ANATOMIE PATHOLOGIQUE GENERALE

La mthode de base en pathologie reste l'tude morphologique conventionnelle au microscope optique. Les donnes morphologiques sont compltes dans un nombre limit de cas par des mthodes telles l'immunohistochimie ou la biologie molculaire. Quels que soient les progrs technologiques, la valeur du diagnostic dpend de la qualit du prlvement effectu par le clinicien. La majorit des checs diagnostiques est lie des fautes dans la conduite du prlvement avant l'arrive au laboratoire. Le diagnostic histo-cyto-pathologique est une synthse des donnes morphologiques dans un contexte clinique prcis. Le clinicien doit prciser sur la demande d'examen: le sexe, l'ge, l'histoire clinique rsume, les examens anatomo-cyto-pathologiques antrieurs, le sige du ou des prlvements, l'aspect des lsions, les traitements et si possible le diagnostic voqu.

I. LES PRELEVEMENTS HISTOPATHOLOGIQUES 1. Les prlvements tissulaires Les prlvements tissulaires sont obtenus soit par biopsie, soit par dissection d'une pice opratoire ou d'organes.

Les biopsies
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La biopsie est le prlvement d'un fragment de tissu durant la vie par diverses mthodes (pinces, trocart, bistouri etc.)

La valeur des biopsies vise diagnostique repose sur: - La taille du prlvement - Le nombre de fragments biopsis - La bonne qualit du matriel biopsi, due l'habilet du prleveur et la bonne qualit du matriel biopsique: les fragments tissulaires ne doivent pas tre crass ou tirs - La validit des zones biopsies: les foyers de ncrose ou d'hmorragie ne devraient pas tre prlevs

Lorsque le prlvement n'est pas valable pour une tude histopathologique, la biopsie doit tre renouvele

Lorientation des prlvements est souvent ncessaire en cancrologie, pour permettre une tude histopathologique rigoureuse: - Les biopsies exrses, par exemple cutanes, seront orientes, soit par des fils de suture de couleurs diffrentes, soit par un tatouage l'encre de chine - Les biopsies multiples intressant plusieurs territoires d'un mme organe seront individualises dans des flacons diffrents numrots et rpertoris. Par exemple, pour les biopsies bronchiques: flacon n1 - peron lobaire suprieur gauche, 2 fragments; flacon n2 - bronche lobaire suprieure gauche, 2 fragments.

Les prlvements biopsiques sont tudis en totalit

Les pices opratoires

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Lors de la dissection d'une pice opratoire, le pathologiste choisit les territoires lui semblant reprsentatifs des lsions.

Les pices opratoires sont dissques selon des protocoles prcis. Le pathologiste dcrit et mesure la tumeur, son extension locale, dnombre les ganglions, recherche les lsions associes, tudie les limites de l'xrse, ces limites ayant au pralable t repres par le chirurgien (fils de suture de couleurs diffrentes, tatouage l'encre de chine). Cet examen macroscopique oriente le choix et le nombre des zones qui seront prleves pour l'tude histopathologique. Une photographie macroscopique de la pice opratoire peut tre ralise dans la majorit des laboratoires.

2. La fixation (Tableau I) La fixation, tape essentielle dans la prparation tissulaire, est en fait sous la responsabilit du clinicien. Son but est de s'opposer l'autolyse tissulaire et de conserver aux tissus une structure la plus proche possible de la structure "in vivo".

La fixation se fait par immersion du prlvement dans un liquide fixateur et rpond des rgles strictes qui motivent le transfert rapide des prlvements vers le laboratoire d'anatomie pathologique. Elle doit:
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tre immdiate se faire dans un volume suffisant de fixateur correspondant 10 fois le volume de la pice opratoire

tre brve pour viter la rtraction cellulaire et tissulaire. Une fixation prolonge est l'obstacle majeur aux techniques d'immunohistochimie. La dure de la fixation dpend de la taille du prlvement: 1 5 heures pour une biopsie, 24 heures pour une pice opratoire.

Tableau I. Mthodes dtude et fixation tissulaire Ce tableau souligne les diffrentes mthodes pouvant tre ralises partir des tissus selon leur mode de fixation. (-) (+++) : valeur de la mthode en fonction de la conservation tissulaire (fixation, conglation)

FIXATION Formol Etude morphologique standard Immunohistochimie Hybridation in situ PCR partir des tissus Cytomtrie en flux Microscopie ++ ++ ++ ++ + Bouin +++ + Glutaraldhyde Autres

CONGELATION

+++ ++ +++ ++ -

lectronique Cytogntique -

Paraformaldhyde Milieu de culture cellulaire -

Il n'existe pas de fixateur universel, idal. Deux types de fixateurs sont habituellement utiliss:
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Les solutions de formol 10 % permettent lutilisation des tissus fixs pour limmunohistochimie, les techniques de biologie molculaire ou de cytomtrie en flux

Le liquide de Bouin aqueux ou alcoolique permet une bonne analyse morphologique. Le liquide de Bouin peut tre utilis pour l'immunohistochimie, mais n'est pas recommand pour les techniques de biologie molculaire.

D'autres mthodes de conservation des tissus sont parfois ncessaires en pathologie, ainsi la conglation -180C (azote liquide) d'un fragment de tumeur, en particulier en pathologie hmatologique

3. La partition du prlvement tissulaire Des approches mthodologiques autres que l'examen histopathologique standard sont parfois utiles partir des prlvements tissulaires. Ces mthodes sont l'immunohistochimie, l'histochimie, la cytomtrie en flux, la microscopie lectronique, l'analyse cytogntique ou la biologie molculaire. Leur choix ncessite d'adopter un protocole de gestion bien dtermin et une stratgie de partition des tissus pour les diffrentes techniques (Tableau I). 4. La mthode standard en histopathologie Le but est d'obtenir une section tissulaire fine, pour pouvoir tre traverse par la lumire, et colore, car les tissus sont incolores, pour tre observe au microscope optique (grandissement de 20 1000).

Les fragments tissulaires sont deshydrats avant d'tre inclus en paraffine (blocs dinclusion). Des coupes fines (4 m) sont obtenues l'aide d'un microtome. Ces coupes, colles des lames de verre, sont colores par l'hmatine osine.

L'automatisation d'une partie des manipulations a permis de rduire la dure de la technique. Cependant, un minimum de 24 heures pour une biopsie et de 48 heures pour une pice opratoire correspond au dlai incompressible de la technique. Le degr variable de difficult d'interprtation des lsions et la ncessit de faire appel des techniques spciales allongent les dlais jusqu' 6 10 jours.

5. L'examen extemporan L'examen extemporan est un examen d'orientation proposant un diagnostic de prsomption. Effectu au cours de l'intervention chirurgicale, il apporte, en quelques minutes, une orientation diagnostique et sera obligatoirement complt par l'inclusion en paraffine du fragment tissulaire examin extemporanment. Les techniques utilises en examen rapide altrent la morphologie tissulaire et rendent difficiles l'analyse ultrieure aprs fixation et inclusion.

Indications Lexamen extemporan est indiqu lorsque la rponse du pathologiste conditionne un choix immdiat entre deux gestes thrapeutiques chirurgicaux. Il peut s'agir, soit d'un diagnostic de cancer, par exemple en pathologie mammaire, soit de l'tude des limites de l'xrse, en fait rarement justifie sauf dans des cas trs spcifiques, par exemple les tumeurs cutanes de la face ou les tumeurs des tissus mous.

Limites
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Certaines tumeurs sont de diagnostic difficile voire impossible en technique rapide, par exemple les tumeurs du tissu lymphode ou les tumeurs osseuses

Les tumeurs de petite taille (infrieure 1 cm) seront de diagnostic difficile en examen extemporan et l'analyse finale sera gne par les altrations tissulaires lies la conglation Ltude extemporane des limites dxrse donne parfois une fausse scurit De mme l'tude extemporane des ganglions pour la poursuite du curage ganglionnaire des tumeurs solides risque d'ignorer les micro-mtastases et ne

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tient pas compte du fait que la dissmination mtastatique peut sauter des relais ganglionnaires.

II. LES PRELEVEMENTS CYTOPATHOLOGIQUES 1. Les diffrents types de prlvements Diffrents types de prlvements cytologiques sont soumis au pathologiste: leurs techniques dtude sont diffrentes. Ce sont:

Les liquides (LCR, urines, panchements pleuraux, ascite, kystes, etc.) et les coulements (sein essentiellement)

Les lsions solides prleves soit par ponction laiguille avec ou sans aspiration, soit par empreintes, grattages, brossages et frottis (ganglions, muqueuses respiratoires ou digestives suprieures, gnitales fminines [frottis cervico-vaginaux] et masculines, maladie de Paget du mamelon, lsions cutanes, etc.)

2. Origine des prlvements cellulaires Les prlvements peuvent provenir de tissus ou organes:

Soit superficiels accessibles: grattages, empreintes et frottis, ponction laiguille fine, directe ou guide en cas de lsion infraclinique par chographie, strotaxie, scanner, voire amplificateur de brillance

Soit profonds et un reprage ou un guidage est alors ncessaire dans la plupart des cas. Des prlvements cytologiques peuvent tre obtenus au cours des explorations endoscopiques dont la frquence augmente avec les techniques non invasives de diagnostic et de traitement.

3. Transmission des prlvements

Les liquides sont transmis tels quels au pathologiste qui les centrifuge, tale sur lames ou inclut en paraffine le culot de centrifugation

Les produits de ponctions, empreintes, frottis seront tals sur lames propres et sches Ltalement est un temps capital de la cytologie et doit tre parfaitement maitris par le prleveur: talement du produit de ponction dpos une extrmit de la lame avec une autre lame, dune manire uniforme, sans retour en arrire, en dissociant sans craser les placards cellulaires pour obtenir un talement en couche monocellulaire

La fixation, simple schage lair, la laque ou lalcool, est sous la responsabilit du prleveur en fonction des souhaits ou recommandations du pathologiste

III. LE DIAGNOSTIC ET LE COMPTE-RENDU

Le diagnostic histo-cyto-pathologique est fond sur l'analyse des modifications cellulaires et tissulaires, et la synthse des donnes histo-cyto-pathologiques et cliniques exprimes par lintermdiaire dun compte-rendu. 1. Compte-rendu histo-cyto-pathologique

Le compte-rendu anatomo-cyto-pathologique est un document de communication entre clinicien et pathologiste. Il comporte une description et une conclusion.

La conclusion doit tre claire et prcise. Elle indiquera, par exemple, pour une tumeur:
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La dnomination prcise propose par une classification internationale, par exemple de l'OMS

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Le caractre bnin ou malin L'histognse La diffrenciation du cancer Pour certains cancers, le grade et/ou le stade dont les rfrences seront cites

D'autres informations seront signales selon le type de prlvement:

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Biopsie exrse: taille de la tumeur, sa distance par rapport aux diffrentes limites de rsection

Pice opratoire: la conclusion doit apporter les lments aidant l'valuation du stade clinique: taille de la tumeur, extension locale, tat des limites de rsection, nombre de ganglions mtastatiques

Prlvement cytopathologique: le compte-rendu doit signaler la cellularit du prlvement. Si celle-ci est insuffisante ou de mauvaise qualit, aucune conclusion ne doit tre donne, en dehors de prlvement non significatif sans valeur. Il faut viter les termes de prlvement positif, et surtout prlvement ngatif qui peut signifier sans lment malin ou sans lment significatif.

Le compte-rendu cytologique a ses limites par rapport au compte-rendu histologique car il manque les arguments darchitecture, les relations cellules pithliales - tissu conjonctif, et donc le caractre in situ ou invasif d'un carcinome.

2. Les consultations inter-pathologistes L'avis de consultants est plus facile obtenir en pathologie que dans les autres disciplines en raison de la facilit d'adresser des lames ou des blocs d'inclusion. Cette circulation de prlvements tissulaires et cellulaires est actuellement courante et se fait de pathologiste pathologiste. Ces consultations peuvent tre demandes pour plusieurs raisons:

Incertitude diagnostique ou discordance entre plusieurs pathologistes du mme centre Transfert du patient dans un autre hpital Le patient, ou le clinicien, demande un deuxime avis

IV. LES METHODES NOUVELLES La microscopie lectronique na pas apport dlment majeur dans le diagnostic ou la classification des cancers, et ses indications diagnostiques sont de plus en plus limites. En revanche, limmunohistochimie a rvolutionn la classification des tumeurs indiffrencies et des tumeurs des tissus hmatopotiques. La biologie molculaire semble suivre un chemin analogue. La cytomtrie en flux et balayage par analyse dimage donne des informations sur le

contenu en ADN et lactivit prolifrative des cellules cancreuses dont la valeur pronostique est controverse. Les rsultats de ces mthodes compltent ou prcisent le diagnostic histo-cyto-pathologique. Aucune delles nest cependant assez informative pour tre interprte isole de son contexte morphologique. 1. Immunohistochimie Limmunohistochimie est une mthode de dtection dune protine sur coupe tissulaire ou sur un talement cytologique. Cette dtection se fait laide dun anticorps, rvl par une raction colorimtrique enzymatique ou par une substance fluorescente. Limmunohistochimie est en fait une raction immunologique in situ et son interprtation est associe une analyse morphologique. Elle est la seule mthode, parmi les autres mthodes immunologiques, permettant de prciser le type de la cellule contenant le signal et la topographie du signal dans la cellule.

Mthodologie
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Tissu fix et inclus en paraffine La rsistance partielle des protines la fixation et linclusion en paraffine permet de dtecter une partie des protines sur le matriel usuel danatomie pathologique. La fixation est ltape la plus importante pour la prservation des antignes. Les fixateurs agissent en modifiant la structure des protines. Leffet nocif des fixateurs est limit par une dure brve de la fixation. Lactivit antignique peut tre partiellement restaure par laction denzymes protolytiques ou de la chaleur (micro-ondes).

Tissu congel La conglation permet la conservation optimale de la majorit des protines. Le fragment tissulaire congel -180C (azote liquide) est conserv soit 180C, soit -60C. Les avantages de la conglation sont la prservation de la plupart des protines. Les inconvnients sont une morphologie cellulaire mdiocre et la ncessit de prvoir la conglation avant le geste biopsique ou opratoire.

Indications de limmunohistochimie en pathologie tumorale

Lindication essentielle actuelle est laide au diagnostic. Si les informations sur ltude fonctionnelle des cancers nont pas actuellement de valeur pronostique clairement dfinie, ces informations sont essentielles pour la comprhension de la biologie des tumeurs. Limmunohistochimie est une technique performante pour dterminer lexpression des protines dans les cellules cancreuses ou dans le stroma.
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Aide au diagnostic Mthode performante, complmentaire de lanalyse morphologique, ses indications sont en fait peu nombreuses, non systmatiques et limites un nombre restreint de cas, environ 5 10 % des tumeurs. Les indications et le choix des anticorps sont dtermins par le pathologiste en fonction de laspect morphologique et des informations cliniques.

Classification des cancers indiffrencis (Tableau II) La classification des cancers indiffrencis reprsente lindication essentielle de limmunohistochimie. Un diagnostic prcis est souvent ncessaire en raison de stratgies thrapeutiques diffrentes selon les types de cancer. La diffrenciation cellulaire se traduit par lexpression de protines particulires ces cellules et la dtection de ces protines permet dvoquer lorigine de la cellule cancreuse. Un nombre restreint danticorps permet une orientation histogntique dans la majorit des cas, sur tissu fix et inclus en paraffine. Il reste nanmoins des tumeurs inclassables, soit parce que les cellules tumorales nexpriment pas de molcules actuellement reconnues, soit parce quelles expriment de faon inhabituelle des molcules prsentes normalement dans dautres types cellulaires (exemple: certains lymphomes malins contiennent des kratines).

Diagnostic entre lsion bnigne et cancer Limmunohistochimie apporte rarement des renseignements utiles sauf dans un nombre restreint de situations. Par exemple, dans un ganglion, la distinction entre lsion bnigne et lymphome malin B peut tre facilite par lidentification dune seule chane lgre dimmunoglobuline suggrant le caractre clonal et tumoral de la population lymphode. En fait, dans la majorit des tumeurs, ce diagnostic diffrentiel repose sur la seule analyse histopathologique.

Etude fonctionnelle et pronostique des tumeurs - Prolifration cellulaire Des anticorps ont t obtenus permettant didentifier des protines intervenant dans le contrle du cycle cellulaire. La dtection immunohistochimique de ces protines (PCNA, Ki-67, p53) permet dapprcier le nombre des cellules engages dans le cycle cellulaire. De mme, la dtection par immunohistochimie de facteurs de croissance, de produits doncognes ou danti-oncognes, de molcules de rsistance la chimiothrapie ou de molcules dadhsion est un lment important pour la comprhension de la biologie tumorale. Seules de trs rares molcules ont une valeur pronostique dmontre (exemples: bcl-2 et survivine dans les lymphomes diffus grandes cellules B). - Rcepteurs hormonaux Ltude des rcepteurs aux oestrognes et la progestrone dans les cancers du sein a prouv son intrt pour lvaluation du pronostic et le traitement du cancer du sein. Limmunohistochimie sur coupes de tissus fixs et inclus en paraffine, ou sur ponctions cytologiques, reprsente une mthode de choix pour la dtection des rcepteurs, en particulier dans les cancers de petite taille, les biopsies laiguille ou les tudes rtrospectives. Parce quelle est associe une analyse morphologique, cette mthode permet dindividualiser la prsence des rcepteurs dans les cellules tumorales.

Tableau II. Immunohistochimie des cancers indiffrencis Exemples (tissu fix et inclus en paraffine)

cytokratines + EMA + ACE + CANCER INDIFFERENCIE CD45 + LYMPHOME lymphome B CD20 + CARCINOME carcinome neuroendocrine chromogranine A+

lymphome T

CD3 +

ALC mlanome

CD30 + PS100 + HMB45 +

vimentine +

AUTRE TUMEUR

sarcome musculaire

a-actine +

neuroblastome

neurofilaments +

EMA: antigne pithlial membranaire. ACE: antigne carcino-embryonnaire. CD45: antigne leucocytaire commun. CD20: antigne associ aux lymphocytes B. CD3: antigne associ aux lymphocytes T. ALC : lymphome malin grandes cellules anaplasiques. CD30: antigne d'activation. PS100: Protine S100. HMB45: anticorps anti-mlanocytaire. 2. Application des techniques de biologie molculaire en histopathologie Les progrs raliss en biologie molculaire ont permis le transfert des techniques molculaires ltude des tissus. Deux types de techniques sont utiliss partir dun matriel tissulaire: lhybridation in situ base sur lobservation microscopique du signal; les techniques ralises partir dextractions dacide nuclique.

Hybridation in situ

Lhybridation in situ sur coupe tissulaire correspond la dtection microscopique dun signal dhybridation entre une sonde marque et un acide nuclique, ADN ou ARN. Lhybridation in situ est la seule technique de biologie molculaire permettant de localiser les acides nucliques dans les diffrents territoires dun tissu ou dune cellule et de prciser le type de la cellule contenant le signal.
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Mthodologie - Les sondes Les diffrents types de sondes utilises en biologie molculaire peuvent tre

appliques en hybridation in situ : sondes ADN, ribosondes, oligonuclotides de synthse. Les sondes sont marques soit par un isotope radio-actif (P33, S35, H3) rvl par autoradiographie, soit par une molcule non isotopique visualise par un fluorochrome ou par une raction colore visible au microscope optique standard. - Prparation tissulaire et cellulaire La conglation dun fragment tissulaire permet une excellente conservation des ADN et des ARN cellulaires. En revanche, les acides nucliques sont, comme les protines, partiellement masqus ou dtruits par la fixation et linclusion en paraffine. La conservation des acides nucliques dpend essentiellement du choix du fixateur.
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Applications en oncologie Lhybridation in situ est utilise de faon extensive pour la comprhension de la biologie tumorale. En revanche, les indications diagnostiques sont rserves un nombre limit de cas. Les applications au diagnostic sont: - La dtection dADN ou dARN viral La dtection du virus d'Epstein Barr (EBV) est utile dans quelques rares cas de pathologie tumorale : carcinome indiffrenci du naso-pharynx, lymphoprolifration post-transplantation. Les diffrents sous-types de papillomavirus ont t tudis de faon extensive dans les noplasies intra-pithliales du col utrin. - La dtection des ARN messagers cellulaires Ltude des ARN messagers dans un but diagnostique na pas prouv sa supriorit par rapport la dtection immunohistochimique de la protine correspondante. Actuellement, lindication diagnostique reste limite (ARN messagers des chanes lgres Kappa et Lambda des immunoglobulines). - La dtection des altrations gntiques au cours des cancers Des modifications gntiques, telles les translocations, peuvent tre actuellement dtectes par hybridation in situ dans les noyaux des cellules interphasiques. Ces mthodes sont utilises en cytogntique, sur des prparations cytologiques, laide de fluorochromes (technique FISH). Des techniques plus complexes peuvent galement tre utilises: hybridation

gnomique comparative (CGH), caryotype spectral (SKY), biopuces (DNAchips).

PCR : Amplification lective in vitro de squences dacides nucliques

La technique de PCR permet damplifier in vitro, en trs grande quantit, une squence dacide nuclique (ADN) dont on connait les deux extrmits. Il est donc possible par cette technique danalyser de faon fine nimporte quel fragment dADN, voire dARN, aprs une tape pralable de transcription inverse dun ARN en ADN. De par sa capacit amplifier spcifiquement une trs faible quantit dADN, cette technique est tout particulirement approprie lanalyse de sections tissulaires ou de culots cellulaires. En anatomie pathologique, partir dun fragment tissulaire analys sur le plan morphologique et immunohistochimique, il sera possible dextraire de lADN sur des coupes sries et ainsi danalyser certaines squences dacides nucliques. Des recherches visent actuellement dvelopper les techniques de PCR in situ ou de RT PCR in situ pour rechercher des squences dADN ou dARN aprs amplification directe des coupes tissulaires sans extraction pralable dADN du tissu, mais les rsultats sont peu reproductibles. Des techniques de microdissection-laser, suivies d'extractions d'acides nucliques, sont prfres.
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Mthodologie Les techniques de PCR consistent le plus souvent extraire dans un premier temps de lADN double brin partir de coupes tissulaires que lon aura au pralable analyses sur le plan morphologique. Extraction dADN partir des tissus et des cellules: Les coupes de tissu congel et les culots de cytocentrifugation permettent de garantir une bonne qualit dextraction dADN. Cependant les coupes de tissu fix au formol et inclus en paraffine peuvent donner des rsultats tout fait interprtables mme si les ponts nucloprotiques induits par la fixation rendent difficiles lextraction dADN et laccessibilit la matrice nuclique. En revanche, le liquide de Bouin entrane, en plus des ponts nucloprotiques, des cassures de lacide nuclique rendant les rsultats de la PCR alatoires: seul un rsultat positif est prendre en compte.

Applications en anatomie et cytologie pathologiques des tumeurs Les principales applications de la PCR partir dacides nucliques extraits de culots cellulaires ou de coupes tissulaires concernent ltude de rarrangement de gnes, la recherche de mutation, dexpression de gnes, dADN ou dARN viral. - Rarrangement de gnes Cest surtout dans cette application que les techniques de PCR ont pris une place importante en diagnostic des tumeurs hmatopotiques. En effet, il est possible par PCR de rechercher les rarrangements des gnes du rcepteur T et des immunoglobulines, permettant dtudier la clonalit dune population lymphode B ou T. Cette technique est dun apport considrable dans les rares cas o le diagnostic histopathologique est difficile entre une hyperplasie lymphode et un lymphome malin; il est toutefois fondamental de savoir que les techniques de PCR, si sensibles soient-elles, ntudient pas toutes les possibilits de rarrangement de gnes. Ainsi, un rsultat ngatif en PCR nlimine pas un authentique lymphome malin. Enfin, lexistence dune monoclonalit en PCR nest pas automatiquement synonyme de malignit. Cest pourquoi il est fondamental dintgrer les donnes de la gntique molculaire aux donnes cliniques, morphologiques et immunophnotypiques. - Recherche de mutations Les techniques de PCR en utilisant des techniques fines danalyse de produits damplication (DGGE ou SSCP) peuvent permettre sur coupes tissulaires de rechercher des mutations sur les points chauds (sites les plus frquents de mutations) des exons de certains oncognes ou antioncognes (ras, p53, Rb...). - Expression de certains gnes En utilisant une phase pralable de transcription inverse, il est possible dtudier lexpression de certains oncognes au sein dune tumeur. - Recherche dADN ou dARN viral Il est possible par PCR danalyser la prsence dun gnome viral ou de ses transcrits au sein dune tumeur. Cependant, ces techniques sont souvent moins intressantes que lhybridation in situ qui permet de visualiser au sein de quelles cellules les gnomes ou les transcrits viraux sont prsents.

3. Etude de l'ADN et de la prolifration cellulaire Lactivit prolifrative dune tumeur peut tre tudie par diffrentes mthodes, telles la quantification de lADN dans les cellules tumorales, la dtection dune protine prsente dans les cellules en cycle ou lincorporation in vivo ou in vitro de pyrimidines modifies, par exemple la bromodoxyuridine (BrdU) apparie ladnosine au cours de la rplication de lADN. Ces mthodes permettent de chiffrer le pourcentage de cellules en cycle. La dernire peut fournir des informations sur la vitesse de la prolifration cellulaire. Ces tudes sont ralises soit sur les cellules en suspension analyses en cytomtrie en flux, soit sur des talements cytologiques ou des coupes tissulaires, analyses en microscopie optique en particulier par des systmes danalyse dimage.

Mthodes
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Cytomtrie en flux La quantification de l'ADN, value aprs incorporation d'iodure de propidium, est exprime en histogrammes d'ADN. Deux types de paramtres sont mesurs partir de ces histogrammes: - La quantit d'ADN ou ADN plodie. Celle-ci est soit quivalente celle de cellules normales, ADN diplodie, soit anormale, ADN aneuplodie. - L'analyse de la cintique cellulaire est obtenue partir des histogrammes d'ADN. Le pourcentage de cellules engages dans le cycle, en phase de synthse d'ADN (phase S), permet d'valuer l'activit prolifrative de la tumeur.

Cytomtrie balayage par analyse dimage La cytomtrie balayage par analyse d'image se caractrise par la digitalisation des images observes au microscope et par l'tude automatise de l'image colore du noyau permettant d'analyser plusieurs paramtres de quantit d'ADN et de cintique cellulaire sur 300 600 cellules par lame.

Les applications en oncologie

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Valeur diagnostique Ltude de lADN a peu de valeur dans le diagnostic diffrentiel entre lsion

bnigne et cancer. Il existe des populations aneuplodes dans des lsions bnignes et certains cancers sont en majorit diplodes.
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Intrt pronostique La valeur pronostique de lADN plodie, utilise seule, est limite. En revanche, lassociation de lADN plodie et du pourcentage de cellules en phase S fournit des informations sur la cintique de croissance tumorale et pourrait apporter des lments pronostiques.