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Stage MAFPEN

CHROMATOGRAPHIE

26 et 28 Janvier 1998

Edith ANTONOT Robert MARCHAL

Lyce Louis Vincent - METZ

Stage MAFPEN - Chromatographie

Chromatographie: thorie
Bibliographie: "Chimie organique exprimentale" Auteurs: Chavanne, Beaudoin, Jullien, Flamand . Editeur: Belin "Analyse chimique (mthodes et techniques instrumentales modernes)" Auteur: Rouessac . Editeur: Masson "144 manipulations de chimie gnrale et minrale" Auteur: Defranceschi. Editeur : Ellipses cours de chromatographie en phase gazeuse de Jean UMBER, professeur au lycee Louis Vincent. 1. Chromatographie: aspects gnraux: 1.1. Dfinitions: La chromatographie est une mthode physique de sparation base sur les diffrences d'affinits des substances analyser l'gard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la sparation des composants entrans par la phase mobile, rsulte soit de leur adsorption et de leur dsorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilit diffrente dans chaque phase. On dfinit un coefficient de partition K: masse de solut dans la phase stationnaire par unit de volume K = masse de solut dans la phase mobile par unit de volume On peut classer les mthodes chromatographiques d'aprs la nature des phases utilises ou celle des phnomnes mis en oeuvre dans la sparation. Nature des phases: Phase fixe: La phase fixe peut tre solide ou liquide. Les solides, silice ou alumine traites, permettent la sparation des composants des mlanges grce leurs proprits adsorbantes. Ils peuvent tre employs comme remplissage d'une colonne (chromatographie par gravit et chromatographie haute performance ou HPLC) ou tals en couche mince sur une plaque de verre, d'aluminium ou sur une feuille de matire plastique (chromatographie sur couche mince ou CCM) La phase fixe peut aussi tre constitue par un liquide imprgnant un support solide ou encore par une chane carbone fixe sur un support (phase greffe). ainsi en chromatographie sur papier, la phase fixe est forme par l'eau que les molcules de cellulose du papier adsorbent, alors qu'en chromatographie en phase gazeuse, elle est constitue d'un liquide peu volatil et thermiquement stable imprgnant un granul poreux. Phase mobile: 26 et 28 Janvier 1998 Page 1

Stage MAFPEN - Chromatographie La phase mobile est: soit un gaz (ex: chromatographie en phase gazeuse): la phase mobile est appele gaz vecteur ou gaz porteur. soit un liquide (ex: chromatographie sur papier, couche mince ou colonne): la phase mobile est appele luant. Nature des phnomnes: On distingue quatre types de phnomnes que nous allons tudier successivement: chromatographie d'adsorption chromatographie de partage chromatographie ionique chromatographie d'exclusion 1.2. Chromatographie d'adsorption: Elle est illustre par la sparation chromatographique classique, sur colonne remplie ou sur couche mince, des composs molculaires.

Phnomnes d'adsorption et de partage. 26 et 28 Janvier 1998 Page 2

Stage MAFPEN - Chromatographie a) l'adsorption est un phnomne d'interface la diffrence de l'absorption (reproduit avec l'autorisation de M. Lagus, L'Actualit Chimique 1990, (1) p.l7) b) lorsqu' la surface du gel de silice on greffe une monocouche d'hydrocarbure, les molcules, qui prsentent une partie lipophile et l'autre hydrophile, s'orientent l'interface comme en tmoigne l'exemple de l'orang d'acridine en phase aqueuse. (Chem. & Eng. News 1991, 69(37) p.25). Polarit des phases: Les sparations sont bases sur le principe de polarit c'est dire l'existence de diples. Phase mobile: Le pouvoir luant d'un liquide dpend de sa propre polarit. Les liquides classs cidessous le sont par polarit croissante. On obtient ainsi une srie luotropique. ther de ptrole cyclohexane ttrachloromthane trichlorthne tolune benzne dichloromthane ther dithylique trichloromthane thanoate d'thyle pyridine propanone propan-1-ol thanol mthanol eau acide thanoque Adsorbants: Les adsorbants figurant dans la liste ci-dessous sont classs selon l'ordre croissant de leurs forces d'interactions avec des composs polaires. Papier, cellulose Kieselguhr, terre de diatomes Amidon Sucres Talc Carbonate de sodium Oxyde de magnsium Gel de silice Alumine Charbon activ Le gel de silice et l'alumine sont les adsorbants les plus utiliss. En gnral, plus un adsorbant est actif, plus il retient fortement les composs polaires. Il est cependant 26 et 28 Janvier 1998 Page 3

Stage MAFPEN - Chromatographie possible de traiter un adsorbant pour modifier ses capacits d'adsorption et ses proprits: Plus la teneur en eau d'un adsorbant est faible (ce qui a pour consquence la prsence d'un plus grand nombre de sites d'adsorption pour le solut), plus il est polaire ou actif. Interactions entre le compos analyser et les deux phases: Lorsque les soluts sont neutres, l'ordre d'adsorption sur un adsorbant polaire comme le gel de silice ou l'alumine est le mme que celui prsent pour les solvants. Les soluts apolaires (ex: alcanes) sont peu adsorbs alors que les soluts polaires (ex: mthanol) le sont fortement. Par contre, on utilisera de prfrence l'alumine pour sparer des soluts basiques comme les amines et le gel de silice pour les phnols et les acides car les soluts acides sont fortement adsorbs par l'alumine alors que les soluts basiques le sont par la silice. 1.3. Chromatographie de partage: Elle est fonde sur la diffrence de solubilt des substances sparer dans deux fluides parfaitement miscibles. Elle est mise en pratique en chromatographie sur papier. Un des fluides est un liquide retenu sur un support inerte et constitue la phase stationnaire. L'autre, liquide ou gaz en dplacement, constitue la phase mobile.Le facteur principal qui intervient est le coefficient de partage entre chaque phase.On peut sparer des soluts dont les coefficients de partage entre les deux phases sont diffrents. Les plus solubles dans la phase mobile se dplacent plus facilement que ceux qui le sont moins. Un autre facteur qui intervient est la polarit de la phase: ainsi en HPLC on peut utiliser des phases stationnaires peu ou non polaires, la phase mobile tant polaire (eau ou mlange eau - mthanol): on parlera alors de chromatographie de partage polarit de phase inverse. 1.4. Chromatographie ionique: La phase mobile est une solution tampon aqueuse et la phase stationnaire la plus courante est constitue de polystyrne sous forme de sphres de quelques micromtres de diamtre, lesquelles ont t chimiquement transformes en surface pour faire apparatre des sites ioniques. Ces phases permettent l'change de leurs contre-ions mobiles avec des ions, de mme signe, prsents dans la phase mobile. La sparation repose sur les coefficients de distribution ionique entre les deux phases. 1.5. Chromatographie d'exclusion: La phase stationnaire est gnralement un polymre poreux dont les pores ont des dimensions choisies en rapport avec la taille des espces sparer. On ralise une sorte de tamis l'chelle molculaire, dit permation slective. Le coefficient de partition s'appelle dans ce cas le coefficient de diffusion. Cette technique est encore appele filtration sur gel ou permation de gel selon la nature de la phase mobile (aqueuse ou organique). Le diamtre des pores est une caractristique de chaque type de gel. Un mlange de soluts de masses molaires variables traverse une paisseur donne de gel: les grosses molcules, celles dont le diamtre est suprieur celui des pores, sont exclues et lues les premires; les petites et moyennes molcules sont lues plus tardivement, car incluses, leur migration est freine en diffusant dans le gel. 26 et 28 Janvier 1998 Page 4

Stage MAFPEN - Chromatographie La sparation est donc ralise par le fait que les soluts sont lus dans l'ordre inverse des masses molaires.

2 Chromatographie sur couche mince (CCM) 2.1.Dfinition et appareillage: La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phnomnes d'adsorption : la phase mobile est un solvant ou un mlange de solvants, qui progresse le long d'une phase stationnaire fixe sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matire plastique ou d'aluminium. Aprs que l'chantillon ait t dpos sur la phase stationnaire, les substances migrent une vitesse qui dpend de leur nature et de celle du solvant. Les principaux lments d'une sparation chromatographique sur couche mince sont: la cuve chromatographique : un rcipient habituellement en verre, de forme variable, ferm par un couvercle tanche. la phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autre adsobant est fixe sur une plaque de verre l'aide d'un liant comme le sulfate de calcium hydrat (pltre de Paris) l'amidon ou un polymre organique. l'chantillon : environ un microlitre (l) de solution dilue ( 2 5 %) du mlange analyser, dpos en un point repre situ au-dessus de la surface de l'luant. l'luant : un solvant pur ou un mlange : il migre lentement le long de la plaque en entranant les composants de l'chantillon. 2.2.Principe de la technique. Lorsque la plaque sur laquelle on a dpos l'chantillon est place dans la cuve, l'luant monte travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarit. En outre, chaque composant de l'chantillon se dplace sa propre vitesse derrire le front du solvant. Cette vitesse dpend d'une part, des forces lectrostatiques retenant le composant sur la plaque stationnaire et, d'autre part, de sa solubilit dans la phase mobile. Les composs 26 et 28 Janvier 1998 Page 5

Stage MAFPEN - Chromatographie se dplacent donc alternativement de la phase stationnaire la phase mobile, l'action de rtention de la phase stationnaire tant principalement contrle par des phnomnes d'adsorption. Gnralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarit migrent plus rapidement que les composants polaires. 2.3.Applications de la CCM. Lorque les conditions opratoires sont connues, elle permet un contrle ais et rapide de la puret d'un compos organique. Si l'analyse, ralise avec divers solvants et diffrents adsorbants, rvle la prsence d'une seule substance, on peut alors considrer que cet chantillon est probablement pur. De plus, tant donn que la chromatographie sur couche mince indique le nombre de composants d'un mlange, on peut l'employer pour suivre la progression d'une raction. La chromatographie sur couche mince est galement la technique habituellement employe pour rechercher le meilleur solvant, avant d'entreprendre une sparation par chromatographie sur colonne. 2.4.Adsorbants et plaques chromatographiques. Par ordre d'importance dcroissante, les adsorbants employs en CCM sont : le gel de silice, l'alumine, le kieselguhr et la cellulose. Les plaques vous seront fournies prtes l'emploi. 2.5.Choix de l'luant. L'luant est form d'un solvant unique ou d'un mlange de solvants. Un luant qui entrane tous les composants de l'chantillon est trop polaire; celui qui empche leur migration ne l'est pas suffisamment. Une mthode simple pour trouver l'luant appropri consiste prparer des solutions de l'chantillon dans diffrents solvants, en concentration d'environ 2 5% en volume. A l'aide d'une micropipette, on dpose une goutte de chaque solution sur une plaque, chacune spare d'environ 1 cm. Le meilleur luant est celui qui, lorsqu'il a termin sa migration, a entran le solut une distance d'environ la moiti de celle qu'il a parcourue.

Une autre mthode consiste dposer une solution des substances analyser en plusieurs points, spars d'environ 2 cm. Aprs schage, on applique au centre de chaque point une micropipette remplie de solvant; Aprs diffusion, l'luant qui convient spare les soluts.

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Choix de l'luant dans le cas d'analyses : d'hydrocarbures : hexane, ther de ptrole ou benzne. de groupements fonctionnels courants : hexane ou ther de ptrole mlangs en proportions variables avec du benzne ou de l'ther dithylique forment un luant de polarit moyenne. de composs polaires : thanoate d'thyle, propanone ou mthanol. 2.6.Dpt de l'chantillon. L'chantillon est mis en solution (2 5 %) dans un solvant volatil, qui n'est pas forcment le mme que l'luant : on emploie frquemment le trichloromthane (chloroforme),la propanone ou le dichloromthane.La solution est dpose en un point de la plaque situ environ 1 cm de la partie infrieure. Il est important que le diamtre de la tache produite au moment du dpt soit faible; idalement, il ne devrait pas dpasser 3 mm. Ce sont gnralement les dpts les moins tals qui permettent les meilleures sparations. Pour augmenter la quantit dpose, il est toujours prfrable d'effectuer plusieurs dpts au mme point, en schant rapidement entre chaque application plutt que de dposer en une seule fois un grand volume d'chantillon qui produirait une tache plus large. L'chantillon est dpos l'aide d'une micropipette ou d'un tube capillaire en appuyant lgrement et brivement l'extrmit de la pipette sur la couche d'adsorbant en prenant soin de ne pas le dtriorer. On peut aussi utiliser l'extrmit, un peu mousse, d'un cure-dent. On vrifie l'identit des composants prsums d'un chantillon, en procdant un dpt spar d'une solution de chacun d'eux puis celui de leur mlange. Ces solutions tmoins permettent de comparer la migration de chaque compos avec celle de l'chantillon analyser. 2.7.Dveloppement de la plaque. Le dveloppement consiste faire migrer le solvant sur la plaque. Dans les analyses usuelles de laboratoire, le principal type de dveloppement est la chromatographie

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Stage MAFPEN - Chromatographie ascendante : la plaque est place en position verticale dans une cuve et le solvant qui en recouvre le fond monte par capillarit. Le niveau de liquide est ajust environ 0,5 cm du fond de la cuve; on place souvent du papier filtre contre les parois de la cuve pour saturer plus rapidement la cuve en vapeurs d'luant et viter les effets de bords.Pendant le dveloppement du chromatogramme, la cuve doit demeurer ferme et ne pas tre dplace. Lorsque la position du front du solvant arrive environ 1 cm de l'extrmit suprieure, la plaque est retire de la cuve, le niveau atteint par le solvant est marqu par un trait fin, puis la plaque est sche l'air libre ou l'aide d'un schoir. 2.8.Rvlation. L'identification des substances isoles se fait selon diffrentes mthodes (valable galement pour la chromatographie sur papier): directement si les substances sont colores l'aide de rvlateurs si elles sont incolores afin de les transformer en taches colores; les produits sont souvent dcels par leurs ractions fonctionnelles classiques: les acides amins par la ninhydrine qui donne avec la plupart une couleur bleu-violet, les acides organiques par des indicateurs colors, les sucres par le ractifde Molisch qui utilise le pouvoir rducteur des sucres. Quelques ractifs comme l'iode ou le permanganate donnent des colorations non spcifiques avec la plupart des composs organiques. toutes les ubstances ayant une absorption dans la rgion au-dessus de 230 nm sont tudies sur des supports additionnns de corps fluorescents par irradiation de lumire UV ondes courtes (max< 254 nm). L'emploi de couches non additionnes de produits fluorescents permet aussi la mise en vidence de beaucoup de substances dans l'UV ondes courtes (max <254 nm) ou ondes lon,gues (max > 366 nm) par suite de la fluorescence propre des composs. Dans tous les cas, il faut noter les positions des taches colores juste la fin de la chromatographie en les cerclant car certains produits disparaissent avec le temps. 2.9.Calcul de Rf (retarding factor ou rapport frontal) Erreur ! di : distance parcourue par le compos (mesure au centre de la tache) ds : distance parcourue par le front du solvant Pour un couple luant et support dtermin, Rf est une caractristique de chaque solut la temprature de l'exprience. Rf est toujours indpendant dfe la longueur de bande utilise. 2.10.Description d'une analyse par CCM selon l'ordre chronologique. Prparation de la cuve chromatographique. Introduire l'luant ou le mlange de solvants. Ajuster le niveau environ 0,5 cm du fond de la cuve.

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Fermer le rcipient (la cuve doit tre sature de vapeur de solvant). Pour que la saturation et l'lution soient plus rapides, on peut placer une bande de papier filtre contre les parois de la cuve chromatographique. Dpt de l'chantillon sur la plaque. Procder au nettoyage de la plaque si ncessaire. Dissoudre l'chantillon dans un solvant appropri en solution de 2 5 % . Dposer environ 0,5 l de la solution en un point situ 1 cm de l'extrmit infrieure de la plaque; le diamtre de la tache doit tre d'environ 2 mm pour la disposition de plusieurs produits. Scher l'aide d'un schoir;ventuellement faire de nouvelles applications Dveloppement du chromatogramme. Placer la plaque dans la cuve en position verticale. Refermer le rcipient. Lorsque le front du solvant se trouve environ 1 cm de l'extrmit suprieure de la plaque, la retirer et marquer cette position.(le trait peut tre trac l'avance et servir de repre pour arrter l'lution). Rvlation et calcul de Rf Scher la plaque l'aide d'un schoir Rvler les taches sous une lampe U V ou l'aide d'un rvlateur Cercler les taches et pointer leur centre. Calculer les Rf

3. Chromatographie sur papier: 3.1. Principe de la technique et applications: La technique ressemble celle de la CCM mais le principe repose sur des phnomnes de partage. La phase mobile est le plus souvent un solvant organique et l'eau; la phase stastionnaire est constitue par l'eau elle-mme adsorbe sur la cellulose du papier ou lie chimiquement elle. Comme en chromatographie sur couche mince, l'chantillon, mis en solution, est dpos en un point repre du papier et le solvant, qui se dplace par capillarit, fait migrer les composants de l'chantillon des vitesses variables selon leur solubilit. Gnralement, les composs les plus solubles dans l'eau ou ceux qui forment facilement des associations par liaisons hydrogne sont fortement retenus par la phase stationnaire et migrent donc lentement. Lorsque l'eau est un des solvants de la phase mobile, le ou les solvants organiques doivent y tre assez solubles. Des produits comme l'acide thanoque, le propanol, le phnol ou la pyridine sont les solvants les plus frquemment utiliss en mlange avec de l'eau pour dvelopper un chromatogramme. La chromatographie sur papier est employe principalement pour l'analyse de composs trs polaires, tels les acides amins, les sucres et les composs polyfonctionnels. Ses plus grands inconvnients par rapport la CCM sont:

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une dure de dveloppement beaucoup plus longue une sparation gnralement moins bonne.

3.2. Papier: On peut utiliser du papier filtre ordinaire, mais il est prfrable de se procurer du papier conu pour cet usage, ayant un faible taux d'impurets et dont les caractristiques sont uniformes. Les marques principales sont Whatman, Schleicher et Schll, Durieux, Arches. Il existe huit catgories de papier Whatman, classs selon leur paisseur, la texture de leur surface et la vitesse avec laquelle l'eau y diffuse. Par exemple le papier Whatman n 1 est le plus utilis, mais si on dsire une grande vitesse d'coulement, on emploiera le n 4; le papier n 20 est trs lent, mais il permet une meilleure sparation , donnant des taches trs denses et uniformes. La description de l'analyse par chromatographie sur papier est identique celle sur couche mince. 4. Chromatographie sur colonne: Alors que les autres mthodes chromatographiques sont habituellement employes pour l'analyse et la sparation de trs faibles quantits de produits, la chromatographie sur colonne peut tre une mthode prparative; elle permet en effet la sparation des constituants d'un mlange et leur isolement , partir d'chantillons dont la masse peut atteindre plusieurs grammes. Elle prsente cependant plusieurs inconvnients: de grandes quantits de solvant sont ncessaires l'lution la dure de l'lution est gnralemnt trs grande la dtection des composs exige une attention constante. Elle est adapte la purification de faibles quantits de produit, lorsque les conditions opratoires sont au point. Cependant, la mthode tant trs empirique, sa mise au point ncessite souvent de nombreux essais. 4.1. Description et principe: C'est une technique base sur des phnomnes d'adsorption. La phase solide, le plus souvent l'alumine ou la silice, remplit une colonne de longueur et de section variables; l'chantillon, en solution concentre, est dpos en haut de la colonne et la sparation des composants rsulte de l'coulement continu d'un luant, traversant la colonne par gravit ou sous l'effet d'une faible pression. On peut utiliser comme luant un solvant unique ou bien accrotre progressivement la polarit de l'luant de faon acclrer le dplacement des composs. Les molcules sont entranes vers le bas des vitesses variables selon leur affinit pour l'adsorbant et leur solubilit dans l'luant. Le chromatogramme se dveloppe en formant une succession de zones cylindriques qui se sparent en migrant vers le bas. A mesure que chaque zone s'coule de la colonne, on la recueille. 4.2. Facteurs dont dpend la sparation: Quatre facteurs interviennent: l'adsorbant l'luant 26 et 28 Janvier 1998 Page 10

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la dimension de la colonne la vitesse d'lution

Adsorbant: Le plus utilis est l'alumine; cependant, on la limitera aux composs organiques stables car, sous sa forme basique, elle peut provoquer la dshydratation des esters par exemple. Le gel de silice est galement frquemment utilis pour la sparation de composs qui n'ont pas une stabilit suffisante pour tre traits par l'alumine. La granulomtrie de l'adsorbant doit tre suprieure celle des adsorbants utiliss en CCM. Leur taille est habituellement comprise entre 50 et 200 m. La quantit d'adsorbant dpend de la difficult de la sparation et de la masse d'chantillon.On peut considrer que pour chaque gramme d'chantillon, il faut 30 50 g d'adsorbant si la polarit des composants sparer est trs diffrente et jusqu' 200 g si la sparation est difficile. Eluant: L'luant est en gnral un mlange de deux solvants. Au dbut de l'lution, on commence par le solvant le moins polaire qui entrane les substances les moins retenues par l'adsorbant (les moins polaires). Ensuite on fait varier la composition de l'luant en additionnant graduellement le solvant le plus polaire. Ainsi les composs les plus polaires, retenus sur l'adsorbant, ne migreront que graduellement vers le bas de la colonne.

Dimension de la colonne: Les colonnes spcialement conues pour cet usage ont leur base une plaque de verre fritt ou de porcelaine qui permet l'coulement libre de l'luant tout en empchant le passage de l'adsorbant. On peut aussi utiliser une burette, au fond de laquelle on place un tampon de laine de verre et du sable. La quantit d'adsorbant est telle qu'il occupe une hauteur gale environ 10 fois le diamtre de la colonne. Il faut galement prvoir un espace de 10 cm environ au-dessus de l'adsorbant pour placer le solvant. Vitesse d'lution: Elle doit tre la plus constante possible. Il faut qu'elle soit suffisamment lente pour que le solut soit au plus prs de l'quilibre entre les phases liquide et adsorbe. Elle ne doit pas tre trop lente car sinon les substances diffusent dans le solvant et on obtient des bandes de plus en plus larges et une sparation mdiocre. 4.3. Remplissage de la colonne: C'est l'opration le plus dlicate car le remplissage doit tre le plus homogne possible et exempt de bulle d'air. Les surfaces infrieure et suprieure de l'adsorbant doivent tre parfaitement horizontales. La colonne tant verticale, le remplissage peut tre ralis selon deux mthodes au choix.

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Stage MAFPEN - Chromatographie Remplissage par voie humide: On prpare dans un bcher un mlange homognis de l'adsorbant et du moins polaire des solvants utilis pour le dveloppement en ajoutant par petites quantits l'adsorbant dans le solvant pour obtenir une bouillie suffisamment fluide pour couler facilement. A l'aide d'un entonnoir, on verse suffisamment de bouillie pour que l'adsorbant qui se dpose progressivement forme une couche d'environ 2 cm. On tapote les parois de la colonne pour favoriser le tassement de l'adsorbant. On ouvre alors le robinet pour que le solvant s'coule lentement et on poursuit l'addition de la bouillie homognise par portions successives. Quand tout l'adsorbant est introduit, on laisse dcanter jusqu' ce que le liquide qui surnage soit limpide. Pendant l'opration,on doit veiller ce que le niveau de solvant soit toujours suprieur celui de l'adsorbant. Remplissage par voie sche: La colonne est remplie au deux tiers par le moins polaire des deux solvants et l'adsorbant en poudre est ajout en portions successives dans la colonne l'aide d'un entonnoir; pendant l'addition, on frappe continuellement sur les parois pour obtenir un tassement maximal. Quand la premire portion forme une couche d'environ 2 cm, on ouvre le robinet pour faire couler lentement le solvant. On termine comme prcdemment. 4.4. Dpt des produits analyser: Ils doivent former une zone cylindrique troite dans le haut de la colonne. Un liquide est dpos tel quel. Un solide sera dissous dans le minimum du moins polaire des deux solvants . On ajuste d'abord le niveau de solvant pour qu'il soit juste au-dessus de celui de l'adsorbant. A l'aide d'une pipette, on coule l'chantillon au sommet de la colonne de faon uniforme sur toute la surface de la colonne sans la dformer. Si ncessaire, on ajuste nouveau, comme prcdemment, le niveau de liquide de la colonne : l'chantillon est ainsi adsorb uniformment au sommet de la colonne. On peut placer un verre fritt ou une rondelle de papier filtre au-dessus de l'adsorbant pour prvenir une remise en suspension de l'adsorbant. 4.5. Elution: On peut alimenter la colonne en continu l'aide d'une ampoule de coule ou bien ajouter manuellement l'luant. Dans tous les cas, la surface de l'adsorbant ne doit jamais tre au contact de l'air. En quelques minutes, une colonne laisse sec se dtriore: des fissures apparaissent dans la phase fixe et toute lution ultrieure se transforme en ruissellement. Pour la plupart des oprations, une vitesse de 5 50 gouttes la minute convient (la limite infrieure correspond aux sparations difficiles) Lorsque l'analyse des fractions est termine, on runit celles qui correspondent des produits identiques, en prenant soin d'liminer celles qui correspondent des recouvrements de zones. Les substances obtenues de cette faon sont gnralement d'une trs grande puret.

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Stage MAFPEN - Chromatographie 5. Chromatographie en phase gazeuse (CPG): Le principe de la sparation par C.P.G. consiste partager l'chantillon analyser entre deux phases. L'une de ces phases est un liquide stationnaire uniformment rparti sous forme d'une pellicule mince sur un solide inerte de grande surface spcifique, tandis que l'autre phase est un gaz mobile qui s'coule travers l'ensemble stationnaire. 5.1.Description d'un chromatographe.
Seringue Injecteur Manodtendeur vers un dbimtre Manomtre Enregistreur Dtecteur Thermostats

Bouteille de gaz comprim

Colonne
Thermostat de colonnne

Four

Ventilateur

Intgrateur ou ordinateur

Un chromatographe est constitu en premire approximation de trois organes essentiels : l'injecteur le dtecteur la colonne Injecteur: Il permet d'introduire un liquide qui doit tre vaporis instantanment avant d'tre transfr dans la colonne. Sa temprature doit tre suprieure d'environ 20C la temprature du produit le moins volatil. La figure suivante le reprsente: le gaz porteur, de prfrence prchauff, entre dans une chambre chauffe, obture par une pastille dlastomre, le septum, qui assure ltanchit. A laide dune seringue hypodermique de petite capacit, on pique au travers du septum, afin que lextrmit de laiguille arrive au-dessous du niveau de larrive du gaz porteur, puis on pousse le piston pour raliser linjection.

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introduction de la seringue crou ailettes pour serrage et refroidissement du septum

septum

Il faut que la chambre dinjection ait un volume aussi petit que possible, pour limiter les volumes morts du chromatographe. D'autre part,si on observe des baisses de pression dans le circuit gazeux, cela indique souvent quil faut changer le septum, us par les multiples injections. Il ne faut pas oublier de nettoyer la seringue dinjection avec un solvant volatil aprs chaque injection, puis de la scher convenablement.

bloc chauff

chambre de vaporisation
raccord de colonne

Dtecteur: Il permet de mettre en vidence le passage des diffrents gaz spars par la colonne. La dtection peut tre base sur des techniques de mesures diffrentes. Le dtecteur le plus utilis en CPG est celui conductibilit thermique appel catharomtre. (cas de notre chromatographe) Sa temprature est gnralement la mme que celle de l'injecteur. Catharomtre Le catharomtre est un appareil simple et robuste, rponse universelle, mais relativement peu sensible. Il est fond sur une comparaison continuelle entre le flux de chaleur emport par le gaz vecteur pur et le flux de chaleur emport par le gaz vecteur charg des molcules de solut. Ces flux de chaleurs sont produits par des thermistances, parcourues par un courant continu de tension fixe, dans une enceinte thermostate avec prcision.

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gaz vecteur pur G gaz vecteur contenant les soluts


En faisant passer le gaz vecteur contenant les constituants spars sur la cellule du dtecteur, nous obtiendrons un signal chaque fois que l'un des constituants se prsentera dans la cellule car la conductibilit thermique du gaz vecteur (qui traverse le dtecteur) varie quand le constituant X traverse le dtecteur. L'lment sensible du capteur est un fil de platine parcouru par un courant constant (I 1200 mA). Quand l'quilibre entre l'apport d'nergie par effet Joule et la dissipation d'nergie par conduction et rayonnement est atteint, le fil prend une temprature d'quilibre qui est fonction de la conductibilit thermique du milieu gazeux o est plac le fil. Le passage d'un constituant diffrent dans le dtecteur va modifier cette conductibilit, d'o une variation de la temprature du fil et par consquent de sa rsistance lectrique. L'lment sensible est incorpor dans l'une des branches d'un pont de Wheatstone. Dans l'autre branche est plac un fil absolument identique, mais qui est toujours plac dans le gaz porteur pur et dont la rsistance sera donc constante; on constitue ainsi deux cellules, l'une de mesure et l'autre de rfrence. Le pont est mis l'quilibre en absence de solut inject. Quand un constituant passe dans la cellule de mesure (port par le gaz vecteur), un dsquilibre apparait. Il est amplifi et mesur par l'enregistreur dont la dviation est proportionnelle la diffrence de potentiel apparue. Pour obtenir la plus grande rponse pour un solut donn, il est donc ncessaire quil y ait la plus grande diffrence possible entre la conductivit de ce solut et celle du gaz porteur. A cet effet, on utilise pratiquement toujours lhydrogne (danger dexplosion) ou lhlium comme gaz vecteur.

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Stage MAFPEN - Chromatographie Dtecteur ionisation de flamme.


0V 300V
flamme

Cest un dtecteur beaucoup plus sensible que le catharomtre, mais moins universel, car il ne donne de rponse quaux composs organiques. Il a aussi linconvnient, contrairement au catharomtre, de dtruire le solut qui le traverse, car son principe est de brler, dans une flamme dhydrogne, leffluent apport par de lazote (gaz vecteur). Sous leffet dun champ lectrostatique, il se forme des ions carbone de charge positive qui sont prcipits sur une lectrode o ils crent un courant dionisation que lon amplifie grce un lectromtre amplificateur. Sur un enregistreur, on obtient par consquent un signal proportionnel au dbit-masse du solut dans le dtecteur. En fait, il nest pas exactement proportionnel au nombre datomes de carbone du compos concern, car il y a une influence dfavorable des autres atomes que C et H. Par contre, il est inutile de placer ce dtecteur dans une enceinte thermostate.

hydrogne

Colonne

Dtecteur capture dlectrons. Une source telle que le tritium

( H) ou le (
3

63

Ni envoie des lectrons libres dans le

dtecteur. Quand ce dtecteur est travers par des substances ayant une affinit pour les lectrons libres, il se produit des ions qui, comme pour le dtecteur ionisation de flamme, dans le champ lectrostatique existant, sont recueillis par une lectrode et forment un courant dionisation amplifier convenablement. Performances des dtecteurs Catharomtre 1 10 ng (tous composs) Dtecteur ionisation de flamme Dtecteur capture dlectrons 20 100 pg (composs organiques) 0,1 pg (composs halogns)

Colonne: C'est l'organe principal. Elle est constitue d'un tube gnralement mtallique de diamtre intrieur de l'ordre du millimtre. Ce tube contient la phase stationnaire constitue par un liquide adsorbant fix sur un solide inerte ( ex : brique pile, alumine etc... soigneusement calibre) On distingue les colonnes remplissage proprement dit, constitues dune tubulure en verre, acier ou autre mtal (les plus frquentes sont en acier inoxydables), dont les dimensions varient de 2 6 mm pour le diamtre intrieur et de 1 10 m pour la longueur. Le support remplissant la colonne est constitu de grains dont les dimensions varient de 60 70 m; ils sont base soit de matriau rfractaire soit de silice. La phase 26 et 28 Janvier 1998 Page 16

Stage MAFPEN - Chromatographie stationnaire est un liquide peu volatil, formant environ 10% de la masse du support non imprgn. Par ailleurs, on utilise des colonnes capillaires, formes dun tube de mtal, de verre, de silice fondue ou de quartz, dont le diamtre intrieur est de lordre de 0,2 0,5 mm et la longueur de 50 100 m, ou davantage. Ladsorbant y est fix sous forme dune fine couche colle la paroi du tube, ou bien la phase stationnaire est fixe en film mince, sans support, sur cette mme paroi. Dans tous les cas, ces colonnes comportent un canal central largement ouvert, offrant peu de pertes de charge la progression du gaz porteur. La russite d'une bonne sparation chromatographique dpend dans une large mesure du choix de la phase stationnaire. On distingue les phases apolaires et les phases polaires. Les premires sont base dhydrocarbures aliphatiques saturs ou de silicones (squalane, apiezon,...). Les secondes sont des polymres possdant des fonctions polaires: polyols, polyesters, polyamides. En gnral, les phases polaires retiennent plus les composs polaires, alors que ceux-ci sortent plus rapidement des colonnes apolaires que les composs du mme nom. Les adsorbants les plus classiques sont les adsorbants minraux, tels le charbon actif, lalumine, les tamis molculaires. Ils sont pratiquement indispensables pour lanalyse des gaz, car ceux-ci sont peu solubles dans les phases stationnaires, et donc mal spars par elles. Cependant, la dsorption de ces gaz sur les adsorbants est lente, ce qui provoque gnralement des tranes des pics. On utilise aussi des adsorbants organiques haut poids molculaire. Ce sont des copolymres (du type styrne + divinylbenzne). Ils ont lavantage de permettre toutes sortes danalyses

CH

CH 2 + CH 2

CH

CH

CH 2

Performances des colonnes. Une colonne remplissage bien prpare peut atteindre une efficacit de lordre de 1 500 plateaux thoriques par mtre, soit HEPT = 0,66 mm (Voir cette notion dans l'annexe I). Les colonnes capillaires atteignent facilement 2 000 10 000 plateaux thoriques par mtre, soit HEPT compris entre 0,5 et 0,1 mm. On ne doit jamais effectuer danalyse CPG sans avoir stabilis lensemble de lappareil en dbit de gaz vecteur et en temprature pendant au moins deux heures. En dehors des priodes dutilisation, les colonnes doivent tre bouches pour viter lhumidit pouvant se solubiliser dans la phase stationnaire, ainsi que loxydation de celle-ci. La temprature de la colonne est en gnral infrieure de 20C celle du point d'bullition du solut le plus volatil. Plus la temprature de colonne est basse, meilleure est la sparation, mais cela risque d'allonger le temps d'analyse. Le choix de la phase stationnaire conditionne la bonne sparation des constituants.Il faudra la choisir polaire ou apolaire en fonction de la nature des substances sparer. 26 et 28 Janvier 1998 Page 17

Stage MAFPEN - Chromatographie Le gaz employ (phase mobile) est un gaz inerte (hlium ou azote). Le gaz utilis par notre installation est l'hlium. Ce gaz vecteur ou gaz porteur pousse les constituants travers la colonne. En chaque point de cette dernire, il se produit un quilibre entre la fraction du constituant en phase stationnaire et en phase mobile. Il s'agit de chromatographie de partage. L'ensemble des organes dcrits ci-dessus est plac dans des enceintes thermostates des tempratures programmes selon la disposition des organes et la nature de l'chantillon analyser. 5.2. Analyse qualitative en CPG: Gnralits: Si on injecte un mlange de plusieurs liquides dans la colonne par l'intermdiaire de l'injecteur, ces liquides sont transforms en gaz, lesquels sont entrans dans la colonne par le gaz vecteur. La phase stationnaire selon sa constitution, va plus ou moins retenir slectivement chacun des produits. Les vitesses de progression seront diffrentes pour chaque constituant. Nous arriverons ainsi luer le mlange, c'est dire sparer dans l'espace et dans le temps les diffrents composants du mlange. On appelle coefficient de partage K pour un constituant X : Masse de constituant X par unit de volume de phase stationnaire K = Masse de constituant X par unit de volume de phase mobile Ce coefficient de partage est un des paramtres qui conditionne la dure de parcours de la colonne par le constituant. Si les autres paramtres (temprature, dbit gazeux) sont constants, alors pour un mlange analyser, la dure de parcours sera diffrente pour chaque constituant si leurs coefficients de partage sont diffrents. Cette dure est appele temps de rtention. Moyennant un talonnage pralable avec des produits purs, la CPG permet donc l'analyse qualitative des constituants d'un mlange. Allure du chromatogramme Un chromatogramme correct est compos de pics de forme symtrique, pas trop larges et bien spars. C'est en jouant sur les conditions opratoires que l'on arrive un tel chromatogramme. Les facteurs favorables une bonne sparation sont : des temps de rtention suffisamment diffrents (choix de la colonne) des pics peu largis. Diffrence entre temps de rtention. Le principal paramtre est la diffrence entre les coefficients de partage de chaque constituant. Ce dernier dpend beaucoup de la temprature et de la longueur de la colonne. Une diminution de la temprature du four entrane une augmentation du temps de rtention.

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Stage MAFPEN - Chromatographie Une augmentation de la longueur de la colonne augmente les temps de rtention mais s'accompagne souvent d'un largissement des pics. Largeur des pics L'obtention de pics larges est due au fait que les multiples quilibres de rpartition des constituants entre les deux phases (liquide et gazeuse) durant leur sjour dans la colonne, au lieu de s'tablir sur une longueur extrment faible de la colonne s'tablissent en fait sur une longueur non ngligeable que l'on appelle plateau thorique. 5.3. Analyse quantitative en C.P.G: Une fois identifi(s) le (ou les) solut(s) intressant(s), le chromatogramme permet aussi une analyse quantitative grce la relation : mi : masse du solut i inject mi= Ki Ai Ai : aire du pic reprsentant ce solut Ki : coefficient de proportionnalit Il est donc ncessaire de dterminer pour chaque solut la valeur de Ki Ki dpend en outre du dbit gazeux, de la temprature du dtecteur ainsi que de l'intensit du courant qui le traverse. Mesure de laire des pics. On utilise essentiellement la triangulation manuelle et lintgration automatique. (c'est cette dernire mthode qui sera utilise ici.) Quand les pics sont trs pointus et trs troits, on peut se contenter des mesures des hauteurs H , alors proportionnelles aux aires. Dtermination du coefficient de proportionnalit. Il est impossible avec les chromatographes courants de calculer le coefficient de proportionnalit par mesure directe de laire du pic enregistr quand on introduit une masse exacte, connue, dun solut dun injecteur. Les seringues dinjection ne permettent pas de reprer le volume dchantillon avec une prcision suffisante. On aura donc recours des mthodes dtalonnage, qui, comme en analyse qualitative, feront de la chromatographie quantitative un procd relatif vis--vis de substances connues. Voici les principales mthodes utilises. Normalisation interne. On considre ici, en premire approximation, que tous les Ki sont gaux (principalement dans les sries homologues telles que alcanes, alcools, etc..). On obtient alors les pourcentages en masse de chaque solut de la manire suivante:
Yi % = Ai 100 Ai
i

Mthode des ajouts doss.

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Stage MAFPEN - Chromatographie Le principe est le suivant: on prend dabord le chromatogramme du mlange de soluts tudier. Admettons que lon cherche dterminer le pourcentage en masse du compos n 2. On va obtenir laire du pic correspondant A2 , et lon dtermine galement celle dun pic voisin, par exemple A3. On pse ensuite exactement une masse M de ce mlange voisine de 1g par exemple. Puis un y rajoute une masse m0 du compos n2, connue exactement, voisine de 300 mg environ. Le chromatogramme du nouveau mlange donne deux aires A2 et A3. Dmontrons maintenant le rsultat suivant:
% en masse = m0 100 A' A3 M 2 1 ' A2 A3

Soit M0 la masse initiale de mlange, et m0i les masses des divers constituants de ce mlange. On en pse exactement une fraction M qui contient les masses mi des constituants. Grce la seringue chromatographique, on injecte dans la colonne une masse contenant les masses i des constituants. Nous allons nous intresser aux constituants n2 et n3. Comme les rapports des masses des constituants dun mlange se conservent dans toute fraction de ce mlange, il vient:
m02 m 2 2 = = M0 M et m03 m3 3 = = M0 M

(1)

A la masse M prpese, on rajoute alors une masse m0 pese prcisment de compos n2. En appelant la masse injecte et i les masses des constituants de , il vient:
m3 ' = 3 M + m0 ' et m2 + m0 '2 = ' M + m0

(2)

A3

premire injection

A' 3

' A2

deuxime injection

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Stage MAFPEN - Chromatographie En admettant que tout ce qui a t inject sort de la colonne, on a :
2 = K 2. A 2 , '2 = K 2 . A '2 2 A2 = '2 A '2 , 3 = K 3. A 3 3 A 3 = ' ' 3 A 3
' ' , 3 = K 3. A 3

Do nous liminons les constantes de proportionnalit:


et

Le rapport de ces galits donne:


2 '3 A 2 A '3 = '2 3 A '2 A 3

(3)

(1) et (2) nous donnent dautre part:


'3 m3 = ' 2 m 2 + m0 et 2 m2 = 3 m3

En combinant (3) et (4), nous obtenons une relation o seul m2 est inconnu:
m2 m3 A A' m2 = '2 3 = m3 m 2 + m0 A 2 A 3 m2 + m0 m2 = m0 A '2 A 3 1 ' A2 A3 m0 100 A' A3 M 2 1 ' A2 A3

Le pourcentage en masse de 2 dans le mlange est donc:


%age en masse =

La mthode demande une bonne linarit de la rponse du dtecteur chromatographique, ce qui nest pas toujours le cas. Nous supposerons cependant que le dtecteur utilis en TP, le catharomtre, prsente cette qualit. talonnage interne Dans cette mthode, on compare individuellement chacun des pics valuer au pic dune substance talon E , convenablement choisie, introduite en proportion connue dans le mlange analyser. il convient videmment que le pic talon ne soit confondu avec aucun des pics du chromatogramme. On peut crire: me = K e A e
soit: mi K A = i i me K e A e

; On dfinit alors K i e =

Ki Ke

On calculera donc la rponse de chaque solut concern par rapport ltalon. La mthode est gnrale. Elle est prcise et reproductible.

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Stage MAFPEN - Chromatographie Elle suppose nanmoins le choix dun talon qui, outre la ncessit de ne pas chevaucher avec les autres soluts, doit donner un pic de valeur de rtention proche de celle du pic mesurer, daire approximativement gale celle du pic du solut, et dont la rponse doit se situer dans la zone de linarit du dtecteur utilis.

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Chromatographie: Liste des expriences proposes


1. Chromatographie sur couche mince (CCM)

Isomrisation de l'azobenzne Sparation des pigments du paprika Chromatographie de parfums (Rvlation par les U.V) Chromatographie des produits rsultant de l'oxydation de l'alcool benzylique (Rvlation par les U.V) Chromatographie d'acides amins rsultant de l'hydrolyse de l'aspartame (Rvlation par la ninhydrine) Chromatographie de glucides (Rvlation par le ractif de Molisch) Chromatographie de produits odorants Etude par CCM (adsorbant: cellulose) des anthocyanines de fruits et lgumes CCM "autour de la lavande"

2. Chromatographie sur papier


Encres Sparation de cations mtalliques Etude des colorants alimentaires des M et M's Recherche de l'acide malique dans le vin

3. Chromatographie sur colonne


Sparation des pigments des feuilles Sparation de colorants Sparation des colorants d'un sirop de menthe Dtermination de la "somme des cations" d'une eau minrale en utilisant une rsine changeuse d'ions Exemple de chromatographie d'exclusion

4. Chromatographie en phase gazeuse


Etude d'un mlange d'alcools Mthode de l'talon interne: Dosage de l'thanol du vin par CPG Pinacol-pinacolone

5. Une chromatographie que l'on peut porter

Chromatographie sur T- shirt

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CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM)

1. Isomrisation de l'azobenzne: Bibliographie: "Chimie organique exprimentale" Auteurs:Blanchard ...Editeur : Hermann Cette raction peut illustrer le paragraphe sur les ractions photochimiques et le principe de la vision en option sciences exprimentales de 1re S. L'azobenzne --N = N-- est commercialis sous forme de l'isomre E. Sous l'action de la lumire, il se transforme partiellement en isomre Z. Dissoudre 0,1 g d'azobenzne dans 4 mL de tolune et verser rapidement la solution dans un tube essai bouch et plac dans un manchon qui le maintient l'obscurit. Avec un capillaire, on dpose un peu de solution 1 cm environ du bord infrieur d'une plaque de silice pour CCM. La tache doit faire de 3 4 mm de diamtre. On pourra effectuer le dpt en plusieurs fois pour viter l'talement. Laisser scher et clairer fortement pendant 1 H 30 2H l'aide d'une lampe de bureau. Dposer ensuite 2 cm de la premire tache et mme distance du bord infrieur, une tache de solution conserve l'abri de la lumire. En luant au tolune, on observe que la tache qui a t claire se ddouble: l'isomre Z form par photoisomrisation migre plus lentement que l'isomre E, seul prsent dans le produit non clair (l'isomre Z, plus polaire, est mieux retenu par la silice). On pourra mesurer les Rf correspondant aux deux isomres. 2. Sparation des pigments du paprika: Bibliographie: "Chimie des couleurs et des odeurs" Auteurs : Capon, Courilleau-Haverlant, Valette Editeur: Cultures et techniques, IUFM de Nantes Placer dans un ballon de 100 mL, 2 grammes de paprika commercial et 20 mL de dichloromthane. Chauffer reflux pendant 30 minutes. Filtrer. La solution obtenue renferme tous les pigments du paprika qui ont t extraits par le dichloromthane. Procder la CCM (3 dpts sur la mme plaque) Adsorbant : gel de silice Eluant : dichloromthane Rvlateur: inutile, les pigments apparaissent sous forme de taches colores que l'on peut facilement identifier. Questions : a)Quel est le nombre de pigments du paprika ? b)Existe-t-il des pigments prpondrants ? 26 et 28 Janvier 1998 Page 24

Stage MAFPEN - Chromatographie c) Calculer les diffrents Rf. Remarques: On trouve parfois dans un mode opratoire de CCM, le conseil suivant: passer les plaques l'tuve pour les activer. Cette opration a pour effet de dshydrater la plaque en librant ainsi des groupes -OH ractifs de l'adsorbant qui seront alors susceptibles de fixer les constituants polaires des mlanges analyser. Le paprika contient de nombreux pigments colors qui sont facilement spars par chromatographie. Par CCM, on obtient une large tache rouge reprsentant le pigment majoritaire qui donne au paprika sa couleur rouge sombre. Il est constitu d'un mlange d'esters d'acides gras de la capsanthine.

Le paprika contient d'autres carotnodes que la capsanthine, en particulier: des esters d'acides gras de la capsorbine

du - carotne:

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Stage MAFPEN - Chromatographie 3. Chromatographie de parfums: Bibliographie: "Analyse d'un parfum par chromatographie d'adsorption" BUP n 684 p 865 869 Les parfums, les eaux de toilette, sont des mlanges de bases communes qui sont: des essences naturelles (bergamote, citron,rose, cannelle, lavande) des essences de synthse (trs diverses ,permettant d'avoir des "bouquets fleuris") des produits odorants fournis par des animaux: ambre gris, musc, civette, castoreum Un parfum comporte toujours: un complexe lger fruit, s'vaporant facilement, destin provoquer une premire senstion olfactive, passagre le parfum proprement dit, dont l'odeur ne doit pas tre fugace et qui ragit avec la peau de la personne qui le porte, ce qui le personnalise et le fait abandonner ou adopter. Nous rechercherons dans des eaux de toilette si possible "citronnes", la prsence de citral de formule (CH3)2C = CH CH2 CH2 C(CH3) = CHCHO. Avec l'luant utilis, on peut mettre en vidence la prsence de terpnes linaires (C5H8)n (contenant des "units isoprniques" CH2 = C(CH3) CH =CH2) pour des Rf de l'ordre de 0,20 0,50. Adsorbant: silice Eluant: pour 50 mL d'hexane, 20 mL de chloroforme et 2 mL d'actone. Rvlateur: U.V Procder la CCM en dposant des taches d'eau de toilette, de citral mis en solution dans un peu d'luant et ventuellement d'essence de citron galement dilue dans un peu d'luant. Comparer les Rf des produits obtenus. 4. Chromatographie des produits rsultant de l'oxydation de l'alcool benzylique (rvlation par les U.V) Bibliographie: "Physique- chimie , enseignement de spcialit" Auteurs: Durandeau, Durupthy .... Editeur : Hachette Lors de l'oxydation de l'alcool benzylique en acide benzoque, le produit brut obtenu, avant recristallisation, contient diffrentes impurets qui sont l'alcool de dpart non oxyd ( l'tat de traces) le benzaldhyde rsultant d'une oxydation secondaire On se propose d'identifier ces impurets ventuelles en ralisant une chromatographie sur couche mince. On pourra ventuellement rechercher aussi la prsence de benzaldhyde dans l'essence d'amande amre.

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Stage MAFPEN - Chromatographie Prparer des solutions 1 % d'acide benzoque commercial, de benzaldhyde commercial, d'alcool benzylique commercial et du produit brut (rsultant de la raction d'oxydation de l'alcool benzylique), dans l'ther. Procder la CCM des quatre solutions prpares et ventuellement de l'essence d'amande amre sur la mme plaque. Adsorbant : gel de silice sur une plaque sensible aux U.V. Rvlateur : lampe U V (cercler les taches sous la lampe) Eluant : cyclohexane/actone (2/1 en volume) Exploitation: Rappeler la dfinition d'un groupement chromophore. Expliquer pourquoi les diffrents produits organiques tudis apparaissent sous la forme de taches sombres lors de l'exposition aux radiations U.V.. Calculer les diffrents Rf. Quelles sont les impurets contenues dans le produit brut rsultant de la raction d'oxydation de l'alcool benzylique ? Justifier la prsence de deux taches partir du dpt de la solution thre de benzaldhyde. Quels corps peut-on identifier dans l'essence d'amande amre? 5. Chromatographie d'acides amins rsultant de l'hydrolyse de l'aspartame: Bibliographie: "Etude de l'aspartame" Concours rgional des Olympiades de chimie 91/92, centre de Strasbourg "Additifs alimentaires et auxiliaires technologiques; chimie et sant" Auteurs: N et M Moll Editeur: Masson "Physique- chimie , enseignement de spcialit" Auteurs: Durandeau, Durupthy .... Editeur : Hachette L'aspartame (pouvoir sucrant 200 fois plus important que celui du saccharose), fut dcouvert par hasard en 1969 par J. Schlatter (SEARLE & CO) lors de la synthse d'un ttrapeptide gastrique destin un essai biologique. Le produit intermdiaire de la raction de synthse, un dipeptide, constitu d'acide aspartique et de phnylalanine se rvla sucr. Searle essaya de nombreux composs de structure voisine, mais dcida finalement de commercialiser le produit original qui devint connu sous le nom d'aspartame. 26 et 28 Janvier 1998 Page 27

Stage MAFPEN - Chromatographie Les principales raisons de ce choix sont: aucun des analogues ne pouvait tre fabriqu de faon plus conomique. le pouvoir sucrant et la "qualit got" taient excellents les deux constituants acide aspartique et phnylalanine sont mtaboliss normalement. Searle a spcul sur le fait que l'aspartame avait une excellente chance de survivre aux tests les plus svres. Il fut commercialis sous le nom "Nutrasweet" et a fait l'objet de dpt de nombreux brevets. L'expiration des brevets d'exclusivit de Nutrasweet date de 1987pour le Canada; 1987-1989 pour l'Europe, 1992 pour les USA. Stabilit: L'aspartame est l'dulcorant de synthse dont la stabilit a t la plus tudie. Ce produit est relativement instable en solution et se dcompose en donnant naissance un dipeptide: aspartyl phnylalanine et la dictopiprazine dpourvue de pouvoir sucrant. Les tapes de la dcomposition thermique de l'aspartame sont reprsentes ainsi:

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Stage MAFPEN - Chromatographie Les deux consquences de cette dcomposition sont: la diminution du pouvoir sucrant l'apparition de produits secondaires dont l'ventuelle toxicit a fait l'objet d'tudes importantes: le mthanol qui ne devrait pas tre prsent des doses toxiques, la dictopiprazine dont les tests de toxicit se sont rvls ngatifs, la phnylalanine qui, par sa prsence peut provoquer des maladies chez des personnes souffrant de phnylctonurie. L'tiquetage des aliments et boissons dulcores l'aspartame doit mentionner "contient de la phnylalanine". Les principaux paramtres qui interviennent dans la stabilit de l'aspartame sont: le temps de stockage (diminution de l'aspartame) l'humidit (diminution de l'aspartame) la temprature (diminution de l'aspartame) le pH a des effets variables. La meilleure stabilit de l'aspartame en solution aqueuse 25C se situe entre pH 3 et pH 5, conditions ralises dans les boissons carbonates type colas, limonades et sodas. D.J.A (dose journalire admissible): 0,40 mg/kg p.c. Hydrolyse de l'aspartame: En milieu acide, on hydrolyse les fonctions amide et ester de l'aspartame. Placer dans un ballon 2 comprims d'dulcorant base d'aspartame et 20 mL d'acide chlorhydrique 1 mol/L: les comprims se dissolvent rapidement. Chauffer reflux pendant 30 min. Refroidir sous un courant d'eau froide, puis verser la solution obtenue dans dans un bcher et la neutraliser avec une solution d'hydrognocarbonate de potassium ou de sodium 10% jusqu' ce que le dgagement gazeux cesse. Chromatographie: Porter des gants pour la manipulation pour viter que les acides amins de la peau se dposent sur la plaque. Adsorbant: silice Eluant: butan-1-ol/acide actique/eau: 6/2/2 On dispose des solutions suivantes: solution de phnylalanine 1g/L solution d'acide aspartique 1g/l solution de leucine 1g/l solution de lysine 1g/l solution d'aspartame hydrolys solution frache d'aspartame obtenue par dissolution d'un comprim de 20 mg dans 20 mL d'eau. A l'aide de capillaires (un par solution), disposer une goutte de solutions de phnylalanine, d'acide aspartique, d'aspartame hydrolys, d'aspartame frais et ventuellement de leucine et de lysine si l'dulcorant en contient et si la taille de la plaque le permet. Eluer.

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Stage MAFPEN - Chromatographie Scher la plaque, pulvriser une solution 2% environ de ninhydrine dans l'actone, sous la hotte. Chauffer pour faire apparatre les taches colores et identifier les acides amins prsents dans les solutions frache et hydrolyse d'aspartame. Les ractions entre la ninhydrine et les acides amins sont dtailles dans l'annexe (II). 6. Chromatographie de glucides: Bibliographie: BUP n 774 mai 1995 p 960-961 "Deuxime recueil d'preuves slectionnes des Olympiades Nationales de la Chimie" p93 95 "Physique- chimie, enseignement de spcialit" Auteurs: Durandeau, Durupthy... Editeur: Hachette Prparer 100 mL de solutions 2,5 g.L-1 de fructose, glucose et saccharose. Placer 10 mL d'une ampoule de jus de fruit pour bb dans une fiole jauge de 50 mL et complter au trait de jauge avec de l'eau dminralise. Prlever 10 mL de cette solution et les placer dans un ballon. Ajouter 5 mL d'acide chlorhydrique 2 mol.L-1 et chauffer pendant 20 min reflux lger. Eluant: butan-1-ol/actone/eau: 5/4/1 Faire un dpt des solutions de glucose, fructose, saccharose, jus de fruits dilu, jus de fruit hydrolys. Eluer . Scher la plaque. Rvler la plaque: les taches de sucres n'tant pas visibles, on utilisera un rvlateur, le ractif de Molisch qui forme des drivs colors avec les glucides. Pour cela on pulvrisera du ractif de Molisch sur les plaques (hotte; gants) et on placera la plaque sur une plaque chauffante ou dans une tuve jusqu' obtention de taches colores. Mesurer les Rf. Identifier les glucides prsents dans le jus de fruit et dans le jus de fruit hydrolys. Le ractif de Molisch est prpar ainsi: 0,50 g d'- naphtol dans 100 mL d'thanol + 100 mL d'acide sulfurique 20% Les ractions mises en jeu sont voques dans l'annexe (III). 7. Chromatographie de produits odorants: Bibliographie: "Journal of Chemical Education" decembre 95 page 1137 1138 On peut analyser par chromatographie sur couche mince des produits odorants purs et des mlanges quelconques de ces produits.

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Stage MAFPEN - Chromatographie On dispose de: citral ou 3,7-dimthylocta-2,6 dinal, Z et E:

citronellol ou 3,7-dimthyl oct-6-nol:

eugnol ou4-allyl 2-mthoxyphnol:

limonne:

linalol ou 3,7-dimthyloct-2,6-dine-1-ol

menthol

On utilise des plaques de silice. L'luant est un mlange tolune/actate d'thyle (proportions 90/10 en volume). Les solutions analyser sont prpares ainsi: 3 gouttes (si produit est liquide) dans 5 mL de dichloromthane 0,05 g (si le produit est solide) dans 5 mL de dichloromthane On pourra raliser des mlanges galement. On prparera deux plaques de CCM identiques car on dispose de deux rvlateurs: solution de permanganate de potassium (dissoudre 1,6 g de permangante de potassium et 15 g de carbonate de sodium anhydre dans 100 mL d'eau dminralise; vrifier qu'il n'y a pas formation de dioxyde de manganse brun) solution de DNPH (dissoudre 0,1 g de 2,4-dinitrophnylhydrazine dans 100 mL d'thanol 95% et 1 mL d'acide chlorhydrique 12 mol/L) Lorque l'lution est termine, vaporiser sur une plaque la solution de permanganate de potassium et sur l'autre la solution de DNPH. La solution de permanganate de potassium donne des taches brunes (MnO2) avec tous les composs odorants ( vrifier avec le menthol), tandis que la solution de DNPH ne ragit qu'avec les composs carbonyls (citral).

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Stage MAFPEN - Chromatographie L'article du Journal of Chemical Education donne les valeurs des Rf pour de nombreux produits odorants: citronellal (0,72)- piperonal (0,49)- menthol (0,26)- citronellol (0,20)- 4-allylanisole (0,66)- actate de linalyle (0,55)- carvone (0,45) - cuminaldhyde (0,57)- eugnol (0,44)vanilline (0,19) - citral (0,48)- linalol (0,33) - limonne (0,72) - anisaldhyde (0,44). 8. Etude par CCM (adsorbant: cellulose) des anthocyanines de fruits et lgumes: Bibliographie: "Journal of Chemical Education" Avril 96 page 306 309 "Chimie des couleurs et des odeurs" Association Cultures et Techniques

Nantes

Principe: Les couleurs rose, mauve, violette et bleues des ptales de fruits et des lgumes sont dues la prsence d'anthocyanines, qui sont des flavonodes c'est dire des molcules drivant du noyau flavone

Ce sont des hrrosides substitus du cation flavylium:

Selon la nature du sucre R3, on obtient une grande varit d'anthocyanines. Par hydrolyse acide, on peut casser la liason avec le sucre et obtenir des aglycones appels anthocyanidines. Il n'existe que 6 anthocyanidines existant l'tat naturel:

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Voici la liste de quelles anthocyanidines prsentes dans quelques fruits et lgumes: pomme myrtille airelle chou rouge fraise Fruit ou lgume Cy. Mv. Pt. Dp. Cy. Pn. Dp. Cy. Pg. Cy. Anthocyanidine Par chromatographie sur couche mince, on pourra mettre en vidence le nombre d'anthocyanines prsentes dans le fruit et le lgume et ventuellement les anthocyanidines obtenues aprs hydrolyse acide. les composs tant colors, il ne sera pas ncessaire d'utiliser un rvlateur pour les plaques. Exprience: Extraction des anthocyanines: On extrait les anthocyanines en couvrant 5 10 g de fruit ou de lgume (ou de peau de pomme rouge) d'un mlange mthanol/acide chlorhydrique concentr (proportions 99/1 en volume). L'extraction ncessite environ une heure. Si l'extrait doit subir ensuite une hydrolyse, on pourra le concentrer en utilisant l'vaporateur rotatif ou en laissant le rcipient ouvert sous une hotte. Hydrolyse des anthocyanines: Mlanger volume volume , la solution contenant les pigments prcdemment extraits et de l'acide chlorhydrique 4 mol/L dans un tube essais que vous munirez d'un rfrigrant air. Chauffer au bain-marie 80C pendant une dure variable (il faut environ 30 minutes pour une hydrolyse partielle et 1 heure pour une hydrolyse totale dans le cas de pomme ou des autres fruits mais plus longtemps pour le chou rouge qui est un diglycoside alors que les autres sont des monoglycosides. Chromatographie sur couche mince: On utilisera une plaque dont la phase stationnaire est de la cellulose. Il faudra faire plusieurs dpts pour obtenir une tache de petite taille mais bien colore. L'luant est constitu d'un mlange acide chlorhydrique concentr/ acide mthanoque/eau dans les proportions volumiques 19,0/39,6/41,4. On observera une ligne de l'luant moins nette qu'en chromatographie sur couche mince avec support silice. Rsultats: On peut mettre envidence le nombre d'anthocyanines prsentes dans les diffrents extraits avant hydrolyse et mesurer les Rf correspondant.

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Stage MAFPEN - Chromatographie L'article du Journal of Chemical Education donne : Pomme (0,47)- Myrtille (0,32 - 0,47 0,60)- Fraise (0,44- 0,60) - Airelle (0,49- 0,62) - Chou rouge (0,93). Les anthocyanidines obtenues aprs hydrolyse sont moins polaires et migrent moins sur la plaque. On peut mettre en vidence aprs hydrolyse, la prsence des mmes anthocyanidines dans des solutions provenant de fruits diffrents 9. CCM "autour de la lavande": Bibliographie: Prparation aux Olympiades de chimie (Besanon 95/96 et Nancy-Metz 96/97) "Aspic, lavande et lavandin" BUP n 789 dcembre 96 p 1941 1950 On peut: extraire de l'huile essentielle de lavande synthtiser de l'thanoate de linalyle, constituant prsent dans la lavande et dans la bergamote comparer par CCM: l'thanoate de linalyle, l'huile essentielle de lavande, le linalol, l'essence de bergamote, un parfum "lavande" (on dispose de ces produits) Extraction de l'huile essentielle de lavande: On adaptera le mode opratoire au matriel prsent. Rduire de la lavande en poudre fine (mortier ou moulin caf) pour obtenir environ 200 mL de poudre fine Mettre la poudre dans un ballon de 1 litre contenant environ 600 mL d'eau et raliser une hydrodistillation On obtient une fine pellicule d'huile essentielle: on ajoutera quelques spatules de chlorure de sodium pour faciliter la sparation de l'essence. Introduire le distillat dans une ampoule dcanter, agiter, laisser reposer. Aprs sparation des 2 phases, vacuer la phase aqueuse puis recueillir l'huile essentielle qui surnage. Si on obtient suffisamment d'huile essentielle, on pourra ajouter une pointe de spatule de sulfate de sodium pour dshydrater l'huile essentielle. Si la quantit d'huile essentielle obtenue par hydrodistillation est trop faible, on pourra la rcuprer par extraction l'ther et limination ensuite de l'ther l'vaporateur rotatif ou avec deux fioles vide (une de garde). Synthse de l'thanoate de linalyle: L'thanoate de linalyle est un ester prsent dans la lavande (de 35 55%) et dans la bergamote (de 35 45 %). Il peut tre obtenu par action de l'anhydride thanoque sur un alcool tertiaire possdant des doubles liaisons: le 3,7- dimthyloct-1,6-dine-3-ol ou linalol.

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Stage MAFPEN - Chromatographie Dans la lavande on trouve galement de l'thanoate de granyle, qui peut tre obtenu par action de l'anhydride thanoque sur le graniol ou 3,7-dimthyloct-2,6-dine-1-ol. Introduire dans un ballon 10 mL de linalol et 20 mL d'anhydride thanoque (sans rincer l'prouvette gradue) Adapter sur le ballon le rfrigrant reflux. Mettre en route la circulation d'eau froide. Chauffer l'aide d'un chauffe-ballon pendant 30 min partir de l'bullition. Arrter le chaffage, introduire par le sommet du rfrigrant 25 mL d'eau dminralise. Laisser refroidir le contenir du ballon , ventuellemnt en refroidissant sous un filet d'eau. Tranvaser dans l'ampoule dcanter Eliminer la phase aqueuse Verser dans l'ampoule dcanter 20 mL de solution d'hydrognocarbonate de sodium 5%. Agiter. Attention au dgagement gazeux. Recommencer la mme opration avec 20 mL d'eau dminralise. Placer l'ester dans un erlen, ajouter environ 2 g de K2CO3 anhydre. Boucher l'erlen et agiter quelques instants pour scher la phase organique Recueillir le liquide surnageant. linalol anhydride actique thanoate de linalyle Densit 0,87 1,08 0,89 Temprature d'bullition 199 139,5 220 Solubilit dans l'eau non oui non Caractrisation par C.C.M: On dispose: d'thanoate de linalyle prpar d'huile essentielle de lavande d'un parfum "lavande" d'essence de bergamote de linalol Prparer un mlange cyclohexane/ thanoate d'thyle (proportions volumiques (8/2)) qui servira la fois d'luant et de solvant. Prparer la cuve chromatographique. Prparer les solutions analyser en mettant dans un tube essais 3 mL du mlange cyclohexane/ thanoate d'thyle et une goutte du produit tudi. Procder de la mme faon pour les cinq produits. Procder la C.CM. Rvlation: I2 (+ sable) dans un flacon bouch. Variante: L'article du BUP propose de diluer les produits tudier raison de 1 goutte dans 1 mL de dichloromthane et d'utiliser le dichloromthane comme luant.

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CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER

1. Chromatographie d'encres de feutres: Dcouper une bande de papier Whatman n 1, suffisamment large pour dposer toutes les taches de feutres. La bande sera dispose en cylindre. Eluant: butan-1-ol/ thanol/ammoniac 2mol.L-1: 6/2/2 Raliser la chromatographie. Application: identifier les colorants purs et les mlanges. 2. Sparation de cations mtalliques: Bibliographie: Journal of Chemical Education, Avril 93 Eluant: actone/ acide chlorhydrique 6 mol.L-1: 4/1 On dispose de solutions de nitrate, sulfate ou chlorure de nickel, cobalt, cuivre environ 5.10-2mol/L. Faire, l'aide de capillaires, des taches de chacune de ces solutions et une tache d'un mlange de ces solutions environ 1 cm du bord infrieur de la bande de papier Whatman n 1. Placer le papier sous forme d'un demi-cylindre et luer (30 40 min). Scher le papier l'air libre pendant 10 min avant de le placer dans une chambre ammoniac ( 5 mL d'ammoniac concentr dans un bcher de 30 mL, lui-mme plac dans un bcher sec de 600 mL) sous la hotte. Quand la couleur bleue caractristique de Cu(II) apparat, enlever la papier de la chambre ammoniac et appliquer avec soin une goutte de dimthylglyoxime l'aide d'un compte-goutte sur la tache initiale de la solution de nickel et sur la tache initiale du mlange. Une couleur rose indique la prsence de Ni(II) . Placer le papier dans une chambre sulfure d'ammonium (prparation identique celle ammoniac). Les cations donnent des prcipits de couleur brune noire. Valeurs indiques dans l'article pour les Rf: Ni2+: 0,08 Co2+: 0,35 Cu2+: 0,60 3. Etude des colorants alimentaires des M & M's: Bibliographie: " Sparation de colorants par chromatographie" BUP n 750 p 59 " Chromatography of M& M's candies" Journal of Chemical Education Dec 92

" Additifs alimentaires et auxiliaires tecnologiques" Auteurs: N et M Moll Editeur: Masson

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Stage MAFPEN - Chromatographie Manipulation: Les colorants alimentaires sont des addtifs alimentaires qui ont un numro de code C.E.E de 100 199 prcd de la lettre E. Cette manipulation peut tre effectue en option sciences exprimentales en 1re S. On dispose tout d'abord d'un lot de trois colorants alimentaires commercialiss sous la marque Vahin: colorant jaune:E 102, tartrazine colorant rouge: E 122, azorubine colorant vert: mlange de tartrazine (Jaune, E 102) et de Bleu Patent V (Bleu E 131) D'autre part, on dispose de bonbons chocolats "M & M's" contenant les colorants E 104, E 110, E 122, E 124, E 131, E 171 Les formules de ces colorants, leurs utilisation ainsi que la D.J.A (dose journalire admissible exprime en mg/kg de poids corporel mg/kg p.c) figurent dans l'annexe (IV) . Vous pourrez raliser sur une mme bande de papier Whatman n 1, la chromatographie sur papier de chacun des colorants Vahin, d'un colorant M & M's et ensuite exploiter ce chromatogramme. On dcoupera une bande de papier Whatman n 1 de hauteur telle qu'elle tienne comme indiqu dans le bocal.(en vitant de mettre ses doigts sur le papier !!) A 2 cm du bord infrieur du papier Whatman, on placera un centimtre l'une de l'autre quatre taches ainsi, en commenant environ 1 cm du bord: une tache de chaque colorant Vahin. Pour chaque tache, on prendra un capillaire diffrent. l'aide d'un cure-dent que l'on mouillera, on grattera le bonbon de la couleur choisie pour extraire le colorant. Il faut faire attention ne pas atteindre le chocolat. Le cure-dent est essuy doucement sur du papier filtre ou sur de l'essuie-tout et l'extrait est appliqu d'un mouvement rapide sa place prvue sur le papier Whatman. On pourra faire 2 applications successives au mme endroit pour avoir une tache bien colore. Scher la bande de papier Whatman au sche-cheveux , puis placez-la avec la pince dessin dans un bocal o vous aurez vers auparavant 1 cm de haut environ de solution de chlorure de sodium 0,1% en masse (luant) ;l'luant ne doit pas atteindre la ligne de dpt en dbut d'exprience. Observez la migration pendant 10 20 minutes: le solvant doit arriver 2 cm du haut du papier Whatman environ. Noter rapidement au crayon de papier les positions du solvant (front du solvant) et de chaque tache. Schez la feuille de papier Whatman rapidement au sche-cheveux. Mesurer les Rf de chaque constituant.Pour les taches tales, on prendra le milieu de la tache.

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Stage MAFPEN - Chromatographie Exploitation: Montrer que le colorant utilis sur les M & M's jaunes n'est pas de tartrazine (suspecte allergisante) Rechercher la prsence ventuelle des colorants E 122 et E 131 dans les colorants alimentaires des M & M's. Identifier le ou les colorants prsents dans l'enrobage d'un M& M's l'aide du chromatogramme et des donnes figurant dans l'annexe (IV). Savoir si l'enrobage d'un M&M's de couleur donne est un colorant pur ou un mlange 4. Recherche de l'acide malique dans le vin: Bibliographie: "Recherche et valuation de l'acide malique par chromatographie" BUP n 775, juin 95 p 1181 " Sparation des acides d'un vin par CCM" Deuxime recueil d'preuves slectionnes des Olympiades Nationales de la Chimie La prparation d'un vin partir de jus de raisin commence par la fermentation alcoolique qui conduit la transformation des sucres en alcool. On peut arrter l'volution ce stade par filtration. C'est le cas des vins blancs. Le produit obtenu contient alors, l'tat de traces, plusieurs composs acides: acide malique: HOOC-CH2-CHOH-COOH acide tartrique HOOC-CHOH-CHOH-COOH acide succinique HOOC-CH2-CH2- COOH acide lactique HOOC- CHOH-CH3 L'acide malique du vin est biologiquement instable. Sa teneur diminue au cours de la fermentation alcoolique et devient nulle aprs la fermentation malolactique (deuxime fermentation au cours de laquelle l'acide malique se transforme en acide lactique); cette fermentation malolactique est recommande pour la plupart des vins rouges car cela diminue leur acidit. Les vins peuvent contenir jusqu' 5g/L d'acide malique. Une mthode simple par chromatographie sur papier permet de savoir si le vin contient ou non de l'acide malique et d'en apprcier la teneur. Cette chromatographie est surtout ralise pour suivre l'volution de la fermentation malolactique. Eluant ( prparer au moment de l'emploi): 40 mL de solution A de butan-1-ol 1 g/L de bleu de bromophnol 20 mL de solution B d'acide thanoque 50%

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Stage MAFPEN - Chromatographie Vous disposez de: vin blanc vin rouge solution d'acide malique 10g/L solution d'acide tartrique 10 g/L solution d'acide lactique 10 g/L solution d'acide succinique 10 g/L papier Whatman n 1 Dposer en des positions pralablement repres 1 ou 2 cm du bord infrieur de la feuille de papier Whatman, l'aide de capillaires, des taches des solutions analyser. On obtiendra des taches plus intenses et moins tales en renouvelant les dpts aux mmes endroits et en schant la feuille entre chaque opration au sche-cheveux. Aprs lution, on marque le front du solvant puis on fait scher la feuille sous une hotte bien ventile: le papier initialement imbib de solvant acide (BBP jaune) , devient bleuviolet sauf aux endroits o se situent les acides du vin. Aprs rvlation des taches du vin, on peut observer trois spots d'acides: acide tartrique la partie infrieure acides lactique et succinique non spars la partie suprieure ventuellemnt acide malique au centre

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CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE

1. Sparation des pigments des feuilles: Bibliographie: Journal of Chemical Education Dcembre 92 p 987 et 988

Cette exprience peut tre ralise partir de feuilles d'arbres, de buissons, de plantes d'intrieur, de feuilles de salades colores.... Deux petites feuilles sont crases dans un mortier en prsence de 2 3 mL d'actone pour raliser un extrait. Le liquide est extrait l'aide d'un compte-goutte pour le sparer de la pulpe. La colonne est contitue d'hydrognocarbonate de sodium dans l'hexane ou dans l'ther de ptrole (prparation par voie sche ou par voie humide) sur 2 ou 3 cm de haut. Le niveau de l'luant est plac au niveau suprieur de l'hydrognocarbonate de sodium et l'extrait "jus de feuilles" est plac avec prcaution en haut de la colonne. On ajuste nouveau le niveau au ras de l'hydrognocarbonate de sodium. On lue tout d'abord l'ther de ptrole: une bande d'un vert lumineux se spare: elle est compose essentiellement de chlorophylle et de pigments carotnodes; elle peut tre recueillie dans un premier tube essais. Quand cette premire bande est limine de la colonne, on change d'luant: on utilise alors de l'actone. Selon les espces, la bande lue a une coloration vert ple jaune due des pigments phytochromes. Quand la bande lue l'actone a t rcupre, l'luant est nouveau chang pour un mlange propan-2-ol/eau en proportions volumiques 7/3. Deux ou trois bandes de coloration jaune-brune apparaissent. Une dernire bande de coloration rouge-brun est enfin lue par une solution aqueuse sature en hydrognocarbonate de sodium. Ces dernires bandes, lues par le mlange propan-2-ol/eau et par la solution d'hydrognocarbonate de sodium contiennent des pigments flavonodes solubles dans l'eau. 2. Sparation de colorants: Bibliographie: Journal of Chemical Education Dcembre 92 p 991 et 992

Attention, les colorants utiliss marquent les tissus. Utilisez des gants!! Un mlange de 100 mg de rhodamine B base et de 100 mg de diphnylthiocarbazone ou dithizone dissous dans 10 mL d'actone a t prpar peu avant ce stage car le colorant vert (diphnylthiocarbazone) s'estompe la longue. Exprience pralable: Placez dans un bcher 10 mL d'eau et 10 mL d'heptane puis une goutte du mlange de colorants. Agitez si ncessaire pour acclrer la sparation: on observe une phase 26 et 28 Janvier 1998 Page 40

Stage MAFPEN - Chromatographie infrieure (phase aqueuse) rose brillant (coloration due la rhodamine B base) et une phase suprieure (heptane) verte (coloration due la dithizone). Elution du colorant vert sur colonne: Prparation de la colonne: Mettre au fond d'une pipette Pasteur, un peu de coton puis la remplir au 2/3 de gel de silice et ajouter un peu de sable en haut. Humidifier avec environ 5 gouttes d'heptane. Elution: Ajouter 2 gouttes du mlange de colorants en haut de la colonne de silice, au centre. Laisser le mlange migrer jusqu' ce qu'il atteigne le haut de la colonne. Ajouter de l'heptane pour remplir la pipette. Eluer le colorant vert en renouvelant les ajouts d'heptane si ncessaire et veillant ce que la colonne ne s'assche pas. On spare ainsi le pigment vert du pigment rouge qui reste lui sur la colonne. 3. Sparation des colorants d'un sirop de menthe: Bibliographie: " Sparation des colorants d'un sirop de menthe par chromatographie" BUP n 756 Juillet-aot-septembre 93 Prparation de la colonne: Placer un petit morceau de coton au fond d'une pipette de Pasteur. Verser une spatule de silice dans de l'eau. Mettre en suspension, puis verser dans la pipette Pasteur maintenue verticale. Elution: Ds que le niveau d'eau atteint le lit de la colonne, dposer l'aide d'un compte-gouttes deux gouttes de sirop de menthe, puis maintenir immdiatement la colonne pleine d'eau ras bord. Le premier colorant est lu l'eau: il s'agit de la tartrazine (voir annexe IV sur les colorants alimentaires). On peut tracer rapidement son spectre l'aide du spectrophotomtre plac dans la salle. Eluer le second colorant l'aide d'thanol 95%: il s'agit de bleu Patent V; on pourra galement tracer son spectre. On peut comparer ces spectres avec les spectres des colorants Vahin: colorant jaune (tartrazine) colorant vert (mlange de tartrazine et de bleu patent V) On pourra galement tracer le spectre d'une solution aqueuse de sirop de menthe. Variante : On peut galement extraire les colorants du sirop de menthe en les fixant sur de la laine puis les extraire de celle-ci en utilisant le fait que la laine ne fixe ces colorants anioniques quen milieu acide. On place dans un bcher 4 5 brins de laine incolore de 20 cm puis environ 40 mL de sirop de menthe et 5 mL dune solution dacide actique 2 mol/L. On porte le mlange bullition douce pendant 10 minutes : la laine prend une couleur verte intense alors que la solution devient presque incolore. A laide dun agitateur, on retire la laine et on la 26 et 28 Janvier 1998 Page 41

Stage MAFPEN - Chromatographie rince leau (bonne tenue de la teinture). On introduit ensuite cette laine teinte dans un bcher contenant environ 15 mL dune solution dammoniac 0,1 mol/L et on porte bullition douce. Rapidement la solution prend une couleur verte. On retire la laine et on laisse bouillir la solution quelques instants afin de la concentrer par vaporation de leau. On utilisera cette solution pour faire une C.C.M (plaque de silice) en la comparant des solutions de tartrazine et ventuellement de bleu patent. Lluant sera constitu dun mlange thanol, solution de chlorure de sodium 40 g/l dans les proportions volumiques 1/5. On peut faire de mme avec un sirop de grenadine contenant de lazorubine (E 122) et du rouge cochenille (E 124) ou un sirop dorange contenant du jaune orang S (E 110). 4. Dtermination de la "somme des cations" d'une eau minrale en utilisant une rsine changeuse d'ions: Gnralits sur les rsines changeuses d'ions (voir aussi annexe V) Les changeurs d'ions sont des solides insolubles qui ont la proprit de pouvoir changer leurs ions avec ceux d'une solution. Ce sont en gnral des rsines synthtiques constitues par un rseau macromolculaire (le plus souvent du polystyrne) sur lequel sont greffs des radicaux ionisables ou ioniss, dites soit cationiques lorsque elles + peuvent changer leurs cations (tels que H ), soit anioniques lorsqu'elles peuvent changer leurs anions (tels que OH ou Cl ). Les rsines sont gnralement utilises en colonnes en faisant couler trs doucernent la solution dans la colonne. Lorsque l'on veut sparer les constituants d'un mlange, on choisit les conditions opratoires de telle sorte qu'un des constituants du mlange ne soit pas retenu sur la rsine, et que l'autre constituant soit fix sur la rsine. On modifie ensuite les conditions opratoires en faisant couler sur la rsine un solvant appropri, appel luant, tel que le constituant fix sur la resine soit entrane par l'luant. Cette technique s'appelle la chromatographie par change d'ions. Prcaution opratoire : la rsine ne doit jamais tre en contact avec l'air : elle doit toujours tre surmonte d'un peu de liquide. Principe de la manipulation: L'eau minrale analyser (Hpar ou Contrexville) contient comme cations Ca2+, Mg2+, Na+ et K+. L'eau analyser est passe sur une rsine cationique(IR 120) . Les cations Ca2+,Mg2+,K+,Na+ sont remplacs par des ions ions H+ fournis par une rsine changeuse d'ions fortement acide selon la raction: Mn+(solution) + nH+(rsine) Mn+(rsine) + nH+(solution) L'luat contient donc comme espces ayant des proprits acidobasiques des ions H3O+ provenant du passage sur la rsine et des ions HCO3- provenant de l'eau minrale. On portera l'luat bullition pendant quelques minutes de telle sorte que la raction suivante ait lieu: H3O+ + HCO3- CO2 + 2 H2O

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Stage MAFPEN - Chromatographie Aprs refroidissement, on dosera par pH-mtrie l'luant l'aide d'une solution d'hydroxyde de sodium de concentration connue, voisine de 5,00 . 10-2 mol/L. Mode opratoire: Verser l'aide d'une prouvette gradue 200 ml d'eau dminralise dans un bcher et 50 ml d'acide chlorhydrique au demi. Faire passer lentement cette solution sur la colonne de rsine pour la convertir en rsine acide. Veiller ce que la colonne de liquide ne descende jamais au-dessous du sommet du lit de rsine.

Rincer la colonne avec de l'eau dminralise jusqu' limination totale des chlorures. Contrler cette limination par l'absence de prcipit avec une solution de nitrate d'argent . Faire passer lentement sur la rsine E=20 ml d'eau minrale. Recueillir l'luat dans un bcher de 250 ml. Rincer 3 fois la colonne avec 20 ml d'eau dminralise et recueillir les eaux de lavage dans le mme bcher. Porter bullition pendant 5 min pour chasser le dioxyde de carbone. Laisser refroidir. Titrer par pH-mtrie l'aide de la solution de soude talonne.(Soit Ve le volume quivalent.)

Vrifier la relation donnant la "somme des cations" partir des indications fournies par le fabricant sur l'tiquette de l'eau minrale: 2 [Ca2+] + 2 [Mg2+] + [Na+] + [K+] - [HCO3-] = Erreur ! Remarque: On peut trouver une exprience utilisant une rsine changeuse d'ions analogue dans un article publi dans le n 762 du BUP (Mars 1994) et intitul:" Dosage du magnsium dans un mdicament" 5. Exemple de chromatographie d'exclusion: Bibliographie: Journal of Chemical Education Dcembre 92 p 993 et 994

Prparation du gel Sephadex: Le Sephadex est un gel fait partir de polyosides bactriens: les dextrans. Les Sephadex prsentent une grande affinit pour l'eau, ils s'hydratent fortement, fixant jusqu' dix fois leur masse d'eau, et gonflent jusqu' former un rseau dont le nombre et les dimensions des mailles sont dtermins par les liaisons tablies dans l'difice molculaire form par le dextran hydrat. Les gels polyosides sont insolubles dans l'eau et dans les solutions salines, stables dans les solutions alcalines ou faiblement acides mais hydrolyss par les acides forts. de plus

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Stage MAFPEN - Chromatographie ces gels doivent tre protgs d'une hydrolyse enzymatique conscutive une contamination bactrienne. Pour cela le gel hydrat sera stock dans une solution de chlorure de sodium sature. Le gel a t prpar en ajoutant 1 g de Sephadex environ 20 mL d'eau et l'ensemble a gonfl pendant 1 heure: on peut ainsi raliser 10 20 colonnes. Au fond de la colonne forme d'une pipette Pasteur, on placera un petit morceau de papier filtre; ensuite on ajoutera l'aide d'un compte-gouttes, les "perles" de Sephadex hydrat jusqu' ce que la colonne soit remplie environ 1/2 2/3. A aucun moment, la colonne ne doit tre sec!! Elution de la solution de diiode: On dispose d'une solution de diiode dans un compte-gouttes prpare raison de 250 mg de I2 dans 100 mL d'thanol 50%. Ds que la colonne est prte, ajouter une goutte de solution de diiode en haut de la colonne. Laver constamment l'eau (pas plus de quelques gouttes en haut de la colonne). Rcuprer les gouttes dans un tube essais ou un petit bcher qui contient quelques gouttes d'une solution aqueuse sature d'amidon.. Compter le nombre de gouttes qui tombent partir du moment o on place la solution de diiode en haut de la colonne et jusqu' ce que la coloration de la solution du tube collecteur change. Elution de la solution d'amidon: Placer une goutte de solution d'amidon en haut de la colonne et luer l'eau en recueillant l'luat dans un tube contenant quelques gouttes de la solution de diiode. Compter de mme le nombre de gouttes qui tombent partir du moment o on place la solution d'amidon en haut de la colonne et jusqu' ce que la coloration de la solution du tube collecteur change. Elution de la solution de diiode, suivie par la solution d'amidon: Placer une goutte de solution de diiode en haut de la colonne. Eluer l'eau et rcuprer l'luat dans un tube vide. Quand la bande jaune-brune du diiode est peu prs mihauteur dans la colonne,ajouter une goutte de solution d'amidon en haut de la colonne et continuer luer l'eau. Noter les ventuels changements de couleurs. Eluer le diiode en totalit. Sparation diiode/amidon Mlanger 2 gouttes de solution de diiode et deux gouttes de solution d'amidon. Ajouter une goutte de ce mlange en haut de la colonne et luer l'eau en rcuprant l'luant dans un tube vide.Compter de mme le nombre de gouttes qui tombent partir du moment o on place le mlange en haut de la colonne et jusqu' ce que la coloration de l'luat change. Noter les ventuels changements de couleurs dans la colonne.

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CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE

1. Etude d'un mlange d'alcools Vous trouverez ci-joints (Annexe VI) les chromatogrammes de trois alcools purs et celui d'un mlange de ces trois substances. Les valeurs lues au niveau des pics correspondent aux temps de rtention.Les manipulations ont t ralises sur une colonne dont la phase stationnaire est polaire (carbowax). Les diffrents paramtres sont : temprature de l'injecteur : 220C temprature du dtecteur:220C temprature du four:85C temprature du filament:285C pression d'hlium:6 bar attnuation:128. Y-a-t-il une relation entre les temps de rtention et les points d'bullition ?Justifier. Faire l'analyse chromatographique d'un mlange inconnu de deux de ces alcools.(un certain nombre de mlanges sont dj prpars dans des piluliers ) Injecter 1 L Dduire du chromatogramme obtenu - la composition qualitative du mlange - la composition quantitative du mlange Attention : il est important de bien rincer l'actone (plusieurs fois) puis avec le produit injecter et de bien essuyer la seringue avant chaque nouvelle injection. 2. Mthode de l'talon interne Exemple n 1: Dosage de l'thanol du vin par CPG Bibliographie: "Chimie tout, expriences commentes" Auteurs:Haurat-Bentolila; Lecorgne; Leduc Editeur: Association Cultures et Techniques- Nantes Principe: On utilisera ici la mthode de l'talon interne. On prparera une srie de mlanges contenant, pour 10 mL de solution, des pourcentages en volume d'thanol variant de 3 21%. A chaque mlange, on ajoutera toujours le mme volume de propan-1-ol (1 mL). On injectera ensuite 0,3 L de chacune des solutions ainsi ralises. En ralit, on n'est pas toujours certain d'injecter exactement le volume de 0,3 L (prsence de bulles dans la seringue..). Cependant comme la concentration en propan-1-ol est la mme dans toutes les solutions, le mesure du rapport : aire du pic thanol/ aire du pic propanol est proportionnelle la concentration en thanol dans le mlange et ne dpend pas du volume vers. On pourra donc tracer une courbe d'talonnage et l'utiliser pour dterminer la teneur en thanol dans le vin. Manipulation: Prparer dans des piluliers, les mlanges suivants: 26 et 28 Janvier 1998 Page 45

Stage MAFPEN - Chromatographie % thanol (v/v) thanol (mL) eau dminralise (mL) 3 0,3 9,7 6 0,6 9,4 9 0,9 9,1 12 1,2 8,8 15 1,5 8,5 18 1,8 8,2 21 2,1 7,9

Ajouter dans chaque pilulier, 1,0 mL de propan-1-ol. Prparer de mme un pilulier contenant 10,0 mL de vin et 1,0 mL de propan-1-ol. Injecter les diffrentes solutions avec les rglages suivants: temprature du four: 45C temprature du dtecteur et de l'injecteur: 200 C pression d'hlium: 6 bars temprature du filament rgle 285C pour avoir i= 200 mA dans le catharomtre Relever les aires correspondant aux pics de l'thanol et du propan-1-ol. On donne les tempratures d'bullition sous un bar: propan-1-ol: 97C thanol: 78,3C Tracer la courbe aire du pic thanol/ aire du pic propan-1-ol en fonction du % en thanol. En dduire le pourcentage en thanol du vin. Vous trouverez en Annexe VII, un exemple de rsultats exprimentaux. Exemple 2 : pinacol - pinacolone Lorsqu'on traite le pinacol (2,3-dimthylbutane-2,3-diol) par de l'acide bromhydrique 48 % et chaud, il se forme : de la pinacolone (2,2-dimthybutan-3-one) rsultant d'une transposition ou rarrangement pinacolique. du 2,3-dimthylbuta-1,3-dine rsultant de la dshydratation "normale" du diol Afin d'tudier correctement la composition du mlange en CPG, il nous faut envisager la mthode dite de l'talon interne. On choisit pour cela la mthylisobutylctone ou 4mthylpentan-2-one. Manipulation. Dans des piluliers, prparer 2 mL de solution Ai(i = 1 , 2 ou 3) 25 % , 50 % , 75 % de 2,3-dimthylbuta-1,3-dine (1) dans la 3,3-dimthyl butan-2-one (pinacolone) (2). Prparer d'autre part 15 mL d'une solution B 50 % de 4-mthylpentan- 2-one (I) dans (2). Effectuer ensuite les mlanges suivants: aux 2 mL des solutions Ai, on ajoute 2 mL de B, oprations faites pour chacune des solutions Ai ainsi que pour (1) et (2) purs.

Injecter successivement les diffrents mlanges aprs avoir fait les rglages convenables. temprature du four : 70C temprature de l'injecteur : 220C

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temprature du dtecteur : 220C temprature du filament : 285C i = 200 mA attnuation : 128 pression d'hlium : 6 bar injection : 0,7 L

Dans ces conditions, les temps de rtention observs sont : (1) 2,3-dimthylbutadine : 1,1 min (2) 3,3-dimthylbutan-2-one : 2,2 min (I) 4-mthylpentan-2-one : 2,9 min Tracer la courbe d'talonnage Erreur ! Pour les solutions inconnues, ajouter 1 mL de ces solutions 1 mL de B. Dterminer le rapport des aires obtenues aprs injection. A l'aide de la courbe d'talonnage, dduire le pourcentage en (1) des solutions inconnues. NB : La courbe d'talonnage a t trace partir des solutions prpares ( % en volumes). Il est donc ncessaire d'en dduire les titres massiques correspondants. titre massique en (1) = Erreur !

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UNE CHROMATOGRAPHIE QUE L'ON PEUT PORTER

Chromatographie sur T-shirt Bibliographie Journal of Chemical Education Dcembre 92 p 877 et 978

L'exemple qui suit est une chromatographie radiale que l'on fera de prfrence sous la hotte cause des solvants utiliss:

Tendre sur un cristallisoir d'environ 15 cm de diamtre, un morceau de tissu de coton blanc. Le maintenir tendu l'aide d'un lastique ou de ficelle. Reprer le centre du cercle form par le tissu. Placer 4 6 taches de feutres permanents sur la circonfrence d'un cercle imaginaire, environ quatre fois plus petit que le cristallisoir. A l'aide d'un compte-gouttes, appliquer l'luant (propan-2-ol/eau en proportions volumiques 7/3) au centre du cercle de telle sorte que l'luant mouille le tissu et se dplace radialement vers les bords en crant un chromatogramme. Quand le motif a atteint la taille voulue, arrter les ajouts d'luant et laisser scher le tissu environ 10 min sous la hotte.

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Stage MAFPEN - Chromatographie TABLE DES MATIERES : Chromatographie: thorie ........................................................................................1 Bibliographie: ...............................................................................................1 1. Chromatographie: aspects gnraux: .........................................................1 1.1. Dfinitions:..................................................................................1 1.2. Chromatographie d'adsorption: ....................................................2 1.3. Chromatographie de partage: .......................................................4 1.4. Chromatographie ionique:............................................................4 1.5. Chromatographie d'exclusion:......................................................4 2 Chromatographie sur couche mince (CCM)................................................5 2.1.Dfinition et appareillage:.............................................................5 2.2.Principe de la technique. ...............................................................5 2.3.Applications de la CCM................................................................6 2.4.Adsorbants et plaques chromatographiques...................................6 2.5.Choix de l'luant. ..........................................................................6 2.6.Dpt de l'chantillon. ..................................................................7 2.7.Dveloppement de la plaque. ........................................................7 2.8.Rvlation.....................................................................................8 2.9.Calcul de Rf (retarding factor ou rapport frontal)..........................8 2.10.Description d'une analyse par CCM selon l'ordre chronologique.....................................................................................8 3. Chromatographie sur papier: .....................................................................9 3.1. Principe de la technique et applications: ......................................9 3.2. Papier: .........................................................................................10 4. Chromatographie sur colonne:...................................................................10 4.1. Description et principe:................................................................10 4.2. Facteurs dont dpend la sparation: .............................................10 4.3. Remplissage de la colonne:..........................................................11 4.4. Dpt des produits analyser: .....................................................12 4.5. Elution:........................................................................................12 5. Chromatographie en phase gazeuse (CPG): ...............................................13 5.1.Description d'un chromatographe..................................................13 5.2. Analyse qualitative en CPG: ........................................................18 5.3. Analyse quantitative en C.P.G: ....................................................19 Chromatographie: Liste des expriences proposes..................................................23 1. Chromatographie sur couche mince (CCM)...............................................23 2. Chromatographie sur papier ......................................................................23 3. Chromatographie sur colonne....................................................................23 4. Chromatographie en phase gazeuse ...........................................................23 5. Une chromatographie que l'on peut porter .................................................23 CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE (CCM)...................................24 1. Isomrisation de l'azobenzne: ..................................................................24 Bibliographie:.....................................................................................24 2. Sparation des pigments du paprika:..........................................................24

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Stage MAFPEN - Chromatographie Bibliographie:.....................................................................................24 Remarques:.........................................................................................25 3. Chromatographie de parfums: ...................................................................26 Bibliographie:.....................................................................................26 4. Chromatographie des produits rsultant de l'oxydation de l'alcool benzylique (rvlation par les U.V)...............................................................26 Bibliographie:.....................................................................................26 5. Chromatographie d'acides amins rsultant de l'hydrolyse de l'aspartame: ...................................................................................................27 Bibliographie:.....................................................................................27 Stabilit: .............................................................................................28 Hydrolyse de l'aspartame: ...................................................................29 Chromatographie: ...............................................................................29 6. Chromatographie de glucides: ...................................................................30 Bibliographie:.....................................................................................30 7. Chromatographie de produits odorants: .....................................................30 Bibliographie:.....................................................................................30 8. Etude par CCM (adsorbant: cellulose) des anthocyanines de fruits et lgumes:........................................................................................................32 Bibliographie:.....................................................................................32 Principe: .............................................................................................32 Exprience:.........................................................................................33 Rsultats:............................................................................................33 9. CCM "autour de la lavande":.....................................................................34 Bibliographie:.....................................................................................34 Extraction de l'huile essentielle de lavande: ........................................34 Synthse de l'thanoate de linalyle:.....................................................34 Caractrisation par C.C.M: .................................................................35 CHROMATOGRAPHIE SUR PAPIER ..................................................................36 1. Chromatographie d'encres de feutres: ........................................................36 2. Sparation de cations mtalliques:.............................................................36 Bibliographie:.....................................................................................36 3. Etude des colorants alimentaires des M & M's: .........................................36 Bibliographie:.....................................................................................36 Manipulation: .....................................................................................37 Exploitation:.......................................................................................38 4. Recherche de l'acide malique dans le vin:..................................................38 Bibliographie:.....................................................................................38 CHROMATOGRAPHIE SUR COLONNE..............................................................40 1. Sparation des pigments des feuilles: ........................................................40 Bibliographie:.....................................................................................40 2. Sparation de colorants: ............................................................................40 Bibliographie:.....................................................................................40 Exprience pralable: .........................................................................40

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Stage MAFPEN - Chromatographie Elution du colorant vert sur colonne: ..................................................41 3. Sparation des colorants d'un sirop de menthe:..........................................41 Bibliographie:.....................................................................................41 Prparation de la colonne:...................................................................41 Elution:...............................................................................................41 Variante :............................................................................................41 4. Dtermination de la "somme des cations" d'une eau minrale en utilisant une rsine changeuse d'ions:...........................................................42 Gnralits sur les rsines changeuses d'ions (voir aussi annexe V) ...........................................................................................................42 Principe de la manipulation: ...............................................................42 Mode opratoire: ................................................................................43 Remarque: ..........................................................................................43 5. Exemple de chromatographie d'exclusion:.................................................43 Bibliographie:.....................................................................................43 Prparation du gel Sephadex:..............................................................43 Elution de la solution de diiode: .........................................................44 Elution de la solution d'amidon:..........................................................44 Elution de la solution de diiode, suivie par la solution d'amidon: ........44 Sparation diiode/amidon ...................................................................44 CHROMATOGRAPHIE EN PHASE GAZEUSE....................................................45 1. Etude d'un mlange d'alcools.....................................................................45 2. Mthode de l'talon interne .......................................................................45 Exemple n 1: Dosage de l'thanol du vin par CPG.............................45 Exemple 2 : pinacol - pinacolone........................................................46 UNE CHROMATOGRAPHIE QUE L'ON PEUT PORTER....................................48 Chromatographie sur T-shirt .........................................................................48 Bibliographie......................................................................................48

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