowli, czy o wyselekcjonowanie jakiego okrelonego gatunku, czy te o zrnicowanie gatunkw wystpujcych w mieszaninie. Zalenie od potrzeby moemy zastosowa podoe minimalne lub pene, podoe selekcyjne lub te rnicujce. Jednym z koniecznych warunkw, jaki musz spenia wszystkie podoa, jest ich sterylno, co oznacza, e musz by pozbawione wszelkich organizmw - zarwno ich form wegetatywnych jak i przetrwalnych. Proces sterylizacji mona przeprowadzi dwiema drogami: - przez zabicie drobnoustrojw i ich form przetrwalnych w danym rodowisku w wyniku dziaania: (a) wysokiej temperatury - suszarka, autoklaw, aparat Kocha; (b) promieniowania UV, , , X; (c) zwizkw chemicznych - tlenek etylenu lub propylenu; - przez usunicie drobnoustrojw i ich form przetrwalnych z danego rodowiska (filtracja). Wybr metody sterylizacji zaley od rodzaju sterylizowanego podoa (rodowiska) a take od wyposaenia laboratorium; naley wybra metod nie niszczc podoa a skuteczn, moliwie szybk i tani. Pamita naley, e w pracowni mikrobiologicznej sterylizujemy wszystko, czym moglibymy zakazi badan hodowl drobnoustrojw. 1. Zasady przygotowywania pod Przygotowujc podoa naley: a) uywa szka odpowiednio wymytego i wypukanego; b) przestrzega cile przepisw przygotowania poywek (odwaa dokadnie skadniki, zwraca uwag na kolejno ich dodawania i na uwodnienie soli); c) uywa tylko wody destylowanej; d) ustawia odpowiednie pH podoa, pamitajc o tym, e po jaowieniu w autoklawie pH moe si obniy; e) do jaowienia rozlewa podoe do kolb do objtoci nie wikszej ni 3/4 naczynia, aby nie wykipiao w czasie jaowienia; f) kolby zatyka korkami z waty, zabezpiecza korki przed zamoczeniem foli aluminiow i odpowiednio podpisywa; g) stosowa moliwie najnisz temperatur do jaowienia.

4 2. Sposoby sterylizacji 2.1. Jaowienie szka w suszarce a) Odpowiednio zapakowane szko uoy luno w suszarce, aby umoliwi swobodne krenie powietrza. b) Wczy ogrzewanie. Czas sterylizacji liczy od momentu osignicia odpowiedniej temperatury: przy 160oC - 2 godz., przy 180oC - 1 godz. (nie wolno przekracza temp. 180oC, gdy grozi to zwgleniem papieru i waty). 2.2. Jaowienie w autoklawie Temperatura 100oC nie zabija form przetrwalnych i niektrych wirusw. Wysz temperatur wrzenia wody mona osign po zastosowaniu nadcinienia. W autoklawie - hermetycznie zamknitym kotle - stosujc nadcinienie 1 atm, uzyskuje si atmosfer nasyconej pary wodnej o temp. 121oC. W tej temperaturze wszystkie mikroorganizmy i ich przetrwalniki zostaj zabite w cigu okoo 30 min. Czas trwania sterylizacji w autoklawie zalee bdzie od rodzaju jaowionego materiau i jego objtoci. W autoklawie jaowi si podoa (oprcz tych, ktre rozkadaj si w tej temperaturze), sl fizjologiczn, bufory, wod destylowan, narzdzia chirurgiczne, opatrunki. Nie sterylizuje si tu stonych roztworw cukrw oraz substancji atwo hydrolizujcych. 2.3. Jaowienie w aparacie Kocha (tyndalizacja) W aparacie Kocha sterylizuje si substancje, ktre ulegaj rozkadowi w temp. powyej 100oC. Tyndalizacja polega na trzykrotnym ogrzewaniu jaowionego podoa w temp. 100oC przez 30 min, co 24 godz. W czasie pierwszego ogrzewania zabite zostaj formy wegetatywne, a przetrwalniki zostaj zaktywowane do kiekowania, w wyniku dziaania wysokiej temperatury i obecnoci pewnych zwizkw organicznych. Proces ten jest moliwy dziki pozostawieniu jaowionego materiau w temp. pokojowej przez okoo 24 godz. Nastpne ogrzewanie zabija kiekujce przetrwalniki (ktre utraciy ciepooporno). Trzecie ogrzewanie zabija ewentualne formy wegetatywne powstae po opnionym kiekowaniu. Poniewa tyndalizacja opiera si na zjawisku kiekowania przetrwalnikw, stosowa j moemy tylko do substancji umoliwiajcych ten proces, a wic zawierajcych okrelone zwizki organiczne. W ten sposb jaowi si stone roztwory cukrw, witamin, aminokwasw, itp. 2.4. Jaowienie przez filtracj Filtracja pozwala na jaowienie pynw, ktre ulegaj rozkadowi pod wpywem ciepa (np. roztwr mocznika, surowica ). Polega ona na przepuszczaniu jaowionego pynu przez filtr o okrelonej wielkoci porw przy zastosowaniu nad- lub podcinienia. Filtr zatrzymuje bakterie na zasadzie mechanicznej i/lub fizyko-chemicznej. Filtry i oprawki do filtrw naley przed uyciem wyjaowi (na og w autoklawie); sterylne musi te by naczynie, do ktrego filtrujemy jaowy pyn. Do jaowienia niewielkich iloci pynu bardzo wygodne s wysterylizowane filtry jednorazowe.

5 3. Przygotowanie bulionu odywczego, agaru odywczego i 20% roztworu glukozy oraz ich jaowienie 3.1. Bulion odywczy Skad: bulion w proszku woda destylowana 15 g 1000 ml

a) Bulion w proszku wsypa do kolby, wla wod, rozpuci mieszajc. Sprawdzi pH podoa przy pomocy papierka wskanikowego - powinno wynosi 7,2 - 7,4. b) Cz bulionu rozla po okoo 200 ml do 3 kolb o pojemnoci 300 ml. Kolby zatka korkami z waty i zabezpieczy przed zamokniciem foli aluminiow. c) Jedn kolb jaowi w autoklawie przy nadcinieniu 1 atm przez 30 min, drug w aparacie Kocha (3 razy po 30 min. co 24 godz. - tyndalizacja), trzeci pozostawi bez jaowienia. d) Pozostay bulion zuy do przygotowania agaru odywczego. 3.2 Agar odywczy Skad: bulion odywczy agar-agar w proszku 200 ml 4g

a) Do kolby o pojemnoci 300 ml odway 4 g sproszkowanego agaru i wla 200 ml przygotowanego bulionu odywczego. b) Kolb zatka korkiem z waty, zabezpieczy foli aluminiow. c) Jaowi w autoklawie przy nadcinieniu 1 atm przez 30 min. Kady student przygotowuje sobie 200 ml agaru odywczego na nastpne wiczenia. 3.3. 20% roztwr glukozy a) Przygotowany 20 % roztwr glukozy w wodzie destylowanej rozla do 3 probwek po okoo 5 ml. b) Jedn probwk wyjaowi w aparacie Kocha (tyndalizacja), drug w autoklawie przy nadcinieniu 1 atm przez 30 min, trzeci pozostawi bez jaowienia. Zaobserwowa zmian barwy roztworu po wyjaowieniu w autoklawie. 4. Zapoznanie si z technik pracy sterylnej i sposobami posiewu bakterii 4.1 Technika pracy sterylnej a) Dezynfekcja stow laboratoryjnych za pomoc sterinolu lub alkoholu etylowego. b) Praca w bezporednim ssiedztwie pomienia palnika. c) Wyarzanie ez i opalanie gaszczek. 4.2. Praktyczne zastosowanie poznanych technik i metod posiewu bakterii a) Przestrzegajc zasad pracy sterylnej rozla do 3 probwek po 2 ml jaowego bulionu. Po tygodniu sprawdzi jaowo bulionu we wszystkich 4 probwkach (rwnie w tej, z ktrej pobierany by bulion). b) Otrzyman hodowl bakteryjn wysia ez wedug wskazwek asystenta: - na skos z agarem odywczym; - na pytk z agarem odywczym - posiewem redukcyjnym (p. rysunek 1).

Rys. 1. Posiew redukcyjny. (1) pocztek linii posiewu; (2) i (3) miejsca, w ktrych przerywa si posiew i opala ez w celu usunicia nadmiaru materiau. III. Zagadnienia do opracowania 1. Jakie parametry naley uwzgldni przy sporzdzaniu podoa mikrobiologicznego? 2. Kryteria podziau podoy mikrobiologicznych. 3. Sterylizacja i sposoby jej przeprowadzania. 4. Pasteryzacja, dezynfekcja i zastosowanie tych procesw w praktyce.

7 wiczenie 2 Temat: Izolowanie drobnoustrojw z rnych rodowisk naturalnych. Izolowanie czystych kultur. I. Wprowadzenie Woda, gleba i organizmy ywe s rodowiskami dogodnymi dla wzrostu rnych mikroorganizmw. Mikroorganizmy znajduj si rwnie w powietrzu, ktre nie jest jednak rodowiskiem sprzyjajcym ich rozwojowi. To wanie mikroorganizmy wytyczaj granice biosfery, a tak szerokie rozprzestrzenienie w przyrodzie zawdziczaj nastpujcym cechom: 1) mae rozmiary; 2) krtki czas generacji; 3) rnorodno metaboliczna (zdolno do wykorzystania wielu rde wgla, azotu, energii, rnych kocowych akceptorw elektronw); 4) zdolno adaptacji do zmieniajcych si warunkw rodowiska; 5) zdolno do ycia w warunkach ekstremalnych (dotyczy to temperatury, pH, potencjau oksydoredukcyjnego, cinienia osmotycznego, cinienia hydrostatycznego i bardzo niskich ste substancji pokarmowych); 6) wytwarzanie form przetrwalnych. Na og w danym rodowisku wystpuj rne mikroorganizmy. Jeli chcemy wic wyizolowa okrelony gatunek, musimy zastosowa odpowiednie podoa i warunki hodowli, hamujce wzrost innych mikroorganizmw i prowadzce do selekcyjnego namnaania mikroorganizmu poszukiwanego. Z wyrosych kolonii moemy nastpnie zaoy czyste kultury, a po ich identyfikacji, uzyska czyst kultur poszukiwanego przez nas gatunku. Podstawowe pojcia w mikrobiologii to hodowla, czysta kultura, kolonia, klon i szczep. Hodowla to podoe z namnoonymi mikroorganizmami. Hodowle mona prowadzi na podou pynnym bd staym. Hodowle mog by jednogatunkowe (gdy na podou ronie jeden gatunek bakterii) lub mieszane (gdy rosn w nich przynajmniej dwa gatunki). Kolonia to widoczne goym okiem skupisko drobnoustrojw na podou staym. Na og kolonia powstaje w wyniku podziaw pojedynczej komrki. Czyst kultur nazywamy hodowl, w ktrej bakterie stanowi potomstwo jednej, pierwotnie wyosobnionej komrki bakteryjnej. Klon to czysta kultura i pochodzce od niej populacje bakteryjne. Szczepy to rne klony nalece do tego samego gatunku, a wyprowadzone z poszczeglnych czystych kultur, izolowanych niezalenie od siebie. II. Cz praktyczna 1. Przygotowanie podoy a) Rozla agar odywczy (przygotowany na poprzednich wiczeniach) na pytki Petriego. b) Po zastygniciu podoa, pytki wysuszy. c) Przed dokonaniem posieww pytki naley odpowiednio podpisa flamastrem na denku, uwzgldniajc rodzaj posiewanej prbki, rozcieczenie, inicjay osoby wykonujcej posiew. 2. Izolowanie drobnoustrojw z powietrza metod sedymentacyjn Kocha. a) Pytki z agarem odywczym postawi w miejscu, gdzie wykonany bdzie posiew. b) Zdj wieczko i wystawi poywk na dziaanie powietrza przez 5, 10 lub 15 minut zalenie od przewidywanego skaenia powietrza. Po ekspozycji pytki zakry. c) Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze pokojowej policzy kolonie bakterii, a nastpnie obliczy liczb drobnoustrojw (X) w 10 dm3 (0,01 m3) powietrza wedug zamieszczonego

8 niej wzoru (wedug zaoenia Omeliaskiego na 100 cm2 podoa osiada w cigu 5 minut tyle mikroorganizmw, ile znajduje si wanie w 10 dm3 powietrza): a x 100 X = --------bxc gdzie: a - uredniona liczba kolonii na pytce; b - powierzchnia pytki w cm2; c - wspczynnik czasu: (dla 5 minut wynosi 1, dla 10 - 2, dla 15 3); 100 - przeliczenie powierzchni pytki na 100 cm2.

Powietrze atmosferyczne uwaamy za: - nie zanieczyszczone, jeli oglna liczba bakterii w 1 m3 wynosi mniej ni 1000; - rednio zanieczyszczone, jeli oglna liczba bakterii w 1 m3 wynosi od 1000 do 3000; - silnie zanieczyszczone, jeli oglna liczba bakterii w 1 m3 wynosi wicej ni 3000. Dopuszczalny stopie mikrobiologicznego zanieczyszczenia powietrza atmosferycznego wynosi 3000 mikroorganizmw w 1 m3. Dopuszczalna liczba mikroorganizmw w 1 m3 powietrza pomieszcze uytkowych wynosi: - pomieszczenia suby zdrowia sala operacyjna - 100 sala opatrunkowa - 150 sala z chorymi - 1000 - pomieszczenia domw mieszkalnych kuchnia i jadalnia - 2000 pokj do przyj - 1500 sypialnia - 1000 - pomieszczenia szkolne sale wykadowe - 1500 sale do wicze - 2000 sale gimnastyczne - 3000 3. Izolowanie mikroorganizmw z naturalnego zbiornika wodnego i szacowanie ich liczby a) Rozcieczy wod ze zbiornika (10-1 - 10-4) wg schematu przedstawionego na stronie 9. - Wla do 4 probwek po 4,5 ml soli fizjologicznej. - Do pierwszej probwki odmierzy pipet ( 1 ml ) 0,5 ml badanej wody. Pipet odoy, a zawarto probwki dobrze wymiesza. W ten sposb rozcieczylimy badan wod dziesiciokrotnie (10-1). - Przenie 0,5 ml rozcieczenia 10-1 do nastpnej probwki z sol fizjologiczn i wymiesza. Uzyskujemy stukrotne rozcieczenia badanej wody (10-2). - Postpujc analogicznie otrzymujemy rozcieczenia 10-3 i 10-4. b) Na pytki z agarem odywczym wysia po 0,1 ml kadego rozcieczenia w 2 powtrzeniach. c) Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze pokojowej zaobserwowa zrnicowan morfologi kolonii mikroorganizmw. d) Nastpnie policzy kolonie na pytkach. Do liczenia naley wzi te pytki, na ktrych wyroso od 30 do 300 kolonii. Obliczy liczb bakterii w 1 ml badanej wody (X) wg wzoru: X = a x b x 10 gdzie a - rednia liczba bakterii na pytkach; b - odwrotno wysianego rozcieczenia; 10 - przeliczenie na 1 ml.

wysiew po 0,1ml z kadej probwki na dwie pytki z agarem odywczym Rys. 2. Schemat rozcieczania hodowli bakteryjnej. 4. Izolowanie mikroorganizmw z gleby i okrelanie ich liczby a) Przygotowa roztwr glebowy. W tym celu odway 10 g gleby i wsypa do kolby zawierajcej 90 ml soli fizjologicznej i cao wytrzsa kilka minut w celu wymycia mikroorganizmw z czstek gleby. Poczeka, a czstki stae opadn na dno. b) Przygotowa kolejne rozcieczenia gleby (10-1 - 10-6) tak jak w punkcie 3a, traktujc roztwr glebowy jako rozcieczenie 10-1. Wysia na dwie pytki z agarem odywczym po 0,1 ml kadego z rozciecze od 10-2 do 10-6. c) Po kilkudniowej inkubacji w temperaturze pokojowej zaobserwowa zrnicowan morfologi kolonii mikroorganizmw. d) Policzy kolonie, a nastpnie obliczy liczb bakterii w 1 g gleby, stosujc wzr z punktu 3d). e) Wybra jedn z wyrosych kolonii i opisa w zeszycie jej morfologi, uwzgldniajc: - wielko (rednic) w mm; - typ wzrostu (na powierzchni lub czciowo wronita w podoe); - barw kolonii i jej otoczenia (barwnik moe dyfundowa do podoa); - przejrzysto (przejrzysta, nieprzejrzysta, opalizujca); - ksztat (kolonia moe by okrga z brzegiem o zrnicowanym wygldzie; moe by rozgaziona, amebowata, pofadowana, strzpiasta, nieregularna; p. str. 37); - brzeg kolonii (gadki, falisty, patkowaty, zbkowany, nitkowaty); - wzniesienie (paska, wypuka, ppkowata, kraterowata, z waem brzenym); - powierzchni (gadka, lnica, matowa, pomarszczona, pofadowana, krzaczkowata, koncentrycznie piercieniowata); - struktur (ziarnista, wknista, skrzasta, krucha, cignca si - struktur bada si za pomoc ezy).

10 Naley przy tym pamita, e morfologia kolonii zaley nie tylko od rodzaju mikroorganizmu, ale rwnie od skadu podoa i warunkw hodowli. Hodowla danego mikroorganizmu moe charakteryzowa si te swoistym zapachem. f) Wybran koloni posia metod posiewu redukcyjnego na agar odywczy (tak jak pokazano na str. 6). Pytk inkubowa w temperaturze pokojowej. Sprawdzi, czy uzyskana hodowla jest jednorodna i czy pojedyncze kolonie maj tak sam morfologi jak pobrana kolonia wyjciowa, a wic czy rzeczywicie udao si uzyska czyst kultur. 5. Izolowanie mikroorganizmw z innych rodowisk a) Na jednej pytce z agarem odywczym wykona posiew dowolny, np. kaszln, dotkn palcem brudnym i przetartym etanolem, dotkn jakim przedmiotem itp. b) Po inkubacji w temperaturze pokojowej obserwowa wzrost bakterii. III. Zagadnienia do opracowania 1. Przyczyny szerokiego rozpowszechnienia mikroorganizmw w przyrodzie. 2. Metody izolowania mikroorganizmw z rnych rodowisk naturalnych. 3. Metody izolowania czystych kultur - bezporednie i porednie. 4. Podstawowe pojcia mikrobiologiczne - hodowla, czysta kultura, kolonia, szczep, klon.

11 wiczenie 3 Temat: Wzrost hodowli bakteryjnej. I. Wprowadzenie Po wsianiu bakterii na odpowiednie podoe pynne i inkubacji w optymalnych dla danego gatunku warunkach nastpuje, po pewnym okresie adaptacji, intensywny przyrost liczby bakterii w hodowli. Jednake skad podoa takiej hodowli podlega cigym zmianom; uboeje ono w skadniki pokarmowe, natomiast nagromadzaj si w nim stopniowo metabolity, wykazujce czsto dziaanie toksyczne. Bakterie po okresie intensywnego wzrostu, zaczynaj si dzieli coraz rzadziej, w wyniku czego hodowla wchodzi w faz rwnowagi a nastpnie w faz zamierania, w ktrej podziay prawie zupenie ustaj, a liczba ywych komrek maleje. Tego typu hodowle nosz nazw hodowli okresowych. Jeeli chcemy utrzyma hodowl w fazie intensywnego wzrostu, musimy cigle uzupenia zuywane z podoa skadniki pokarmowe i odprowadza z hodowli nagromadzajce si metabolity i nadmiar komrek. W takiej hodowli cigej faza logarytmicznego wzrostu moe trwa przez czas nieograniczony, jeli nie dopuci si do wytworzenia warunkw obniajcych szybko wzrostu. Jeszcze inny rodzaj hodowli uzyskamy, jeli stworzymy warunki do rwnoczesnego podziau wszystkich bakterii w hodowli. Taka synchroniczna hodowla jest odbiciem zachowania si pojedynczej komrki i przez to moe by przydatna w wielu badaniach dotyczcych fizjologii bakterii. II. Cz praktyczna Szczepy: Escherichia coli (dziki szczep) Podoa i roztwory: - bulion odywczy - podoe Davisa (pynne) - agar odywczy - roztwr fizjologiczny (0,85% NaCl) 1. Badanie wzrostu bakterii w hodowli okresowej a) Przygotowa nocne hodowle szczepu w bulionie odywczym oraz w minimalnym podou Davisa. b) Kad z otrzymanych hodowli rozcieczy odpowiednim wieym podoem w stosunku 1 : 20. c) Zmierzy absorbancj poszczeglnych hodowli - nie powinna by wysza ni 0,1. d) Rozcieczone hodowle nocne podzieli na 3 czci: - jedn inkubowa w warunkach statycznych w 37oC; - drug - z napowietrzaniem rwnie w 37oC; - trzeci pozostawi w temp. pokojowej bez napowietrzania. e) Inkubacj prowadzi przez 3 godziny. Co godzin pobiera prbki hodowli i oznacza ich absorbancj.

12 f) Na podstawie uzyskanych wynikw przygotowa wykres zalenoci absorbancji kadej hodowli od czasu. Porwna uzyskane wyniki. 2. Okrelanie liczby bakterii w hodowli a) Upynni agar odywczy, rozla na szalki Petriego; po zakrzepniciu agaru pytki wysuszy. b) Otrzyman hodowl bulionow E. coli rozcieczy w roztworze soli fizjologicznej do wartoci 10-6 (milion razy). c) Z rozciecze 10-5 i 10-6 wysia po 0,1 ml na szalki z agarem odywczym - kade rozcieczenie na dwie szalki. d) Inkubowa w temp. 37oC przez 24 godz. Policzy kolonie otrzymane na szalkach. Obliczy liczb bakterii w 1 ml wyjciowej hodowli wg wzoru: liczba bakterii w 1 ml = a x b x 10 gdzie: a - rednia liczba kolonii na pytce b - odwrotno wysianego rozcieczenia

III. Zagadnienia do opracowania 1. Hodowle bakteryjne - kryteria podziau, warunki hodowli. 2. Fazy wzrostu w hodowli okresowej. 3. Typy wzrostu bakterii na rnych podoach. 4. Czynniki, jakie naley bra pod uwag przy zakadaniu hodowli bakteryjnych. 5. Okrelanie liczebnoci mikroorganizmw.

13 wiczenie 4 Temat: Formy morfologiczne bakterii. I. Wprowadzenie Komrki bakteryjne s zwykle bardzo mae i charakteryzuj si ma gstoci - sabo zaamuj i pochaniaj wiato, dlatego te trudno jest odrni je od podoa. Przed ogldaniem w mikroskopie, najczciej si je wic wybarwia, stosujc rne metody w zalenoci od rodzaju bakterii oraz celu, jaki chcemy osign. W barwieniu prostym stosujemy tylko jeden barwnik, natomiast w zoonym co najmniej dwa barwniki, a czsto rwnie rne zaprawy i odbarwiacze. Przykadem barwienia zoonego jest metoda Grama, ktra jest podstaw klasyfikacji i identyfikacji bakterii. Oprcz barwienia pozytywnego, w ktrym ogldamy wybarwione bakterie na bezbarwnym tle, istniej te barwienia negatywne, w ktrych wybarwia si to (czyli szkieko podstawowe) za pomoc tuszu bd nigrozyny. W ten sposb uwidacznia si otoczki bakteryjne, ktre trudno wybarwiaj si metodami pozytywnymi. Podstawowe ksztaty bakterii to kula (ziarniaki), cylinder (paeczki i laseczki) i skrcony cylinder (przecinkowce, krtki i rubowce). Istniej te bakterie o ksztatach nieregularnych, np. maczugowce. Bakterie mog tworzy charakterystyczne ukady komrek, takie jak: dwoinki, pakiety, grona (takie ukady tworz ziarniaki), a take acuszki (ziarniaki i laseczki). II. Cz praktyczna 1. Barwienie proste preparatw bakteryjnych Szczepy bakteryjne - paeczki: Escherichia coli, Proteus vulgaris, Pseudomonas fluorescens - laseczki: Bacillus subtilis, B, megaterium - ziarniaki: Micrococcus luteus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis Barwniki - fiolet krystaliczny (barwi 1 minut) - bkit metylenowy (barwi 5 minut) a) Przygotowanie preparatu - Zrobi rozmaz na szkieku podstawowym. - Wysuszy go w temperaturze pokojowej. - Utrwali, przeprowadzajc ostronie szkieko trzykrotnie przez pomie palnika. Przed barwieniem poczeka, a szkieko ostygnie. b) Barwienie preparatu - Zala cay preparat wybranym barwnikiem. - Po okrelonym czasie zla barwnik i przemywa szkieko wod wodocigow a do momentu, gdy woda spywajca z preparatu bdzie bezbarwna. - Delikatnie usun wod ze szkieka za pomoc bibuy. - Po cakowitym wyschniciu preparatu oglda go pod mikroskopem, najpierw pod maym powikszeniem, a nastpnie stosujc obiektyw imersyjny. - Narysowa wszystkie ogldane formy morfologiczne bakterii i tworzone przez te bakterie ukady komrek.

14

2. Barwienie zoone metod Grama Szczepy bakteryjne - Escherichia coli i Bacillus megaterium - Proteus vulgaris i Bacillus megaterium - Proteus vulgaris i Micrococcus luteus Roztwory stosowane do barwienia - fiolet krystaliczny - safranina - pyn Lugola - 95% etanol a) Przygotowanie preparatu - Na szkieku podstawowym zmiesza hodowle bakterii gramujemnej (np. E. coli) i gramdodatniej (np. Bacillus megaterium). - Zrobi rozmaz, wysuszy i utrwali jak w punkcie 1a). b) Barwienie metod Grama - Preparat barwi fioletem krystalicznym przez 2 minuty. - Zla fiolet, wypuka szkieko pynem Lugola i zala je pynem Lugola na 2 minuty. - Spuka preparat wod, osuszy bibu i zala na 30 sekund 95% etanolem. - Spuka wod, osuszy bibu i dobarwia safranin przez 5 minut. - Spuka wod, osuszy i oglda. - Narysowa obraz widziany w mikroskopie, uwzgldniajc kolor, na jaki wybarwiy si komrki poszczeglnych bakterii. III. Zagadnienia do opracowania 1. Podstawowe ksztaty komrek bakteryjnych i tworzone przez nie ukady. 2. Technika sporzdzania preparatw mikroskopowych (cel i sposoby utrwalania preparatw). 3. Podzia metod barwienia: barwienia proste i zoone; pozytywne i negatywne. 4. Zasada barwienia metod Grama. 5. Bakterie gramujemne i gramdodatnie. 6. Technika mikroskopowania.

15 wiczenie 5 Temat: Budowa komrki bakteryjnej. I. Wprowadzenie Strukturami wystpujcymi powszechnie w komrce bakteryjnej s: nukleoid, bona cytoplazmatyczna i rybosomy. Poza tym, prawie wszystkie bakterie posiadaj cian komrkow, a niektre - otoczki i rzski. ciana komrkowa zawiera warstw mureiny, ktra u bakterii gramdodatnich jest gruba, za u gramujemnych cienka i pokryta bon zewntrzn. Stosujc bejce (zaprawy), mona pogrubi cian komrkow i rzski, a nastpnie je wybarwi, dziki czemu staj si widoczne w zwykym mikroskopie optycznym. Obecno otoczek mona wykaza, stosujc zoone barwienie negatywno-pozytywne. Pewne gatunki bakterii (np. laseczki) wytwarzaj endospory, ktre umoliwiaj im przetrwanie w niekorzystnych warunkach rodowiska. Mona je uwidoczni, stosujc zoone barwienie, w ktrym stosuje si ziele malachitow (na gorco) i safranin. II. Cz praktyczna Szczepy: Bacillus megaterium Bacillus subtilis Micrococcus luteus Proteus vulgaris 1. Barwienie ciany komrkowej a) Przygotowa rozmaz z nocnej hodowli Bacillus megaterium. b) Po wysuszeniu preparat utrwala przez 1 min alkoholem metylowym. c) Zla alkohol, przepuka preparat roztworem taniny (bejca) i zala roztworem taniny na 30 min. d) Spuka preparat wod. e) Barwi 30-60 sek. 0,01% roztworem safraniny. f) Obejrze pod mikroskopem najpierw pod maym powikszeniem, potem pod imersj. Narysowa obraz mikroskopowy i opisa. 2. Barwienie przetrwalnikw metod Schaeffer-Fultona a) Wykona rozmazy z 24- i 48-godzinnej hodowli B. megaterium lub B. subtilis. b) Preparat wysuszy i utrwali w pomieniu. c) Barwi zieleni malachitow przez okoo 8 min, podgrzewajc preparat, co pewien czas, pomieniem palnika, a do ukazania si pary. d) Spuka wod. e) Barwi 0, 5 % safranin przez 4 min. f) Spuka wod i osuszy. g) Preparat obejrze pod imersj. Przetrwalniki powinny by wybarwione na zielono a wntrze komrki na rowo. Barwniki, utrwalacze, zaprawy i inne: - wodne roztwory safraniny (0,01%; 0,2%; 0,5%) - wodny roztwr zieleni malachitowej (5%) - roztwr taniny (10%) - tusz chiski - alkohol metylowy

16 3. Barwienie otoczek metod Burriego-Ginsa a) Na odtuszczone szkieko podstawowe nanie kropl pynnej hodowli Micrococcus luteus (lub B. megaterium) lub zrobi zawiesin bakterii z hodowli staej i nanie kropl na szkieko. b) Doda kropl tuszu i zmiesza z hodowl. c) Drugim szkiekiem podstawowym rozprowadzi zawiesin po powierzchni szkieka tak, aby powstaa jednorodna, ciemna (lecz nie czarna) warstwa. d) Rozmaz wysuszy na powietrzu, ostronie utrwali w pomieniu palnika. e) Barwi 0,2% safranin przez okoo 15 sek. f) Spuka barwnik, preparat osuszy. g) Obejrze pod mikroskopem. To powinno by ciemne, bakterie zabarwione na rowo, za otoczki pozostaj niewybarwione. 4. Wykazanie zdolnoci bakterii do ruchu a) Z pynnej hodowli Proteus vulgaris przygotowa preparat w postaci tzw. kropli wiszcej: - na szkieko nakrywkowe nanie malek kropl pynnej hodowli szczepu; - za pomoc wazeliny naoonej na rogach szkieka przyklei je nad ezk szkieka podstawowego. b) Nastawi pod mikroskopem obraz brzegu kropli na maym powikszeniu, a nastpnie zmieni obiektyw na imersyjny. Obserwowa ruch wasny bakterii. III. Zagadnienia do opracowania 1. Budowa i funkcja bakteryjnych struktur komrkowych; porwnanie komrki prokariotycznej z eukariotyczn. 2. Zastosowanie zoonych metod barwienia do uwidocznienia niektrych struktur komrkowych (otoczka, ciana komrkowa, przetrwalniki). 3. Metody okrelania zdolnoci bakterii do ruchu.

17 wiczenie 6 Temat: Metabolizm bakterii - odywianie I. Wprowadzenie Skadniki poywienia, to zwizki, ktre po przyswojeniu przez komrk bakteryjn, wczaj si do jej metabolizmu jako budulec lub rdo energii. Kada bakteria musi mie zapewnione do wzrostu podstawowe rdo wgla, azotu, siarki i fosforu oraz rdo energii. Typ pokarmowy bakterii wskazuje zwykle na: 1) gwny proces, za pomoc ktrego bakteria zdobywa energi (fototrofy wykorzystuj energi wietln a chemotrofy chemiczn), 2) donory protonw i elektronw przy redukcji NAD lub NADP (litotrofy wykorzystuj zwizki nieorganiczne, a organotrofy - organiczne) i wreszcie 3) na gwne rdo wgla (autotrofy wykorzystuj dwutlenek wgla, a heterotrofy - zwizki organiczne). Chemolitoautotrof jest wic bakteri samoywn, ktra jako gwne rdo energii wykorzystuje energi chemiczn, uzyskan z utleniania zwizkw nieorganicznych. Chemoorganoheterotrof to mikroorganizm, dla ktrego zwizek organiczny jest rdem wgla, energii i elektronw. Niektre bakterie potrafi syntetyzowa wszystkie niezbdne im zwizki z jednego, prostego zwizku wgla i soli mineralnych. Nazywamy je prototrofami. Inne, zwane auksotrofami, nie potrafi syntetyzowa pewnych zwizkw, ktre musz wic znajdowa si w ich podou. Zwizki te, zwane czynnikami wzrostowymi, to aminokwasy, witamy, zasady purynowe i pirymidynowe i inne. Bakterie potrafi wykorzysta jako rdo azotu nie tylko zwizki nieorganiczne (jony NH4+, NO3-) i organiczne (np. aminokwasy), ale rwnie azot czsteczkowy. Zdolno do wizania azotu czsteczkowego jest cech wystpujc u wielu rnych bakterii zarwno wolnoyjcych jak i symbiotycznych, autotroficznych jak i heterotroficznych, tlenowych i beztlenowych, a take u archeonw. II. Cz praktyczna 1. Przygotowanie podoy a) Podoe AB Zmiesza ze sob:

50 ml soli A (Na2HPO4, KH2PO4, pH 8,4) 50 ml soli B (NH4Cl, MgSO4, Na2S2O3, pH 7,0) 2 ml roztworu czerwieni fenolowej 2 ml soli Tuovinena (wersenian sodu, ZnSO4, CaCl2, MnCl2, FeSO4, (NH4)6Mo7O24, CuSO4, CoCl2, pH 6,0) 100 ml 4% agaroidu

b) Agar odywczy Skad: wycig misny, ekstrakt drodowy, pepton, NaCl, woda, agar-agar. c) Podoe dla nitryfikatorw Do 2 kolb 300 ml wla po 50 ml wody wodocigowej i doda do kadej z nich po 2 ml nastpujcych roztworw: 6% (NH4)2SO4; 0,6% MgSO4; 0,1% FeSO4; 0,3% K2HPO4; 0,6% NaCl; 20% CaCO3. d) Agar odywczy ze skrobi (1%) e) Agar odywczy z mlekiem (4%) Do upynnionego agaru odywczego doda 8 ml jaowego, odtuszczonego mleka. f) Agar odywczy z tuszczem (3%) Do upynnionego agaru odywczego doda 6 g wrzcej margaryny.

18 g) Podoe EMB z laktoz Zmiesza: 190 ml upynnionego podoa (o skadzie: ekstrakt drodowy, hydrolizat kazeiny, K2HPO4, NaCl, woda, agar-agar) 2 ml wodnego roztworu 4% eozyny 2 ml wodnego roztworu 0,65% bkitu metylenowego 10 ml 20% roztworu laktozy. h) elatyna odywcza: woda, elatyna, pepton i) Podoe Davisa dla prototrofa Zmiesza ze sob: 40 ml soli Davisa (K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, (NH4)2SO4, cytrynian sodu, woda) 4 ml 20 % glukozy 150 ml agaroidu j) Podoe Davisa dla auksotrofa Do podoa Davisa sporzdzonego jak wyej doda 2 ml hydrolizatu kazeiny i 2 ml roztworu tiaminy. k) Podoe dla bakterii wicych azot Skad: woda, mannitol, K2HPO4, KH2PO4, MgSO4, NaCl, CaCO3, lady MnSO4, FeCl2, Na2MoO4. l) Podoe Davisa z rnymi rdami azotu Zmiesza ze sob: 40 ml bezazotowych soli Davisa 4 ml 20% glukozy 2 ml roztworu zawierajcego rdo azotu 150 ml agaroidu rda azotu to: 10 % roztwr NH4Cl 10 % roztwr KNO3 20 % roztwr hydrolizatu kazeiny 2. rda wgla i energii a) Okrelenie typu pokarmowego badanych szczepw Szczepy Bacillus subtilis Halothiobacillus neapolitanus Paracoccus versutus Micrococcus luteus Podoa podoe mineralne AB agar odywczy

- Pytk z podoem AB i z agarem odywczym podzieli na 4 sektory i odpowiednio podpisa. - Kady ze szczepw wysia rys na oddzielnych sektorach obu podoy. - Po inkubacji w temperaturze pokojowej okreli typ pokarmowy badanych bakterii. Zmiana barwy podoa AB z czerwonej na t wiadczy o jego zakwaszeniu. b) Wykazanie obecnoci bakterii nitryfikacyjnych w glebie Materia badany gleba Podoe podoe mineralne z punktu 1c)

19 - Podoe przygotowane w punkcie 1c) rozla do 2 kolbek 100 ml. - Do jednej z nich wprowadzi grudk gleby. Drug zostawi niezaszczepion jako kontrol. Po 1 i 2 tygodniach inkubacji w temperaturze pokojowej zbada, czy w hodowli pojawiy si azotyny. Do jednej probwki pobra okoo 2 ml poywki z kolby zaszczepionej gleb, a do drugiej z kolby kontrolnej. Do obu probwek doda po kilka kropli mieszaniny -naftyloaminy z kwasem sulfanilowym lub wsypa odrobin odpowiedniego odczynnika firmy Merck. Pojawienie si rowego zabarwienia wiadczy o obecnoci azotynw w prbie. c) Badanie zdolnoci bakterii heterotroficznych do wykorzystywania rnych organicznych rde wgla Szczepy Podoa + Escherichia coli dzika (Lac ) agar odywczy ze skrobi Escherichia coli mutant (Lac-) agar odywczy z mlekiem Bacillus subtilis agar odywczy z tuszczem Pseudomonas fluorescens EMB z laktoz elatyna odywcza - Pytki z poywkami podzieli na p, odpowiednio podpisa i zrobi posiewy: - na agar odywczy z mlekiem i ze skrobi posia rys B. subtilis i dzik E. coli; - na agar odywczy z tuszczem posia rys E. coli i P. fluorescens; - na podoe EMB z laktoz posia posiewem redukcyjnym dzik E. coli (Lac+) i mutanta E. coli (Lac-); - Na jeden supek z elatyn odywcz wsia ig B. subtilis, a na drugi E. coli. - Pytki z podoem EMB inkubowa w 37oC przez noc, (a nastpnie wstawi do lodwki, jeli nie mog by zaraz obejrzane). - Pozostae posiewy inkubowa w temperaturze pokojowej przez kilka dni. Odczyt posieww po inkubacji: - Pytki z agarem odywczym i skrobi naley zala pynem Lugola. Brak fioletowego zabarwienia wok strefy wzrostu bakterii wiadczy o rozkadzie skrobi. - Na agarze odywczym z mlekiem obserwuje si przejrzyste strefy wok linii wzrostu szczepw hydrolizujcych kazein. - Pytki z agarem odywczym i tuszczem naley zala 20% roztworem CuSO4. Pojawienie si szmaragdowego zabarwienia wok linii wzrostu wiadczy o rozkadzie tuszczu. - Na podou EMB kolonie bakterii zuywajcych cukier s fioletowe z metalicznym poyskiem, a kolonie bakterii niezdolnych do zuycia danego cukru s rowe. d) Prototrofy i auksotrofy Szczepy E. coli dzika E. coli AB1157 thr leu pro his arg thi E. coli 108 pro met thy Podoa: podoe Davisa podoe Davisa z hydrolizatem kazeiny i tiamin agar odywczy - Pytk z agarem odywczym, podoem Davisa oraz podoem Davisa uzupenionym hydrolizatem kazeiny i tiamin podzieli na trzy sektory i odpowiednio podpisa. - Na jednym sektorze wszystkich trzech poywek posia wykiem dzik E. coli, a na dwch pozostaych oba mutanty auksotroficzne. - Po inkubacji zinterpretowa otrzymane wyniki.

20 3. rda azotu a) Izolowanie z gleby bakterii wicych azot czsteczkowy - Z kolbki zawierajcej podoe bezazotowe (punkt 1k) odla do probwki okoo 10 ml. - Do probwki doda szczypt sacharozy. - Probwk i kolb zaszczepi grudk gleby. Inkubowa w temperaturze pokojowej. - Po tygodniu zaobserwowa wzrost Azotobacter sp. w postaci bonki na powierzchni poywki. - Pobra prbk z bonki na dwa szkieka podstawowe. - Jedno przykry szkiekiem nakrywkowym i obserwowa przyyciowo komrki Azotobacter sp. oraz jego cysty, widoczne jako okrge twory, do silnie zaamujce wiato. - Na drugim wykona preparat tuszowy dobarwiony bkitem metylenowym. Obserwowa komrki z otoczkami. - Jeli w probwce z poywk bezazotow namnoy si Clostridium pasteurianum, z dna probwki powinny odrywa si pcherzyki gazu, a po zdjciu korka czu jest zapach kwasu masowego. - Z dennej czci probwki pobra pipet nieco hodowli i zmiesza na szkieku podstawowym z rwn objtoci pynu Lugola. Przykry szkiekiem nakrywkowym. - Obserwowa w mikroskopie laseczki z zabarwionym na fioletowo materiaem zapasowym granuloz. b) Wykorzystywanie rnych innych rde azotu - Trzy pytki z podoem Davisa z trzema rnymi rdami azotu - NH4Cl, KNO3 i hydrolizatem kazeiny - podzieli na dwie czci. - Na jednej poowie posia rys E. coli, a na drugiej - B. subtilis. - Po inkubacji zaobserwowa, jakie rda azotu moe wykorzystywa kada z badanych bakterii. III. Zagadnienia do opracowania 1. rda wgla i energii. 2. Typy pokarmowe bakterii. 3. Prototrofy i auksotrofy; czynniki wzrostowe. 4. Rnorodno rde azotu wykorzystywanych przez bakterie.

21 wiczenie 7 Temat: Metabolizm bakterii - procesy oddechowe. I. Wprowadzenie Chemotrofy uzyskuj energi z utleniania jakich pierwiastkw bd zwizkw chemicznych. Proces utleniania zachodzcy z udziaem acucha transportu elektronw i egzogennego kocowego akceptora elektronw nazywamy oddychaniem. W tym procesie ATP powstaje w wyniku fosforylacji oksydacyjnej. Ilo uwalnianej energii jest tym wiksza, im duszy jest acuch przenonikw, dlatego te najbardziej wydajne energetycznie jest oddychanie tlenowe, w ktrym kocowym akceptorem jest tlen. Istnieje dua grupa bakterii wzgldnie tlenowych, ktre - przy braku tlenu - mog oddycha beztlenowo, wykorzystujc utlenione zwizki nieorganiczne, znajdujce si w podou, jako kocowe akceptory elektronw. W oddychaniu azotanowym (ktrego przykadem jest denitryfikacja), akceptorem s azotany. Beztlenowce nie potrafi wykorzysta tlenu jako akceptora elektronw. Niektre z nich wykorzystuj siarczany (bakterie redukujce siarczany), inne dwutlenek wgla (bakterie homoacetogenne). W warunkach braku tlenu i innych egzogennych akceptorw bakterie mog te uzyskiwa energi z utleniania zwizkw organicznych, bez udziau acucha transportu elektronw, z wykorzystaniem endogennych akceptorw elektronw. Taki sposb uzyskiwania energii nazywamy fermentacj. W metabolizmie fermentacyjnym ATP powstaje w wyniku fosforylacji substratowej. Nazwy fermentacji wywodz si od najbardziej charakterystycznego produktu kocowego, ktrym jest zwizek (lub zwizki) organiczny. II. Cz praktyczna Szczepy: Escherichia coli Bacillus subtilis Pseudomonas fluorescens Serratia marcescens Enterococcus faecalis Clostridium sporogenes Pseudomonas stutzeri 1. Okrelenie stosunku bakterii do tlenu a) Przygotowane w probwkach podoa zaszczepi kropl nocnej hodowli bulionowej wybranego szczepu wg wskazwek asystenta: - bulion odywczy z dodatkiem 0,5% glukozy - wysoki sup podoa; - bulion odywczy - niski sup podoa. Przed posiewem probwki z wysokimi supami podoa naley zagrza we wrzcej ani wodnej, a nastpnie szybko schodzi. b) Po posiewie - wysoki sup podoa naley zala jaow parafin, aby uniemoliwi dostp powietrza. Zaszczepione podoa inkubowa w 37oC przez 24 godz. c) Obserwowa wzrost lub jego brak w poszczeglnych probwkach. Okreli stosunek badanych bakterii do tlenu. Podoa i roztwory: - bulion odywczy - bulion odywczy z KNO3 (0,1%) - mleko z lakmusem - 20% roztwr glukozy - 0,3% roztwr bkitu metylenowego - woda utleniona - jaowa parafina

22 2. Wykazanie obecnoci katalazy u wybranych szczepw bakterii 24-godzinne hodowle szczepw bakterii na pytkach z agarem odywczym zala wod utlenion. Wydzielanie si pcherzykw gazu wiadczy o obecnoci katalazy - enzymu rozkadajcego nadtlenek wodoru na wod i tlen. 3. Oddychanie bakterii w warunkach beztlenowych 3.1. Oddychanie azotanowe i denitryfikacja a) Dwie probwki zawierajce bulion odywczy z KNO3 (wysoki sup poywki i rurka Durhama) zaszczepi jedn P. stutzeri, drug E. coli; trzeci pozostawi jako kontrol. b) Po 24-godzinnej inkubacji w 30oC obserwowa obecno gazu w rurkach Durhama, okreli zmian pH podoa (za pomoc papierka wskanikowego), sprawdzi obecno jonw NO2- w hodowli (za pomoc specjalnego odczynnika). c) Na podstawie uzyskanych wynikw okreli, ktry ze szczepw jest zdolny do denitryfikacji. 2.2. Fermentacja i peptonizacja mleka a) Do probwek zawierajcych odtuszczone, jaowe mleko z lakmusem wsia kolejno: Enterococcus faecalis, E. coli, B. subtilis, czwart probwk pozostawi nie zaszczepion. b) Inkubowa 24 godz w 37oC, zaobserwowa zmiany w podou: zakwaszenie lub alkalizacj, powstanie skrzepu kazeiny, hydroliz kazeiny, redukcj lakmusu. c) Na podstawie zaobserwowanych zmian okreli zdolno badanych szczepw do fermentacji i peptonizacji mleka. Mleko odtuszczone zawiera laktoz, kazein, sole mineralne i witaminy - jest wic znakomit poywk, na ktrej moe rozwija si ogromna liczba gatunkw bakterii. Jeli bakterie fermentuj laktoz, wwczas powstaje kwas mlekowy w takiej iloci, e wytrca si kazeina jako tzw. skrzep kwany. Nastpuje zmiana barwy lakmusu na row. Wskutek wytworzenia si warunkw prawie beztlenowych w dolnej czci supa poywki nastpuje redukcja lakmusu, ktry peni rol ostatecznego akceptora elektronw. Bakterie, ktre nie fermentuj laktozy mog wykazywa zdolno do peptonizacji kazeiny po jej uprzednim wytrceniu przez podpuszczk (tzw. skrzep sodki). W tym przypadku obserwuje si alkalizacj mleka (zmiana barwy lakmusu na niebiesk). 3. Test redukcji bkitu metylenowego jako demonstracja intensywnoci procesu oddechowego a) Ponumerowa pi probwek. b) Przygotowa rozcieczenia modej hodowli bulionowej E. coli wg schematu: nr probwki bulion (ml) hodowla (ml) 1 9 1 2 7 3 3 5 5 4 10 5 (kontrola) 10 -

23 c) Do kadej probwki doda 0,1 ml wodnego roztworu bkitu metylenowego. Zawarto probwek dokadnie wymiesza i wstawi je do termostatu o temp. 37oC. d) W odstpach 10-minutowych obserwowa zabarwienie zawartoci probwek. Zanotowa czas odbarwienia bkitu w poszczeglnych probwkach. e) Po zakoczeniu obserwacji zawarto probwek ponownie wymiesza. Wyjani obserwowane zmiany zabarwienia. III. Zagadnienia do opracowania 1. Stosunek bakterii do tlenu: tlenowce bezwzgldne i wzgldne, beztlenowce bezwzgldne i aerotolerancyjne. 2. Metody hodowli beztlenowcw. 3. Kocowe akceptory elektronw w procesach oddechowych i produkty oddychania. 4. Zysk energetyczny w rnych typach oddychania.

24 Cwiczenie 8 Temat: Koniugacja u bakterii. I. Wprowadzenie Koniugacja jest jednym ze sposobw przekazywania materiau genetycznego u bakterii. Proces ten wymaga bezporedniego kontaktu dwu komrek, z ktrych jedna peni rol dawcy a druga biorcy materiau genetycznego. Zdolno do przekazywania materiau genetycznego (bycia dawc) jest uwarunkowana obecnoci w komrce plazmidu koniugacyjnego. Jednym z badanych na wiczeniach plazmidw jest plazmid F. Jest to kolicie zamknita, dwuniciowa czsteczka DNA wystpujca albo w stanie autonomicznym (szczepy F+), w ktrym replikuje si niezalenie od chromosomu gospodarza, albo w stanie zintegrowanym z chromosomem (szczepy Hfr), w ktrym replikuje si jako jego cz. Plazmid F niesie informacj genetyczn nadajc komrce gospodarza cechy dawcy, a take informacj dotyczc inicjacji i regulacji wasnej replikacji oraz transferu do komrki pozbawionej tego plazmidu. W wyniku koniugacji biorcy F- z dawc F+ powstaj transkoniuganty, ktre uzyskuj plazmid F. Koniugacja biorcy F- z dawc typu Hfr prowadzi do ukierunkowanego przekazywania chromosomu dawcy, w wyniku czego powstaj z du czstoci rekombinanty chromosomowe, nie zawierajce jednak plazmidu F. Czsto pojawiania si rnego typu rekombinantw jest zalena od odlegoci danego markera od punktu pocztkowego transferu (ang. origin) i jest tym wiksza, im bliej tego punktu ley dany gen. W zalenoci od miejsca integracji plazmidu F z chromosomem bakteryjnym, powstaj rnego typu szczepy Hfr; dany typ ma jednak zawsze ten sam punkt pocztkowy i ten sam kierunek przekazywania DNA. Zastosowanie rnych typw Hfr pozwolio na okrelenie pooenia rnych genw na chromosomie bakteryjnym i skonstruowanie tzw. map chromosomowych, podajcych odlegoci midzy poszczeglnymi genami w jednostkach rekombinacyjnych (czsto rekombinacji) lub czasowych ( czas wejcia danego genu do komrki biorcy). Podobnie jak plazmid F mog by przekazywane inne plazmidy koniugacyjne. Nios one czsto, poza genami warunkujcymi replikacj i transfer koniugacyjny, take geny nadajce komrce gospodarza okrelone cechy fenotypowe, np. oporno na antybiotyki, metale cikie, czy te zdolno do metabolizowania okrelonych rde wgla (np. toluenu). Cechy te w pewnych warunkach rodowiska mog sta si selektywnie korzystne dla bakterii, ktra uzyskaa plazmid. Koniugacja (wraz z transformacj i transdukcj) jest sposobem horyzontalnego transferu genw midzy bakteriami. II. Cz praktyczna Szczepy: Escherichia coli a) F 108 Hfr C

pro met thy Strr prototrof Strs Rifr Apr Cmr

- biorca - dawca - biorca - dawca - dawca

b) MC1061R DH1 (R6K/drd1) MC1061(R6K/drd1Cm)

25 Podoa i roztwory: - agar odywczy - podoe Davisa pynne (150 ml wody dest., 40 ml soli Davisa, 4 ml 20% glukozy) - podoe Davisa stae (150 ml agaroidu, 40 ml soli Davisa, 4 ml 20% glukozy) - roztwr fizjologiczny - roztwr hydrolizatu kazeiny (20%) - roztwory aminokwasw: metioniny i proliny (1 mg/ml) - roztwr tyminy (3 mg/ml) - roztwr streptomycyny (5 mg/ml) - roztwr ampicyliny (5 mg/ml) - roztwr chloramfenikolu (2 mg/ml) - roztwr ryfampicyny (5 mg/ml). Uwaga: Studenci otrzymuj gotowe, jaowe roztwory metioniny, proliny, tyminy i antybiotykw. Naley dodawa je w iloci 1 ml na 100 ml podoa. Kady student wykonuje jedn z koniugacji: 1) F-108 x HfrC 2) MC1061R x DH1(R6K/drd1) 3) MC1061R x MC1061(R6K/drd1Cm) Koniugacja 1 1. Szczepy rodzicielskie hodowa przez 18 godz. w minimalnym podou Davisa uzupenionym wymaganymi przez szczep czynnikami oraz hydrolizatem kazeiny. 2. Nocn hodowl kadego szczepu rozcieczy 1 : 20 wieym podoem i inkubowa w 37oC do osignicia fazy wzrostu logarytmicznego (2,5 - 3 godz.). 3. Hodowle dawcy i biorcy zmiesza w stosunku 1:10 (4,5 ml hodowli biorcy i 0,5 ml hodowli dawcy Hfr). 4. Mieszanin koniugacyjn wstawi do termostatu o temp. 37oC na 60 min. 5. Rozcieczy hodowl szczepu dawcy i wysia na pytki z agarem odywczym w celu okrelenia liczby komrek uytych do koniugacji. Pytki inkubowa przez 24 godz. w 37oC. 6. Po zakoczeniu koniugacji mieszanin koniugacyjn rozcieczy i wysia na odpowiednie podoa selekcyjne wg schematu: a) selekcja rekombinantw Pro+Strr - na podou Davisa z dodatkiem metioniny, tyminy i streptomycyny - wysia rozcieczenie 10-2 i 10-3 (po dwa powtrzenia); b) selekcja rekombinantw Met+Strr - na podou Davisa z dodatkiem proliny, tyminy i streptomycyny - wysia rozcieczenie 10-1 i 10-2 (po dwa powtrzenia). Inkubowa w 37oC przez 48 godzin. 7. Policzy kolonie rekombinantw i szczepu dawcy; obliczy czsto rekombinacji wg wzoru: liczba rekombinantw w 1 ml x 100 -------------------------------------------------liczba dawcy w 1 ml mieszaniny koniug. 8. Zinterpretowa otrzymane wyniki.

26 Koniugacja 2 i 3 1. Przygotowa nocne hodowle szczepu MC1061R na bulionie odywczym, DH1(R6K/drd1) na bulionie z ampicylin (st. 50 g/ml), a MC1061(R6K/drd1Cm) na bulionie z chloramfenikolem (20 g/ml). 2. Nocne hodowle rozcieczy 10-krotnie wie poywk bez antybiotyku i inkubowa w 37oC do uzyskania fazy wzrostu logarytmicznego (2-3 godziny). 3. Zmiesza logarytmiczne hodowle biorcy i dawcy w stosunku 1:1 i inkubowa 60 min w 37oC. 4. Rozcieczy mieszaniny koniugacyjne i wysia rozcieczenia 10-2 10-3 na podoa selekcyjne: a) agar odywczy z ryfampicyn i ampicylin (po 50 g/ml) - dla transkoniugantw RifrApr; b) agar odywczy z ryfampicyn (50 g/ml) i chloramfenikolem (20 g/ml) - dla transkoniugantw RifrCmr. Pytki inkubowa w 37oC przez 24godziny. 5. Rozcieczy hodowl szczepu dawcy i wysia na pytki z agarem odywczym w celu okrelenia liczby komrek uytych do koniugacji. Pytki inkubowa przez 24 godz. w 37oC. 6. Policzy kolonie transkoniugantw i szczepw dawcw; obliczy czsto przekazywania plazmidu wg wzoru: liczba transkoniugantw w 1 ml x 100 -------------------------------------------------liczba dawcy w 1 ml mieszaniny koniug. 7. Zinterpretowa otrzymane wyniki. III. Zagadnienia do opracowania 1. Sposoby przekazywania materiau genetycznego u bakterii. 2. Rne typy dawcw w koniugacji. 3. Przekazywanie cech chromosomowych i plazmidowych. 4. Selekcjonowanie rnych typw rekombinantw i transkoniugantw.

27 wiczenie 9 Temat: Podstawowe techniki pracy z bakteriofagami I. Wprowadzenie Bakteriofagi, zwane w skrcie fagami, s bezwzgldnymi, wewntrzkomrkowymi pasoytami bakterii. S one zdolne do reprodukcji, ale nie maj wasnego metabolizmu. Do namnaania si wykorzystuj aparat metaboliczny gospodarza. Zwykle dany fag infekuje tylko okrelony gatunek, bd szczep czy grup szczepw bakterii. Kolejne etapy infekcji fagowej to 1) adsorpcja do wraliwej komrki, posiadajcej okrelony receptor; 2) penetracja kwasu nukleinowego do komrki; 3) replikacja kwasu nukleinowego wirusa; 4) synteza podjednostek biakowych paszcza; 5) czenie si podjednostek biakowych i pakowanie kwasw nukleinowych (czyli tworzenie czstek wirusa); 6) uwolnienie namnoonych czstek wirusa z komrki, najczciej w wyniku jej lizy. Niektre fagi nitkowate po namnoeniu opuszczaj komrki gospodarza nie doprowadzajc do ich lizy. Fagi agodne (umiarkowane) maj zdolno wejcia w stan stabilnej rwnowagi (zwanej lizogeni) z komrkami gospodarza. W czasie infekcji populacji bakterii fagiem agodnym wikszo komrek ulega lizie, a tylko cz lizogenizacji. Fagi hoduje si i bada na podou staym poronitym gsto bakteriami (tzw. murawa bakteryjna), gdzie w wyniku ich dziaalnoci mona obserwowa tzw. ysinki, lub w pynnej hodowli bakterii wraliwych, gdzie aktywno fagw przejawia si stopniowym spadkiem mtnoci hodowli, w miar lizy komrek gospodarza. ysinka jest to widoczna goym okiem strefa przejanienia w gstym wzrocie bakterii na podou staym, powstajca najczciej wskutek lizy czci lub wszystkich komrek przez fagi. Zwykle ysinka powstaje w wyniku pierwotnej infekcji jednej bakterii przez jeden wirion. Morfologia ysinki tzn. wielko, ksztat brzegw, stopie przejrzystoci, moe by pomocna w identyfikacji faga, np. fagi zjadliwe tworz ysinki przejrzyste, za fagi agodne - mtne, gdy nie lizuj wszystkich komrek. II. Cz praktyczna Szczepy i bakteriofagi E. coli JM109 F lub TG1 E. coli DH1 lub DH5 E. coli() vir M13 Podoa agar odywczy agar odywczy ppynny (0,7%) bulion odywczy

1. Oznaczenie miana faga technik agaru dwuwarstwowego a) Rozcieczy odpowiednio zawiesin faga bulionem odywczym (wg wskazwek asystenta). b) Do 4 probwek wla po 0,1 ml hodowli E. coli DH1, a nastpnie doda po 0,1 ml ssiednich rozciecze zawiesiny faga w dwch powtrzeniach (np. do dwch 10-4 i do dwch 10-5). Inkubowa 20 min w 37oC. c) Do kadej probwki doda po 3 ml upynnionego i schodzonego do okoo 46oC agaru ppynnego. Wymiesza, obracajc probwk midzy domi. d) Natychmiast wylewa zawarto probwki na szalk z agarem odywczym i rozprowadzi rwnomiernie po caej jej powierzchni.

28 e) Po zastygniciu agaru, inkubowa pytki w 37oC przez 24 godziny. f) Obliczy liczb ysinek fagowych. Uredni wyniki z dwch pytek i uwzgldniajc rozcieczenie obliczy miano faga (X) wg wzoru: X = a x b x 10 gdzie X - miano faga PFU/ml a - rednia liczba ysinek b - odwrotno rozcieczenia 10 - przeliczenie na 1 ml wyjciowej zawiesiny 2. Rodzaje ysinek fagowych a) Do probwki doda 0,1 ml hodowli E. coli TG1 i 3 ml upynnionego, schodzonego agaru ppynnego. Wymiesza i wyla na szalk z agarem odywczym, rozprowadzajc rwnomiernie po caej powierzchni. b) Po zastygniciu podzieli pytk na 3 sektory i na kady z nich nakropli nie wicej ni 10 l zawiesiny: faga vir faga M13 hodowli E. coli() c) Po wsikniciu zawiesin, odwrci pytki do gry dnem i inkubowa w 37oC. d) Opisa rodzaje stref lizy na murawie bakteryjnej. 3. Test wraliwoci na infekcj fagiem (cross-streaking) a) Na szalk z agarem odywczym nanie w postaci rysy, za pomoc ezy, zawiesin faga vir i rwnomiernie j rozprowadzi wzdu linii posiewu. b) Rwnolegle w podobny sposb nanie faga M13. c) Po wsikniciu zawiesin fagowych nabra na ez hodowl E. coli TG1 i jednym ruchem posia j rys w poprzek posiewu faga vir. d) Ez opali, ponownie nabra hodowli tego samego szczepu i posia j rys w poprzek faga M13. d) W taki sam sposb posia E. coli DH5. e) Po wsikniciu hodowli w poywk inkubowa pytki w 37oC. f) Oceni wraliwo obu szczepw na badane fagi.

F1
B1 B2 B1 B2

F2

Rys. 3. Okrelanie wraliwoci bakterii na fagi (test cross streaking).

29 III. Zagadnienia do opracowania 1. Etapy infekcji fagowej, cykl lityczny i lizogenny. 2. Od czego zaley wraliwo szczepu bakteryjnego na infekcj bakteriofagiem? 3. Podstawowe techniki pracy z bakteriofagami i ich zastosowanie. 4. ysinka fagowa.

30 wiczenie 10 Temat: Analiza mikrobiologiczna wody do celw sanitarnych Oznaczanie bakterii grupy coli - miano coli I. Wprowadzenie W wodach powierzchniowych, oprcz typowej mikroflory wodnej, mog si te znajdowa mikroorganizmy, ktre zostay wypukane z gleby lub przedostay si do niej wraz ze ciekami. W skad mikroorganizmw ciekowych mog wchodzi bakterie stanowice normaln mikroflor przewodu pokarmowego ludzi i zwierzt oraz mikroorganizmy chorobotwrcze. Woda jest konsumowana w znacznych ilociach, wic jeli nawet zawiera niewielka liczb mikroorganizmw patogennych, moe stanowi rdo zakaenia. Zmusza nas to do prowadzenia staej kontroli sanitarnej wody pitnej, wd zbiornikw powierzchniowych i wody w basenach. O moliwoci wystpowania w badanej wodzie mikroorganizmw patogennych wnioskuje si porednio, badajc obecno tzw. bakterii wskanikowych, ktre stale yj jako saprofity w przewodzie pokarmowym czowieka i zwierzt wyszych. Najwaniejsz bakteri wskanikow jest Escherichia coli, ktra wchodzi w skad tzw. grupy coli. Bakterie z grupy coli to gramujemne paeczki, nieprzetrwalnikujce, wzgldnie beztlenowe, fermentujce laktoz po 48 godz. z wytworzeniem kwasu oraz gazu i tworzce na podou Endo charakterystyczne bordowe kolonie z metalicznym poyskiem. Bakterie z grupy coli dziel si na dwa typy: typ fekalny, w skad ktrego wchodz bakterie fermentujce laktoz z wytworzeniem kwasu i gazu w 37o i 44oC (E. coli) i typ ziemny, w skad ktrego wchodz bakterie ziemne, niezdolne do fermentacji laktozy w 44oC (Citrobacter sp. i Enterobacter sp.). Obecno w wodzie bakterii z grupy coli wiadczy o skaeniu badanej wody ciekami bytowymi lub gleb. Obecno w wodzie bakterii z grupy coli bada si stosujc metod fermentacyjnoprobwkow lub metod filtrw membranowych, w zalenoci od spodziewanego stopnia skaenia badanej wody. Miano coli jest to najmniejsza objto badanej wody (wyraona w cm3), w ktrej znajduj si jeszcze bakterie z grupy coli. Oprcz tego oznacza si te liczb bakterii psychrofilnych i mezofilnych w badanej wodzie, wysiewajc j na agar odywczy i inkubujc pytki odpowiednio w temperaturze 20 i 37oC. II. Cz praktyczna Materia woda wodocigowa woda ze zbiornika naturalnego cieki komunalne 1. Badanie wody wodocigowej. a) Pobra prbk wody wodocigowej. - W tym celu wylot kranu naley wymy, wytrze do sucha i opali palnikiem. - Nastpnie spuszcza wod z kranu przez 10 minut. - Po tym czasie, nie zakrcajc dopywu, pobra okoo 200 ml wody do jaowej kolby 300 ml. Kolb zamkn jaowym korkiem. b) Oznaczy liczb bakterii psychrofilnych i mezofilnych. - W tym celu na 4 pytki Petriego wla po 1 ml pobranej wody. Podoa agar odywczy podoe Eijkmana o skadzie: pepton, laktoza, NaCl, purpura bromokrezolowa

31 - Nastpnie na kad z nich wla 20 ml upynnionego agaru odywczego ostudzonego do temperatury 46o C. - Cao rozprowadzi rwnomiernie po powierzchni pytki. - Po zakrzepniciu dwie pytki inkubowa w 20oC (przez 72 godz.) i dwie w 37oC (przez 24 godz). - Po inkubacji policzy liczb kolonii na pytkach i uredni. Porwna liczb psychrofili i mezofili. c) Oznaczy bakterie z grupy coli. - Do 10 probwek zawierajcych po 10 ml podoa Eijkmana wla po 1 ml wody wodocigowej - 5 probwek inkubowa w 37oC, a 5 w 44oC. - Po 24 i 48 godzinach inkubacji obserwowa zmiany poywki. Zakwaszenie podoa (zmiana barwy podoa z fioletowej na t) i obecno gazu w rurce Durhama wiadcz o wystpowaniu bakterii z grupy coli. Takie zmiany podoa obserwowane w probwkach inkubowanych w obu temperaturach wskazuj na obecno bakterii z grupy coli typu fekalnego. Brak gazu i zakwaszenia po 48 godzinach uznaje si za wynik ujemny. 2. Badanie wody ze zbiornika a) Pobra prbk wody ze zbiornika. b) Oznaczy liczb bakterii psychrofilnych i mezofilnych. - Rozcieczy badan wod 10-1 do 10-4. - Po 0,1 ml kadego z rozciecze wysia na 4 pytki z agarem odywczym. - Dwie z nich inkubowa w 37oC, a dwie w temperaturze pokojowej. - Policzy wyrose kolonie. Na podstawie wzoru z punktu 2c ze str. 4 obliczy liczb bakterii psychrofilnych i mezofilnych w 1 ml badanej wody. Porwna krytycznie wyniki. c) Oznaczy miano coli metod fermentacyjno-probwkow. - Do probwek zawierajcych po 10 ml podoa Eijkmana i rurki Durhama, ponumerowanych od 1 do 10 dodajemy kolejno wg schematu: 1 ml wody nierozcieczonej probwka nr 1 i 2 probwka nr 3 i 4 1 ml wody rozcieczonej 10-1 -2 1 ml wody rozcieczonej 10 probwka nr 5 i 6 1 ml wody rozcieczonej 10-3 probwka nr 7 i 8 -4 1 ml wody rozcieczonej 10 probwka nr 9 i 10 - Szereg probwek o numerach parzystych inkubowa w temperaturze 37oC, a o numerach nieparzystych w 44oC. Obserwacje naley przeprowadzi po 24 i 48 godz. inkubacji. Zakwaszenie podoa (zmiana barwy podoa z fioletowej na t) i obecno gazu w rurce Durhama wiadcz o wystpowaniu bakterii z grupy coli, przy czym jeli takie zmiany podoa obserwuje si w probwkach inkubowanych w 44oC - bakterii z grupy coli typu fekalnego. Ostatnia probwka w szeregu z wynikiem pozytywnym stanowi podstaw do oznaczenia miana coli i miana coli typu fekalnego. Brak gazu i zakwaszenia po 48 godz. przyjmuje si jako wynik ujemny.

32 3. Oznaczy bakterie z grupy coli w ciekach komunalnych metod fermentacyjnoprobwkow a) Przygotowa rozcieczenia badanych ciekw 10-1 do 10-5. b) Oznaczy miano coli metod fermentacyjno-probwkow tak jak w punkcie 2c). III. Zagadnienia do opracowania 1. Waciwe bakterie wodne. 2. Mikroorganizmy chorobotwrcze, ktre mog si dosta do wody wraz ze ciekami. 3. Bakterie wskanikowe wiadczce o skaeniu wody. 4. Sanitarna analiza bakteriologiczna wody. 5. Wykrywanie bakterii grupy coli metod fermentacyjno-probwkow i metod filtrw membranowych. 6. Miano coli i wskanik coli.

33

III. KRTKA CHARAKTERYSTYKA BAKTERII STOSOWANYCH NA WICZENIACH

(na podstawie Bergeys Manual of Systematic Bacteriology, red. J.G. Holt. Williams & Wilkins, Baltimore, 1984-1989, tomy I-IV oraz wydanie II, tom 2, 2005. TYP FIRMICUTES 1. Rodzaj Bacillus (ac. bacillum laseczka/paeczka) Laseczki gramdodatnie, poruszajce si za pomoc rzsek. Wystpuj pojedynczo lub tworz acuszki. Tlenowce lub warunkowe tlenowce. Chemoorganoheterotrofy - s wrd nich prototrofy i auksotrofy. Tworz endospory. Ich pierwotnym siedliskiem jest gleba, ale dziki endosporom mona je izolowa z najrniejszych rodowisk. Niektre gatunki s patogenami, np. B. anthracis (laseczka wglika). a) B. megaterium (laseczka olbrzymia) (gr. mega wielki; gr. teras potwr, bestia) Tworzy acuszki. Centralnie pooone endospory nie powoduj rozdcia komrki macierzystej. Prototrof. Temp. optymalna 30oC. b) B. subtilis (laseczka sienna) (ac. subtilis wysmuky, cienki, niky) Tworzy acuszki. Centralnie pooone endospory nie powoduj rozdcia komrki macierzystej. Prototrof. Temp. optymalna 37oC. atwo mona wyizolowa t bakteri z siana. 2) Rodzaj Clostridium (gr. kloster wrzeciono; clostridium mae wrzeciono) Laseczki gramdodatnie. Beztlenowce. Chemoorganoheterotrofy. Tworz endospory owalne bd okrge, czsto o rednicy wikszej od rednicy komrki macierzystej. Niektre gatunki s chorobotwrcze, np. C. tetani (laseczka tca), C. botulinum (laseczka jadu kiebasianego). a) C. pasteurianum (ac. pasteurianum nalecy do Pasteura) Prototrof zdolny do wizania azotu czsteczkowego. Gromadzi granuloz. Owalne endospory pooone s subterminalnie i powoduj rozdcie komrki macierzystej. Temp. optymalna 30-37oC. Wystpuje w glebie na caym wiecie. 3) Rodzaj Enterococcus (gr. enteron jelito; gr. kokkos pestka, ziarno, jagoda; Enterococcus ziarniak jelitowy) a) Enterococcus faecalis (paciorkowiec kaowy) (ac. faex odchody; faecalis kaowy)

34 Gramdodatni ziarniak wystpujcy w parach i krtkich acuszkach. Nieruchliwy. Lepiej ronie przy obnionym cinieniu tlenu (beztlenowiec aerotolerancyjny lub mikroaerofil). Fermentuje wglowodany z wytworzeniem gwnie kwasu mlekowego (bez gazu). Chemoorganotrof, auksotrof. Wystpuje w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierzt, na owadach i rolinach. Znajdowany rwnie w ywnoci. Zdolny do wzrostu w temp. 10o i 45oC, w obecnoci 6,5% NaCl i pH9,6. Patogen oportunistyczny odpowiedzialny za wiele zakae szpitalnych, np. powoduje infekcje drg moczowych, zakaenia ran pooperacyjnych. 4) Rodzaj Staphylococcus (gronkowce) (gr. staphyle winne grono; gr. kokkos pestka, ziarno, jagoda) a) S. epidermidis (gronkowiec skrny, dawniej gronkowiec biay) (ac. epidermidis skrny) Gramdodatni ziarniak wystpujcy gwnie w postaci dwoinek i tetrad (tworzy te grona). Nieruchliwy. Wytwarza biay barwnik. Warunkowy tlenowiec. Chemoorganoheterotrof, auksotrof. Wzrost w temp. 15o-45oC (temp. optymalna 3037oC). Ronie w podoach zawierajcych do 7,5 % NaCl. Powszechnie wystpuje na skrze i bonach luzowych zwierzt i ludzi. Moe sta si patogenem oportunistycznym. TYP ACTINOBACTERIA 1) Rodzaj Micrococcus (gr. micros may; gr. kokkos pestka, ziarno, jagoda) a) M. luteus (pakietowiec ty) (ac. luteus zoto-ty) Gramdodatni ziarniak tworzcy ukady zoone z 4 komrek (pakiety). Nieruchliwy. Tlenowiec. Chemoorganoheterotrof, auksotrof. Temp. optymalna 25-37oC. Wystpuje w glebie, wodzie, kurzu, mleku i jego przetworach, na skrze ludzi i zwierzt. TYP PROTEOBACTERIA Klasa Alphaproteobacteria 1) Rodzaj Paracoccus (gr. para obok, przy, podobny do; gr. kokkos pestka, ziarno, jagoda) a) P. versutus (ac. versutus zmienny) Gramujemna paeczka. Warunkowy chemolitoautotrof zdolny do wzrostu autotroficznego na podou mineralnym z tiosiarczanem. Prototrof. Ronie chemoorganotroficznie na poywkach zawierajcych rne zwizki organiczne jako jedyne rdo wgla i energii. Tlenowiec. Zdolny do denitryfikacji. Temp. optymalna 30oC. Wystpuje w glebie. Klasa Gammaproteobacteria Rodzina Enterobacteriaceae (paeczki jelitowe) Gramujemne paeczki. Chemoorganoheterotrofy. Warunkowe tlenowce.

35 1) Rodzaj Escherichia (Teodor Escherich mikrobiolog niemiecki, ktry wyizolowa t bakteri) a) E. coli (paeczka okrnicy) (gr. colon jelito grube/okrnica; miejsce wystpowania tej bakterii) Paeczka jelitowa. Warunkowy tlenowiec. Chemoorganoheterotrof. Prototrof. Temp. optymalna 37oC. Wystpuje w jelicie grubym czowieka i licznych zwierzt. Szeroko rozpowszechniona w rodowisku ycia czowieka. Najlepiej poznana bakteria pod wzgldem fizjologicznym i genetycznym. 2) Rodzaj Proteus (paeczka odmieca) (gr. Proteus grecki boek morski zdolny do przybierania rnorodnych ksztatw) a) P. vulgaris (ac. vulgaris pospolity) Bardzo ruchliwa paeczka. W czasie wzrostu na wilgotnych podoach staych komrki wielu szczepw podlegaj cyklicznym przemianom. Formy osiade s krtkie (1-3 m dugoci) i maj nieliczne rzski. Po osigniciu pewnego zagszczenia przeksztacaj si one w formy dugie (20 - 80 m dugoci), posiadajce liczne rzski. Formy dugie migruj (ang. swarming), a nastpnie osiadaj i tworz formy krtkie. Takie powtarzajce si cykle daj w rezultacie wzrost w postaci koncentrycznych piercieni wok pierwotnego punktu posiewu. Bakteria odgrywa wan rol w rozkadzie materii organicznej. W organizmie czowieka jest na og komensalem, ale niekiedy staje si patogenem. Moe powodowa wtrne infekcje u ludzi dorosych, zakaenia ukadu moczowego oraz biegunki i zatrucia u niemowlt. 3) Rodzaj Serratia (Serafino Serrati - woski fizyk) a) S. marcescens (paeczka cudowna. paeczka krwawa) (ac. marcescens zwidy, przekwity) Prototrof. W temp. poniej 30oC wiele szczepw wytwarza czerwony barwnik prodigiozyn. Wystpuje na rolinach, w glebie i wodzie, niekiedy jest komensalem czowieka. Moe by patogenem oportunistycznym u ludzi hospitalizowanych. Inne rodziny 1) Rodzaj Pseudomonas (gr. pseudes faszywy, rzekomy; gr. monas jednostka, monada) Gramujemne paeczki poruszajce si dziki rzskom. Tlenowce, niektre wykorzystuj azotany jako kocowe akceptory elektronw. Wikszo to chemoorganoheterotrofy, prototrofy. Niektre gatunki s warunkowymi chemolitoautotrofami, zdolnymi do wykorzystania H2 lub CO jako rda energii. a) P. fluorescens (paeczka fluoryzujca) (ac. fluorescens fluoryzujca) Chemoorganoheterotrof, prototrof. Nie ronie autotroficznie. Zdolny do denitryfikacji. Temp. optymalna 25-30oC. Wystpuje w wodach i glebie. Moe spowodowa zanieczyszczenie ywnoci. b) P. stutzeri (ac. stutzeri nalecy do Stutzera)

36 Chemoorganoheterotrof, prototrof. Nie ronie autotroficznie. Zdolny do denitryfikacji. Temp. optymalna 30-35oC. Wystpuje w wodach i glebie. 2) Rodzaj Halothiobacillus (gr. hals morze, sl; gr. thios siarka; bacillum paeczka/laseczka) Gramujemne paeczki. Tlenowce. Bezwzgldne chemolitoautotrofy. Uzyskuj energi z utleniania siarki i jej zwizkw nieorganicznych. Niektre szczepy s umiarkowanymi halofilami, wymagajcymi NaCl (opt. st. 0,4-1,0 M). a) H. neapolitanus (ac. neapolitanus neapolitaski) Wyizolowany w 1902 r. z Zatoki Neapolitaskiej. Wystpuje w wodzie morskiej i na korodujcym betonie.

37 IV. ADDENDUM Opis kolonii bakteryjnych

WYGLD OGLNY KOLONII

okrga

nieregularna

nitkowata

strzpiasta

BRZEG KOLONII

gadki

falisty

patkowaty

nitkowaty

zbkowany

WZNIESIENIE KOLONII

paska

wypuka

ppkowata

kraterowata

z waem brzenym

38 V. ZALECANA LITERATURA 1) Kunicki-Goldfinger W.J.H. ycie bakterii. PWN, 2001. 2) Madigan M.T., Martinko J.J., Parker J. Brock biology of microorganisms. Prentice Hall International Inc., London,1997. (oraz wszystkie nastpne wydania tej ksiki) 3) Schlegel H.G. Mikrobiologia oglna. PWN, 1996. 4) Salyers A.A, Whitt D.D. Mikrobiologia rnorodno, chorobotwrczo i rodowisko. PWN, 2003. 5) Baj J., Markiewicz Z. (red.) Biologia molekularna bakterii. PWN, 2006. 6) Ralski A. wiczenia z mikrobiologii oglnej skrypt dla studentw biologii. Wyd. Uniwersytetu dzkiego, d, 1996. 7) Duszkiewicz-Reinhard W., Grzybowski R., Sobczak E. Teoria i wiczenia z mikrobiologii oglnej i technicznej. Wyd. SGGW, Warszawa, 1996. 8) Grabiska-oniewska (red). wiczenia laboratoryjne z mikrobiologii oglnej. Oficyna Wyd. Politechniki Warszawskiej, Warszawa, 1996.