Estudo do ciclo biolgico do tripanossomatdeo Phytomonas serpens no hospedeiro experimental Oncopeltus fasciatus (Hemptera: Lygaeidae)

Aluno: Maria Fernanda Vieira da Cunha Cardoso de Almeida Orientador: Msc. Felipe de Almeida Dias Co-Orientadora: Dra. Angela Hampshire de Carvalho Santos

Novembro de 2007 FICHA CATALOGRFICA

A447e

Almeida, Maria Fernanda de. Estudo do ciclo biolgico do tripanossomatdeo Phytomonas serpens no hospedeiro experimental Oncopeltus fasciatus (Hemptera: Lygaeidae) / Maria Fernanda Vieira da Cunha Cardoso de Almeida. 2007. 29f. : il. (algumas color.) Orientadores: . Felipe de Almeida Dias e Angela Hampshire de Carvalho Santos Monografia (Graduao) Universidade Santa rsula. Instituto de Cincias Biolgicas e Ambientais. Relao hospedeiro-parasito. 2. Hempteros 3. Tripanossomatdeo 4. Tomate Doenas e pragas. I. Dias, Felipe de Almeida. II. Santos, Angela Hampshire de Carvalho. III. Ttulo. 577.857 CDD 21.ed.

ABSTRACT Phytomonas species, parasites of both plants and insects, have recently begun to attract attention due to their role as agricultural parasites. The hemipteran Oncopeltus fasciatus is not only the natural host for Phytomonas elmasiani, but it is also capable of hosting different species of trypanosomatids by experimental infection. The life cycle of Phytomonas spp in the insect host involves the colonization of the intestinal tract, the passage to the haemolymph, and the infection of salivary glands. In the present study we observed the experimental infection of O. fasciatus, which was "cured" from other trypanosomatids that naturally infect its midgut, with P. serpens. The distribution of this parasite along the intestinal tract of the insects was monitored for a month. This study was carried out by means of light and scanning electron microscopy. In the first 24 hours we observed the presence of a great number of parasites in the first and second ventricles (V1 and V2) of the midgut and the absence of parasites in the third and fourth ventricles (V3 and V4). However, after 48 hours, it was observed the opposite, the absence of parasites in the two first ventricles and the third and fourth were filled with flagellates. The infection of V3 and V4 was persistent for 15 days, when the parasites began to reach the hindgut. In the following days, live parasites were observed in fresh feces. RESUMO As espcies de Phytomonas (Trypanosomatidae) so parasitas de plantas e possuem como vetores insetos fitfagos, principalmente da ordem Hemiptera. Ao se alimentar em plantas infectadas com Phytomonas, os insetos ingerem os parasitas, que atravessam a parede intestinal, alcanando a hemolinfa, veculo pelo qual migram at a as glndulas salivares. Com a invaso das glndulas, os parasitas alcanam a saliva e, ento, outras plantas so contaminadas, quando o inseto se alimenta novamente. O hemptero fitfago Oncopeltus fasciatus, alm de ser hospedeiro natural de algumas espcies de tripanossomatdeos, dentre elas a espcie Phytomonas elmasiani, tambm possui reconhecida capacidade de albergar, por infeco experimental, outras espcies desta mesma famlia, motivo pelo qual est sendo utilizado em nosso estudo. Em 1957, Gibbs, analisando tomates da espcie Solanum lycopersicum (Lycopersicum esculentum), encontrou um parasito flagelado, o qual foi denominado Leptomonas serpens e posteriormente Phytomonas serpens. Em 1989, Jankevicius e colaboradores descreveram o ciclo biolgico desta espcie nos hospedeiros naturais Nezara viridula e Phthia picta dando nfase na interao do parasita com as glndulas salivares destes insetos. No presente trabalho, utilizamos o hemptero da espcie O. fasciatus (livre de tripanossomatdeos) como modelo biolgico para o estudo da interao da P. serpens com o trato digestrio de insetos vetores. Previamente, fizemos uma triagem entre as variedades esculentum, pyriforme e cerasiforme de tomates da espcie Lycopersicum esculentun, e detectamos que a inoculao de P. serpens em L. esculentun var. esculentum rende um maior ttulo de infeco. Desta forma, insetos adultos foram alimentados com suspenso de parasitas cultivados em Lycopersicum esculentun var. esculentum e, posteriormente, dissecados. As regies anatmicas do trato digestrio foram separadas e processadas para a microscopia ptica e eletrnica de varredura. Devido aos experimentos que envolvem microscopia serem mais prolongados e requererem maior nmero de

repetio do processo experimental, o trabalho ainda no est fechado, se encontrando em processo de finalizao at o final do ms de outubro.
PALAVRAS CHAVE: Trypanossomatidae, Inseto fitfago, Solanum lycopersicum, ciclo biolgico.

Este trabalho foi realizado no Laboratrio de Bioqumica de Microrganismos do departamento de Microbiologia Geral do Instituto de Microbiologia Prof. Paulo de Ges da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ). Apoio: FAPERJ, CNPq and CNPq/PIBIC-UFRJ.

AGRADECIMENTOS Agradeo de corao a todos que de qualquer forma participaram desta etapa da minha vida. Obrigada, mesmo. Um obrigada especial para todos do meu laboratrio, principalmente Felipe, por todas as atenes que me foram dadas, pela compreenso, pelo apoio, pela pacincia, pelas risadas. Agradeo demais a Angela por me receber com todo o carinho e me considerar uma aluna sem distino. Um obrigada ao laboratrio do lado por toda a parceria que existe, foi muito bom ter todos na minha vida. Queria agradecer a todos da minha faculdade, Universidade Santa rsula, a todos os funcionrios que acima de qualquer problema desejam o melhor para todos os alunos, fazendo sempre o possvel para que tudo fique bem. So funcionrios que trabalham com o corao. Aprendi com este trabalho que conhecimento nunca demais, quero ter dentro de mim sempre a fora para busc-los. O obrigada mais importante dedicado aos meu pais, pelo apoio e investimento, pela confiana e pelo amor que eles me dedicam todos os dias, ganhei um prmio de ter pais como os meus. Obrigada ao resto da minha famlia, minha irm (Xerinha), Tereza e Carol, pelo apio dirio e s por saber que vocs esto ali, j fico em paz. Obrigada ao meu nego por ter feito desses ltimos tempos de correria, dias de mais pura felicidade. Termino com um poema de Fernando Sabino que reflete ao meu momento: De tudo, ficaram trs coisas: A certeza de que estamos sempre comeando... A certeza de que precisamos continuar... A certeza de que seremos interrompidos antes de terminar... Portanto devemos: Fazer da interrupo um caminho novo...

Da queda um passo de dana... Do medo, uma escada... Do sonho, uma ponte... Da procura, um encontro... SUMRIO

ABSTRACT & RESUMO.....................................................................................3 AGRADECIMENTOS..........................................................................................5 SUMRIO.............................................................................................................6 1. Introduo 1.2 Famlia Trypanosomatidae...............................................................................7 1.3 Gnero Phytomonas.........................................................................................7 1.4 Espcie Phytomonas serpens...........................................................................8 1.5 Solanum lycopersicum (L. esculentum)...........................................................8 1.6 Insetos vetores de Phytomonas........................................................................9 2. Materiais & Mtodos 2.1 Colnia e insetos...............................................................................................11 2.2 Estabelecimento da colnia de insetos curados................................................11 2.3 Phytomonas serpens.........................................................................................11 2.4 Microscopia ptica..........................................................................................12 2.5 Microscopia eletrnica de varredura................................................................12 2.6 Infeco experimental dos insetos com P. serpens crescida em meio Warren............................................................... ........... .................12 2.7 Infeco de tomates com P. serpens................................................................12 2.8 Curva de crescimento da P. serpens nas variedades de L. esculentum............14 2.9 Infeco experimental dos insetos com parasitas crescidos no tomate............14 3. Resultados & Discusso 3.1 3.2 Infeco experimental dos insetos com parasita crescido em meio Warren...........................................................................................................16 Infeco do inseto por parasitas crescidos em tomate........................ ....18 4. Concluso....................................................................................................21 6

Bibliografia.....................................................................................................22

1. INTRODUO 1.1 Famlia Trypanosomatidae: Os tripanossomatdeos atualmente esto divididos em treze gneros, de acordo, principalmente, com aspectos morfolgicos e especificidade por hospedeiros. Dos treze gneros, oito so constitudos por parasitos monoxnicos (desenvolvem todo o seu ciclo de vida em um hospedeiro invertebrado) e cinco por parasitos heteroxnicos (durante o seu ciclo de vida necessitam de dois hospedeiros distintos para completar seus ciclos invertebrado e planta ou invertebrado e vertebrado, dependendo do gnero) (Vickerman, 1994). Estes microrganismos tm sido amplamente utilizados como modelos biolgicos em diversas reas da cincia, como a biologia celular e molecular, gentica, evoluo, imunologia, bioqumica e fisiologia (Wallace, 1966; Vickerman, 1976; Wallace, 1979; Dutra, 2000; Romeiro, 2001). A famlia Trypanosomatidae apresenta tambm grande importncia na rea mdica, j que possui constituintes potencialmente patognicos para o homem, e na rea econmica, devido aos prejuzos que causam no setor agropecurio (Wallace, 1979; McGhee & Cosgrove, 1980; Vickerman, 1994; Camargo, 1999). 1.2 Gnero Phytomonas: Em 1909, foi descoberto que tripanossomatdeos poderiam infectar plantas (revisto por Camargo, 1999). Diferentes famlias de vegetais so conhecidamente capazes de abrigar, por infeco natural e/ou artificial, parasitos da famlia Trypanosomatidae (Revisto por Camargo, 1999). Os tripanossomatdeos do gnero Phytomonas constituem modelos biolgicos interessantes para muitos estudos, j que seu ciclo evolutivo ocorre em condies bem diferenciadas, seja no trato digestivo e nas glndulas salivares de insetos, no ltex, nos vasos condutores de seiva, em frutos e sementes de vrios tipos de vegetais (revisto por Camargo, 1999). Os processos envolvidos na interao destes parasitos com seus 7

hospedeiros (Jankevicius et al., 1989; Kastelein & Camargo, 1990; Jankevicius, 1992) permanecem pouco estudados e, portanto, pouco entendidos.

1.3 Espcie Phytomonas serpens: Em 1957, Gibbs, analisando frutos da planta Solanum lycopersicum (tomate), encontrou um parasito flagelado, o qual foi denominado de Leptomonas serpens e posteriormente reposicionado como Phytomonas serpens por Podlipaev (1986). Em 1989, Jankevicius e colaboradores pesquisando a presena de Phytomonas em plantas laticferas, na cidade de Londrina (Estado do Paran), observaram que duas espcies de insetos (Phthia picta e Nezara viridula), que se alimentavam nestas plantas, tambm se alimentavam em tomates (Lycopersicum sculentum), nos quais constatou-se a presena de flagelados da espcie P. serpens. Neste estudo ficou demonstrado que P. serpens possui pelo menos dois insetos fitfagos vetores para tomates, Ph. picta e N. viridula. Ainda neste trabalho foi observado, em tomates, o aparecimento de manchas amareladas nos locais onde foram picados pelos insetos, manchas essas que foram atribudas atividade metablica do tripanossomatdeo, j que tomates picados por insetos no infectados, criados em laboratrio, no apresentaram tais manchas. 1.4 Solanum lycopersicum (Lycopersicum esculentum): O tomate foi originalmente denominado de Solanum lycopersicum por Linnaeus (1753). Philip Miller no Gardeners Dictionary, em 1768, utilizou a denominao Lycopersicon esculentum e este se tornou o nome aceito at hoje. As variedades foram originadas do tomate cereja, lycopersicum esculentum var. (Heiser and Anderson, 1999). A trs variedades da espcies de S. Lycopersicum, utilizadas neste trabalho, podem ser definidas da seguinte forma: L.esculentum var. esculentum - nome popular: tomate salada L.esculentum var. cerasiforme nome popular: tomate cereja L.esculentum var. pyriforme nome popular: tomate italiano

As variedades so analisadas em relao fruta, intensidade da cor, forma, qualidade, hbito de crescimento, e morfologia da folha (Grandioso et al., 1996; Carrinha der Knaap et al., 2002; Frank et al. Holtan e Mar luzam peixe Yates et al., 2004). H atualmente uma enorme variedade de tomates, muitos desenvolvidos a partir de manipulao gnica. Muitas pesquisas esto sendo realizadas no tomate para garantir resistncia doena e tambm um maior rendimento. Cultivos novos de tomates vm aparecendo no mercado todos os anos, expandindo a seleo e melhorando a resistncia da doena (Heiser and Anderson, 1999).

VARIEDADE DE TOMATES Imagem retirada do site: www.taps.org.br/Paginas/agroartigoai01.html - Foto: ROBERTO CARRA

1.5 Insetos vetores de Phytomonas: Os insetos, baseando-se nas especificidades alimentares, foram divididos por Brues (1946) em quatro grandes grupos: parasitas, herbvoros, predadores e saprfitos, considerando parasitas aqueles que se alimentam em animais, herbvoros aqueles que se alimentam de plantas (fitfagos) ou fungos (micetfagos), predadores aqueles que se alimentam de outros insetos e saprfitos aqueles que se alimentam de matria em decomposio.

Em lavouras, os insetos, alm de serem polinizadores e controladores de pragas, podem tambm agir como vetores e disseminadores de doenas causados por microrganismos. Entre essas doenas esto, as causadas por tripanossomatdeos do gnero Phytomonas, que tm insetos fitfagos como seus vetores (revisto por Camargo, 1999). No que diz respeito transmisso de flagelados aos insetos hospedeiros na natureza, observa-se que esta ocorre por via oral, pela ingesto de fluidos de vegetais infectados, como a seiva e o ltex (Wallace, 1966; Jankevicius, 1992), ou por coprofagia direta e indireta (Gibbs, 1950; Mcghee & Hanson, 1962). Isso torna possvel a transmisso de tripanossomatdeos de inseto para inseto e permite que esses atuem no somente como vetores, mas tambm como reservatrios de doenas de plantas. O parasitismo dos tripanossomatdeos em insetos ocorre, geralmente, sem causar dano ao seu hospedeiro, desde que este esteja em bom estado nutricional (Vickerman, 1962; Wallace, 1966; Romeiro, 1997). O gnero Oncopeltus, da famlia Lygaeidae, abriga algumas espcies de insetos vetores de tripanossomatdeos parasitas de vegetais (Vickerman, 1962; Hanson & McGhee, 1963; McGhee & Hanson, 1964). Em 1925, Holmes observou que o hemptero Oncopeltus fasciatus era capaz de transmitir tripanossomatdeos para plantas. Por abrigar diferentes espcies de tripanossomatdeos por infeco natural ou experimental (Hanson & McGhee, 1963; McGhee & Hanson, 1964; Romeiro, 1997; Romeiro et al., 2000; Romeiro et al., 2003), e ser de fcil manuteno, em colnias em laboratrios, o O. fasciatus mostrou-se um importante modelo nos estudos de interao entre tripanossomatdeos e seus insetos hospedeiros.

FOTO DE TODAS AS FASES DE VIDA DO INSETO, ONCOPELTUS FASCIATUS. Foto: Arquivo pessoal de Felipe de Almeida Dias. 2007

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2. MATRIAS & MTODOS 2.1 Colnia de insetos: Neste trabalho foram utilizados insetos da espcie Oncopeltus fasciatus naturalmente infectados com o tripanossomatdeo Leptomonas wallacei (Romeiro et al., 2000). A partir de exemplares originrios da colnia do Dr. Alexandre Romeiro, do Instituto de Biofsica Carlos Chagas Filho (UFRJ) conseguimos estabelecer uma nova colnia em nosso laboratrio. Os insetos foram mantidos em potes plsticos, a 26oC, e alimentados com gua filtrada e sementes de girassol descascadas. A partir da colnia de insetos infectados, estabelecemos uma colnia de insetos curados. 2.2 Estabelecimento da colnia de insetos curados: Trs dias aps a postura, os ovos foram colhidos da colnia de insetos infectados e tratados, por 5 min, a 28oC, com hipoclorito de sdio a 2%, e, em seguida, em etanol a 70%. Aps a ecloso, as ninfas foram alimentadas at a fase adulta da mesma forma descrita anteriormente. Os insetos adultos foram, ento, dissecados e seu trato intestinal observado por microscopia ptica e eletrnica de varredura para checar a eficcia da metodologia. A ausncia de parasitas, ou seja, a cura dos insetos, foi confirmada por microscopia ptica e eletrnica de varredura. 2.3 Phytomonas serpens: Os parasitos da espcie Phytomonas serpens (isolado 9T, CT-IOC-189) foram mantidos em meio Warren modificado (infuso de crebro e corao a 37 g/L, cido flico a 10 g/L e hemina a 1mg/L), suplementado com 10% de soro fetal bovino, a

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26oC. Os repiques das culturas foram realizados a cada 48 h, em tubos de rosca (13x100mm) contendo 5 ml de meio.

2.4 Microscopia ptica: Insetos adultos das colnias parental e curada tiveram o trato digestivo dissecado em PBS e o contedo das diferentes regies do trato digestrio (V1, V2, V3, V4 e reto) fixados em lmina e corados com corante de Giensa. As lminas foram analisadas em microscpio Axioplan 2 (Zeiss, Germany) e as imagens captadas pela cmera digital Color View SX. 2.5 Microscopia eletrnica de varredura: Insetos adultos das colnias parental e curada tiveram o trato digestivo dissecado em PBS, fixado em sacarose 3,7%, p-formaldedo 4%, glutaraldedo 2,5% em tampo Cacodilato 0,1 M. Os ventrculos 3 e 4, e o reto foram separados, secos pelo mtodo do ponto crtico com CO2 no aparelho Balzers CDP-20 (Balzers Union, Frstentun Liechstenstein) e cobertos com ouro no aparelho Balzers modelo FC- 9646. As observaes e micrografias foram feitas em microscpio eletrnico Jeol JSM-5310. Da mesma forma foram processados os ovos e as fezes dos insetos das colnias parental e curada. 2.6 Infeco experimental dos insetos com P. serpens crescida em meio Warren: Foram separados 80 insetos no 5o estgio de ninfa. Aps a passagem para a fase adulta, os insetos foram colocados na ausncia de gua por 15 horas. Em seguida, no bebedouro dos insetos, foi colocada, ao invs de gua, uma suspenso de P. serpens (105cels/ml) em soluo salina (NaCl 0,89 %). A cada 48 horas aps a infeco, grupos de insetos eram dissecados, como previamente descrito, e o contedo das diferentes regies do trato digestrio, e as glndulas salivares foram analisadas por microscopia ptica e eletrnica de varredura. 12

No grupo de insetos controle, no lugar da suspenso de parasitas, foi administrada apenas soluo salina. 2.7 Infeco de tomates com P. serpens: Os tomates foram adquiridos no supermercado da linha Hortifruti, e foram utilizadas as variedades salada, italiano e cereja da marca Taeq. Todos em fase de maior amadurecimento, com pigmentao vermelha.

DO LADO ESQUERDO, FOTO DE TOMATE MADURO, LADO DIRETIO TOMATE VERDE, E NO MEIO VARIAES NA MATURIDADE.
Imagem retirada do site: www.feagri.unicamp.br/.../consumidordicas2.htm

O processo de higiene dos tomates envolveu o uso de Clor-in, que um poderoso potabilizador a base de cloro orgnico cujo princpio ativo o dicloroisocianurato de sdio. Este produto, apresentado na forma de comprimidos, elaborado para tratamento de gua para consumo humano, eliminando os microorganismos causadores das doenas de veiculao hdrica. Foram utilizados 2 comprimidos para cada litro de gua. Esta dosagem deixa um residual aproximado de 20 PPM de Cloro livre por litro de gua. Os tomates foram tratados por 15 min nessa soluo (clor-in + gua). Depois do processo de limpeza foram retirados os tomates e espalhados em uma bacia, aonde permaneceram por 30 min no fluxo laminar expostos luz UV. Aps a permanncia na luz UV, ocorreu o processo de inoculao nos tomates, atravs de seringa Hamilton, injetando 5 l de soluo salina contendo 5x104 parasitas. Foram escolhidos 3 pontos do tomate e colocado uma etiqueta de identificao em cada parte selecionada, ao redor dessas etiquetas foram realizadas 5 inoculaes com a seringa, como mostra a foto abaixo:

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Foto: Arquivo pessoal de Felipe de Almeida Dias. 2007

Aps esse processo, os tomates foram guardados em estufa a 22oC, passado o tempo de 24 h foi realizada a primeira anlise. A anlise foi realizada nos trs diferentes pontos do tomate, aonde foi extrado o endosperma e analisado atravs da contagem de parasitas em cmara de Neubauer, sendo inseridos 10 l de cada regio. Essas anlises formaram a curva de crescimento descrita no prximo tpico. A cada 48 horas aps a infeco, 3 tomates eram dissecados, sendo analisados por microscopia ptica. 2.8 Curva de Crescimento da P.serpens nas variedades de L. esculentum: A grfico foi feito atravs do programa SIGMAPLOT, aonde foram includos resultados referentes a 4 meses de experimento. 2.9 Infeco experimental dos insetos com parasitas crescidos no tomate: Foram separados 80 insetos no 5 estgio de ninfa. Aps a passagem para a fase adulta, os insetos foram colocados na ausncia de gua por 15 horas. Em seguida, no bebedouro dos insetos, foi colocada, ao invs de gua, uma suspenso de P. serpens, crescida no tomate (105cels/ml), em soluo salina (NaCl 0,89 %). A cada 48 horas aps a infeco, grupos de insetos eram dissecados, como previamente descritos, e o contedo das diferentes regies do trato digestrio, a

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hemolinfa e as glndulas salivares foram analisados por microscopia ptica e eletrnica de varredura. No grupo de insetos controle, no lugar da suspenso de parasitas, foi administrado apenas soluo salina.

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3. Resultados & Discusso 3.1 Infeco experimental dos insetos com parasita crescido em meio Warren Os parasitas foram recolhidos por centrifugao do meio Warren e lavados com salina para que, desta forma, pudessem ser colocados no bebedouro dos insetos. Os insetos ficaram 15h sem ingerir gua. Desta forma, logo que foi oferecida a soluo A (P.serpens + salina) os insetos rapidamente ingeriram o contedo. A soluo A foi retirada do contato com os insetos aps 12h, voltando a ser administrada gua. Foram separados 5 insetos, para dissecao, a cada 24h. Aps 3 dias(72h) de infeco, o intervalo de anlise ficou a cada 48h. O processo de dissecao envolveu a utilizao de microscpio estereoscpio (lupa), aonde foram separadas as regies de anlise (V1, V2, V3,4 e reto), demonstrado em vermelho na prxima foto:

FOTO DO APARELHO DIGESTRIO DO INSETO FITFAGO ONCOPELTUS FASCIATUS

Imagem retirada de: Hood, C. W. (1937). Ohio J. Science. Vol. XXXVII 151-160.

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A freqncia da P.serpens no fitfago O. fasciatus est demonstrada na tabela abaixo.

Regies anatmicas do inseto

1dia 24h

2dia 24h

3dia 24h

5dia 48h

7dia 48h

9dia 48h

11 dia 48h

13 dia 48h

15 dia 48h

17 dia 48h

V1

+/-

V2

+/-

+/-

V3,4

+/-

+/-

Reto

LEGENDA O Ausncia de P.serpens +/- Baixa presena de P.serpens + Alta presena de P.serpens A presena alta da P.serpens na regio V1 do inseto nas primeiras 24h justificada por ser a regio mais prxima da rea de suco sendo o primeiro local de passagem do parasita. Esta regio tem o pH mais cido, o que nos leva a pensar que seja difcil a permanncia do parasita neste local. Este fato fica claro nas prximas 24h aonde aparece a diminuio da freqncia do parasito, sendo observado que com 72h de infeco no mais encontrado P.serpens nesta regio. Na regio V2 foi observado presena baixa do parasita e o seu surgimento somente aps 24h da infeco. Com 48h de infeco foi observada presena alta do parasita, explicada pelo tempo normal que o parasita leva na passagem do V1 para o V2. Foi observado que aps os 3 primeiros dias de infeco o parasita no mais observado na regio, levando a pensar que o desaparecimento seja causado pela sua passagem para o V3,4.

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As regies V3,4 s apresentaram a presena do parasita aps 1 semana da infeco. Este tempo de demora devido ao percurso que o parasita teve que percorrer pelas regies V1, V2. O parasita mostrou presena alta depois do 9 dia, permanecendo alta por 24h. Aps esse perodo foi constatado uma diminuio da P.serpens at chegar ao ponto do seu desaparecimento, no 15 dia de infeco. No foram observados parasitas na regio do reto por todo o tempo de experimentao, o que nos remete achar que o parasita no foi eliminado pelas fezes. Acreditamos que o parasita no conseguiu estabelecer a infeco no inseto e no obteve xito na colonizao das regies estomacais do O.fasciatus, o que causou o seu completo desaparecimento. 3.2 Infeco do inseto por parasitas crescidos em tomate Os parasitas foram recolhidos do meio Warren por centrifugao e lavados com salina para que desta forma pudessem ser inoculados nos tomates. Os tomates, aps serem lavados e ficarem imersos na gua clorada, foram retirados, separados em uma bandeja e logo aps foram colocados no fluxo laminar sob exposio luz UV, por 30 min. Aps esse tempo foi iniciado o processo de infeco em todos os tomates das trs variedades (salada, cereja e italiano). Aps a inoculao foram recolocados na bandeja e guardados na estufa 22C, sendo feitas anlises de 48h em 48h como mostra a curva de crescimento abaixo:

3000

2500

Nmero de parasitas x 104

2000

1500

1000

500

10

15

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25

Dias aps a inoculao dos parasitas

Variedade salada Variedade italiano Variedade cereja

Como observado

foi o 18

tomate L.esculentum var. esculentum (variedade salada) foi a variedade em que a P.serpens apresentou o maior ndice de crescimento. Dessa forma foi a espcie de tomate utilizada para o crescimento de parasitas que foram oferecidos aos insetos. Um fato observado foram os tomates infectados apresentarem sinal de deteriorizao maior que os tomates do controle , o que nos faz acreditar que a P. serpens deixa o local mais favorvel aos organismos invasores como por exemplo bactrias fitopatognicas.

TOMATE INFECTADO COM P.SERPENS, EM PROCESSO DE DETERIORIZAO Foto: Arquivo pessoal de Felipe de Almeida Dias. 2007

O principio da infeco foi a retirada do bebedouro aonde os insetos ficaram 15h sem ingerir gua, desta forma logo que foi oferecida a soluo B (extrato do tomate + P.serpens lavada em salina) os insetos rapidamente ingeriram o contedo. A soluo B foi retirada do contato com os insetos aps 12h voltando a ser administrada gua. Foram separados 5 insetos, para dissecao, a cada 24h. Aps 3 dias(72h) de infeco, o intervalo de anlise ficou a cada 48h. O processo de dissecao foi o mesmo do experimento anterior, no qual o inseto se alimentou do parasita vindo de meio axnico. A freqncia da P.serpens no fitfago O. fasciatus est demonstrada na tabela a seguir.

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Regies anatmicas do inseto

1dia 24h

2dia 24h

3dia 24h

5dia 48h

7dia 48h

9dia 48h

11 dia 48h

13 dia 48h

15 dia 48h

17 dia 48h

V1

+/-

+/-

V2

+/-

+/-

V3,4

+/-

Reto

LEGENDA O Ausncia de P.serpens +/- Baixa presena de P.serpens + Alta presena de P.serpens Foi observado que nas primeiras 24h o parasita ainda no aparecia em nenhuma regio do trato digestrio do inseto. Aps essas primeiras horas foi constatado o aparecimento da P.serpens, em baixa quantidade, na regio V1. Aps outras 24h a quantidade de parasita foi desaparecendo desta regio, at que foi constatada sua ausncia por completo. Na regio V2, s a partir do 3 dia (72h de experimento), o parasita aparece em pouca quantidade, desaparecendo aps 48h. Na regio V3,4 foi encontrada presena baixa de P. serpens aps 7 dias de experimento, ficando por apenas algumas horas, constatando-se aps, seu desaparecimento por completo. No reto no foi encontrado parasita em nenhum momento, o que nos remete a achar que o parasita no foi eliminado pelas fezes.

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4. CONCLUSO O experimento de crescimento do parasita em tomates foi realizado aps o experimento que utilizava o parasita crescido em meio axnico. Acreditamos que o parasita sofreria alguma alterao e se tornaria infectante para o inseto, aps a passagem pelo tomate. Como pde ser observado o parasita no conseguiu estabelecer infeco no inseto, j que as duas formas de estabelecer a infeco de P.serpens que utilizamos no obtiveram xito. Percebemos que P.serpens consegue infectar o inseto, mas no se perpetua devido a alguma ao vinda do inseto como uma defesa, ou uma ao do parasita que no tem o ambiente adequado para proliferar. Muitos fatores podem ser comentados para explicar a ausncia de parasita aps alguns dias no trato digestrio do inseto. Um fator principal que o inseto utilizado no presente trabalho no o hospedeiro natural do parasita P. serpens, logo no possui a coneco perfeita para estabelecer uma colonizao, como foi dito anteriormente o O. fasciatus foi usado como hospedeiro experimental. Pensamos que seria possvel essa interao devido ao parasita possuir como hospedeiro um inseto de caractersticas fisiolgicas muito parecidas com o O. fasciatus, assim as interaes no seriam prejudicadas pois o metabolismo seria praticamente igual. Um estudo mais detalhado poderia revelar a verdadeira causa, um trabalho que comparasse os dois insetos checando quais as diferenas que no permitem a permanncia do parasito. O trabalho teve um resultado interessante que poder envolver mais estudos no futuro, a P. serpens quando foi inoculada no tomate provocou alguma reao que causou uma proliferao de bactrias, aparecendo um muco esbranquiado. No nos aprofundamos nesse assunto, mas ficou constatado que o parasita usado no trabalho pode oferecer uma quantidade de informaes muito maior do que existem no momento atual, representando uma pea chave para estudos de controle biolgico em tomateiros.

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BIBLIOGRAFIA

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