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IFTAB

BIOCHIMIE STRUCTURALE

Les PROTIDES

Christine CHEVALIER

Cours biochimie Protides IFTAB 2005-2006

Christine CHEVALIER

BIOCHIMIE STRUCTURALE PROTIDES


Comptences attendues lissue du cours et des travaux dirigs Dcrire les caractristiques des acides amins naturels Donner leur classification en fonction de la nature de leur radical et illustrer l'aide d'exemples. Dcrire leurs proprits physiques et chimiques en soulignant les proprits originales dues la prsence simultane des fonctions amine et acide carboxylique. Dgager les proprits prsentant un intrt analytique. Dfinir ion mixte, pH isolectrique Prciser les caractristiques gomtriques de la liaison peptidique. Exposer les proprits physiques et chimiques des peptides intressantes pour l'analyse. Donner un exemple de peptides d'intrt biologique : ( glutathion, peptides hormonaux, antibiotiques..) Hirarchiser et reconnatre les diffrents niveaux de structure des peptides et des protines : structure primaire, secondaire, tertiaire et quaternaire. Illustrer les diffrents niveaux de structure par des exemples simples Dfinir les protines fibreuses et les protines globulaires. Indiquer les liaisons chimiques faibles participant la stabilisation des structures tridimensionnelles. Dcrire schmatiquement deux types de structure secondaire : hlice alpha et feuillet pliss bta. Montrer le rle des liaisons peptidiques et des liaisons hydrognes dans ces architectures. Mettre en vidence la relation entre l'intgrit de l'activit spatiale et l'activit biologique Indiquer les principaux agents dnaturants Dcrire les proprits exploitables dans la prparation et l'analyse des protines : solubilit, absorption de la lumire, diffusion, ionisation, ractions colores, proprits immunologiques. Connatre les principes, l'intrt et les limites des mthodes d'extraction, de fractionnement, de purification, d'identification et de dosage appliqu aux protines. Dfinir holoprotines et htroprotines. Donner des exemples de protines globulaires et fibreuses. Montrer l'aide d'exemples la diversit des htroprotines.

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Introduction........................................................................................................

Les acides amins .................................................................................. 5


1.1 Proprits des acides amins ...............................................................................8
Proprits physiques ............................................................................................................... 8 Solubilit.............................................................................................................................. 8 Proprits optiques : le pouvoir rotatoire ............................................................................ 8 Absorption lumineuse dans lultraviolet............................................................................... 9 Proprits ioniques.................................................................................................................. 9 Cas des acides amins neutres: ......................................................................................... 9 Cas des acides amins acides:......................................................................................... 12 Cas des acides amins basiques:..................................................................................... 13 Proprits chimiques communes tous les acides amins.................................................. 16 Proprits de la fonction acide carboxylique -COOH ....................................................... 16 Proprits de la fonction amine primaire NH2 ................................................................. 16 Proprits des fonctions COOH et -NH2 conjointes........................................................ 18 Proprits chimiques des chanes latrales.......................................................................... 18 1.1.1 1.1.1.1 1.1.1.2 1.1.1.3 1.1.2 1.1.2.1 1.1.2.2 1.1.2.3 1.1.3 1.1.3.1 1.1.3.2 1.1.3.3 1.1.4

1.2

Mthodes de dosage et danalyse des acides amins ........................................19

1.2.1 Mthodes de dosage total ..................................................................................................... 19 1.2.1.1 Mthode de Kjeldahl ......................................................................................................... 19 1.2.1.2 Mthode de Srensen ....................................................................................................... 20 1.2.1.3 Dosage spectrophotomtrique la ninhydrine ................................................................. 20 1.2.2 Mthodes de dosage spcifiques de certains acides amins ............................................... 20 1.2.2.1 Dosage spectrophotomtrique dans lultraviolet ............................................................... 20 1.2.2.2 Dosage spectrophotomtrique dans le visible .................................................................. 20 1.2.3 Techniques de sparation des acides amins ...................................................................... 20 1.2.3.1 llectrophorse ................................................................................................................. 20 1.2.3.2 La chromatographie .......................................................................................................... 20

1.2.3.2.1 1.2.3.2.2 1.2.3.2.3 1.2.3.2.4


1.2.3.3

Chromatographie papier des acides amins .....................................................21 Chromatographie sur couche mince des acides amins (CCM) ......................22 Chromatographie ionique des acides amins ...................................................22 La chromatographie gazeuse (CG) ..................................................................23

Llectrochromatographie.................................................................................................. 23

les peptides ........................................................................................... 24


2.1
2.1.1

Proprits de la liaison peptidique et des peptides..............................................24


Squence dun peptide.......................................................................................................... 25

2.2
2.2.1 2.2.2 2.2.3 2.2.4

Dtermination de la squence dun peptide ........................................................25


Dtermination de la composition brute dun peptide ............................................................. 25 Dtermination de lacide amin N terminal............................................................................ 26 Dtermination de lacide amin C terminal............................................................................ 26 Coupures spcifiques internes .............................................................................................. 26

2.3
2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4

Quelques peptides dintrt biologique ou alimentaire ........................................27


Peptides hormonaux.............................................................................................................. 27 Glutathion .............................................................................................................................. 28 Peptides antibiotiques ........................................................................................................... 28 Peptides dintrt alimentaire ................................................................................................ 29

Les protines ........................................................................................ 29


3.1 Structure des protines .......................................................................................29
3.1.1 La structure primaire.............................................................................................................. 30 3.1.2 La structure secondaire ......................................................................................................... 30 3.1.2.1 Lhlice alpha .................................................................................................................... 31

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3.1.2.2 Le feuillet ........................................................................................................................ 33 3.1.3 La structure tertiaire............................................................................................................... 33 3.1.3.1 Maintien de la structure..................................................................................................... 34 3.1.3.2 Protines globulaires......................................................................................................... 34 3.1.3.3 Protines fibreuses............................................................................................................ 35 3.1.4 La structure quaternaire ........................................................................................................ 35

3.2
3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6

Proprits des protines......................................................................................36


Solubilit ................................................................................................................................ 36 Dnaturation .......................................................................................................................... 36 Proprits optiques................................................................................................................ 37 Proprits ioniques................................................................................................................ 37 Proprits chimiques ............................................................................................................. 37 Proprits antigniques......................................................................................................... 37

3.3
3.3.1 3.3.2

Mthodes de sparation des protines................................................................37


Prcipitation des protines .................................................................................................... 37 Dialyse- Ultrafiltration ............................................................................................................ 37

3.4
3.4.1 3.4.2 3.4.3 3.4.4 3.4.5

Electrophorse ....................................................................................................38
Electrophorse en veine liquide ............................................................................................ 38 Electrophorse de zone......................................................................................................... 38 La focalisation isolectrique (IEF) ......................................................................................... 38 Electrophorse bidimensionnelle........................................................................................... 39 Lisotachophorse (ITP) ........................................................................................................ 39

3.5
3.5.1 3.5.2 3.5.3 3.5.4

Chromatographie.................................................................................................39
Chromatographie hydrophobe............................................................................................... 39 Chromatographie dchange dions....................................................................................... 39 Chromatographie dexclusion-diffusion ou Chromatographie de filtration sur gel................. 39 Chromatographie daffinit .................................................................................................... 40

3.6

Analyse des protines .........................................................................................40

3.6.1 Dtermination du poids molculaire ...................................................................................... 40 3.6.1.1 Mthode chimique ............................................................................................................. 40 3.6.1.2 Chromatographie dexclusion-diffusion ............................................................................. 40 3.6.1.3 Electrophorse en gel natif ............................................................................................... 41 3.6.1.4 Electrophorse SDS-PAGE .............................................................................................. 41 3.6.1.5 Spectromtrie de masse ................................................................................................... 42 3.6.2 Dtermination du pHi: Isolectrofocalisation ......................................................................... 42

3.7
3.7.1 3.7.2

Mthodes de dosages des protines...................................................................42


Mthodes non spcifiques..................................................................................................... 42 Mthodes spcifiques............................................................................................................ 43

3.8

Les htroprotines.............................................................................................43

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Introduction Le terme protide regroupe des molcules de fonctions biologiques diverses mais possdant une structure, une organisation proche. Chimiquement les protides sont caractriss par la prsence dazote en proportion importante( 16 %) et dun peu de soufre. Ils ragissent spcifiquement la raction du biuret et la raction xanthoprotique. Lhydrolyse (coupure par leau) des molcules protidiques libre toujours un mlange de composs structure caractristique : les acides amins. Le terme protide dsigne donc lensemble des acides amins naturels et de leurs combinaisons chimiques qui sont les peptides (enchanement dun petit nombre dacides amins, structure simple) et les protines (enchanement dun grand nombre dacides amins, architecture complexe). Une molcule protidique peut sassocier avec dautres molcules (ions mtalliques, glucides, lipides ou autres) par des liaisons covalentes ou de faible nergie. Une protine forme exclusivement dacides amins est une holoprotine, si un compos, appel groupement prosthtique, est li la chane protique, la protine est une htroprotine.

Composs protidiques

Acides amins

Peptides

Protines (polypeptides) n 100

Oligo Peptide n 10 Hydrolyse

Peptide n 100

Holo protines Hydrolyse

Htro protines Hydrolyse

Hydrolyse

Acides amins

Groupement prosthtique

Les acides amins

Un acide amin ou aminoacide est un compos comportant toujours une chane carbone plus ou moins longue, une fonction acide carboxylique (-COOH) et une amine qui, une exception prs, est une amine primaire (-NH2). Dans les acides amins naturels, qui constituent les peptides et protines, ces deux fonctions sont supportes par le mme carbone, not carbone , do le terme dacides amins. La formule gnrale est donc: R-CH-COOH | NH2 Les 20 acides amins naturels se distinguent entre eux par la structure de R qui est nomm radical ou chane latrale. R peut tre un radical purement hydrocarbon ou comporter un groupement fonctionnel.

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Structure et classification des 20 acides amins naturels: Suivant la nature du radical R et les proprits qui en dcoulent plusieurs critres de classification des acides amins (AA) peuvent tre retenus: Structure linaire ou cyclique de R - AA aliphatiques (R non cyclique) - AA aromatiques (R cyclique de type benznique) - AA htrocycliques (R cyclique avec un atome autre que le carbone dans le cycle) Prsence ou non dans R dun groupement pouvant prendre une charge lectrique - AA neutres - AA acides (charge potentielle ngative) - AA basiques (charge potentielle basique) Prsence ou non dans R dun groupement polaire - AA polaires - AA non polaires Prsence ou non dun groupement fonctionnel dans R - AA hydrocarbons (pas de groupement fonctionnel dans R, chane aliphatique ou cycle aromatique) - AA hydroxyls (prsence dun groupement alcool ou phnol dans R) - AA soufrs (prsence dun groupement thiol ou thiol-ther dans R) - AA htrocycliques (R est un htrocycle) - AA acides (prsence dun groupement acide carboxylique dans R) - AA amide (drivent des prcdents par amidification) - AA basiques (prsence dun groupement azot, amine ou autre, dans R) - AA particulier : fonction amine en est une fonction amine secondaire Les AA sont symboliss soit par un code trois lettres (en gnral les trois 1res du nom) commenant par une majuscule soit par un code une seule lettre. Il est important de noter que 8 de ces acides amins sont indispensables chez ladulte et 9 chez lenfant, ce sont : histidine (enfant), leucine, isoleucine, lysine, mthionine, phnylalanine, thronine, tryptophane, valine. Il existe une phrase mnmotechnique pour se souvenir des 8 AA indispensables chez ladulte: Le trs lyrique Tristan fait vachement mditer Iseult, ce qui donne : Leucine, Thronine, Lysine, Tryptophane, Phnylalanine, Valine, Mthionine, et enfin Isoleucine.

Liste des 20 acides amins naturels avec leurs symboles:

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1.1 Proprits des acides amins 1.1.1 Proprits physiques

1.1.1.1 Solubilit Les AA sous forme solide sont en gnral des poudres blanches cristallises. Ils ont une solubilit plus ou moindre dans l'eau et dans les solvants organiques selon la nature du radical R. Si R est polaire ou ionique la solubilit dans leau est importante, si R est apolaire la solubilit dans leau est plus faible. 1.1.1.2 Proprits optiques : le pouvoir rotatoire Tous les acides amins sauf le glycocolle possdent au moins un carbone asymtrique C*, qui est le carbone . Les acides amins existent donc sous forme de plusieurs stroisomres, dont deux nantiomres symtriques lun par rapport lautre.
Ex : Lalanine: CH3 CH(NH2) COOH
H C CH3 COOH HOOC H C CH3

NH2

NH2

En projection de Fischer:
basculer NH2 H projeter dans (P) NH2

COOH H NH2 CH3 P


Reprsentation de Fischer

C
H COOH CH3

C
COOH

CH3

Perspective de Cram

Dans cette reprsentation plane : - C* n'est pas reprsent, - le groupe carboxyle -COOH est obligatoirement projet en haut et le rsidu R- (ici CH3) en bas, donc NH2 et H sont gauche ou droite. Lnantiomre o le NH2 est gauche en projection de Fischer appartient la srie L, celui o il est droite appartient la srie D

COOH H2N C H H

COOH C NH2 CH3 D-Alanine

CH3 L-Alanine

La plupart les acides amins naturels sont de la srie L.

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1.1.1.3 Absorption lumineuse dans lultraviolet Tous les acides amins absorbent les radiations ultraviolettes des longueurs dondes infrieures 230 nm. Les acides amins ayant un radical aromatique (Tyr, Trp, Phe) absorbent vers 280 nm. 1.1.2 Proprits ioniques

La prsence dans la mme molcule d au moins deux groupements fonctionnels antagonistes, lun acide : -COOH, lautre basique : -NH2, donne des proprits trs particulires aux acides amins. La forme acide du groupement acide carboxylique est COOH, sa forme basique est COOLa forme acide du groupement amine est NH3+, sa forme basique est NH2 Rappel un groupement est dautant plus acide donc perd plus facilement son proton que son pKa est faible. Pour les acides amins cest le groupement -COOH qui est le plus fort (pKa 2), le groupement NH3+ est un acide trs faible (pKa 9) 1.1.2.1 Cas des acides amins neutres: En milieu trs acide : Le groupement acide COOH est presque entirement proton, donc pratiquement pas ionis, lquilibre: R-COOH + H2O R-COO- + H3O+ est presque totalement dplac vers la gauche en prsence dions H3O+ Le groupement amine -NH2 est lui aussi presque entirement proton, donc pratiquement totalement ionis, lquilibre: R-NH3+ + H2O R-NH2 + H3O+ est presque totalement dplac vers la gauche en prsence dions H3O+ Donc en milieu acide, lacide amin existe essentiellement sous forme de cation :

En milieu trs basique : Le groupement acide COOH perd son proton par raction pratiquement totale avec les ions hydroxydes HO-, il est donc pratiquement totalement ionis, lquilibre : R-COOH + HO- R-COO- + H2O est presque totalement dplac vers la droite en prsence dions OHLe groupement amine NH3+ perd lui aussi son proton par raction pratiquement totale avec les ions hydroxydes HO-, il nest donc pratiquement pas ionis, lquilibre: R-NH3+ + OH- R-NH2 + H2O est presque totalement dplac vers la droite en prsence dions OHEn milieu trs basique, lacide amin existe essentiellement sous forme danion :

En milieu intermdiaire : Les deux groupes fonctionnels antagonistes changent un proton, Le groupement acide COOH cde son proton tandis que le groupe amine -NH2 le capte. Il sagit donc dune raction acidobasique intramolculaire. Dans le milieu il existe alors un quilibre entre la forme molculaire de

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lacide amin et une forme doublement ionise globalement neutre que lon appelle ion mixte ou amphion ou encore zwitterion :

Remarques : 1- Cette double ionisation permet dexpliquer la grande solubilit des acides amins polaires et ioniques dans leau, lquilibre ci-dessus tant trs dplac vers la droite. En solution aqueuse ils existent sous la forme d amphions. 2- Inversement la solubilit dans les solvants organiques est faible. 3- En solution aqueuse les acides -amins se comportent comme des ampholytes, ils ont des proprits amphotres.

Ka1

AA+ AA

[AA].[H3O+] Ka1 = ---------------------[AA+]

pKa1 = - log Ka1

Si Ka1 = [H3O+], alors [AA] = [AA+], cest la dissociation du premier quilibre et pH = pKa1.

Ka2

AA AA-

[AA-].[H3O+] Ka2 = ---------------------[AA]

pKa2 = - log Ka2

Si Ka2 = [H3O+], alors [AA] = [AA-], cest la dissociation du deuxime quilibre et pH = pKa2. Donc les formes prpondrantes en fonction du pH sont donnes par le schma suivant: pH: forme majoritaire [AA ]
+

pka1 [AA+] = [AA] [AA ]

pKa2 [AA] = [AA-] [AA-]

Point isolectrique : Le passage dun milieu trs acide un milieu trs basique par augmentation progressive du pH provoque le passage de la forme cationique la forme damphion puis la forme anionique. Il existe donc, pour chaque acide amin, une valeur du pH pour laquelle lamphion est majoritaire et sa concentration maximale, la charge nette globale de lacide amin est donc nulle. Ce pH particulier, compris entre pKa1 et pKa2, est appel point isolectrique ; il se note pHi. Il est caractristique de chaque acide -amin et sa valeur est donne par la relation :

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pHi =

1 (pKa1 + pKa2) 2

Donc: Si pH = phi, la charge de lacide amin est nulle Si pH < phi, la charge de lacide amin est positive Si pH > phi, la charge de lacide amin est ngative La charge (+ ou-) est dautant plus forte que lon sloigne du pHi. Dissociation en fonction du pH
% des formes

AA+ 100

AA

AA-

50

pKa1

pHi

pKa2

Courbe de titration dun acide amin neutre : lalanine

pH
2me zone tampon

1re zone tampon

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1.1.2.2 Cas des acides amins acides: Les deux acides amins : acide aspartique et acide glutamique possdent un groupement acide carboxylique dans le radical R, ils ont donc trois groupements ionisables. Cest le groupement -COOH en qui est le plus fort (pKa 2), puis vient le groupement COOH du radical R (pKa 4), le groupement -NH3+ est lacide le plus faible (pKa 9,7) Lordre dionisation est donc le suivant:
+

H3N-CH-COOH | (CH2)n | COOH AA+

Ka1
+ H2O

H3N-CH-COO| (CH2)n | COOH AA

H3O

[AA].[H3O+] Ka1 = ---------------------[AA+]

H3N-CH-COO| (CH2)n | COOH AA

Ka2
+ H2O

H3N-CH-COO| (CH2)n | COOAA-

H3O

[AA-].[H3O+] Ka2 = ---------------------[AA]

H3N-CH-COO| (CH2)n | COO-

Ka3
+ H2O

H2N-CH-COO| (CH2)n | COOAA2-

H3O

[AA2-].[H3O+] Ka3 = ---------------------[AA-]

AA-

La forme amphionique neutre se situe entre la premire et la deuxime ionisation donc:

pHi =

1 (pKa1 + pKa2) 2

Donc les formes prpondrantes en fonction du pH sont donnes par le schma suivant: pH: forme [AA+] majoritaire [AA+] = [AA] pka1 [AA] [AA] = [AA-] pka2 [AA-] pKa3 [AA2-] [AA-] = [AA2-]

Dissociation en fonction du pH:

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% des formes

AA+
100

AA

AA-

AA2-

50

pKa1 pHi

pKa2

pKa3

pH

Courbe de titration dun acide amin acide

pH

3me zone tampon pKa3

2mre zone tampon 1re zone tampon pHi pKa1 pKa2

1
H3O

0,5
+

0
quivalents

0,5

1
OH
-

1,5

1.1.2.3 Cas des acides amins basiques: Trois acides amins, lysine et arginine et histidine possdent un groupement azot dans le radical R, ils ont donc galement trois groupements ionisables. Cest le groupement -COOH en qui est le plus fort (pKa 2), puis vient le groupement -NH3+ en (pKa 9), le groupement azot du radical R est lacide le plus faible (10 <pKa > 13), sauf pour lhistidine o le groupement azot du radical R est plus fort (pKa 6) que le groupement -NH3+ en (pKa 9).

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Lordre dionisation est donc le suivant (exemple de la lysine):


+

H3N-CH-COOH | (CH2)4 | NH3+ AA2+

pKa1
+ H2O

H3N-CH-COO| (CH2)4 + H3O+ | NH3+ AA+

[AA2+].[H3O+] Ka1 = ---------------------[AA+]

H3N-CH-COO| (CH2)4 | NH3+


AA+

pKa2
+ H2O

H2N-CH-COO| (CH2)4 + H3O+ | NH3+ AA

[AA].[H3O+] Ka2 = ---------------------[AA+]

H2N-CH-COO| (CH2)4 | NH3+ AA

pKa3
+ H2O

H2N-CH-COO| (CH2)4 + H3O+ | NH2 AA-

[AA-].[H3O+] Ka3 = ---------------------[AA]

La forme amphionique neutre se situe entre la deuxime et la troisime ionisation donc:

pHi =

1 (pKa 2 + pKa 3) 2

Donc les formes prpondrantes en fonction du pH sont donnes par le schma suivant: pH: pka1 [AA2+] [AA+] pka2 [AA] pKa3 [AA-]

forme majoritaire

[AA2+] = [AA+]

[AA+] = [AA]

[AA] = [AA-]

Dissociation en fonction du pH:

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% des formes

100

AA2+

AA+

AA

AA-

50

pKa1

pKa2

pKa3

pH

pHi

Courbe de titration dun acide amin basique

pH
3me zone tampon 2mre zone tampon pHi pKa2 pKa3

1re zone tampon

pKa1

2 H3O

1,5
+

0,5

0 quivalents

0,5 OH-

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1.1.3

Proprits chimiques communes tous les acides amins

1.1.3.1 Proprits de la fonction acide carboxylique -COOH Formation de sels Les acides amins ragissent avec les bases en formant des sels. Le groupement carboxyle perd un proton.
O R CH NH2 C OH + NaOH R CH NH2 C OO + Na+

Ce sel a pour nom : (nom de lacide amin termin par ate) de sodium, ex glycinate de sodium. A linverse la fonction -COO- ragit avec un acide pour redonner -COOH Rduction La fonction acide peut tre rduite en fonction alcool
O R CH NH2 C OH + NaBH4 R CH NH2 Fonction ester O + OH R-OH R CH NH2 C + O-R Fonction amide O + H2N-R OH R CH NH2 C + NH-R H2O H2O CH2OH

Fonction alcool Iaire

Estrification Les acides amins ragissent avec les alcools en formant des esters.
O R CH NH2 C

Action des amines primaires: Cette raction aboutit la formation damides.


O R CH NH2 C

Dcarboxylation Cette raction est intressante dun point de vue biochimique. Elle aboutit la formation dune amine.
O R CH NH2 C OH R CH NH2 2 + CO2

Cette dcarboxylation peut se faire par: - voie chimique : chauffage de lAA dans une solution inerte - Voie enzymatique : sous laction denzymes, les dcarboxylases. 1.1.3.2 Proprits de la fonction amine primaire NH2 Formation de sels Les acides amins ragissent avec les acides en formant des sels. Le groupement amine capte un proton.

O R CH NH2 C OH + HCl R CH NH3+ C

O + OH Cl-

Ce sel a pour nom : chlorhydrate dacide amin.

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A linverse la fonction NH3+ ragit avec une base pour redonner NH2 Substitution par un radical R Les hydrognes ports par la fonction amine peuvent tre remplacs par un radical organique. - Substitution par le Dinitrofluorobenzne (DNFB)
R CH O C OH Dinitrofluorobenzne DNFB C OH NH2 + NO2 F NO2 NO2 R CH NH NO2 + HF

Dinitrophnyl acide amin DNP-AA

- Substitution par le Phnylisothiocyanate (PITC)


R CH O C OH NH2 + S=C=N Phnylisothiocyanate PITC R CH C O R CH O C OH NH NH C S Acide phnylthiohydantoque aminoacide

NH

C N

Phnylthiohydantone aminoacide PTH-AA

- Substitution par le Chlorure de Dimthyl Amino1 Sulfonyl 5 Naphtalne (Chrorure de DANSYL)


CH3 N R CH O C OH O O S Cl C OH O R CH O NH S O NH2 DANSYL-aminoacide + CH3 CH3 N CH3

Substitution par le formaldhyde (formol)


O + O 2 HCHO R CH N CH2OH CH2OH C OH

CH NH2

C OH

Cette raction permet de bloquer la fonction amine.

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Action des acides carboxyliques : Cette raction aboutit la formation damides. Dsamination Lacide nitreux ragit sur les acides amins en librant du diazote qui peut tre dos.
O R CH NH2 C OH + HNO2 R CH OH C OH O + N2 + H2O

Une dsamination existe galement par voie biochimique, elle est enzymatique. 1.1.3.3 Proprits des fonctions COOH et -NH2 conjointes Raction avec la ninhydrine

CO2

R-CHO

H2O

Le compos form : Pourpre de Ruhemann prsente une coloration violette sauf avec la proline avec laquelle il sera jaune. 1.1.4 Proprits chimiques des chanes latrales

Acides amins aromatiques - Absorption en UV: Les acides amins aromatiques absorbent les radiations lumineuses dans lUV Les max des trois acides amins aromatiques (Trp, Tyr, Phe) sont diffrentes.

Absorbance

Trp

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Phe

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Tyr

- Raction de Folin Lacide phosphotungstomolybdique est rduit par la tyrosine et le tryptophane et forme diffrents composs colors en bleu violac. - Raction xanthoprotique Les noyaux aromatiques forment des drivs nitrs jaunes avec lacide nitrique. Acides amins soufrs Ils ragissent avec lactate de plomb en milieu alcalin pour former du sulfure de plomb noir. Cystine Les groupements thiol de la cystine soxydent facilement en crant un pont disulfure formant la cystine: 2 cystines cystine + 2H+ + 2

+ 2H+ + 2

Tyrosine Les groupements phnoliques substitus ragissent avec le mercure en donnant une coloration rouge (Raction de Millon). Tryptophane Les aldhydes ragissent avec le noyau indole du tryptophane pour former des composs violets. (Raction dAdamkiwich-Hopkins). Arginine L-naphtol en prsence dhybobromite et en milieu basique ragit avec le groupement guanidine (NH=CNH2) pour former un compos rouge (Raction de Sakaguchi). Proline Donne une coloration particulire avec la ninhydrine Ragit avec lisatine pour former un compos bleu intense. 1.2 Mthodes de dosage et danalyse des acides amins 1.2.1 Mthodes de dosage total

Ces mthodes permettent de doser tous les acides amins, quelle que soit la nature du radical R. 1.2.1.1 Mthode de Kjeldahl Les acides amins sont minraliss totalement par oxydation en milieu sulfurique concentr et chaud. Il se forme du sulfate dammonium, acide faible qui peut tre dos par une base forte.

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1.2.1.2 Mthode de Srensen La raction employe est la substitution par le formaldhyde, le compos qui en rsulte est une amine tertiaire, qui est une base plus faible (donc un acide plus fort sous la forme protone)que lamine primaire initiale. Le dosage de la molcule est donc plus ais par une base en prsence dun indicateur color. Cette mthode a pour nom formol-titration de Srensen 1.2.1.3 Dosage spectrophotomtrique la ninhydrine Les acides amins sont dosables spectromtriquement aprs drivation la ninhydrine car cette raction entrane la formation dun compos de couleur violette ou jaune (proline) (cf. proprits chimiques), qui absorbe fortement dans le visible. La loi de Beer-Lambert : Absorbance = .l.[c], montre que labsorption lumineuse est proportionnelle la concentration molaire, condition de travailler la longueur donde dabsorption maximum de la molcule ou max et avec une solution limpide et suffisamment dilue. 1.2.2 Mthodes de dosage spcifiques de certains acides amins

1.2.2.1 Dosage spectrophotomtrique dans lultraviolet Les acides amins aromatiques absorbent les radiations lumineuses dans lUV, labsorption rpond la loi de Beer-Lambert. 1.2.2.2 Dosage spectrophotomtrique dans le visible Les ractions spcifiques certains acides amins produisant des composs colors (cf.; proprits chimiques du radical R) dont labsorption rpond la loi de Beer-Lambert peuvent tre utilises pour doser ces AA par colorimtrie. 1.2.3 Techniques de sparation des acides amins

1.2.3.1 llectrophorse Rappel: cette technique spare les acides amins selon leur charge lectrique. Une solution aqueuse d'un mlange d'AA est place sur un papier spcial ou un gel dlectrophorse Un champ lectrique de haut-voltage est appliqu ce gel plac dans une solution tampon de pH fixe. A cause de leurs diffrents pHi, les AA possdent des charges distinctes et migrent dans des directions et des vitesses diffrentes selon le pH du systme tampon et le type de support. Pour tablir leur localisation caractristique, des chantillons d'AA tmoins sont traits dans les mmes conditions. Le support est ensuite color la ninhydrine. 1.2.3.2 La chromatographie Gnralits: La chromatographie, mthode d'analyse physico-chimique, spare les constituants d'un mlange (les soluts) par entranement au moyen d'une phase mobile (liquide ou gaz) le long d'une phase stationnaire (solide ou liquide fix), grce la (r)partition slective des soluts entre ces deux phases. Chaque solut est donc soumis une force de rtention exerce par la phase stationnaire et une force de mobilit due la phase mobile. Les facteurs qui interviennent dans le partage des molcules sparer entre les phases fixe et mobile sont : la solubilit dans un solvant liquide, la taille (la forme), la polarit, la charge lectrique, la prsence de groupements d'atomes formant des sites particuliers. Les diffrents types de chromatographie rsultent du fait que l'on a privilgi l'effet de l'un ou lautre de ces facteurs, mais l'exclusivit d'un mcanisme n'est jamais totale au cours d'une sparation chromatographique. Chromatographies en phase liquide (CPL) : la phase mobile est un liquide. Selon la nature de la phase stationnaire, on distingue : les chromatographies de partage :

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la chromatographie de partage :c'est une chromatographie liquide-liquide. La phase stationnaire est un liquide fix sur un support inerte. Cette chromatographie est ainsi dnomme car elle est base sur le partage du solut dans les deux phases liquides. la chromatographie d'exclusion :elle est encore appele chromatographie d'exclusion-diffusion, tamisage molculaire, gel-filtration, permation de gel. La phase stationnaire est un solide poreux : les grosses particules sont exclues de la phase fixe, en revanche les petites particules incluses diffusent dans les pores du gel. les chromatographies d'adsorption : la chromatographie d'adsorption :c'est une chromatographie liquide-solide. la phase stationnaire est un adsorbant solide polaire. la chromatographie d'adsorption en phase inverse :c'est une chromatographie liquide-solide dans laquelle la phase stationnaire est apolaire la chromatographie sur changeurs d'ions :la phase stationnaire est un changeur d'ions constitu par une rsine porteuse de groupements ioniss ngativement ou positivement, exerant des interactions de type lectrostatique avec les soluts ioniques du milieu. la chromatographie d'affinit : la phase stationnaire est un support macromolculaire chimiquement inerte, sur lequel est greff un effecteur qui prsente une affinit biologique (bio-affinit) pour un solut de l'chantillon analyser (affinit enzyme-substrat, ligand-rcepteur, antigne-anticorps).

chromatographies gazeuses (CG) : la phase mobile est un gaz vecteur. On distingue dans ce cas : - la chromatographie gaz-liquide :c'est une chromatographie de partage. La phase stationnaire est un liquide fix par imbibition d'un support inerte. - la chromatographie gaz-solide :c'est une chromatographie d'adsorption. La phase stationnaire est un solide adsorbant.

Si la phase stationnaire se prsente sous forme de microbilles contenues dans un tube de verre ou de mtal on parle de chromatographie colonne, si elle est sur un support plan on parle de chromatographie de surface ou planaire.

Phase mobile

Mlange sparer Phase stationnaire

Pour les acides amins, peuvent mettre en uvre: les chromatographies de surface: - sur papier - sur couche mince les chromatographies sur colonne les chromatographies en phase gazeuse (CPG) 1.2.3.2.1 Chromatographie papier des acides amins

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Cest une chromatographie de partage entre leau (phase stationnaire) retenue sur le papier et un solvant organique (phase mobile) qui monte par capillarit le long de la phase fixe, entranant plus ou moins les AA en fonction de leur polarit. Les AA sparer sont chromatographis en prsence de tmoins. Aprs migration et coloration la rfrence frontale (Rf) de chaque AA inconnu ou tmoin est calcule. Rf = Dplacement du compos / dplacement du solvant La Rf est une caractristique dun compos dans un systme donne pour des conditions opratoires dfinies. La Chromatographie papier peut tre bidimensionnelle:le dpt du mlange analyser se fait dans un angle, sans tmoin, la migration dans la 1re dimension se fait avec un premier solvant organique puis le papier est tourn d un de tour et une nouvelle migration se fait avec un autre solvant organique de polarit diffrente. 1.2.3.2.2 Chromatographie sur couche mince des acides amins (CCM)

Cest une chromatographie dadsorption avec une phase stationnaire polaire (cellulose ou silice) tale en fine couche sur un support rigide inerte (verre ou feuille de mtal) et une phase mobile qui est un solvant organique moins polaire. Les AA sparer sont chromatographis en prsence de tmoins. Aprs migration et coloration la rfrence frontale (Rf) de chaque AA inconnu ou tmoin est calcule. La Chromatographie couche mince peut tre galement bidimensionnelle 1.2.3.2.3 Chromatographie ionique des acides amins

C'est le procd le plus utilis pour sparer, identifier et quantifier chaque AA dans un mlange. Elle est base sur les diffrences de comportement acido-basique des AA. La colonne de chromatographie est un long tube rempli d'une rsine synthtique sur laquelle sont fixs des groupements chargs : Une rsine avec des groupements anioniques est un changeur de cations. Une rsine avec des groupements cationiques est un changeur d'anions. Les groupements anioniques sont en gnral: Rsine carboxylique
particule COOCOOCOO-

Rsine sulfonique
particule

SO3HSO3HSO3H-

Les groupements cationiques sont en gnral: Rsine ammonium


NH3+ particule NH3+ NH3+

Pour la sparation des AA, une rsine changeuse de cations est gnralement utilise. A pH = 3*, on place un mlange d'AA au sommet de la colonne. * pH = 3, la plupart des AA sont sous-forme de cations, mais diffrent par leur degr d'ionisation.

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+ SO- Na 3 + SO- Na 3

+ + NH-CHR-COOH 3 Echange de cations

+ SO- NH-CHR-COOH 3 3 + SO- NH-CHR-COOH 3 3 + 2 Na


+

Sites

SO- (groupements sulfonates) 3

Ex : les AA (His, Lys, Arg) dplacent en premier Na+ et seront solidement fixs. Les AA (Glu, Asp) seront les moins fixs. Les AA seront ensuite lus par changement de pH. Ces AA sont ensuite collects la sortie de la colonne , colors la ninhydrine, leur absorbance est mesure, le chromatogramme se prsente sous forme dun graphe prsentant des pic lors de la sortie dun AA.

Cette mthode est la fois qualitative et quantitative car la surface dun pic est proportionnelle la concentration de lacide amin. 1.2.3.2.4 La chromatographie gazeuse (CG)

Pour pouvoir tre spars par CG les composs doivent pouvoir tre entrans par la phase mobile gazeuse, ils devront donc tre volatils. Ce nest pas le cas pour les acides amins, il faudra donc les rendre volatils par transformation chimique. Ils seront ensuite spar par passage travers une colonne capillaire (2m de long, 0,1mm de diamtre) dont lintrieur est recouvert dun film liquide. Cette colonne est chauffe entre 100 et 200C. Les AA sont partiellement solubles dans cette phase liquide stationnaire non volatile et partiellement vaporiss. Ils sont alors entrans par le gaz vecteur des vitesses diffrentes qui dpendent de leur solubilit dans le film liquide. Il sagit donc dune chromatographie de partage liquide-gaz. 1.2.3.3 Llectrochromatographie Il sagit dun couplage sur un support adquat dune CCM dans une premire dimension et dune lectrophorse dans la dimension perpendiculaire.

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2 les peptides Un peptide est une molcule rsultant de la condensation dacides amins lis les uns autres par des liaisons peptidiques. Cette liaison rsulte de la raction entre la fonction -COOH du 1er AA et la fonction NH2 du 2me AA avec limination deau.
O NH2 CH R1 C OH O O NH2 OH CH R1 C NH CH R1 C O

NH2

CH R2

+ H2O
OH

Liaison peptidique = Fonction amide On appelle rsidus les AA engags par leur COOH dans une liaison peptidique, leurs noms se terminent par le suffixe yl, ex. alanyl, prolyl. Dans les peptides le nombre dAA est < 100, un petit peptide (AA<10) est un oligopeptide, dans les protines, qui sont des polypeptides, le nombre dAA est < 100.. Exemple dun ttrapeptide: O H O H O H || | || | || | NH2CHCNCHCNCHCNCHCOOH | | | Extrmit N terminale | Extrmit C terminale R1 R2 R3 R4

2.1

Proprits de la liaison peptidique et des peptides Le caractre de la liaison peptidique est lgrement acide, ce qui contribue crer de nouvelles proprits, diffrentes celles des acides amins. La liaison peptidique est hydrolysable en milieu acide concentr et chaud. Un peptide possde de nombreux groupements ionisables libres (extrmits N et C terminales, groupements ionisables des groupements latraux R), il va donc exister sous de nombreuses formes ioniques diffrentes, il possde un pHi. Le pHi est, comme pour les AA, la demie somme des pKa qui entourent la forme amphionique. Les peptides partir de 4 AA peuvent tre mis en vidence par la raction du biuret, qui est caractristique de la liaison peptidique. Le peptide, en milieu trs alcalin, ragit avec le cuivre Cu2+ pour donner un complexe rose.

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Langle des liaisons autour des atomes fait que la chane peptidique nest pas plane mais possde une structure spatiale du type:
O C CH R1 N H R2 CH C O H N CH R3 O C N H R4 CH

La chane peptidique est donc une succession des groupements -CH, -C=O, -NH, les groupements R des rsidus dacides amins sont rejets lextrieur. 2.1.1 Squence dun peptide

La squence dun peptide est lordre denchanement des AA. Par convention un peptide scrit en commenant par lextrmit N terminale, (groupement NH2 libre) et en terminant par lextrmit C terminale (groupement COOH libre). Exemple : criture du ttrapeptide:glutamylcystnyllysylglycine O H O H O H || | || | || | NH2CHCNCHCNCHCNCHCOOH | | | | (CH2)2 CH2 (CH2)4 H | | | COOH SH NH2 Pour une criture simplifie, les acides amins peuvent tre reprsents par leur symbole trois lettres ( Glu-Cys-Lys-Gly) ou une lettre (E-C-K-G). 2.2 Dtermination de la squence dun peptide Pour dterminer la structure dun peptide, il faut connatre sa composition brute en acides amins, puis en dterminer sa squence. Pour dterminer la structure dun peptide, il faut connatre sa composition brute en acides amins, puis en dterminer sa squence. 2.2.1 Dtermination de la composition brute dun peptide

Le peptide est d'abord rduit, ou oxyd, afin d'liminer les liaisons disulfure. Mthode de Stein et Moore. Elle comprend plusieurs tapes : Hydrolyse acide ( HCl 6 mol.L-1, 24h 72h, 110C) pour couper les liaisons peptidiques (! lhydrolyse acide dtruit le tryptophane) Sparation des AA librs par chromatographie ionique Dtection dans le visible aprs drivation la ninhydrine Identification des AA par leur temps de rtention Quantification en % par mesure de la surface des pics Mthode des PTC acides amins Hydrolyse acide Raction avec le phnylisothiocyanate PTC (cf. proprits chimiques 1.2.3.2.) Sparation par HPLC dadsorption en phase inverse Dtection dans lUV Identification des AA par leur temps de rtention Quantification par mesure de la surface des pics

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2.2.2

Dtermination de lacide amin N terminal

Il existe plusieurs mthodes chimiques et une mthode enzymatique La dgradation de Sanger utilise le 1-Fluoro-2,4dinitrobenzne comme ractif (cf. proprits chimiques 1.2.3.2.). Ce compos favorise une substitution sur le groupement -NH2 de lAA.. Sur un peptide, il ragit avec l'extrmit amine libre (N terminale)en donnant :

L'hydrolyse suivante coupe les liaisons peptidiques mais pas la liaison DNP-NH. Ainsi le premier acide amin modifi est rcupr et identifi par chromatographie. Cette raction a ouvert la voie de l'analyse, mais le reste de la chane n'est plus reli et l'information sur sa structure est perdue. Le Chlorure de DANSYL (cf. proprits chimiques 1.2.3.2.) peut tre utilis de manire identique avec lavantage que le DANSYL-AA libr est naturellement fluorescent. La dgradation rcurrente d'Edman fait appel au phnylisothiocyanate PITC (cf. proprits chimiques 1.2.3.2.). Le compos form se cyclise spontanment en un cycle 5 lments, cela entrane la rupture d'une seule liaison peptidique et permet de ritrer l'opration sur la partie restante. Ce procd a pu tre automatis et autorise en routine des squenages de 50 acides amins.

Laminopeptidase est une enzyme de la famille des exopeptidases, cest dire quelle catalyse lhydrolyse des liaisons peptidiques en commenant par une extrmit, en loccurrence lextrmit N terminale. Son fonctionnement est rcurrent donc pour librer seulement le premier AA, lenzyme doit agir pendant un temps trs court. LAA libr est identifi par chromatographie. 2.2.3 Dtermination de lacide amin C terminal

Les carboxypeptidases A et B sont des enzymes de la famille des exopeptidases, elles catalysent lhydrolyse des liaisons peptidiques lextrmit C terminale. La carboxypeptidase A catalyse la coupure de la liaison C terminale sauf celle de Gly et des AA basiques condition que lavant dernier AA ne soit pas Pro. La carboxypeptidase B catalyse la coupure de la liaison C terminale des AA basiques condition que lavant dernier AA ne soit pas Pro. Leur fonctionnement est rcurrent donc pour librer seulement le dernier AA, lenzyme doit agir pendant un temps trs court. LAA libr est identifi par chromatographie. 2.2.4 Coupures spcifiques internes

Si le peptide tudier comporte plus de 50 AA il sera rduit en peptides plus courts par coupures spcifiques avant dtre squenc par la mthode dEdman. Des endopeptidases ou des composs chimiques possdant des sites de coupure spcifique seront alors employs. La trypsine est une endopeptidase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans lesquelles un acide amin basique (Lys, Arg) engage sa fonction acide L'-chymotrypsine est une endopeptidase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans lesquelles un acide amin aromatique (Tyr, Trp, Phe ainsi que Met) engage sa fonction acide. La pepsine est une endopeptidase qui hydrolyse les liaisons peptidiques dans lesquelles un acide amin aromatique (Tyr, Trp, Phe) engage sa fonction amine.

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Le bromure de cyanogne coupe les liaisons peptidiques dans lesquelles une Met engage sa fonction acide, elle est transforme en HSL homosrine lactone.. 2.3 Quelques peptides dintrt biologique ou alimentaire 2.3.1 Peptides hormonaux

De nombreuses hormones synthtises par diverses glandes sont de nature peptidique, voici quelques exemples : La Vasopressine, synthtise par lhypophyse, est une hormone diurtique, dont l'extrmit se termine par une fonction amide -CO-NH2 sur la glycine et non par un acide libre -COOH.

Langiotensine II une hormone du sang dorigine hpatique qui rgule la pression sanguine :

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe

Le glucagon est une hormone pancratique hyperglycmiante comportant 29 AA

Linsuline est une hormone pancratique hypoglycmiante comportant 51 AA en deux chanes unies par un pont disulfure.

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2.3.2

Glutathion

Le glutathion est un tripeptide comprenant trois acides amins : acide glutamique, cystine et glycocolle. La cystine et le glycocolle sont lis par une liaison peptidique. La liaison entre l'acide glutamique et la cystine est une liaison amide entre la fonction acide du radical de l'acide glutamique et la fonction amine de la cystine. En somme le glutathion est le -glutamyl-cystinylglycocolle. Par la fonction thiol du radical de la cystine, le glutathion peut exister sous une forme rduite (reprsente ici) ou sous une forme oxyde dans laquelle deux molcules de glutathion sont lies par un pont disulfure.
-

OOCCHCH2CH2CONHCHCONHCH2COO| | NH2 CH2 | SH

2.3.3

Peptides antibiotiques

La gramicidine S est un peptide cyclique form de dix acides amins, de structure :


Leu D-Phe Val Pro Pro D-Phe Leu Orn Val

Orn

La bacitracine A est un peptide partiellement cyclique form de douze acides amins


Orn Ile Phe His

IleCysLeuGluIleLys
Asp Asp

La tyrocidine est galement un peptide cyclique form de dix acides amins

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2.3.4

Peptides dintrt alimentaire

Les dulcorants de synthse haut pouvoir sucrant sont souvent de nature peptidique. Exemple : structure de l'aspartame : cest un dipeptide mthyl : laspartyl-phnylalanine mthyl O O || || 2HNCHCNHCHC-OCH3 | | CH2 CH2 | | COOH C6H5 3 Les protines Les protines sont des constituants fondamentaux des organismes vivants, ce sont des polymres dacides amins (nombre dAA <100), de haut poids molculaire pouvant atteindre 1000 000 D, (la plupart entre 25000 D et 200000 D). Une protine peut tre forme dune seule chane polypeptidique (monomre) ou de plusieurs (dimre, ttramre, ) Suivant leur composition se distingue : Les holoprotines qui sont formes uniquement dunit(s) polypeptidique(s) Les htroprotines auxquelles un groupement prosthtique non protidique est associ. Il peut tre constitu par un enchanement glucidique, des lipides, un ion mtallique, un acide nuclique, un coenzyme, un hme . Suivant leur forme se distingue: Les sclroprotines ou protines fibreuses, de forme allonge, peu solubles, trs rsistantes, ce sont des molcules de structure. Les sphroprotines ou protines globulaires, de forme compacte, solubles, fragiles, ce sont des molcules possdant une fonction biologique active. Les protines ont des fonctions trs diverses : Enzymes :Ce sont les catalyseurs des ractions biologiques et permettent ces ractions, de la plus simple la plus complique, de se produire 37C. Chaque cellule vivante contient des milliers d'enzymes, chacune catalysant une seule raction chimique bien prcise. Citons la chymotrypsine enzyme pancratique constitue par une squence de 246 aminoacides. Protines de structure: Elles constituent la charpente des tissus vivants (peau, cheveux, muscles). Citons les collagnes, les kratines et la myosine. Protines de dfense: Citons les immunoglobulines, protines de la coagulation (fibrinogne, thrombine). Protines rgulatrices: exemple de certaines hormones telles que l'insuline, hormone du pancras, avec une squence de 51 aminoacides, qui rgule le taux de sucre dans le sang ou l'ocytocine (polypeptide avec une squence de 9 acides amins) qui rgule les contractions utrines lors de l'accouchement. Citons aussi comme protines rgulatrices, les cytosines de l'immunit.... Protines de transport: Protines du plasma fixant et transportant des molcules ou des ions d'un organe un autre, comme par exemple l'hmoglobine des rythrocytes, le srumalbumine.... Protines contractiles ou motrices: Elles peuvent se contracter et modifier leur forme. (actine et myosine dans les fibres musculaires). Protines de stockage : l'ovalbumine, principale protine du blanc duf, casines, principales protines du lait, et des protines existant dans les graines de nombreux vgtaux (bl, mas, riz). 3.1 Structure des protines Pour les protines la relation structure-fonction est trs forte, le rle biologique de ces molcules ne peut tre maintenu que si lorganisation tridimensionnelle est respecte. Il existe quatre niveaux structuraux chez les protines, de la structure primaire la structure quaternaire.

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Structure primaire : ordre des acides amins le long de la chane polypeptidique. Structure secondaire : repliement local des acides amins en hlices, en feuillets, ou en d'autres formes similaires. Structure tertiaire : agencement stable dans l'espace de ces hlices et feuillets. Structure quaternaire : agencement des sous-units entre elles, quand la protine est constitue de plusieurs sous-units indpendantes.

3.1.1

La structure primaire

La structure primaire est la squence peptidique. Cest la seule structure tre code gntiquement, elle dtermine les trois autres niveaux structuraux. La conformation privilgie de la liaison peptidique entre les rsidus est en trans. Cette conformation est gnralement plus stable car elle positionne les chanes latrales loin l'une de l'autre.

3.1.2

La structure secondaire

Un effet de rsonance cause le partage d'lectrons entre les atomes du groupe carboxylique d'un rsidu et l'azote du groupe amin du rsidu suivant. Cet effet de rsonance fige la liaison peptidique en une structure planaire, le plan amide.

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Chaque liaison peptidique est donc rigide, mais de part et d'autre les liaisons peuvent effectuer une rotation. L'angle de rotation d'un plan amide par rapport au carbone alpha suivant' est not angle ; l'angle entre le plan amide prcdent et ce mme carbone alpha est not angle :

C'est la succession de ce genre de structures rgulires, hlices, feuillets ou tours qu'on appelle la structure secondaire d'une protine. Le biologiste G.N. Ramachandran, se rendit compte en travaillant avec des modles de polypeptides que certains angles et ne pouvaient pas tre combins cause de lencombrement strique Les structures secondaires les plus souvent retrouves dans les protines sont l'hlice alpha et le feuillet bta

3.1.2.1 Lhlice alpha Une hlice alpha rsulte de la succession d'angles de -57o et d'angles de -47o. Cette hlice est droite.

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L'hlice alpha s'lve 0,54 nm chaque tour. Elle compte 3,6 rsidus par tour. Elle est stabilise dans sa forme hlicodale par des ponts hydrognes tablis entre l'hydrogne d'un groupement amin -NH et l'oxygne d'un groupement carboxylique -C=O et situ quatre rsidus plus loin. Comme ces ponts hydrognes vont dans la mme direction que l'hlice, celle-ci est lastique : les ponts hydrognes briss lors de l'tirement de l'hlice se reformeront facilement quand la tension sera relche. Les chanes latrales des rsidus dans une hlice alpha pointent l'extrieur de la structure. Une telle hlice peut facilement avoir une nature amphipathique si les chanes latrales se trouvant toutes du mme ct ont une nature hydrophile et que celle se trouvant de l'autre ct ont une nature hydrophobe. Vue plongeante d'une hlice alpha amphipathique. Les rsidus chargs ou polaires sont en noir, les rsidus hydrophobiques en gris et les petits rsidus en blanc. Mme si la structure primaire ne rvlerait pas de rgion particulirement hydrophile ou hydrophobe, cette vue de l'hlice nous

montre qu'une de ses faces est plus hydrophile et l'autre face plus hydrophobe. La proline n'ayant pas d'hydrogne sur son groupe amin, elle ne peut pas contribuer au pontage hydrogne. La proline dstabilise donc l'hlice alpha, et il est rare qu'on retrouve un rsidu proline dans une telle hlice. Lhlice alpha est reprsente par une spirale.

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3.1.2.2 Le feuillet Les feuillets bta (-sheet en anglais) se forment quand des parties de la longue chane polypeptidique se replient et se longent l'une l'autre, cte cte, en formant des pont hydrognes avec la voisine. On parle de feuillets bta parallles quand les chanes vont dans le mme sens et d'antiparallles quand elles vont dans des directions opposes. La direction des angles et alterne dans un feuillet bta (un positif, l'autre ngatif), donnant la chane une allure en zigzag.

On peut se reprsenter un feuillet bta comme une tle ondule, avec des chanes latrales pointant en alternance en haut et en bas. La distance entre deux rsidus est de 0,335nm; chaque chane est spare de sa voisine de 0,465nm. Un feuillet bta est reprsent, dans les modles structuraux, par une grosse flche plate qui indique sa direction. Puisque les ponts hydrognes des feuillets bta pointent perpendiculairement l'axe de la chane polypeptidique, ils ne donnent pas d'lasticit la structure. On retrouve beaucoup de feuillets bta dans la soie de ver (Bombyx mori) et la toile d'araigne. 3.1.3 La structure tertiaire

La structure tertiaire est la disposition tridimensionnelle des structures secondaires et des chanes latrales dune protine. En dautres mots, lassemblage des structures secondaires et la disposition spatiale arrange des chanes latrale dterminent la conformation native de la protine.

Certains assemblages de structures secondaires sont connus sous le nom de superstructures. Les plus connues sont : Motif : Deux feuillets bta parallles relis par une hlice alpha. Motif en pingle cheveux : Un feuillet bta antiparallle form de chanes polypeptidiques et reli par des tournants en pingle cheveux.

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Motif : Deux hlices alpha antiparallles relies ensemble ayant un axe inclin afin de favoriser des interactions. Barils : Feuillets bta qui senroulent pour former des structures cylindriques. 3.1.3.1 Maintien de la structure Plusieurs interactions entre diffrents rsidus de la chane polypeptidique replie dans l'espace maintiennent la structure de la protine. Interactions lectrostatiques : on les distingue en... - interactions charge-charge entre rsidus de charge inverse ( -NH3+ contre COO ). Quand une telle interaction est enfouie dans une protine globulaire, l'abri de l'eau, on dit qu'il s'agit d'un pont de sel (salt bridge). - Interactions charge-diple quand une chane latrale ionise interagit avec le diple d'une molcule d'eau. Cette interaction aide aussi l'hydratation et la solubilisation de la protine. - Pont hydrogne entre H d'une part et O ou N d'autre part. Les protines peuvent bien sr former des ponts hydrognes avec des molcules de solvant comme l'eau, et de telles interactions peuvent aussi contribuer la stabilit de la structure globale. Interactions hydrophobes : entre groupes hydrophobiques comme les groupements cycliques de la phnylalanine et de la tyrosine. De telles interactions excluent les molcules d'eau. Forces de Van der Waals : il s'agit de diple temporaires de faible force.. Ceux-ci peuvent se former parce que les nuages lectroniques des atomes individuels peuvent fluctuer, donnant naissance des diples temporaires. Ponts disulfures : Nous l'avons vu dans le 114 : une cystine oxyde peut former un lien covalent avec une autre cystine.

On spare souvent les protines globulaires des protines fibreuses 3.1.3.2 Protines globulaires Les protines globulaires ont une forme compacte, o on peut distinguer une surface en contact avec le solvant et un cur qui en est isol. Les rsidus hydrophiles se retrouvent souvent la surface; les rsidus hydrophobes le plus souvent l'intrieur. Les ponts disulfures peuvent se former plus facilement l'intrieur des protines globulaires, parce qu'ils ncessitent des conditions oxydantes et que le cytoplasme est gnralement rducteur cause de la prsence de glutathion. l'abri des molcules d'eau qui les hydrateraient, les acides amins chargs enfouis

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dans les protines globulaires peuvent former des ponts de sel entre eux. Les acides amins hydrophobes peuvent aussi plus facilement s'y empiler pour former des rgions dpourvues d'eau. 3.1.3.3 Protines fibreuses Puisque toutes les protines sont la base une longue chane polypeptidique, on peut se les reprsenter comme des spaghettis. Alors qu'une protine globulaire est une boule de spaghettis refroidis et fige, une protine fibreuse s'tire en longueur. Voici quelques protines fibreuses typiques: Le tropocollagne, la composante de base du collagne, qui est la protine la plus abondante du corps humain. La structure secondaire la plus prsente dans le tropocollagne est l'hlice de collagne, qui est gauche. Cette hlice n'est pas stabilise par des ponts hydrognes internes. La kratine et la tropomyosine, retrouves dans la peau et les muscles, respectivement. Les deux consistent enhlices alpha, qui sont droites, et sont stabilises par des ponts hydrognes internes orients dans le mme sens que la fibre, ce qui leur permet d'tre tires. Les ponts hydrognes des hlices peuvent se briser sous la traction sans qu'il y ait de bris de liens covalents; quand la tension se relche les ponts hydrognes se reforment. Suffisamment tire, la kratine peut aussi adopter une structure en feuillet bta. Une protofibrille de kratine est forme par l'enroulement de deux ou trois hlices alpha les unes autour des autres, en tournant de faon gauche. 11 protofibrilles forment une microfibrille de kratine; un grand nombre de telles microfibrilles forment une fibre de kratine. La fibrone de la soie est compose de rgions trs rigides et riches en feuillets antiparallles. Ces rgions sont spares par des rgions moins structures confrant une certaine lasticit la soie. On peut retrouver dans la fibrone une rptition du genre Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ser (avec la chane latrale de Gly = un atome d'hydrogne) occupant entirement l'une surface du feuillet: Les rgions rigides riches en feuillets de la fibrone sont peu lastiques parce que leurs nombreux ponts hydrognes sont perpendiculaires la direction de la chane polypeptidique. Llasticit de la soie est confre par les domaines amorphes sparant les feuillets bta. 3.1.4 La structure quaternaire

Il existe des protines complexes formes de plusieurs chanes polypeptidiques. L'assemblage de ces sous-units entre elles constituent la structure quaternaire de la protine. L'hmoglobine est la molcule qui, prsente dans les globules rouges, permet le transport de l'oxygne vers les tissus. Elle contribue aussi, dans une moindre mesure, l'vacuation des ions H+ et du CO2.Chez l'adulte, elle est constitue de deux sous-units d'-globine et de deux sousunits de -globine. Ces sous-units sont assembles de telle faon qu'elles laissent une cavit au centre du ttramre. Chaque unit globine est associe un groupe hme, qui contient un atome de fer capable de s'associer l'oxygne.

Suite au dplacement des sous-units, le mouvement de diffrentes hlices alpha de l'hmoglobine fait que l'atome de fer se dplace par rapport au groupement hme et vient se positionner sur le mme plan (voir figure ci-bas). Cette configuration est propice l'association du fer une molcule de O2. Quand le pH baisse, la raction inverse se produit : les hlices

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reprennent leur position typique de la forme T, la cavit centrale grandit, et l'atome de fer est dplac par rapport au groupe hme. Il relche alors son oxygne. 3.2 Proprits des protines 3.2.1 Solubilit

Les protines fibrillaires sont gnralement peu solubles dans leau et les protines globulaires solubles. Cette solubilit est fonction de la composition du milieu en particulier du pH et de la force ionique. Influence du pH: la solubilit dune protine est minimale au voisinage de son pHi
solubilit

pHi

pH

Influence de la force ionique: les sels neutres interviennent sur la solubilit des protines en fonction de la concentration et de la charge en ions cest dire la force ionique .Laugmentation de la force ionique provoque dans un premier temps un effet dissolvant (salting in) puis au-del dune limite variable selon la protine un effet inverse qui fait prcipiter la protines.(relargage ou salting out)
LogS/S0 Zone deffet dissolvant

+1 0 -1 -2

Zone deffet de relargage

3.2.2 Dnaturation Le maintient des structures secondaire, tertiaire, quaternaire des protines est responsable de leur activit biologique, il est assur par des liaisons de faible nergie. Si ces liaison sont rompues , la protine va perdre son activit et certaines proprits: elle est dnature. Cette dnaturation entrane souvent la prcipitation des protines, elle peut tre rversible ou irrversible. Les principaux agents dnaturants sont: La chaleur: les tempratures leves dtruisent les liaisons hydrognes et hydrophobes Les acides et les bases qui agissent sur les liaisons lectrostatique en introduisant des charges nouvelles. Les solvants organiques qui dtruisent les liaisons hydrophobes

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Les dtergents anioniques qui forment des liaisons lectrostatiques avec les groupements NH3+ et des liaisons hydrophobes avec les chanes latrales non polaires. Lure qui forme de nombreuses liaisons hydrognes avec les liaisons peptidiques Les agents rducteurs ou oxydant qui provoque la rupture des ponts disulfure Les sels de mtaux lourds Les rayons UV Les ultrasons 3.2.3 Proprits optiques

Les protines absorbent dans lUV lointain cause des liaison peptidique ( 190 nm) et 280 nm si les contiennent des AA aromatiques en particulier du tryptophane. Les protines sont doues de pouvoir rotatoire. Les protines diffusent la lumire, ainsi leur solution sont souvent troubles. 3.2.4 Proprits ioniques

Les protines, comme les peptides possdent de nombreux groupements ionisables libres (extrmits N et C terminales, groupements ionisables des groupement latraux R), qui leur confrent un caractre amphotre. Lorsque le nombre de groupement chargs positivement est gal au nombre de ceux chargs ngativement la protines est au point isoionique; ce point isoionique est voisin du point isolectrique o la charge totale de la protines est nulle 0en tenant compte des autres ions en solution. 3.2.5 Proprits chimiques

Les protines possdent les proprits des liaisons peptidiques (cf.; 2.1.) et des chanes latrales des rsidus dacides amins (cf.; 1.1.4.) 3.2.6 Proprits antigniques

Les protines animales, vgtales, bactriennes ou virales possdent des proprits antigniques, cest dire que lorsquelle sont injectes un organisme tranger, elles provoquent chez cet organisme la fabrication danticorps. Les protines tant de grosses molcules, elles possdent plusieurs pitopes ou sites antigniques capable chacun dinduire la fabrication dun type danticorps. Il est noter que les anticorps sont eux mmes de nature protique. 3.3 Mthodes de sparation des protines 3.3.1 Prcipitation des protines

Les protines peuvent tre prcipites par ajout de solvant organique (prcipitation irrversible), par modification de pH ou de temprature (prcipitation irrversible) ou par modification de la force ionique par ajout de sel neutre. Le sel le plus utilis est le sulfate dammonium (NH4)2SO4. Les protines prcipitent des forces ioniques diffrentes. Il existe deux manires dutiliser cette mthode: ajout de sulfate dammonium suffisamment concentr, gnralement 70% de saturation : prcipitation de toutes les protines dun mlange (phnomne relargage).. ajout de sulfate dammonium des concentrations croissantes : prcipitation fractionne, les protines prcipitent sparment (phnomne relargage). Lorsque la protine prcipite est replace dans un milieu de force ionique convenable elle se redissout (phnomne de salting in) 3.3.2 Dialyse- Ultrafiltration

La dialyse est une mthode de sparation des molcules en fonction de leur taille. On utilise une membrane semi-permable qui laisse passer leau et les petites molcules mais pas les protines. Si le boudin de dialyse est mis en agitation dans un milieu moins concentr les petites molcules sortent ce qui purifie en partie la solution protique.

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Lultrafiltration consiste pousser sous forte pression la solution protique contre une membrane poreuse, seules leau et les petites molcules passent au travers de la membrane, les protines restent sur la membrane. Ceci concentre et purifie partiellement la solution protique. 3.4 Electrophorse Llectrophorse est une technique de sparation utilisant la migration des molcules charges dans un champs lectrique. Les protines possdant de nombreux groupements ionisables sont des molcules amphotres : leur charge dpend du pH du milieu ainsi que de leur propre pHi. Si pH < pHi la charge nette est positive Si pH = pHi la charge nette est neutre Si pH > pHi la charge nette est ngative La protine est dautant plus charge que la diffrence entre pH du milieu et pHi est importante. De nombreuses mthodes utilisent ce principe, elles peuvent tre analytiques (but : sparation des molcules) ou prparatives (but : obtention dune quantit plus ou moins importante dun mlange) 3.4.1 Electrophorse en veine liquide

Cest type dlectrophorse le plus ancien, mis au point par Tisellius. La migration seffectue au sein dun liquide de composition dtermin. Abandonne pendant un temps cette technique est ractualise pour la technique dlectrophorse capillaire. Un dtecteur optique est plac la sortie du tube dlectrophorse. La sparation seffectue selon la charge des protines. 3.4.2 Electrophorse de zone

La migration est ralise galement dans une phase liquide mais celle ci imprgne un support solide poreux ou un milieu glifi; Les supports les plus courants sont : le papier, lactate de cellulose, et les gels (agarose, glose, amidon, polyacrylamide ) La sparation seffectue selon la charge et plus ou moins selon le support utilis la masse des protines. Aprs migration les protines sont fixes par prcipitation puis colores. Exemple dutilisation de routine en biochimie clinique : sparation des protines sriques sur gel damidon.

Llectrophorse de zone peut aussi sappliquer des protines dnatures. Dans llectrophorse SDS-PAGE le support est un gel de polyacrylamide rticul prsentant un effet filtrant sur les protines. Le mercaptothanol, le chauffage et le SDS dnaturent les protines qui perdent leur configuration spatiale. Le SDS, dtergent anionique, se lie aux protines par des liaisons hydrophobes et leur confrent toutes une mme charge ngative. La migration ne seffectue alors quen fonction de la taille des molcules, les plus grosses tant rapidement arrtes par les mailles du gel. 3.4.3 La focalisation isolectrique (IEF)

Ici, la sparation des molcules de lchantillon se fait dans un gradient de pH. Les molcules se dplacent sous leffet dun champ lectrique uniforme jusqu ce quelles aient atteint un pH gal leur pHi. Cette mthode prsente lavantage de lutter contre la diffusion de lchantillon hors de sa zone de pHi. En effet, si elles diffusent hors de la zone de pH correspondant leur pHi, elles sont

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aussitt charges et donc ramenes par leffet du champ lectrique dans leur zone de pHi. Les mthodes permettant dobtenir le gradient de pH indispensable cette technique sont principalement au nombre de deux : en utilisant des molcules amphotres (ampholines) de masse infrieure 3000 Da et de pHi compris entre 2 et 11, ou en ralisant un greffage, dans un gel de polyacrylamide, de monomres dacrylamide modifis chimiquement portant des groupements ionisables de pK acides ou basiques(immobilines). 3.4.4 Electrophorse bidimensionnelle

Une IEF est effectue dans un sens sur un boudin de polyacrylamide lche puis, sans fixer les protines, ce boudin est dpos sur un gel polyacrylamide mailles plus serres et une lectrophorse SDS-PAGE est ralise perpendiculairement lIEF. Les protines sont ainsi spares en fonction de leur pHi puis de leur PM. Chaque protine apparat comme un spot sur le gel. Cette mthode est purement analytique. 3.4.5 Lisotachophorse (ITP)

Cette mthode est fonde exclusivement sur la sparation des molcules suivant leur mobilit lectrophortique. Les anions se dplacent tous vers lanode, les plus mobiles en tte et les plus lents en queue. Ceci est possible grce un gradient de champ lectrique, un champ faible tant appliqu aux ions lents, alors quun champ fort est appliqu aux ions rapides. Ce dispositif favorise la sgrgation et la rpulsion mutuelle des ions de mobilit diffrente. 3.5 Chromatographie La chromatographie est une mthode de sparation des protines en fonction de leur affinit pour une phase stationnaire solide ou liquide et une phase mobile liquide. Pour les protines plusieurs types de chromatographies peuvent tre utiliss. 3.5.1 Chromatographie hydrophobe

Le support (souvent silice) a t modifi par un greffage hydrophobe qui peut dont interagir avec les parties hydrophobes des protines. Pour les protines deux types de greffes sont couramment employs: - les amines aliphatiques (C4 C10) - Les amines aromatiques La phase mobile contient du (NH4)2SO4 qui favorise les liaisons hydrophobes entre la phase stationnaire et les protines. Llution peut se faire en diminuant la charge en (NH4)2SO4 ou en ajoutant un dtergent qui solubilise les liaisons hydrophobes. ((NH4)2SO4 et dtergent sont ensuite limins par dialyse ou ultrafiltrafiltration. 3.5.2 Chromatographie dchange dions

La sparation se fait en fonction de la charge de la protine Les changeurs dions sont des substances hautement polymrises constituant un rseau tridimensionnel et portant des groupements ionisables acides (-COO-H+, -SO3-H+) ou basiques (NH4+). Les protines sont dissoutes dans un tampon de pH donn et se chargent diffremment en fonction de leur pHi. Suivant leur charge elles seront plus ou moins retenues sur lchangeur. Llution se fait ensuite par un gradient de pH et/ou de force ionique. Un dtecteur optique 280 plac en sortie de colonne permet de tracer le profil dlution. 3.5.3 Chromatographie dexclusion-diffusion ou Chromatographie de filtration sur gel

Dans cette technique la solution de protines traverse par gravit une colonne contenant des billes tasses poreuses. Les molcules protiques de dimensions suprieures aux plus gros pores des billes ne peuvent pntrer dans le gel et sont exclues du gel, elles sont lues rapidement avec le volume mort. Les molcules moins grosses pntrent dans les billes par les pores et leur lution est retarde. Les molcules les plus petites diffusent entirement dans le gel et sortent en dernier. Ceci nest exact que pour des protines globulaires de formes sensiblement identiques. Chaque gel possde donc un intervalle de poids molculaires lintrieur duquel les protines peuvent tre spares en fonction de leur taille. Cette technique est principalement utilise pour:

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le dessalage des solutions protiques La dtermination du poids molculaire 3.5.4 Chromatographie daffinit

Dans ce type de chromatographie la phase stationnaire est un support macromolculaire chimiquement inerte sur lequel est greff un effecteur qui prsente une affinit pour une protine de lchantillon analyser. Plusieurs types daffinit peuvent tre utiliss: Affinit enzyme-substrat Affinit ligand-rcepteur Affinit antigne-anticorps Affinit moins spcifique Trs souvent leffecteur fix la phase stationnaire sera le substrat, le ligand ou lanticorps, ce qui permettra de purifier lenzyme le rcepteur ou lantigne. La Chromatographie se fait en trois tapes: Etape de fixation : Le mlange contenant la protine purifier est charg sur la colonne daffinit. Seule la protine prsentant une affinit pour la phase stationnaire sera retenue par liaison avec leffecteur greff. Etape de purification : En continuant faire passer du tampon sur la colonne toutes les molcules contaminantes sont limines. Etape dlution : Elle peut tre ralise de diffrentes faons: par changement de pH du tampon dlution, par changement de la force ionique du tampon dlution Par comptition avec un ligand libre Cette mthode est surtout prparative. Toutes ces techniques de chromatographie sont transposables en HPLC o la phase mobile liquide est soumise une forte pression et o la phase stationnaire se prsente sous forme de micrograins. Ceci permet une meilleure slectivit et un temps danalyse plus court; les colonnes ont galement pu tre rduites en taille. Linformatique permet de contrler tous ces paramtres.

3.6

Analyse des protines 3.6.1 Dtermination du poids molculaire

3.6.1.1 Mthode chimique Cette mthode permet de dterminer un poids molculaire minimal; Un lment minoritaire et particulier de la protine est dos et sa concentration est rendue de manire relative en % de poids dans la protine. Le postulat est quil ni ait quun exemplaire de cet lment par chane polypeptidique. Ex: le dosage du fer de lhmoglobine donne un rsultat de 0,34%, la masse atomique molaire du fer tant 55,8 g.mol-1, le poids molculaire minimal de lhmoglobine est:

PM =

55,8x100 = 16400D 0,34

qui est le poids molculaire dune chane de globine, comme il y en a 4, le poids molculaire exact sera 65600 D 3.6.1.2 Chromatographie dexclusion-diffusion Afin de dterminer le PM dune protine dintrt, celle-ci est chromatographie paralllement des protines de poids molculaire connu. Le graphe : Log de la masse molculaire en fonction du volume dlution ou du Kav est trac grce ces talons. Ainsi, d'aprs le Kav de la protine d'intrt, on peut calculer sa masse molculaire.

Kav =

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Ve - Vm VT - Vm 40

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3.6.1.3 Electrophorse en gel natif La migration est rendue seulement dpendante du poids molculaire en ralisant un gradient de polyacrylamide; La protine va migrer jusqu trouver une position o elle ne pourra plus bouger car les pores du gel se resserrent. Un talonnage du gel avec des protines de PM connus permet de tracer la courbe : distance de migration = fonction (PM) et ainsi de dterminer le PM de la protine dintrt. 3.6.1.4 Electrophorse SDS-PAGE C'est la technique la plus utilise. Afin de dterminer le PM dune protine dintrt, celle-ci migre paralllement des protines de poids molculaire connu. Le graphe Une gamme talon est ralise en traant cette fois ci le log de la masse molculaire en fonction du Rf qui est la distance de migration de la bande divise par la distance de migration du front de migration. Etant donn que le SDS dissocie la protine, on ne va plus observer la migration de la protine entire, comme dans le cas de l'lectrophorse en gel natif, mais celle des diffrentes sous units. On va donc pouvoir comparer la masse molculaire de la protine native d'une part et celle des sous units, sil y en a plusieurs, d'autre part. Ainsi, si par filtration sur gel on a un poids molculaire de 50 KDa et sur gel SDS un poids de 25 KDa, on en conclue que la protine est constitue de deux sous units identiques.

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3.6.1.5 Spectromtrie de masse C'est une nouvelle technique utilise pour les petites molcules et qui est trs puissante. Cela consiste vaporiser le compos tudier, le bombarder d'ions l'aide d'un faisceau et le soumettre un champ magntique. Ainsi, les composs sont spars, avec une rsolution de 1 Da, selon le rapport m/z. La technique de l'electrospray permet de vaporiser les protines et on peut dterminer leur masse molculaire jusquau moins 30 KDa 3.6.2 Dtermination du pHi: Isolectrofocalisation

Pour dterminer le pHi grce lIEF le gel en polyacrylamide poreux et lche est talonn avec des marqueurs de pHi cest dire avec des protines de pHi connus. Ensuite le graphe; distance de migration (depuis lun des ples) = fonction (pHi) est trac. La distance de migration de la protine dintrt permet ainsi de dterminer son pHi. 3.7 Mthodes de dosages des protines 3.7.1 Mthodes non spcifiques

Ces mthodes ne permettent pas de faire la distinction entre les diffrentes protines dun mlange, par contre toutes les protines ne ragissent pas forcment avec la mme sensibilit ce qui peut poser des problmes de choix pour la protines servant ltalonnage. Ces mthodes sont: Mthode rfractomtrique: lindice de rfraction dun milieu est proportionnel sa concentration en protines totales Mthode de Kjeldahl Mthodes spectrophotomtriques En UV - Mesure de labsorbance 280 nm Dans le visible (colorimtrie) - Mthode de Gornall base sur la raction du biuret (utilise pour le dosage des protines sriques) - Mthode de Lowry qui combine la raction du biuret et celle de Folin (trs sensible, elle est trs utilise pour le dosage dans les milieu pauvres en protines) - Mthodes qui utilise la fixation dun colorant sur les protines (bleu de coomassie, rouge de pyrogallol) - Etc.

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3.7.2

Mthodes spcifiques

Ces mthodes permettent de doser une protine dintrt dans un milieu riche en protines totales, elles font toutes appel la spcificit de la raction Antigne-anticorps, lantigne tant ici la protine dintrt. Ce sont des immunomthodes. Certaines dentre elles utilisent la proprit du complexe Ag-Ac prcipiter, certaines sont galement couples avec une lectrophorse (immunolectrophorse) 3.8 Les htroprotines Ce sont des protines dites complexes ou conjugues : Dans de telles protines il existe deux parties: la partie protique :apoprotine. la partie non protique : groupement prostthique: il est fortement li l'apoprotine, souvent par liaison covalente et joue un rle important dans la fonction de la protine. Les htroprotines sont classes en fonction de la nature chimique de leur groupement prosthtique. Glycoprotines: Le groupement prosthtique est un groupement glucidique plus ou moins important appel glycanne qui a un rle structural ou de reconnaissance. Ces protines sont largement rpandues dans le monde vivant. Exemples : de nombreuses hormones, les protines des liquides biologiques (salive, larmes, sang,....). Presque toutes les protines du sang sont des glycoprotines (Anticorps, fibrinogne,...). Protolipides : Le groupement prosthtique est un groupement lipidique dont le rle est l'ancrage des protines aux membranes. Ne pas confondre avec les lipoprotines, qui sont des assemblages non covalents impliqus dans le transport des lipides dans l'organisme. Chromoprotines : Ce sont des htroprotines colores. Exemples: les myoglobines ou les hmoglobines o une seule chane peptidique (la globine) est combine un groupement prosthtique (hme) log dans un repliement de la structure tertiaire de la globine. Remarque: L'hme est constitu d'un noyau porphyrine (structure plane) et d'un atome de fer (II); ce complexe est rouge et donne sa couleur au sang: Phosphoprotines: le groupement prosthtique est un groupement phosphate li par une liaison ester-phosphate aux fonctions alcools des rsidus srines et thronines. Nucloprotines : le groupement prosthtique est un acide nuclique (ARN ou ADN) Exemples :la chromatine (ADN) ou les ribosomes (ARN) Mtalloprotines : le groupement prosthtique est un mtal (Mg2+, Zn2+ ), indispensable lactivit.

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