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Universit Paris-VI

Biologie gnique
Objectifs au cours de Formation de base IFTAB (2me anne) Diplme dUniversit P. et M. Curie Formation continue 2006 - 2007

Pr. A. Raisonnier (raisonni@ccr.jussieu.fr) Avec lautorisation des Professeurs J. Etienne et G. Lucotte

Mise jour : 14 juin 2006 Relecture : Pr. A. Raisonnier

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Plan du cours

Plan du cours
3 9 11 13 14 15 16 17 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 39 40

Plan du cours Objectifs Partie I : Chapitre 1 :


1.1 1.2 1.3 1.4

Enzymes agissant sur les acides nucliques Phosphorylation - dphosphorylation

Polynuclotide-kinase Polynuclotide kinase T4 Terminal transferase Phosphatase alcaline

Chapitre 2 :
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 2.10 2.11 2.12 2.13

Les polymrases

DNA polymrase (raction) DNA polymrase (exonuclase 35) DNA polymrase (fonction ddition) DNA-polymrases (tableau) DNA pol I (E. Coli) Fragment de Klenow T4 DNA polymrase Sequenase Taq polymrase Reverse transcriptase RNA polymrase II (raction) RNA polymrases (phages) Poly(A) polymrase

Chapitre 3 :
3.1 3.2 3.3 3.4

Les ligases

DNA ligase (raction) DNA ligase (E. Coli) DNA ligase (phage T4) RNA ligase (phage T4)

Chapitre 4 :
4.1

Les isomrases

Topoisomrase

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Chapitre 5 :
5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 5.6 5.7 5.8 5.9 5.10 5.11 5.12 5.13 5.14 5.15 5.16 5.17 5.18 5.19 5.20 5.21 5.22 5.23 5.24 5.25 5.26 5.27 5.28 5.29 5.30

Les nuclases

Fragment de restriction (dfinition) Systme de restriction-modification Nomenclature des enzymes de restriction Restriction (raction gnrale) Tampons dincubation (restriction) EcoR I EcoR V Pvu II Hae III Pvu I Pst I Kpn I Alphabet dgnr Ava II Hind II Hga I Mbo II Hha I Hpa I Digestion dune squence (Hae III) Digestion dune squence (Mbo II) Ribonuclase A Ribonuclase T1 Ribonuclase H Dsoxyribonuclase I Nuclase BAL 31 Nuclase S1 Nuclease de mung-bean Exonuclase de phage Exonuclase III

Chapitre 6 :
6.1 6.2

Autres enzymes

-galactosidase Protinase K

Partie II : Chapitre 7 :
7.1 7.2

Prparation des acides nucliques Extraction et purification

Purification des lymphocytes Homognisation des tissus, dprotinisation

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7.3 7.4 7.5 7.6 7.7

Extraction de lADN Isolation de lARN Techniques de purification (tableau) Purification par lthanol Purification du RNA-poly(A)

Chapitre 8 :
8.1 8.2 8.3 8.4 8.5 8.6 8.7 8.8 8.9 8.10 8.11 8.12 8.13 8.14 8.15 8.16 8.17 8.18 8.19 8.20 8.21

Synthse des polynuclotides

Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR (I-1) PCR (I-2) PCR (I-3) PCR (II-1) PCR (II-2) PCR (II-3) PCR (III-1) PCR (III-2) PCR (III-3) Nested-PCR Phosphoramidites : dA-3-support protge Phosphoramidites : dtritylation Phosphoramidites : addition dun nuclotide Phosphoramidites : blocage des supports Phosphoramidites : oxydation Phosphoramidites : dprotection Synthse dun cDNA Sondes de cDNA amplifi Structures secondaires Synthse des queues poly(dN)

Chapitre 9 :
9.1 9.2 9.3 9.4 9.5 9.6 9.7 9.8 9.9 9.10 9.11 9.12 9.13

Caractrisation des acides nucliques

Principaux oligonuclotides Spectres UV des bases nucliques Spectre UV des acides amins Dosage des acides nucliques Electrophorse des acides nucliques Sonde nuclique (dfinition) Hybridation dune sonde Calcul de la Tm Southern blot Drpanocytose (anmie falciforme) Marquage : nick translation Marquage : random priming Marquage : terminal transferase

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9.14 9.15 9.16 9.17 9.18 9.19 9.20 9.21 9.22 9.23 9.24 9.25 9.26

Marquage : polynuclotide kinase Didsoxyadnosine triphosphate Raction de squence Squenage de lADN Squenage : dye primers Squenage : dye terminators Gel de squence Squenage : image du gel Squenage : analyse de limage Squenage : analyse de limage Promoteur : foot printing Dosage dARN : PCR quantitative Dosage dARN : protection la RNase

Partie III :

Caractrisation des vnements gntiques

Chapitre 10 : Mutations
10.1 10.2 10.3 10.4 Polymorphismes de restriction Polymorphisme Msp I de lapoA-II Haplotypes Cartes de restriction

Chapitre 11 : Expression
11.1 11.2 11.3 11.4 11.5 11.6 11.7 11.8 11.9 11.10 11.11 11.12 11.13 Vecteur (dfinition) Cellules-htes Cycle du phage Phage Clonage (I) Clonage (II) EMBL Polylinker Clonage directionnel Carte du plasmide pBR322 Carte des plasmides pUC18/19 Cycle de M13 Carte du M13

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Partie IV :

Le gnie gntique

Chapitre 12 : Mutagnse
12.1 12.2 Cration dun site de restriction Mutagnse par PCR

Chapitre 13 : Transposition - recombinaison


13.1 13.2 13.3 13.4 13.5 13.6 Transposition (dfinition) Protine rec-A Transposition (mcanisme) Recombinaison simple (mitose) Modle Holliday Crossing-over

Chapitre 14 : Construction de vecteurs


14.1 14.2 14.3 Carte du virus SV40 Construction dun vecteur Vecteurs hybrides

Chapitre 15 : Transgnse
15.1 15.2 Vecteurs de thrapie Souris knock out

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Objectifs

Objectifs
Des connaissances de base en enzymologie, en virologie et en biochimie des acides nucliques sont indispensables pour suivre cet enseignement. (Objectifs pr-requis). 1. Enzymes agissant sur les acides nucliques Pour chacune des enzymes suivantes, utilises au laboratoire de biologie molculaire, connatre1 les facteurs en prsence utiles la raction (substrat, modles, produits, cofacteurs, effecteurs, conditions physiques), la spcificit de lactivit enzymatique et donner des exemples de lusage quon peut en faire : polynuclotide kinase, terminal transferase, phosphatase alcaline, DNA polymrases, reverse transcriptase, RNA polymrases, poly(A) polymrase, DNA ligases, RNA ligase, topoisomrase, enzymes de restriction, ribonuclases (A, T1, H), dsoxyribonuclases, protinase K, -galactosidase. Dfinir2 les termes suivants : oligonuclotide, sonde, ADN complmentaire. Dcrire les gestes3 qui permettent de faire lextraction et la purification dADN gnomique partir dun prlvement de sang. Expliquer le principe de lextraction de lARN messager dun tissu et de la ralisation pratique dune banque de cDNA. Dcrire les gestes qui permettent de faire lamplification par PCR dun fragment dADN dont on possde les amorces. Expliquer le principe de la synthse dun oligonuclotide au moyen dun synthtiseur et de la technique des phosphoramidites. Dcrire les gestes qui permettent de faire la synthse dune queue de nuclotides lextrmit dun fragment dADN. Expliquer le principe du dosage des acides nucliques. Faire le calcul de la quantit dacides nucliques partir des donnes brutes fournies par un spectrophotomtre, en tenant compte des dilutions et du volume du milieu considr. Expliquer le principe de lhybridation dune sonde. Faire le calcul de la Tm de cette son-

2.

Prparation des acides nucliques

1. Connatre corps chimique : crire sa formule dveloppe, numrer les molcules simples dans une structure complexe et nommer les liaisons qui les unissent, expliquer une exprience mettant en vidence une proprit chimique ou physique ; image : dessiner un objet ou une structure ; raction : crire lquation chimique ; voie mtabolique : tablir son bilan chimique partir des ractions de chaque enzyme. 2. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern. 3. Expliquer le principe, dcrire ou mimer les gestes ou faire un schma explicatif : prciser le motif de chacun de ces gestes. Etre capable de dceler une erreur qualitative dans la description dun protocole. Au niveau des travaux pratiques, les connaissances techniques thoriques tant acquises, on devra tre capable de passer la manipulation sans avoir apprendre que la partie proprement manuelle.

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Objectifs

3.

de partir de sa squence et dune formule de calcul. Etablir les conditions des phases dun programme de PCR utilisant deux amorces de Tm voisines. Expliquer les tapes des techniques dhybridation molculaire qui auront t pratiques ou expliques en cours titre dexemples : hybridation sur filtre, hybridation in situ, hybridation en solution. Dcrire le principe technique et les gestes qui permettent de faire le marquage dune sonde par un atome de 32P ou par un nuclotide marqu. Expliquer le principe du squenage dun fragment dADN au moyen dun squenceur et de la technique des dye primers ou des dye terminators ; dcrire et interprter les rsultats1 apparaissant sur lcran de lordinateur aprs un squenage automatique. Expliquer les principes de la recherche des lments cis-rgulateurs sur la squence dun promoteur (foot printing). Expliquer le principe des ractions permettant le dosage des ARN transcrits : PCR quantitative, protection la Rnase. Dcrire et interprter les rsultats danalyse (sur un exemple emprunt au cours, aux T.P. ou votre exprience personnelle) dune lsion molculaire conduisant une expression anormale du gne considr : mutation faux-sens, non-sens, dcalage du cadre de lecture, protine tronque, Expliquer les tapes (sur un exemple emprunt au cours, aux T.P. ou votre exprience personnelle) des techniques ayant permis : un diagnostic gnotypique, une analyse gnique ou une empreinte gntique : RFLP, carte de restriction, haplotypes, squenage. Dfinir les termes suivants : vecteur, clonage, polylinker, plasmide. Dcrire les tapes de linsertion dun fragment dADN dans un plasmide. Expliquer les tapes (sur un exemple emprunt au cours, aux T.P. ou votre exprience personnelle) des techniques ayant permis : une mutagnse, la transposition dun gne dans une bactrie, la cration dun animal ou dune plante transgnique. Expliquer le principe de la construction dun vecteur : cet objectif servira tester la facult pour ltudiant(e) de faire une synthse des connaissances de lensemble des chapitres prcedents.

Exemples dapplications

4.

Gnie gntique

1. Interpreter les rsultats : partir des donnes affiches par la machine, aprs la validation technique de la squence, savoir dcrire la structure de lacide nuclique squen et reconnatre sur cette squence des lsions molculaires dont linterprtation ne ncessite la leve daucune ambigut.

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Enzymes agissant sur les acides nucliques

Partie I Enzymes agissant sur les acides nucliques


Rappel des objectifs Pour chacune des enzymes suivantes, utilises au laboratoire de biologie molculaire, connatre1 les facteurs en prsence utiles la raction (substrat, modles, produits, cofacteurs, effecteurs, conditions physiques), la spcificit de lactivit enzymatique et donner des exemples de lusage quon peut en faire : polynuclotide kinase, terminal transferase, phosphatase alcaline, DNA polymrases, reverse transcriptase, RNA polymrases, poly(A) polymrase, DNA ligases, RNA ligase, topoisomrase, enzymes de restriction, ribonuclases (A, T1, H), dsoxyribonuclases, protinase K, -galactosidase.

1. Connatre corps chimique : crire sa formule dveloppe, numrer les molcules simples dans une structure complexe et nommer les liaisons qui les unissent, expliquer une exprience mettant en vidence une proprit chimique ou physique ; image : dessiner un objet ou une structure ; raction : crire lquation chimique ; voie mtabolique : tablir son bilan chimique partir des ractions de chaque enzyme.

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Enzymes agissant sur les acides nucliques

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Phosphorylation - dphosphorylation

Chapitre 1 Phosphorylation dphosphorylation

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Phosphorylation - dphosphorylation

1.1 Polynuclotide-kinase

BG 01 La polynuclotide kinase catalyse le transfert du phosphate de lATP sur une fonction alcool du carbone 5 dun ADN ou dun ARN. Le substrat requiert une dphosphorylation pralable si la fonction est estrifie. Lenzyme catalyse aussi lchange du phosphate 5 terminal dun ADN ou dun ARN avec le phosphate de lATP, en prsence dADP comme accepteur de phosphate. La polynuclotide kinase du commerce est extraite dune bactrie (E. coli) infecte par le phage T4. Une unit denzyme catalyse le transfert de 33 picomoles de phosphate par minute 37 C. La polynuclotide kinase est utilise au laboratoire pour incorporer du phosphate radioactif (32P) sur lextrmit 5 dun acide nuclique, soit par transfert, soit par change.

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Phosphorylation - dphosphorylation

1.2 Polynuclotide kinase T4

BG 02 La polynuclotide kinase catalyse le transfert du phosphate de lATP sur une fonction alcool du carbone 5 dun ADN ou dun ARN. Le substrat requiert une dphosphorylation pralable si la fonction est estrifie. Lenzyme catalyse aussi lchange du phosphate 5 terminal dun ADN ou dun ARN avec le phosphate de lATP, en prsence dADP comme accepteur de phosphate. La polynuclotide kinase du commerce est extraite dune bactrie (E. coli) infecte par le bactriophage T4. Une unit denzyme catalyse le transfert de 33 picomoles de phosphate par minute 37 C. La polynuclotide kinase est utilise au laboratoire pour incorporer du phosphate radioactif (32P) sur lextrmit 5 dun acide nuclique, soit par transfert, soit par change.

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Phosphorylation - dphosphorylation

1.3 Terminal transferase

BG 03 La transfrase terminale catalyse laddition de dsoxynuclotides sur une fonction alcool 3OH terminale de lADN. Lenzyme prfre les molcules dADN dont lextrmit 3OH est sortante, mais il existe des conditions qui favorisent la catalyse sur lADN bouts francs, voire sur les extrmits 3OH rentrantes. Elle incorpore plus spcifiquement les purines ou les pyrimidines en fonction du cation divalent quon lui donne comme cofacteur : Mg++ pour les purines, Co++ pour les pyrimidines ou encore Mn++. La transfrase terminale du commerce est extraite du thymus de veau. Une unit denzyme catalyse le transfert de 17 picomoles de dsoxyribonuclotide par minute 37 C. La transfrase terminale est utilise au laboratoire pour : construire des squences polymrises de nuclotides (queues) lextrmit 3OH de lADN (en vue du clonage des fragments dADN) ; marquer les extrmits 3 de lADN avec un nuclotide marqu sur le phosphate ; ajouter un nuclotide la fin dune squence pour induire une mutation (mutagnse dirige).

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Phosphorylation - dphosphorylation

1.4 Phosphatase alcaline

BG 04 Les phosphatases sont des enzymes trs large spcificit, hydrolysant le radical phosphoryle port par une liaison ester ou anhydride... On les divise en plusieurs classes en fonction de leur pH optimum daction : phosphatases acides, phosphatases alcalines. Certaines phosphatases ont une spcificit de substrat plus troite : 5 nuclotidase. La raction catalyse par les phosphatases est irrversible, mais certaines sont capables dchanger le radical phosphate partir de molcules plus riches en nergie comme le pyrophosphate. La phosphatase alcaline du commerce est celle extraite de lintestin de veau. Une unit denzyme catalyse lhydrolyse dune micromole de paranitrophnylphosphate par minute 37 C. La phosphatase alcaline est utilise au laboratoire pour dphosphoryler les extrmits 5 des acides nucliques, soit pour prparer un marquage en 5 par une polynuclotide kinase, soit pour empcher la rannalisation dun ADN circulaire linaris (vecteurs de clonage).

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Les polymrases

Chapitre 2 Les polymrases

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Les polymrases

2.1 DNA polymrase (raction)

BG 05 Les DNA-polymrases sont des enzymes du noyau cellulaire qui agissent en phase S du cycle pour doubler systmatiquement lensemble du gnome diplode. Dautres DNA polymrases interviennent dans la synthse des amorces RNA/DNA, dans la rplication du gnome mitochondrial ou dans la rparation du DNA. Elles ne peuvent dmarrer la condensation des nuclotides que sur la fonction alcool en 3 du ribose du dernier nuclotide dune amorce, nuclotide qui doit tre hybrid avec le nuclotide complmentaire qui sert de modle. Elles utilisent comme substrats des dsoxyribonuclotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) et des amorces de RNA et de DNA synthtises par une primase (RNA polymrase capable de synthtiser un brin de RNA complmentaire dun brin de DNA sur 10 nuclotides) suivie dune DNA polymrase (qui prolonge lamorce de RNA de 20 dsoxyribonuclotides environ). Elles synthtisent lADN nouveau par fragments qui, aprs excision des amorces, sont lis entre eux par une DNA-ligase. Elles ont aussi une activit exonuclasique, qui leur permet en particulier dhydrolyser le dernier nuclotide en 3 du brin synthtis si celui-ci ne sapparie pas correctement avec le nuclotide complmentaire du brin modle.

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Les polymrases

2.2 DNA polymrase (exonuclase 35)

BG 05/1 Les DNA-polymrases sont des enzymes du noyau cellulaire qui agissent en phase S du cycle pour doubler systmatiquement lensemble du gnme diplode. Dautres DNA polymrases interviennent dans la synthse des amorces RNA/DNA, dans la rplication du gnome mitochondrial ou dans la rparation du DNA. Elles ne peuvent dmarrer la condensation des nuclotides que sur la fonction alcool en 3 du ribose du dernier nuclotide dune amorce, nuclotide qui doit tre hybrid avec le nuclotide complmentaire qui sert de modle. Elles utilisent comme substrats des dsoxyribonuclotides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP) et des amorces de RNA et de DNA synthtises par une primase (RNA polymrase capable de synthtiser un brin de RNA complmentaire dun brin de DNA sur 10 nuclotides) suivie dune DNA polymrase (qui prolonge lamorce de RNA de 20 dsoxyribonuclotides environ). Elles synthtisent lADN nouveau par fragments qui, aprs excision des amorces, sont lis entre eux par une DNA-ligase. Elles ont aussi une activit exonuclasique, qui leur permet en particulier dhydrolyser le dernier nuclotide en 3 du brin synthtis si celui-ci ne sapparie pas correctement avec le nuclotide complmentaire du brin modle.

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Les polymrases

2.3 DNA polymrase (fonction ddition)

BG 05/2 Les DNA polymrases ont la fois une activit de polymrase pour ajouter des nuclotides au nouveau brin de DNA, et une activit de 35 exonuclase pour hydrolyser le dernier nuclotide incorpor. Si le nuclotide incorpor est complmentaire du nuclotide du brin modle et donc que lhybridation des bases se fait normalement, lactivit de polymrase est plus rapide que celle dexonuclase et le nuclotide suivant va tre incorpor. Si le nuclotide incorpor nest pas complmentaire du nuclotide du brin modle et donc quil y a msappariement, lactivit dexonuclase est plus rapide que celle de polymrase et ce nuclotide sera hydrolys.

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Les polymrases

2.4 DNA-polymrases (tableau)

BG 06 Les DNA polymrases sont des enzymes qui catalysent la synthse de lADN partir des dsoxyribonuclosides triphosphates en recopiant la squence dune matrice dADN. Certaines dentre elles ont aussi des activits dexonuclase qui peuvent sexercer de 5 vers 3 ou dans lautre sens, afin de corriger les erreurs dincorporation (fonction ddition). Les DNA polymrases sont spcifiques de lADN double brin et incorporent les nuclotides pour faire la synthse dun deuxime brin en utilisant le premier comme matrice. Les DNA polymrases ont besoin dune amorce (extrmit 3OH rentrante dun deuxime brin) pour initier la raction. Tous les tres vivants ont besoin dune DNA polymrase pour la rplication de leur ADN. Ce sont en gnral des protines denviron 100000 daltons. Celles des tres vivants les plus simples (virus, archobactries) sont souvent dpourvues de fonctions ddition. Toutes les DNA polymrases exigent la prsence de lion magnsium. Beaucoup dentre elles fonctionnent en milieu alcalin. Leur temprature optimale daction se situe habituellement dans une fourchette de 20 40 C.

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2.5 DNA pol I (E. Coli)

BG 07 La DNA polymrase I dEscherichia coli (DNA pol I) est une protine qui assure la fonction de rplication de lADN bactrien. Elle initie la raction lextrmit 3 rentrante dune amorce dADN ou dARN. Elle incorpore des nuclotides partir des quatre dsoxyribonuclosides triphosphates, en hydrolysant un pyrophosphate et en incorporant le nucloside et le phosphate . Lorsque cet atome de phosphore est radioactif, le brin dADN produit est aussi marqu. DNA pol I est doue dune double fonction ddition : exonuclase 53 pour digrer le deuxime brin partir de son extrmit 5 (nick translation) exonuclase 35 pour digrer lextrmit 3 dun brin (correction immdiate des misappariements)

Les activits dexonuclase sexercent aussi sur les brins dARN hybrids (amorces). DNA pol I est utilise pour la synthse de brins dADN marqus sur toute la longueur de la chane par la technique de translation de brche avec des dNTP marqus.

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2.6 Fragment de Klenow

BG 07/1 La digestion de la DNA polymrase I par une protase (subtilisine) donne deux fragments : celui de 76 kD (fragment de Klenow) possde encore deux des activits catalytiques de la polymrase : 53 polymrase et 35 exonuclase. Ce fragment peut-tre utilis pour synthtiser le deuxime brin partir dun ADN simple brin et dune amorce. La raction est la mme que celle de la DNA polymrase I. Les conditions de milieu et la vitesse de raction sont les mmes que celles de lenzyme entire. Le fragment de Klenow est utilis pour : la synthse du deuxime brin, complmentaire dun cDNA ; le marquage des extrmits 5 sortantes du DNA double brin ; le marquage du DNA par la technique des amorces alatoires ; le squenage du DNA par la technique des didsoxynuclotides ; la mutagnse dirige partir doligonuclotides synthtiques.

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Les polymrases

2.7 T4 DNA polymrase

BG 08 Dans une culture dE. coli infecte par le bactriophage T4, on peut purifier la DNA polymrase de ce phage. Comme le fragment de Klenow elle est dpourvue dactivit 53 exonuclase, mais elle possde une activit 35 exonuclase 200 fois plus grande. En labsence de dsoxynuclosides triphosphates, seule lactivit 35 exonuclase se manifeste, aboutissant un DNA avec de longues extrmits 5 sortantes. Lorsque les substrats sont ajouts au milieu, la resynthse se fait rapidement, permettant lincorporation de nuclotides marqus. Lactivit de la T4 polymrase est aussi rapide que celle de la DNA polymrase I. La DNA polymrase du phage T4 est utilise pour le marquage du DNA.

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Les polymrases

2.8 Sequenase

BG 09 Les squenases sont une famille denzymes issues de la DNA polymrase du bactriophage T7. Elles sont constitues dune protine du phage (gne 5) et dune protine de la cellule-hte (thioredoxine). Elles sont dpourvues par une modification du gne de toute activit ddition (53 exonuclase et 35 exonuclase). Les squenases sont les plus rapides de toutes les DNA polymrases. Les squenases sont utilises dans les techniques de squenage avec des didsoxyribonuclotides (Sanger). Elles sont responsables de quelques erreurs dfaut dactivit ddition : de lordre de 1 misappariement pour 1000 paires de bases.

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2.9 Taq polymrase

BG 10 Thermus aquaticus est une bactrie thermophile des sources chaudes du parc de Yellowstone (Californie). Elle possde des enzymes thermorsistantes, dont une DNA polymrase (Taq polymrase) rsistante lbullition et active 75-80 C. La Taq polymrase est dpourvue dactivits ddition (53 exonuclase et 3 5 exonuclase). La Taq polymrase est inhibe par les ions phosphates. La Taq polymrase est utilise pour la raction de polymrisation en chane (Polymerase Chain Reaction = PCR), technique courante damplification des fragments de DNA. Parce quelle est dpourvue dactivits ddition la Taq polymrase est responsable de nombreux misappariements : de lordre de 1 pour 100 paires de bases.

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Les polymrases

2.10 Reverse transcriptase

BG 11 Les transcriptases rverses sont des DNA polymrases qui peuvent synthtiser un brin dADN complmentaire (ADNc ou cDNA) en prenant un ARN comme matrice, pour former un hybride ADN:ARN. Elles catalysent donc la raction inverse de la transcription, do le nom de transcriptases rverses. Les transcriptases rverses sont produites par des cellules infectes par des rtrovirus, virus ARN qui font synthtiser un ADNc par la cellule-hte afin de permettre leur rplication. La transcriptase rverse est utilise pour ltude des ARN. Aprs la synthse de lADN complmentaire, on dtruit lARN matrice, puis on soumet lADNc lamplification par la PCR, qui fournit une grande quantit dADNc hybrid avec une copie ADN de la squence de lARN de dpart.

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Les polymrases

2.11 RNA polymrase II (raction)

BG 12 La RNA polymrase II est lenzyme de la transcription des gnes exprims sous forme de protines. Elle est inhibe spcifiquement par un poison extrait de lAmanite phallode, l-amanitine. Elle est prsente dans tous les noyaux cellulaires. Sa masse molculaire est de 500000 daltons pour 10 sous-units. La transcription quelle catalyse ncessite des ribonuclosides triphosphates comme substrats (ATP, CTP, GTP et UTP), plusieurs cofacteurs protiniques (transcription factors TFIIA TFIIJ). Lnergie de la raction est fournie par lhydrolyse des liaisons riches en nergie des nuclosides triphosphates (42 kJ/mol).

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Les polymrases

2.12 RNA polymrases (phages)

BG 13 Les RNA polymrases sont les enzymes de la transcription. Elles sont essentielles au cycle des bactriophages ADN comme le SP6 de Salmonella typhimurium ou le phage T7 dEscherichia coli. Elles sont trs spcifiques des promoteurs correspondants. Lorsque ces promoteurs sont rguls par un inducteur spcifique, la prsence de cet inducteur est indispensable la raction. Les RNA polymrases des phages sont capables dincorporer 17 picomoles de nuclotides la minute 37 C. Les RNA polymrases des phages sont utilises pour la transcription in vitro, pour la synthse des sondes dARN et pour lanalyse des messagers (protection la RNase).

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Les polymrases

2.13 Poly(A) polymrase

BG 14 Lextrmit 3OH terminale du dernier exon du transcrit est dabord coupe par une nuclase environ 15 nuclotides aprs la bote de polyadnylation. Ensuite, une polymrase additionne des nuclotides adnine (plusieurs centaines) pour constituer une queue polyA. La raction se fait sans matrice, partir de lATP et en prsence de Magnsium. Le pyrophosphate produit est hydrolys. La queue polyA est indispensable la sortie du mRNA du noyau vers le cytoplasme. Elle protge le mRNA au cours de la traduction. Les mRNA dsadnyls ne sont plus traduits et seront rapidement digrs par la ribonuclase. Ces deux activits (nuclase et polymrase) seraient catalyses par un mme complexe multienzymatique : polyA polymrase ou polyadnylyl synthtase.

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Les ligases

Chapitre 3 Les ligases

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Les ligases

3.1 DNA ligase (raction)

BG 15 Les DNA ligases sont des enzymes qui sont capables de reconstituer la liaison phosphoester entre le carbone 3-OH et le phosphate-5 de deux nuclotides voisins sur un brin de DNA.

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3.2 DNA ligase (E. Coli)

BG 16 Les DNA ligases catalysent la liaison de lextrmit 5-phosphate terminale dun brin dADN avec lextrmit 3-OH terminale dun autre brin. La DNA ligase de E. coli ne lie les bouts francs de lADN quen prsence de ractifs dexclusion (polythylne glycol ou Ficoll), mais elle est toujours active pour souder les fragments dADN double brin extrmits collantes, ou pour fermer une brche dans un brin dADN dont la resynthse est acheve. La DNA ligase de E. coli utilise le NAD+ comme coenzyme donneur dnergie selon la raction : NAD+ NMN+ + AMP Elle na pas dactivit sur les RNA. Les DNA ligases sont utilises dans le clonage des fragments dADN et dans la construction des vecteurs.

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3.3 DNA ligase (phage T4)

BG 17 La DNA ligase du bactriophage T4 est moins spcifique que celle de E. coli : elle lie bien les fragments de DNA bouts francs et fonctionne dans la plupart des tampons utiliss par les enzymes de restriction. La T4 DNA ligase agit aussi mais moins rapidement sur les ARN. La DNA ligase du phage T4 utilise lATP comme donneur dnergie.

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Les ligases

3.4 RNA ligase (phage T4)

BG 18 La RNA ligase du bactriophage T4 catalyse la liaison des fonctions 5-phosphate des ADN ou ARN simple brin la fonction 3-OH dautres fragments simple brin dARN ou dADN. Lenzyme est capable de lier un fragment dun seul nuclotide. La RNA ligase du bactriophage T4 est utilise pour le marquage des ARN sur leur extrmit 3 et pour la synthse doligonuclotides.

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Les isomrases

Chapitre 4 Les isomrases

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Les isomrases

4.1 Topoisomrase

BG 19 La rplication ou la transcription de lADN ncessite une fusion partielle de la double hlice et modifie lenroulement des deux brins. Afin de permettre ces ractions, la topoisomrase est capable de modifier lenroulement en hydrolysant un brin de lADN et en le reconstituant aprs avoir fait le tour de lautre brin. Aprs cette opration, la torsion de la double hlice tend se rapprocher de la valeur normale : pas de lhlice = 10 paires de nuclotides par tour. Au cours de la rplication et de la traduction le pas de lhlice diminue en avant des polymrases et lhlicase (une des topoisomrases) travaille alors pour augmenter le pas. Au contraire en arrire des polymrases les topoisomrases ajoutent des tours pour reconstituer la double hlice.

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Les nuclases

Chapitre 5 Les nuclases

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5.1 Fragment de restriction (dfinition)

BG 20 Les endonuclases de restriction sont des enzymes bactriennes participant un mcanisme de dfense des bactries vis--vis des virus : systme de restriction-mthylation. Elles catalysent la coupure de lADN non mthyl en des endroits caractriss par une squence spcifique de nuclotides (site de restriction). Les produits de cette digestion sont les fragments de restriction, dont la longueur, toujours la mme pour un ADN donn, ne dpend que de la squence primaire de cet ADN. Lanalyse de la longueur des fragments de restriction, la recherche de variations individuelles (polymorphismes de longueur des fragments de restriction = RFLP) est une des techniques danalyse de la squence primaire de lADN la recherche de substitutions, dinsertions ou de dltions qui modifient le nombre de sites de restriction et donc la longueur des fragments de restriction. Les extrmits des fragments de restriction peuvent tre formes de deux brins dgale longueur (bouts francs) ou bien prsenter un brin plus long que lautre de quelques nuclotides (bouts collants).

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5.2 Systme de restriction-modification

BG 20/1 Les Bactries sont lyses sous leffet de virus bactriophages dont lADN est rpliqu par la Bactrie elle-mme avant sa destruction. Pour dtruire lADN du parasite la Bactrie exprime des gnes de restriction et de mthylation. Les gnes de restriction permettent la synthse dendonuclases coupant lADN en des sites trs spcifiques. Afin de protger lADN bactrien de lhydrolyse par lenzyme, une mthylase, code par le gne de mthylation, va modifier les nuclotides de lADN bactrien en les mthylant pour quils ne soient plus reconnus par lenzyme de restriction. Lensemble du gne de restriction et du gne de mthylation constitue un systme de dfense de la Bactrie vis--vis des phages.

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5.3 Nomenclature des enzymes de restriction

BG 21 Les enzymes de restriction sont des hydrolases (classe 3 de la E.C.) agissant sur des liaisons esters (sous-classe 3.1), cest--dire des estrases. Parmi les estrases on distingue celles qui hydrolysent un acide nuclique en fragments polynuclotidiques (endonuclases) et en particulier celles dont les produits gardent leur phosphate 5 initial (sous-sous-classe 3.1.21). Enfin en fonction des cofacteurs, les enzymes de restriction ne ncessitent que la prsence de lion Mg++ dans le milieu (3.1.21.4) Le nom de chaque enzyme est driv du nom despce ou de varit de la Bactrie qui la produit. On crit linitiale du nom du genre, les deux initiales du nom de lespce, 1 lettre ou 1 nombre pour dsigner la varit (ou souche) et aprs un espace un chiffre romain pour dsigner successivement les diffrentes enzymes de restriction obtenues partir de la mme souche.

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5.4 Restriction (raction gnrale)

BG 22 La raction gnrale catalyse par les enzymes de restriction implique la prsence dans le milieu ractionnel des facteurs suivants : Enzyme (3.1.21.n) Substrat : ADN double brin non digr Produit : ADN double brin digr Cofacteurs

En gnral, seul le Mg++ est indispensable. Quelques endonuclases font appel dautres cofacteurs. Les enzymes de mthylation ont pour coenzyme la S-Adnosyl-Mthionine (S-AdoMet). Des facteurs physiques contrlent aussi ces ractions : pH, potentiel doxydorduction, force ionique. Lnergie libre dgage par lhydrolyse est suffisamment importante pour que la raction ne soit pratiquement pas rversible dans les conditions habituelles.

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5.5 Tampons dincubation (restriction)

BG 22/1 Diffrents tampons sont utiliss pour les enzymes de restriction permettant loptimisation des ractions de multiples enzymes avec le mme tampon. Toutes les enzymes de restriction ncessitent la prsence de lion Mg++ Le pH (7,0 - 7,9), le potentiel doxydo-rduction (dithiothritol 1 mM), la force ionique (NaCl ou CH3COOK de 0 100 mM) varient dun tampon lautre. De rares enzymes ncessitent des conditions spciales prcises par leur mode demploi.

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5.6 EcoR I

BG 23 EcoR I est une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants . La mthylation des adnines ou de la cytosine du site dhydrolyse inhibent la reconnaissance du site par EcoR I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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5.7 EcoR V

BG 24 EcoR V est une enzyme de restriction produite par Escherichia coli, souche R. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 GATATC 3 3 CTATAG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts francs . La mthylation des adnines du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par EcoR V. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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5.8 Pvu II

BG 24/1 Pvu II est une enzyme de restriction produite par Proteus vulgaris. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 CAGCTG 3 3 GTCGAC 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts francs . La mthylation des cytosines au niveau du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Pvu II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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5.9 Hae III

BG 25 Hae III est une enzyme de restriction produite par Haemophilus aegypticus. Le site de liaison lADN est form de quatre paires de nuclotides : 5 GGCC 3 3 CCGG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts francs . La mthylation de la cytosine immdiatement en aval du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Hae III. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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5.10 Pvu I

BG 26 Pvu I est une enzyme de restriction produite par Proteus vulgaris. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 CGATCG 3 3 GCTAGC 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants . La mthylation de la deuxime cytosine proche du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Pvu I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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5.11 Pst I

BG 26/1 Pst I est une enzyme de restriction produite par Providencia stuartii. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 CTGCAG 3 3 GACGTC 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants . La mthylation de la premire cytosine ou de ladnine du site dhydrolyse inhibent la reconnaissance du site par Pst I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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5.12 Kpn I

BG 26/2 Kpn I est une enzyme de restriction produite par Klebsiella pneumoniae. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 CTGCAG 3 3 GACGTC 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants . La mthylation de ladnine ou des cytosines du site dhydrolyse inhibent la reconnaissance du site par Kpn I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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5.13 Alphabet dgnr

BG 27 La spcificit large de certaines enzymes ou encore la dgnrescence du code gntique implique quon doit indiquer quelquefois dans les squences des lettres correspondant plusieurs bases azotes diffrentes pour le mme nuclotide prsent une position. Le choix peut porter sur deux des 4 nuclotides : A ou G, C ou T, G ou T, A ou C, C ou G, A ou T ; ou bien sur 3 nuclotides : C, G ou T, A, G ou T, A, C ou T, A, C ou G ; ou enfin sur les 4 nuclotides : A, C, G ou T. Les rgles de complmentarit impliquent videmment une dgnrescence de la squence de lautre brin en regard dune position dgnre.

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Les nuclases

5.14 Ava II

BG 28 Ava II est une enzyme de restriction produite par Anabaena variabilis. Le site de liaison lADN est form de cinq paires de nuclotides : 5 GGWCC 3 3 CCWGG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait loin du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants . La mthylation des cytosines du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Ava II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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5.15 Hind II

BG 29 Hind II est une enzyme de restriction produite par Haemophilus influenzae, souche Rd. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 GTYRAC 3 3 CARYTG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts francs . La mthylation de ladnine du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Hind II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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Les nuclases

5.16 Hga I

BG 30 Hga I est une enzyme de restriction produite par Haemophilus gallinarum. Le site de liaison lADN est form de cinq paires de nuclotides : 5 GACGC 3 3 CTGCG 5 Les sites de restriction ne sont quelquefois pas des palindromes, cest dire quils sont diffrents sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait en dehors du site de liaison et le site hydrolys nest pas dans le site de restriction. Pour indiquer le site de coupure on ajoute la squence du site de restriction une fraction indiquant le nombre de nuclotides en aval de la squence qui sparent lextrmit 3 de la squence du site de coupure sur le brin de la squence et sur le brin complmentaire : ici, 5 nuclotides en aval de la squence sur le brin de la squence et 10 nuclotides sur le brin complmentaire. Ici, il va rester des nuclotides non apparis : les fragments de restriction sont donc bouts collants . La mthylation de la deuxime cytosine du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Hga I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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5.17 Mbo II

BG 31 Mbo II est une enzyme de restriction produite par Moraxella bovis. Le site de liaison lADN est form de cinq paires de nuclotides : 5 GAAGA 3 3 CTTCT 5 Les sites de restriction ne sont quelquefois pas des palindromes, cest dire quils sont diffrents sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait en dehors du site de liaison et le site hydrolys nest pas dans le site de restriction. Pour indiquer le site de coupure on ajoute la squence du site de restriction une fraction indiquant le nombre de nuclotides en aval de la squence qui sparent lextrmit 3 de la squence du site de coupure sur le brin de la squence et sur le brin complmentaire : ici, 8 nuclotides en aval de la squence sur le brin de la squence et 7 nuclotides sur le brin complmentaire. La mthylation de la dernire adnine du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Mbo II. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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5.18 Hha I

BG 32 Hha I est une enzyme de restriction produite par Haemophilus haemolyticus. Le site de liaison lADN est form de quatre paires de nuclotides : 5 GCGC 3 3 CGCG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait en dehors du centre de symtrie du palindrome certaines paires de nuclotides restent non apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts collants . La mthylation des cytosines au niveau du site dhydrolyse inhibe la reconnaissance du site par Hha I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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5.19 Hpa I

BG 33 Hpa I est une enzyme de restriction produite par Haemophilus parainfluenzae. Le site de liaison lADN est form de six paires de nuclotides : 5 GTTAAC 3 3 CAATTG 5 Les sites de restriction sont souvent de type palindrome, cest dire quils sont identiques sur les deux brins de lADN (mais antiparallles sur lautre brin). Lorsque lhydrolyse des liaisons phosphodiester se fait au centre de symtrie du palindrome toutes les paires de nuclotides restent apparies : les fragments qui en rsultent sont dits bouts francs . La mthylation de la deuxime adnine de la squence inhibe la reconnaissance du site par Hpa I. LADN de la bactrie ainsi mthyl nest pas hydrolys alors que lADN parasite qui nest pas mthyl sera hydrolys.

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5.20 Digestion dune squence (Hae III)

BG 34 Voici le rsultat de la digestion du gne de lapoA-II (brin codant) par Hae III. Chacune des squences GGCC engendre une coupure de lADN, ce qui produit des fragments de restriction dont le longueur dpend de la frquence de cette squence sur lADN. On peut tablir des cartes des emplacements de ces sites sur lADN (cartes de restriction). La recherche de ces sites sur lADN extrait dun sujet permet de dtecter des squences diffrentes qui ajoutent ou suppriment des sites de restriction. Il en rsulte que les fragments de restriction chez ces individus nont pas la mme longueur que les mmes fragments chez les autres individus : il y a un polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism).

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5.21 Digestion dune squence (Mbo II)

BG 34/1 Voici le rsultat de la digestion du gne de lapoA-II (brin codant) par Mbo II. Mbo II est spcifique dun site non palindromique donc dissymtrique : GAAGA (N)8/7. Chacune des squences GAAGA engendre une coupure de lADN, huit nuclotides cot 3 du site. La squence doit tre recherche sur les deux brins, ou bien on peut rechercher la squence complmentaire TCTTC qui engendre une coupure sept nuclotides cot 5. On peut tablir des cartes des emplacements de ces sites sur lADN (cartes de restriction). La recherche de ces sites sur lADN extrait dun sujet permet de dtecter des squences diffrentes qui ajoutent ou suppriment des sites de restriction. Il en rsulte que les fragments de restriction chez ces individus nont pas la mme longueur que les mmes fragments chez les autres individus : il y a un polymorphisme de longueur des fragments de restriction (RFLP = Restriction Fragment Length Polymorphism).

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5.22 Ribonuclase A

BG 35 La ribonuclase A est lenzyme de la digestion des ARN chez les animaux. Elle agit comme une endonuclase, prfrentiellement aprs les nuclotides pyrimidine, en hydrolysant la liaison entre le phosphate et le carbone 5 du nuclotide suivant. Elle hydrolyse les ARN jusqu un mlange doligonuclotides se terminant tous par un nuclotide pyrimidine estrifi par un phosphate en 3. La ribonuclase pancratique est une des plus petites et des mieux connues des enzymes. Elle est thermorsistante et extrmement active. Il existe des inhibiteurs de la RNase : soit des dtergents comme le SDS (laurylsulfate de sodium), soit des protines comme celle extraite du placenta qui est souvent utilise pour protger les ARN dans les ractions enzymatiques.

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5.23 Ribonuclase T1

BG 36 La ribonuclase T1 hydrolyse spcifiquement les ARN en rompant les liaisons 3-5 phosphodiester en aval des GMP, de telle manire que le produit soit une guanosine 3-phosphate ou un oligonuclotide se terminant par une guanosine 3-phosphate. Elle est utilise pour hydrolyser les ARN non-hybrids lors des expriences dhybridation ARN:ADN.

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5.24 Ribonuclase H

BG 37 La ribonuclase H est une ribonuclase bactrienne qui intervient dans la maturation des RNA amorces qui servent initier la rplication des plasmides. Elle est utilise lors de la synthse du deuxime brin dun cDNA issu de la reverse transcription, afin de limiter les brins synthtiss en dehors de lamorce spcifique (self-primed strands).

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5.25 Dsoxyribonuclase I

BG 38 La dsoxyribonuclase I est lenzyme de la digestion des ADN chez les animaux. Elle hydrolyse les ADN double ou simple brin jusqu un mlange de nuclotides et doligonuclotides. Elle agit comme une endonuclase, prfrentiellement sur les liaisons adjacentes aux nuclosides pyrimidiques. En prsence de Mg++ elle hydrolyse les liaisons au hasard indpendamment de la squence ; en prsence de Mn++ elle devient plus dpendante de la squence. La DNase pancratique est utilise pour introduire des brches au hasard dans lADN double brin en vue dun marquage par la DNA polymrase. Elle est galement lenzyme danalyse des sites de liaisons protine-DNA par la technique de foot-printing.

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5.26 Nuclase BAL 31

BG 39 La nuclase BAL 31 est tout dabord une exonuclase 35 qui rsorbe progressivement les extrmits 3 des ADN double brin. Sur les brins 5 sortants quelle isole elle agit ensuite comme une endonuclase pour dtruire les fragments dADN simple brin. Elle est absolument dpendante de la prsence de Ca++ comme cofacteur. Elle a peu dactivit sur les ARN. La nuclase BAL 31 est surtout utilise pour le caractre progressif de son activit exonuclasique : on peut ainsi faire disparatre un un les sites de restriction dun ADN pour connatre lordre dans lequel ils sont prsents dans la squence de cet ADN.

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Les nuclases

5.27 Nuclase S1

BG 40 La nuclase S1 est une nuclase spcifique des ADN (ou ARN) simple brin, bien qu des concentrations leves elle agisse aussi sur les hybrides. Elle agit en milieu acide, en prsence dions Zinc. La nuclase S1 est utilise : pour faire des bouts francs aux extrmits des fragments dADN double brin ; pour hydrolyser les fragments dADN simple brin au niveau des brches (mme sil ne manque quune seule liaison) ; pour isoler les hybrides ADN:ARN lors de lhybridation entre un gne et le cDNA correspondant ; pour ouvrir les pingles cheveux formes lors de la synthse des cDNA.

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Les nuclases

5.28 Nuclease de mung-bean

BG 41 La nuclase des germes de haricot dor est aussi une nuclase spcifique des ADN (ou ARN) simple brin, bien qu des concentrations leves elle agisse galement sur les hybrides. Encore plus douce que la nuclase S1, elle respecte les brins dADN prsentant des brches dune seule liaison (nicks).

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5.29 Exonuclase de phage

BG 42 Les exonuclases sont des enzymes qui hydrolysent le premier ou le dernier nuclotide au bout dun brin dacide nuclique. Lexodsoxyribonuclase du bactriophage , quon rencontre aussi chez les bactriophages T4 ou T7, ainsi que chez les Mammifres (DNase IV), hydrolyse de prfrence les extrmits 5-phosphate des DNA double-brin en continuant vers le ct 3. (53 exonuclase). Elle produit des nuclosides 5-phosphate. Elle est exprime dans les cultures bactriennes infectes par ces phages.

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Les nuclases

5.30 Exonuclase III

BG 43 Les exonuclases sont des enzymes qui hydrolysent le premier ou le dernier nuclotide au bout dun brin dacide nuclique. Lexodsoxyribonuclase III dEscherichia coli, quon rencontre aussi chez Haemophilus influenzae, hydrolyse de prfrence les extrmits 3OH des DNA double-brin en remontant vers le ct 5. (35 exonuclase). Elle produit des nuclosides 5-phosphate. Cette enzyme est aussi capable dhydrolyser un radical phosphoryl li la fonction 3 alcool du ribose du dernier nuclotide (3-phosphate terminal).

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Les nuclases

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Autres enzymes

Chapitre 6 Autres enzymes

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Autres enzymes

6.1 -galactosidase

BG 44 La -galactosidase est une enzyme dEscherichia coli. Lorsque cette bactrie pousse sur un milieu riche en lactose, elle exprime la -galactosidase qui est un des gnes de lopron lactose. La -galactosidase hydrolyse spcifiquement les liaisons osides dans lesquelles lanomre du galactose engage son carbone rducteur. La -galactosidase est utilise comme gne reporter dans beaucoup de constructions de vecteurs. On introduit le promoteur de lopron lactose et le gne de la -galactosidase dans un vecteur puis on transfecte des bactries avec. Les bactries utilises sont dpourvues de lopron lactose (lac-). En faisant pousser les bactries transfectes en prsence dun inducteur de lopron lactose (IPTG = isopropyl-thio-galactoside) on induit la synthse de lenzyme dans les colonies. En faisant pousser ces colonies en prsence dun substrat artificiel (X-Gal, compos incolore) on permet lhydrolyse de ce substrat par lenzyme qui libre le produit X (5Br,4Cl-indol, color en bleu). La prsence de ce colorant donne la preuve de lactivit de la -galactosidase, donc de son expression partir du gne et par consquent de la viabilit du vecteur transfect dans les bactries.

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Autres enzymes

6.2 Protinase K

BG 45 La protinase K est une protase vgtale trs active, mme en prsence de laurylsulfate (SDS) ou dEDTA, et qui na aucun effet dhydrolyse sur les acides nucliques. Elle hydrolyse les protines de toutes origines en quelques heures avec une prfrence pour les liaisons peptidiques situes aprs les acides amins hydrophobes (leucine, par exemple). La protinase K est utilise dans les techniques de prparation et de purification des acides nucliques.

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Prparation des acides nucliques

Partie II Prparation des acides nucliques


Rappel des objectifs Dfinir1 les termes suivants : oligonuclotide, sonde, ADN complmentaire. Dcrire les gestes2 qui permettent de faire lextraction et la purification dADN gnomique partir dun prlvement de sang. Expliquer le principe de lextraction de lARN messager dun tissu et de la ralisation pratique dune banque de cDNA. Dcrire les gestes qui permettent de faire lamplification par PCR dun fragment dADN dont on possde les amorces. Expliquer le principe de la synthse dun oligonuclotide au moyen dun synthtiseur et de la technique des phosphoramidites. Dcrire les gestes qui permettent de faire la synthse dune queue de nuclotides lextrmit dun fragment dADN. Expliquer le principe du dosage des acides nucliques. Faire le calcul de la quantit dacides nucliques partir des donnes brutes fournies par un spectrophotomtre, en tenant compte des dilutions et du volume du milieu considr. Expliquer le principe de lhybridation dune sonde. Faire le calcul de la Tm de cette sonde partir de sa squence et dune formule de calcul. Etablir les conditions des phases dun programme de PCR utilisant deux amorces de Tm voisines. Expliquer les tapes des techniques dhybridation molculaire qui auront t pratiques ou expliques en cours titre dexemples : hybridation sur filtre, hybridation in situ, hybridation en solution. Dcrire le principe technique et les gestes qui permettent de faire le marquage dune sonde par un atome de 32P ou par un nuclotide marqu. Expliquer le principe du squenage dun fragment dADN au moyen dun squenceur et de la technique des dye primers ou des dye terminators ; dcrire et interprter les rsultats3 apparaissant sur lcran de lordinateur aprs un squenage automatique.
1. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern. 2. Expliquer le principe, dcrire ou mimer les gestes ou faire un schma explicatif : prciser le motif de chacun de ces gestes. Etre capable de dceler une erreur qualitative dans la description dun protocole. Au niveau des travaux pratiques, les connaissances techniques thoriques tant acquises, on devra tre capable de passer la manipulation sans avoir apprendre que la partie proprement manuelle. 3. Interpreter les rsultats : partir des donnes affiches par la machine, aprs la validation technique de la squence, savoir dcrire la structure de lacide nuclique squen et reconnatre sur cette squence des lsions molculaires dont linterprtation ne ncessite la leve daucune ambigut.

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Prparation des acides nucliques

Expliquer les principe de la recherche des lments cis-rgulateurs sur la squence dun promoteur (foot printing). Expliquer le principe des ractions permettant le dosage des ARN transcrits : PCR quantitative, protection la Rnase.

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Extraction et purification

Chapitre 7 Extraction et purification

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7.1 Purification des lymphocytes

BG 46 Le prlvement de sang veineux au pli du coude est la technique la plus employe pour obtenir de lADN gnomique. Le sang est recueilli sur EDTA, chlateur des ions divalents, cofacteurs des nuclases. Pour faciliter lextraction de lADN on isole du sang total un culot de cellules nucles, les lymphocytes. Le sang est dabord dpos en gradient de densit dans un tube centrifuger, au-dessus dune couche de polyfluorocarbone liquide (Ficoll ) de densit 1,077. Le plasma flotte au dessus de ce produit car sa densit est de 1,006. Puis on centrifuge ce gradient pendant 25 min 700 g la temprature ambiante. Les lymphocytes et dautres cellules blanches sont recueillies la limite suprieure de la couche de Ficoll, tandis que les autres cellules plus denses ont sdiment au fond du tube. Les lymphocytes sont enfin lavs dans du NaCl 0,15 M et recentrifugs 10 min dans les mmes conditions. Ils forment aprs cette deuxime centrifugation un culot blanc au fond du tube.

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Extraction et purification

7.2 Homognisation des tissus, dprotinisation

BG 47 Lextraction de lADN partir des tissus se fait par broyage dans une presse tissus, suivie dune homognisation dans un tube de Potter. Lhomognat quon obtient est un mlange de dbris de membranes (microsomes), de nombreuses particules subcellulaires (noyaux, mitochondries) et de molcules en solution (cytoplasme). On dissous cet homognat avec une solution de lyse (tampon sans pression osmotique, faisant clater les membranes fermes) en prsence dEDTA et de laurylsulfate de Sodium (SDS) qui inhibent les nuclases. On incube enfin le milieu avec la protinase K, pour dtruire les protines en prsence du dtergent (SDS), la temprature ambiante et pendant toute la nuit.

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Extraction et purification

7.3 Extraction de lADN

BG 48 Les solutions dacides nucliques et de protines issues des prparations prcdentes sont purifies par addition de phnol satur de tampon Tris-EDTA. Aprs agitation douce du mlange, on spare les phases par une centrifugation de 10 min sous 10000 g la temprature de 4C. A la sortie, on distingue une phase aqueuse surnageante contenant les acides nucliques en solution, une phase organique au fond du tube : phnol + lipides et linterface un gateau de protines prcipites. On recueille la phase aqueuse avant de la laver par un mlange de chloroforme (CHCl3) et dalcool isoamylique dans un rapport 24:1 (volume:volume). On recueille nouveau une phase aqueuse contenant lADN en solution et une phase organique (24:1) contenant des restes de phnol, de protines et de lipides.

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Extraction et purification

7.4 Isolation de lARN

BG 49 Pour extraire lARN dun tissu ou dune suspension de cellules, il faut imprativement inhiber toute trace de RNase. Lhomognisation dans le tube de Potter se fait dans un tampon Tris-EDTA en prsence de thiocyanate de guanidinium 4 M et de SDS. Les dbris cellulaires sont sdiments en 10 min 10 C. Le surnageant contenant les acides nucliques est dpos sur un gradient de densit comprenant au fond du tube une solution trs dense de CsCl 5,7 M surmonte dune couche intermdiaire de CsCl 2,4 M. Ce gradient est ultracentrifug durant 24 heures 30000 tours/min la temprature ambiante. On peut alors recueillir un culot dARN de masses molculaires leves qui seront soumis lextraction par le phnol et le chloroforme.

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Extraction et purification

7.5 Techniques de purification (tableau)

BG 50 Il existe de nombreuses techniques de purification des acides nucliques. On peut purifier les ADN par chromatographie dans une colonne de gel en prsence dun dnaturant ou bien par chromatographie dadsorption. Le plus souvent on se contente de multiples prcipitations par lthanol qui suffisent dbarrasser lADN des protines contaminantes et des enzymes.

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7.6 Purification par lthanol

BG 51 La purification dune solution dADN se fait le plus souvent par prcipitations rptes dans lalcool. Une solution dADN, porte haute force ionique par addition de NaCl 3 M (1/10 du volume), est additionne dun large excs dthanol absolu -20C. Au bout de quelques minutes au maximum, on voit apparatre un prcipit blanchtre, translucide et filamenteux (la mduse ) constitu de longs filaments dADN prcipit. On recueille ce prcipit par centrifugation 10000 g pendant un quart dheure environ. Pour laver lADN on resuspend le prcipit dans de lthanol 75 % toujours -20C. puis on centrifuge nouveau. Le culot de cette dernire centrifugation est goutt, puis sch sous vide. On peut conserver lADN sec ou le redissoudre immdiatement soit dans de leau pure strile, soit dans un tampon Tris-EDTA.

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7.7 Purification du RNA-poly(A)

BG 52 Parmi les acides ribonucliques extraits des cellules, la classe la plus tudie est celle des ARN messagers. Ils se caractrisent par la prsence du ct 3-terminal dune longue queue poly(A) synthtise la phase post-transcriptionnelle. On utilisera une chromatographie daffinit entre cette queue poly(A) et une colonne dont la phase fixe est pourvue de fragments doligo(dT) de quelques dizaines de nuclotides qui peuvent shybrider avec les RNA poly(A). Aprs avoir lav la colonne en milieu alcalin (potasse), on charge les RNA totaux haute force ionique (KCl 0,5 M) puis on rince la colonne avec du KCl 0,1 M en surveillant labsorbance de lluat 260 nm pour sassurer de llimination des RNA non retenus par la colonne (rRNA, tRNA,... ). Enfin, on lue la fraction retenue par la colonne en abaissant la concentration de KCl 0,01 M et en levant la temprature. Un micro essai avec la reverse transcriptase permet de sassurer de la qualit de ce RNA poly(A) comme matrice pour la synthse de cDNA.

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Synthse des polynuclotides

Chapitre 8 Synthse des polynuclotides

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8.1 Polymerase Chain Reaction (PCR)

BG 53 La PCR (polymerase chain reaction) permet damplifier spcifiquement une rgion de DNA double brin de quelques centaines de paires de bases. Ce DNA doit dabord tre spar en simples brins (dnaturation 95C). On ajoute au DNA de dpart une large quantit damorces (oligonuclotides synthtiques complmentaires des deux extrmits de la rgion amplifier) qui vont shybrider 50-60C environ avec la squence complmentaire sur chacun des brins de DNA, et les quatre dNTP qui serviront de substrats. On soumet le tout lactivit dune DNA polymrase (Taq polymerase) qui synthtise 72C un brin complmentaire partir du 3OH de lamorce hybride. On obtient quatre brins de DNA. On recommence dnaturer ces 4 brins, puis on les laisse shybrider avec les amorces (toujours en excs) et la polymrase entre en action pour aboutir 8 brins de DNA. On recommence dnaturer ces 8 brins, puis on les laisse shybrider avec les amorces (toujours en excs) et la polymrase entre en action pour aboutir 16 brins de DNA. Et ainsi de suite 30 40 fois, ce qui aboutit 34359738368 brins de DNA (34 milliards), ce qui reprsente une quantit suffisante pour tudier le fragment de DNA amplifi.

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8.2 PCR (I-1)

BG 53/1 La PCR (polymerase chain reaction) est destine synthtiser un grand nombre de fragments dADN identiques un fragment dintrt afin de pouvoir le caractriser. Ce fragment multiplier est situ dans un ADN gnomique ou dans un cDNA. Il est indispensable que soient connues les squences aussi exactes que possible de deux petits oligonuclotides (20 30 nt) situs aux deux extrmits du fragment dintrt (ct 5 ou amont ; ct 3 ou aval). On synthtise ces oligonuclotides pour servir damorces la raction. Lamorce ct 5 est identique la squence connue en amont. Lamorce ct 3 est antiparallle et complmentaire de la squence connue en aval, cest dire identique celle de lautre brin ce niveau. Pour commencer la raction on dnature lADN en le chauffant 95 plusieurs minutes, pour sparer les deux brins.

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8.3 PCR (I-2)

BG 53/2 Chacune des amorces amont et aval est complmentaire dune squence connue et on peut dterminer la Tm de leur hybridation : ici, 52C pour la squence amont et 54C pour la squence aval. En refroidissant la temprature vers 50C (un peu en-dessous des Tm des deux amorces) les fragments dADN dnatur vont pouvoir shybrider avec des squences complmentaires. La concentration des amorces tant beaucoup plus leve que celle des brins dADN, chaque brin dADN shybridera avec une amorce qui lui est complmentaire. Ainsi le brin du bas, orient 53 de droite gauche, shybridera avec lamorce amont, oriente 53 de gauche droite et le brin du haut, orient 53 de gauche droite, shybridera avec lamorce aval, oriente 53 de droite gauche.

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8.4 PCR (I-3)

BG 53/3 A 95C durant la phase de dnaturation, puis 50 C durant la phase dhybridation, la Taq polymrase tait inactive parce que trop loigne de sa temprature optimale dactivit (75 80C). En remontant la temprature 72C, lenzyme commence son activit. Comme toutes les DNA polymrases elle ncessite un ADN double brin avec une extrmit 3OH rentrante pour initier la polycondensation des dsoxyribonuclotides, elle lit le brin modle de 3 vers 5 et elle construit le nouveau brin de 5 vers 3 qui se prolonge autant quil existe un brin complmentaire pour servir de modle. Le nouveau brin dADN est form partir de lamorce amont (ct 5) et se prolonge vers la droite (ct 3). Lautre brin dADN est form partir de lamorce aval (ct 5) et se prolonge vers la gauche (ct 3). La synthse nest limite que par le temps dincubation (environ 1000 nuclotides par minute).

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8.5 PCR (II-1)

BG 53/4 Au cours de la phase dlongation chacun des brins du fragment dintrt a t rpliqu une fois, la nombre de copies a donc doubl. Le deuxime cycle commence par la phase de dnaturation pendant laquelle on dnature nouveau lADN en le chauffant 95 plusieurs minutes, pour sparer les deux brins dorigine des brins nouvellement synthtiss.

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8.6 PCR (II-2)

BG 53/5 Les brins dADN nouvellement synthtiss ont rpliqu le fragment dintrt et aussi la squence complmentaire de lamorce qui le suit. En refroidissant la temprature vers 50C (un peu en-dessous des Tm des deux amorces) les fragments dADN dnatur et les fragments dADN nouvellement synthtiss vont pouvoir shybrider nouveau avec les amorces. Ainsi les brins orients 53 de droite gauche shybrideront avec lamorce amont, oriente 53 de gauche droite et les brins orients 53 de gauche droite shybrideront avec lamorce aval, oriente 53 de droite gauche.

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8.7 PCR (II-3)

BG 53/6 La Taq polymrase, thermorsistante, a t inactive mais pas dnature durant la phase de dnaturation de lADN. En remontant la temprature 72C, lenzyme recommence donc son activit. Elle catalyse la polycondensation des dsoxyribonuclotides, qui se prolonge autant quil existe un brin complmentaire pour servir de modle. Le nouveau brin dADN form partir de lamorce amont (ct 5) et se prolonge vers la droite (ct 3). Lautre brin dADN form partir de lamorce aval (ct 5) et se prolonge vers la droite (ct 3). Sur les brins dADN (en jaune) synthtiss partir des amorces au cycle prcdent, la synthse sera limite au ct 5 de lamorce oppose, faute de modle pour poursuivre. Seul le fragment dintrt sera rpliqu sur ces nouveaux fragments.

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8.8 PCR (III-1)

BG 53/7 Au cours de la prcdente phase dlongation chacun des brins dADN contenant la squence du fragment dintrt a t rpliqu une fois, la nombre de copies a donc encore doubl. A chaque cycle ce nombre doublera nouveau et lamplification se poursuit comme la suite des puissances de 2 : 22, 23, 24, 25, 26, 27,... la fin du 35me cycle, il y aura 235 copies soit plus de 34 milliards de copies ! Le cycle suivant commence par la phase de dnaturation pendant laquelle on dnature nouveau lADN en le chauffant 95 plusieurs minutes. A ce stade, il reste encore les deux ADN de dpart, quelques ADN limits par une seule des squences amorces et les squences, de plus en plus nombreuses, limites par les squences des deux amorces.

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8.9 PCR (III-2)

BG 53/8 En refroidissant la temprature vers 50C (un peu en-dessous des Tm des deux amorces) les fragments dADN dnatur et les fragments dADN nouvellement synthtiss vont pouvoir shybrider nouveau avec les amorces. Ainsi les brins orients 53 de droite gauche shybrideront avec lamorce amont, oriente 53 de gauche droite et les brins orients 53 de gauche droite shybrideront avec lamorce aval, oriente 53 de droite gauche.

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8.10 PCR (III-3)

BG 53/9 En remontant la temprature 72C, lenzyme recommence encore son activit. Elle catalyse la polycondensation des dsoxyribonuclotides, qui se prolonge autant quil existe un brin complmentaire pour servir de modle. Le nouveau brin dADN form partir de lamorce amont (ct 5) et se prolonge vers la droite (ct 3). Lautre brin dADN form partir de lamorce aval (ct 5) et se prolonge vers la gauche (ct 3). Sur les brins dADN (en jaune) synthtiss partir des amorces au cycle prcdent, la synthse sera limite au ct 5 de lamorce oppose, faute de modle pour poursuivre. Seul le fragment dintrt sera rpliqu sur ces nouveaux fragments. Le nombre de copies de lADN dorigine avec une seule amorce-limite va continuer crotre arithmtiquement et le nombre de copies avec deux amorces-limites continuera crotre exponentiellement, jusqu ce que ces dernires, soient pratiquement pures dans lADN amplifi final.

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8.11 Nested-PCR

BG 54 Les amorces spcifiques sont essentielles dans les techniques de PCR car elles seules vont dterminer le fragment amplifier. Lorsquil existe des squences homologues cette spcificit nexiste plus et la technique doit tre modifie pour mieux cibler le fragment amplifier. On utilise deux couples damorces. Des amorces externes dont la spcificit peut permettre damplifier la fois un petit nombre de squences homologues et des amorces internes permettant damplifier spcifiquement une des squences rvles par le couple damorces externes. Cette technique dite de nested-PCR (PCR niche) se pratique comme la PCR avec le couple damorces externes pour dix cycles damplification. A cette tape on ajoute un excs dune ou de deux amorces internes avant de prolonger lamplification pour encore 25 cycles environ. Cette procdure permet le plus souvent dobtenir lamplification spcifique dun seul fragment.

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8.12 Phosphoramidites : dA-3-support protge

BG 55 La synthse des oligonuclotides se fait sur la phase fixe dune colonne parcourue par un flux de liquide contenant successivement les ractifs ncessaires. Contrairement ce qui se passe dans la nature, la synthse chimique des oligonuclotides se fait de 3 vers 5. Sur les particules solides de la colonne est fix au dpart un nuclotide qui sera le dernier de la squence synthtiser (extrmit 3OH terminale). Ce nuclotide est li par sa fonction alcool secondaire en 3 une fonction amine du support, par lintermdiaire dun acide succinique pour permettre la libre rotation de lensemble par rapport au support. Pour permettre de diriger la synthse le nuclotide terminal a toutes ses fonctions bloques par des radicaux empchant les ractions prmatures ou parasites : radical dimthoxytrityl (DMTr), pour lalcool primaire en 5 du dsoxyribose acide benzoque, pour les fonctions amines de ladnine ou de la cytosine acide isobutyrique pour la fonction amine de la guanine.

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8.13 Phosphoramidites : dtritylation

BG 55/1 Avant de faire la liaison du deuxime nuclotide (qui sera lavant-dernier de loligonuclotide final) on enlve le radical DMTr qui protge lextrmit 5OH du nuclotide de dpart. Cette dtritylation est obtenue en faisant passer sur la colonne une solution dacide trichloractique (TCA) qui hydrolyse la liaison ther entre le DMTr et la fonction 5OH du dsoxyribose.

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8.14 Phosphoramidites : addition dun nuclotide

BG 55/2 Laddition dun nouveau nuclotide est faite en chargeant la colonne dune solution contenant le nouveau nuclotide avec des fonctions protges : par le DMTr pour la fonction 5OH par les ractifs (benzoate, isobutyrate) protgeant les fonctions des bases azotes le phosphore li la fonction alcool en 3 est un phosphoramidite dont la fonction amine est substitue par deux radicaux isopropyl et la fonction acide par un radical mthyl. En prsence de ttrazole, le nouveau nuclotide charg voit sa liaison phosphoamide hydrolyse et la fonction acide ainsi apparue va estrifier la fonction alcool dprotge du dernier nuclotide prcdemment fix la colonne. La liaison phosphodiester 35 est cre mais le phosphore est encore rduit (trivalent).

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8.15 Phosphoramidites : blocage des supports

BG 55/3 Toutes les fonctions alcool primaires de la colonne peuvent ragir avec les fonctions acides libres par le ttrazole. En principe, seules les fonctions 5OH terminales du dernier nuclotide li la colonne ont t dprotges et peuvent ragir de la sorte. Le rendement de cette raction est presque total (> 99 %). Afin quaucune erreur de squence ne soit possible par la suite, on passe de lanhydride actique sur la colonne pour bloquer nouveau les fonctions alcool estrifiables qui par accident nauraient pas t lies au phosphoramidite ltape prcdente. Les oligonuclotides qui nauraient pas ragi avec le nouveau nuclotide sont ainsi carts dfinitivement de la suite du cycle de synthse.

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8.16 Phosphoramidites : oxydation

BG 55/4 Le phosphore trivalent de la liaison phosphodiester est ensuite oxyd par liode en phosphore pentavalent (phosphate). La seule fonction acide de ce phosphate non lie aux dsoxyriboses reste bloque par le radical mthyl. La colonne porte maintenant un nuclotide de plus dont les fonctions sont bloques. Lintroduction du nuclotide suivant sera prcde de la dprotection de la fonction alcool primaire en 5, prsentement bloque par un DMTr, et le cycle recommence : addition dun nuclotide, blocage des supports, oxydation, dprotection, etc, autant de fois quil faudra de nuclotides pour complter la squence demande.

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8.17 Phosphoramidites : dprotection

BG 55/6 Lorsque le dernier cycle de synthse a eu lieu, loligonuclotide est encore li la colonne par son extrmit 3 et toutes ses fonctions ractives sont protges. Afin de donner au produit la structure dun ADN normal, on dprotegera progressivement : acide trichloractique pour dprotger la fonction 5OH initiale, thiophnol pour transformer les phosphotriesters en phosphodiesters en enlevant les groupes mthyl, ammoniaque concentre 25 C pour dtacher loligonuclotide de son support et enlever une partie des radicaux actyl de protection, le reste des radicaux actyl et les radicaux benzoyl sont dtachs par lammoniaque concentre 55 C.

Le produit final est habituellement purifi sur colonne ou dans un gel pour liminer les produits de synthses incompltes.

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Synthse des polynuclotides

8.18 Synthse dun cDNA

BG 56 La manipulation et ltude des RNA est difficile cause de leur grande sensibilit aux ribonuclases qui les dtruisent. Il est ncessaire de recopier la squence en DNA pour quelle soit plus stable et quon puisse lamplifier en fonction des besoins. Le mRNA purifi (chromatographie daffinit sur une colonne doligo-d(T)) est li dans un premier temps avec des oligonuclotides poly(T) qui sattachent la queue poly(A). A partir de lextrmit 3 de cette amorce poly(T) la transcriptase rverse, qui est une DNA polymrase, synthtise un brin de DNA complmentaire du messager de dpart. Une fois cette synthse acheve on dgrade le RNA par une base forte ou par une ribonuclase spcifique. Le brin de DNA fabriqu forme spontanment son extrmit 3 une boucle en pingle cheveux en shybridant sur lui-mme. Lextrmit 3 de cette boucle va servir de site de dmarrage pour la DNA polymrase qui va synthtiser un brin de DNA complmentaire du premier. Une nuclase spcifique du DNA simple brin supprimera la boucle de lextrmit. Le cDNA double brin est prt. On peut ainsi constituer autant de cDNA quil existe de messagers dans une cellule : lensemble de ces cDNA forme une banque de cDNA .

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8.19 Sondes de cDNA amplifi

BG 56/1 On peut effectuer directement la synthse biologique dune sonde partir dun ARN messager, isol dans la fraction des RNA-poly(A). Dans une premire tape, une amorce oligo d(T) est hybride avec les squences poly(A) des ARN messagers et la transcriptase rverse permet la synthse dun cDNA. Dans la seconde tape, une amorce spcifique permet de synthtiser le second brin dun cDNA correspondant lamorce choisie. Enfin, la PCR permettra damplifier les deux brins dADN jusqu lobtention dune quantit suffisante de la sonde. Au cours de cette PCR on peut marquer la sonde avec un nuclotide radioactif ou biotinyl. Si la spcificit de lamorce nest pas suffisante, une seconde paire damorces spcifiques permettra dobtenir la squence recherche (nested-PCR).

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8.20 Structures secondaires

BG 56/2 Les amorces synthtises prsentent parfois dans leur structure primaire des zones complmentaires qui shybrident en formant des boucles ou pingles cheveux (hair pin loops). Lorsque ces structures sachvent par une extrmit 3OH rentrante elles forment des sites de dmarrage pour la polymrase. Lenzyme synthtise alors des fragments parasites partir des amorces qui peuvent aller jusqu une taille double de celle des amorces hybrides. Des logiciels permettent de prvoir ces structures pour les viter.

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8.21 Synthse des queues poly(dN)

BG 57 La synthse dune queue poly(dN) est catalyse par la transfrase terminale en prsence de cations divalents : Mg++, Mn++, Co++ LADN allonger doit prsenter une extrmit 3 sortante ou dfaut un bout franc. Cest pourquoi il est utile de le digrer dabord avec une enzyme de restriction comme Kpn I ou Pst I (bouts 3 sortants) ou dfaut comme Pvu II (bouts francs). Lion Co++ permet la condensation prfrentielle du dCTP, donc la synthse de queues poly(dC).

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Chapitre 9 Caractrisation des acides nucliques

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9.1 Principaux oligonuclotides

BG 58 On synthtise des oligonuclotides pour de multiples techniques : des petits oligonuclotides de 6 nt pour le random priming ; des amorces de 20 30 nt pour la PCR ; des amorces modifies pour la cration des sites de restriction ou pour la mutagnse dirige ; des sondes enfin de 30 nt quelques kilobases pour servir de sondes dans les Southern blots.

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9.2 Spectres UV des bases nucliques

BG 59 La plupart des molcules biologiques contenant des noyaux aromatiques absorbent les rayons ultraviolets diffrentes longueurs donde. Dans lultraviolet de trs courte longueur donde presque toutes les solutions de molcules biologiques sont opaques. Dans la rgion dmission des lampes vapeur de mercure (254 nm) les bases puriques et pyrimidiques ont des pics dabsorption spcifiques quon utilise pour comparer avec les spectres dabsorption des acides amins aromatiques dans la mme rgion. Sur ce graphe les ordonnes reprsentent labsorption de la lumire transmise en fonction des longueurs donde reprsentes en abscisse. Les zones dabsorption des quatre bases stalent de 240 280 nm de sorte que les acides nucliques forms de ces quatre types de nuclotides ont un maximum dabsorption 260 nm.

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9.3 Spectre UV des acides amins

BG 60 Les radicaux aromatiques de certains acides amins (Phe, Tyr, et surtout Trp) ont la proprit dabsorber la lumire ultraviolette. Sur ce graphe les ordonnes reprsentent labsorption de la lumire transmise en fonction des longueurs donde reprsentes en abscisse. Labsorption 280 nm est due principalement aux noyaux phnols des tyrosines, parce que cet acide amin est plus frquent que le tryptophane, qui est pourtant beaucoup plus opaque cette longueur donde. Labsorption de la lumire UV 280 nm est caractristique des protines et sert doser ces protines lorsquelles sont en solution dans leau et quil nexiste pas dautres molcules absorbant la lumire UV cette longueur donde (acides nucliques par exemple).

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9.4 Dosage des acides nucliques

BG 61 Pour effectuer par spectrophotomtrie directe le dosage dune solution pure dacides nucliques, on utilise labsorbance des rayons ultraviolets 260 nm. On considre dans les calculs quune mole de nuclotides polycondenss reprsente 309 grammes. Il faut se placer autant que possible dans des conditions standard de mesure : cuve de 1 cm, solution 1 M (309 mg/ mL), temprature ambiante, [Na+] 0,3 M, rapport A260/A280 1,80. Dans ces conditions le coefficient dextinction de lADN double brin est de 6200 A260.M1.cm-1, cest dire quune unit dabsorbance 260 nm (A ) reprsente 50 g/mL. 260 Au cours de la fusion de lADN, le coefficient dextinction de la solution slve (hyperchromicit). Dans ces conditions le coefficient dextinction de lADN simple brin est de 8350 A260.M1.cm-1, cest dire quune unit dabsorbance 260 nm (A ) reprsente 37 g/mL. 260 Dans ces conditions le coefficient dextinction de lARN est de 7700 A260.M-1.cm-1, cest dire quune unit dabsorbance 260 nm (A260) reprsente 40 g/mL.

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9.5 Electrophorse des acides nucliques

BG 62 Les fragments dun DNA digr par une enzyme de restriction comme Hha I, sont des anions et si on les soumet dans un gel un champ lectrique, ils migrent vers le ple positif (anode) une vitesse dautant plus grande quils sont de taille plus petite. On place dans un des puits de dpt des fragments de DNA de tailles connues pour servir de marqueurs de taille. On ajoute dans les dpts deux colorants : un bien visible sur le gel qui va migrer trs rapidement avant les fragments de DNA pour limiter la distance parcourue au bord de lanode ; un autre, le bromure dthidium qui se fixe spcifiquement au DNA quelle que soit la squence et qui met une fluorescence mauve lorsquon lclaire avec des rayons ultraviolets. On examine le gel sous lumire ultra-violette 254 nm et on photographie les fragments dADN digr.

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9.6 Sonde nuclique (dfinition)

BG 63 Une sonde est un marqueur quon introduit dans un milieu biologique pour que ses proprits vis--vis des constituants de ce milieu soient rvles par lmission dun signal dtectable par nos instruments de mesure. Les oligonuclotides sont employs comme sondes parce quils peuvent shybrider spcifiquement avec une squence dun acide nuclique dans un milieu biologique. Lorsquelles sont marques (atomes radioactifs, biotine, fluorochromes) leur prsence dans le milieu peut tre suivie. Aprs lavage du milieu pour liminer les oligonuclotides non-hybrids avec le matriel biologique, la prsence du marqueur rvle les hybrides forms et permet de mettre en vidence la squence reconnue par la sonde. Cette technique sapplique des coupes de tissus (hybridation in situ), des clones bactriens transfects de vecteurs recombins (criblage des banques), etc...

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9.7 Hybridation dune sonde

BG 64 Un fragment de DNA double brin affecte normalement une structure secondaire en double hlice. En levant la temprature jusqu la Tm, on disjoint 50 % environ des liaisons hydrogne qui unissent les brins dADN, ce qui dnature partiellement la double hlice. Lorsque la temprature atteint 95C. toutes les liaisons hydrogne sont rompues et la dnaturation de lADN est complte : ADN simple brin, qualifi de dnatur . Au cours de la dnaturation, le coefficient dextinction de lADN 260 nm augmente (hyperchromicit). En refroidissant brutalement (glace) les structures secondaires ne se reforment pas et lADN reste dnatur. Si on refroidit doucement, la double hlice se reforme progressivement. Un oligonuclotide (sonde) ajout ce moment peut shybrider avec un fragment complmentaire de lADN, ds que la temprature descend en-dessous de Tm. Lhybridation dune sonde marque (atomes radioactifs, radicaux fluorescents ou ligands spcifiques) sur un ADN dnatur permet de marquer spcifiquement tous les fragments de cet ADN dont la squence est complmentaire de la sonde.

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9.8 Calcul de la Tm

BG 65 Il est possible de mesurer directement la temprature de fusion dun ADN double brin en mesurant laugmentation de labsorbance de la solution 260 nm en fonction de la temprature. Toutefois, on se contente la plupart du temps dune estimation partir de la composition de loligonuclotide. Si celui-ci a une longueur gale ou infrieure 20 nt on compte 2C par couple A:T et 4C par couple G:C. A partir de N = 20, on corrige dun multiplicateur proportionnel la longueur au del de ce chiffre : 1 + [(N-20)/20]. Pour tre plus prcis il faut tenir compte aussi de la concentration en sodium du tampon dhybridation. Lorsque cette concentration nexcde pas 1M, on utilise la formule : Tm = 81,5 + 16,6(log10[Na+]) + 0,41[(G+C)/N] - (600/N) Lorsquil existe des misappariements (mismatches) il faut soustraire de la Tm calcule autant de degrs C. que le pourcentage de squence non-apparie de loligonuclotide. Lorsquon travaille en prsence de formamide, il faut encore diminuer la Tm en fonction de la concentration de lamide : Tm = Tm-0,6(% formamide)

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9.9 Southern blot

BG 66 Le Southern blot est une technique mise au point par Edward M. Southern en 1975 pour rechercher des fragments de DNA sur une lectrophorse en les hybridant avec une sonde complmentaire. 1. Aprs avoir digr le DNA par une enzyme de restriction, on obtient un mlange de trs nombreux fragments de restriction. On soumet ces fragments un lectrophorse pour les faire migrer dans un gel de haut en bas en fonction inverse de leur taille. On fait un montage pour faire passer les fragments grce une monte de tampon imprgnant le gel puis une membrane de nylon o le DNA va se fixer par des liaisons stables. La membrane de nylon avec le DNA fix est alors mise incuber dans un sac contenant une solution dune sonde radioactive complmentaire du fragment de DNA quon recherche, une temprature assez basse pour que lhybride se forme mais assez leve pour que cet hybride soit parfaitement complmentaire. On lave la membrane des molcules de la sonde qui ne sont pas fixes leur DNA complmentaire, puis on la met en prsence dun film radiographique vierge dans une enceinte opaque pour que la sonde radioactive fixe sur les fragments de DNA complmentaires impressionne le film. On rvle le film o des taches noires (sur le ngatif) correspondent aux emplacements o ont migr les fragments dADN complmentaires de la sonde. On compare les distances de migration avec des fragments de DNA radioactifs de tailles connues qui servent

2. 3.

4.

5.

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de marqueurs de taille.

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9.10 Drpanocytose (anmie falciforme)

BG 67 La drpanocytose ou anmie falciforme est une maladie des globules rouges qui sont dforms par une cristallisation anormale de lhmoglobine. Cette cristallisation rsulte dune substitution AT dans le sixime codon. Cette substitution sexprime par une mutation Glu6Val de la chane de la globine. Llectrophorse de lADN du gne HBB, qui code pour la chane des globines est rvle par deux sondes : lune spcifique de la squence normale, lautre de celle de la protine mute. LADN dun sujet est rvl par la seule sonde normale sil possde deux gnes HBB normaux (homozygote normal), par la seule sonde de la protine mute sil possde deux gnes HBB responsables de la mutation (homozygote mut) et par les deux sondes sil possde un gne normal et un gne de la protine mute (htrozygote). Les sujets homozygotes muts sont atteints danmie falciforme et sujets des crises graves. Les sujets htrozygotes sont porteurs du trait drpanocytaire , ils nont que peu de troubles mais ils transmettent le gne leurs descendants.

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9.11 Marquage : nick translation

BG 68 Le dplacement de brche (nick translation) est une technique de marquage utilisant les proprits de la DNA polymerase I (E. coli), pour obtenir des sondes radioactives. Louverture dune brche dans la structure primaire dun des deux brins dun fragment dADN est obtenue par laction de la dsoxyribonuclase pancratique. La DNA polymrase synthtise un nouveau brin dADN partir de lextrmit 3OH terminale dun cot de la brche ainsi cre. Simultanment lactivit 53 exonuclase de la DNA pol I hydrolyse les nuclotides du cot 5-phosphate de la mme brche. Il en rsulte un dplacement de la brche le long de lADN avec un remplacement des nuclotides du brin coup. Si cette opration est ralise en prsence de nuclotides substrats fortement marqus, le marqueur sera incorpor dans le DNA synthtis. Pour viter la formation de structures en pingles cheveux, la synthse doit tre maintenue trs lente une temprature basse : 16 C

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9.12 Marquage : random priming

BG 69 La synthse dun brin marqu de DNA peut aussi tre faite par une DNA polymrase partir damorces contenant des squences alatoires. Ces amorces sont obtenues par synthse chimique doligonuclotides contenant au hasard chacune des quatre bases chaque position. On peut aussi utiliser un produit de digestion pousse dun ADN gnomique rduit en fragments alatoires de 6 12 nuclotides. Dans les deux cas, un ou plusieurs des oligonuclotides shybrident avec la squence en 5 du fragment dintrt (ADN simple brin) et servent damorces pour la synthse dun deuxime brin. Si cette opration est ralise en prsence de nuclotides substrats fortement marqus, le marqueur sera incorpor dans le DNA synthtis.

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9.13 Marquage : terminal transferase

BG 70 La transfrase terminale catalyse laddition de dsoxynuclotides sur une fonction alcool 3OH terminale de lADN. Lenzyme prfre les molcules dADN dont lextrmit 3OH est sortante, mais il existe des conditions qui favorisent la catalyse sur lADN bouts francs, voire sur les extrmits 3OH rentrantes. Elle incorpore plus spcifiquement les purines ou les pyrimidines en fonction du cation divalent quon lui donne comme cofacteur : Mg++ pour les purines, Co++ pour les pyrimidines ou encore Mn++. La transfrase terminale du commerce est extraite du thymus de veau. Une unit denzyme catalyse le transfert de 17 picomoles de dsoxyribonuclotide par minute 37 C. La transfrase terminale est utilise au laboratoire pour : construire des squences polymrises de nuclotides (queues) lextrmit 3OH de lADN (en vue du clonage des fragments dADN) ; marquer les extrmits 3 de lADN avec un nuclotide marqu sur le phosphate ; ajouter un nuclotide la fin dune squence pour induire une mutation (mutagnse dirige).

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9.14 Marquage : polynuclotide kinase

BG 71 La polynuclotide kinase catalyse le transfert du phosphate de lATP sur une fonction alcool du carbone 5 dun ADN ou dun ARN. Le substrat requiert une dphosphorylation pralable si la fonction est estrifie. Lenzyme catalyse aussi lchange du phosphate 5 terminal dun ADN ou dun ARN avec le phosphate de lATP, en prsence dADP comme accepteur de phosphate. La polynuclotide kinase du commerce est extraite dune bactrie (E. coli) infecte par le bactriophage T4. Une unit denzyme catalyse le transfert de 33 picomoles de phosphate par minute 37 C. La polynuclotide kinase est utilise au laboratoire pour incorporer du phosphate radioactif (32P) sur lextrmit 5 dun acide nuclique, soit par transfert, soit par change.

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9.15 Didsoxyadnosine triphosphate

BG 71/5 Le didsoxyadnosine triphosphate (ddA) est un nuclotide compos de synthse. Sa structure est dpourvue de fonction alcool en 3. Analogue structural de nuclotide, le ddA est utilis comme inhibiteur de la rplication (DNA polymrase). Labsence de fonction alccol en 3 empche toute condensation avec le nuclotide suivant. Cette inhibition est principalement utilise pour le squenage des DNA.

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9.16 Raction de squence

BG 71/6 Pour lire la squence dun DNA simple brin on hybride une amorce du ct 3 de ce DNA. Puis on effectue avec une DNA polymrase la synthse dun brin complmentaire. Pour cette synthse on apporte comme substrats les quatre dsoxyribonuclosides triphosphates (dATP, dCTP, dGTP et dTTP). En plus une trs petite quantit de didsoxyribonuclosides triphosphates fluorescents (ddATP-JOE, ddCTP-5-FAM, ddGTP-TAMRA et ddTTP-ROX). La polymrase choisira le plus souvent un dsoxyribonucloside normal et la synthse se poursuivra jusqu ce quelle incorpore un didsoxyribonucloside fluorescent. A ce stade le brin en cours de synthse na plus dextrmit 3-OH et la raction de polycondensation ne peut plus se poursuivre. Le didsoxyribonuclotide incorpor en dernier est fluorescent et met sous lexcitation une lumire verte pour JOE (ddAMP), bleue pour 5-FAM (ddCMP), jaune pour TAMRA (ddGMP) et rouge pour ROX (ddTMP). A chaque lettre de la polycondensation un petit nombre de molcules sont ainsi arrtes et marques de la fuorescence correspondant au dernier nuclotide incorpor. En sparant ces molcules par lectrophorse en fonction de leur taille on peut lire les lettres successives qui apparaissent comme des zones sur llectrophorgramme dont la fuorescence correspond la base de ce dernier nuclotide.

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9.17 Squenage de lADN

BG 72 Pour connatre la squence des ADN, on fait synthtiser un brin dADN par une enzyme spcifique. Lenzyme commence son travail partir de lextrmit 3 dune sonde hybride qui sert damorce. Elle ajoute des nuclotides complmentaires de ceux du brin dADN quelle copie. On lui donne pour substrats des dsoxynuclotides triphosphates normaux mlangs avec des didsoxynuclotides dont la fonction alcool secondaire en 3 est rduite ce qui empche la synthse de se poursuivre au del. Les didsoxynuclotides incorpors en dernier sont marqus spcifiquement par des molcules fluorescentes (vert pour didsoxyA, bleu pour didsoxyC, jaune pour didsoxyG et rouge pour didsoxyT). On spare ensuite les fragments synthtiss dans un champ lectrique (lectrophorse : les ADN sont des anions, ils vont donc vers le ple +), en fonction de leur longueur (les plus petits vont plus vite). On lit ensuite les taches successives, identifies par leur couleur, ce qui rvle la squence des fragments synthtiss.

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9.18 Squenage : dye primers

BG 73 La raction de squenage est une technique de synthse de DNA analogue la PCR. On utilise des amorces marques (dye primers) ou des nuclotides marqus (dye terminators). Pour squencer ce fragment de 244 nt on utilisera quatre amorces diffrentes pour chacun des deux brins dADN : la premire amorce lie au fluorochrome JOE (vert) se termine par une squence complmentaire de lextrmit 3 du brin du dessus ; elle sera incube avec le tampon, la DNA polymrase, les quatre dNTP et en addition une quantit plus faible du didsoxynuclotide ddATP (nuclotide dont les carbones 2 et 3 du ribose nont plus de fonctions alcool). Lincorporation de ce dernier va interrompre la synthse de faon alatoire mais toujours au niveau dun A de la squence. la deuxime amorce marque ROX (rouge) sera arrte par du ddTTP la troisime amorce marque 5-FAM (bleu) sera arrte par du ddCTP la quatrime amorce enfin, marque par TAMRA (jaune) sera arrte par du ddGTP.

Tous les fragments synthtiss seront mis ensemble dans une lectrophorse qui les sparera en fonction de leur masse molculaire donc du nombre de nuclotides et on enregistrera la couleur de lamorce qui indiquera spcifiquement les fragments se terminant par chacun des quatre didsoxyribonuclotides. La squence de ces couleurs indique la squence de lADN : vert pour A, rouge pour T, bleu pour C et jaune pour G. On contrle enfin la squence obtenue par celle obtenue avec des amorces shybridant avec

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le brin du dessous, cette seconde squence devant tre antiparallle et complmentaire de la premire.

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9.19 Squenage : dye terminators

BG 73/1 La raction de squenage est une technique de synthse de DNA analogue la PCR. On utilise des amorces marques (dye primers) ou des nuclotides marqus (dye terminators). Pour squencer ce fragment de 244 nt on utilisera une seule amorce spcifique pour chacun des deux brins dADN et complmentaire de lextrmit 3 de ce brin. Elle sera incube avec le tampon, la DNA polymrase, les quatre dNTP et en addition une quantit plus faible des quatre didsoxynuclotides ddATP (li au fluorochrome JOE = vert), ddCTP (li au fluorochrome 5-FAM = bleu), ddGTP (li au fluorochrome TAMRA = jaune) et ddTTP (li au fluorochrome ROX = rouge). Lincorporation de ces didsoxynuclotides marqus va interrompre la synthse de faon alatoire mais toujours au niveau de la lettre correspondante de la squence. Tous les fragments synthtiss seront mis dans une lectrophorse qui les sparera en fonction de leur masse molculaire donc du nombre de nuclotides et on enregistrera la couleur du fluorochrome qui indiquera spcifiquement les fragments se terminant par chacun des quatre didsoxyribonuclotides marqus. La squence de ces couleurs indique la squence de lADN : vert pour A, rouge pour T, bleu pour C et jaune pour G. On contrle enfin la squence obtenue par celle obtenue avec une amorce shybridant avec le brin du dessous, cette seconde squence devant tre antiparallle et complmentaire de la premire.

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9.20 Gel de squence

BG 73/2 En utilisant des amorces spcifiques, on fait synthtiser un brin complmentaire du DNA lire, en prsence dune faible proportion de didsoxyribonuclotides marqus dun radical fluorescent diffrent pour chaque base. La DNA polymrase lorsquelle a incorpor un tel didsoxyribonuclotide ne peut plus continuer la synthse faute dextrmit 3OH libre. Il se forme donc une multitude de brin complmentaires inachevs, chacun termin par un didsoxyribonuclotide fluorescent caractristique de la base de ce dernier nuclotide. En sparant par lectrophorse ces fragments complmentaires on spare dans le gel chacun des fragments, du plus petit au plus grand et on les dtecte au passage par un faisceau laser qui excite la fluorescence et une cellule photolectrique qui lit la lumire mise chacune des longueurs donde des fluorescences caractristiques des quatre bases. Lordinateur reoit donc une srie de mesure dintensit lumineuses en forme de pics correspondant au passage de chacun des fragments : en interprtant la couleur de la fluorescence de chaque pic lordinateur crit la squence de lADN complmentaire.

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9.21 Squenage : image du gel

BG 74 Le gel de squenage est un gel de polyacrylamide trs fin dans lequel migrent des fragments dacides nucliques incolores, marqus leur extrmit 3 par un didsoxynuclotide fluorescent (ddN*). Le laser met une lumire dexcitation qui passe travers le gel et les ddN* excits rmettent une lumire dune longueur donde plus grande spcifique de chaque ddN*, qui sera lue par une camra quatre longueurs donde diffrentes, chacune spcifique dun des quatre didsoxynuclotides. La camra enregistre donc en fonction du temps lintensit de la lumire mise par le gel dans les quatre longueurs donde. Afin de permettre de suivre la progression de llectrophorse sur lcran, lordinateur construit une image virtuelle du gel : le gel y est reprsent avec des taches de couleurs diffrentes pour les quatre ddN* (vert pour A, jaune pour G, bleu pour C et rouge pour T) et dintensit proportionnelle la lecture du gel. Cette image virtuelle est assez longue pour reprsenter toute llectrophorse ; les fragments les plus rapides qui sont depuis longtemps passs dans la cuve de lanode, sont toujours visibles en haut de limage pendant que le bas de limage reprsente les fragments qui parviennent rellement au mme moment lendroit du gel o se fait la lecture. Cette image permet de guider (tracking) la lecture du trac de chaque puits de dpt, mme si celui-ci na pas migr dans le gel en parfaite ligne droite.

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9.22 Squenage : analyse de limage

BG 74/1 La lecture des fluorescences permet de tracer quatre courbes de couleur sur un mme graphe visibles en mme temps et indiquant la densit optique de la lumire mise par le gel chaque longueur donde spcifique dun des quatre ddN*, en fonction du temps de migration qui est proportionnel la longueur des fragments qui migrent. Les fragments successifs apparaissent comme autant de pics qui se succdent, le suivant ayant toujours un nuclotide de plus que le prcdent. Lordinateur interprte alors chacun de ces pics en fonction de la longueur donde et donne le rsultat sous forme dune squence qui scrit au dessus du graphe. Dans une autre fentre de lcran la squence obtenue peut-tre aligne avec les autres squences du mme gne lues sur le mme gel ou dj enregistres comme squences de rfrence. Sur cet exemple, le pointeur de la souris dsigne un moment de llectrophorse o sont passs successivement deux pics reprsents en bleu, donc deux C sur la squence. Le squenage a t fait sur les deux brins de lADN et les squences obtenues sont identiques. Lalignement de ces deux squences avec une squence de rfrence fait apparatre (position 410) que cette dernire est TCTCTT, alors que les squences lues sur le gel sont TCTCCT. Il y a donc une substitution TC.

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9.23 Squenage : analyse de limage

BG 74/2 On rencontre parfois dans un squenage deux pics superposs de couleurs diffrentes, ce qui cre une ambigut que lordinateur traduit par un N sur la squence. Dans cet exemple, on voit la mme position un pic bleu et un pic rouge, donc un C ou un T. LADN gnomique qui a t dpos provient dun gne htrozygote et chacun des deux gnes du mme locus porte lun un C et lautre un T, de sorte quaprs amplification on obtient 50 % damplicons avec chacun de ces nuclotides. Pour distinguer les deux gnes de chaque locus htrozygote, il faut auparavant faire un clonage spcifique qui permet de namplifier quun seul des deux amplicons de ces deux gnes.

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9.24 Promoteur : foot printing

BG 75 Dans lanalyse de la squence des promoteurs, il est important de pouvoir caractriser les squences des lments cis-rgulateurs. Des fragments de lADN du promoteur sont amplifis par PCR et marqus. Ces fragments sont incubs en prsence dun extrait de noyaux (nucloplasme) des cellules qui expriment le transcrit situ en aval de ce promoteur. Cet extrait contient les protines capables de se lier lADN (DNA binding proteins) parmi lesquelles se trouvent les lments trans-rgulateurs. Au cours de cette incubation la liaison entre les lments trans- et cis- stablit. LADN ainsi protg par les lments trans- est soumis une digestion douce par la DNase I en prsence dions Ca++. La raction est stoppe avec de lEDTA et lADN ainsi digr est rextrait (dprotinis) et la longueur des fragments est analyse par un squenceur. Les fragments amplifis ont t digrs au hasard par la DNase mais aucune coupure na pu se faire dans les squences protges de la DNase par les protines nuclaires. Sur lanalyse les fragments se terminant dans ces zones ayant fix les protines, napparatront donc pas. Sur limage du gel des plages noires (traces de pas = foot prints) marqueront les parties de la squence qui ont fix des protines et sont donc probablement cis-rgulatrices.

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9.25 Dosage dARN : PCR quantitative

BG 76 Pour mesurer lexpression dun gne dans une cellule, on doit doser le taux du messager correspondant dans le cytoplasme. Ce taux dpend de la rgulation de la transcription, mais aussi de la dure de vie du messager. Les diffrents mRNA sont amplifis par une RT-PCR qui donne des cDNA dont les taux relatifs sont quivalents ceux des mRNA qui ont servi de modles. Afin de mesurer spcifiquement un messager prcis on construit un DNA identique ce messager, reconnaissable aux extrmits par les mmes amorces, mais prsentant une dltion au centre de la squence le rendant plus court que le cDNA rechercher. Dans une srie de PCR on introduit le cDNA doser, le DNA comptitif des taux croissants pour faire une gamme de dosage, les amorces communes aux deux DNA et les autres facteurs pour la raction. Dans llectrophorse qui suit, les cDNA amplifis de concentration inconnue migrent moins que les DNA comptitifs de concentrations connues pour chaque puits. Les concentrations restant proportionnelles au cours de la PCR, la concentration du cDNA doser est celle qui correspond la concentration du DNA comptitif dans le tube o les deux taches de BET sont dintensits gales. Pour pouvoir comparer les dosages des mRNA on fait en mme temps (comme talon interne) le dosage du mRNA dun gne dexpression ubiquitaire et dexpression constante, par exemple actine ou facteur TFIID.

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Caractrisation des acides nucliques

9.26 Dosage dARN : protection la RNase

BG 77 Pour dtecter et doser un mRNA connu parmi les RNA-poly(A) dun tissu, on peut faire une hybridation spcifique avec une sonde marque. La sonde est un RNA complmentaire du messager rechercher. Elle peut tre construite partir dun mRNA connu dont le cDNA, aprs RT-PCR, a t clon dans un phage. Linsert sens sert de modle une T3 RNA polymrase qui va synthtiser un RNA antisens complmentaire du mRNA de dpart. Cette sonde antisens sera marque (radioactive). 100 g de RNA-poly(A) du tissu o la squence est rechercher sont incubs avec cette sonde dans des conditions dhybridation lente en milieu liquide. Il se forme des hybrides RNA:RNA entre le mRNA recherch et la sonde antisens. Le milieu hybrid est alors incub avec un mlange de ribonuclases toutes spcifiques du RNA simple brin, de telle sorte que seuls les hybrides forms avec la sonde peuvent rsister cette digestion. Le produit de digestion est ensuite dprotinis et repurifi, avant dtre analys par lectrophorse. Les RNA hybrides marqus sont dtects par autoradiographie.

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Caractrisation des vnements gntiques

Partie III Caractrisation des vnements gntiques


Dcrire et interprter les rsultats danalyse (sur un exemple emprunt au cours, aux T.P. ou votre exprience personnelle) dune lsion molculaire conduisant une expression anormale du gne considr : mutation faux-sens, non-sens, dcalage du cadre de lecture, protine tronque, Expliquer les tapes (sur un exemple emprunt au cours, aux T.P. ou votre exprience personnelle) des techniques ayant permis : un diagnostic gnotypique, une analyse gnique ou une empreinte gntique : RFLP, carte de restriction, haplotypes, squenage.

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Mutations

Chapitre 10 Mutations

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10.1 Polymorphismes de restriction

BG 78 Les polymorphismes de longueur des fragments de restriction (Restriction Length Fragment Polymorphism = RFLP) sont des techniques simples pour analyser la squence des acides nucliques. Dans une squence amplifie par PCR partir du gne du rcepteur des LDL, comme celle (148 pb) reprsente ci-dessus, on trouve des sites de restriction : par exemple Hae III (gg/cc). En digrant les amplicons par cette enzyme on peut distinguer les ADN ayant ce site ( llectrophorse deux fragments : 35 et 113 pb) de ceux ayant une squence diffrente au niveau de ces quatre nuclotides (pas de coupure, un seul fragment de 148 pb). Si le prlvement provient dADN gnomique, les squences amplifies partir des deux chromosomes homologues peuvent tre diffrentes (htrozygotie avec trois fragments : 35, 113 et 148 pb). Les polymorphismes sont frquents dans la population : pour celui-ci il y a 77 % qui ont ce site Hae III (squence sauvage ) et 23 % qui ne lont pas. On peut aussi rechercher par cette technique des mutations, par dfinition beaucoup plus rares que ces polymorphismes.

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10.2 Polymorphisme Msp I de lapoA-II

BG 78/1 Le Southern blot permet la dtection des polymorphismes de longueur des fragments de restriction (RFLP ou restriction fragments length polymorphism). Il existe un polymorphisme dans le gne de lapolipoprotine A-II. Ce polymorphisme altre la squence du site reconnu par lenzyme de restriction Msp I situ en aval du gne, de telle sorte que 19 % des sujets (anglais) ne prsente pas de site de restriction cet endroit. Lorsquon digre lADN gnomique de plusieurs individus choisis au hasard on obtient des fragments de taille diffrentes entre chaque point de coupure par lenzyme. Aprs lectrophorse pour sparer ces fragments en fonction de leur taille et transfert sur une membrane, on hybride les fragments sur la membrane avec une sonde complmentaire des exons de lapoAII puis on fait lautoradiograhie de la membrane pour rvler ces fragments. La plupart de ces sujets (81 %) qui possdent trois sites de coupure autour du gne donnent un fragment de 3000 paires de nuclotides (3,0 kb). Dautres sujets, plus rares (19 %) qui ne possdent pas le site de restriction ont un fragment plus grand = 3700 paires de nuclotides (3,7 kb). Le sujet dont lADN a t dpos dans llectrophorse au n3 est dans ce cas. Il arrive quun sujet porte un allle du type frquent sur un chromosome et lautre allle sur lautre chromosome. Il est alors htrozygote pour le polymorphisme et llectrophorse (n4) on voit les deux fragments rvls par la sonde.

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10.3 Haplotypes

BG 78/2 Lorsquune maladie se transmet hrditairement dans une famille et que le gne responsable de cette maladie est unique et parfaitement identifi, les symptmes rvlent la prsence dau moins un allle mut chez les personnes atteintes. Dans un grand nombre de familles le lien direct des symptmes avec une mutation connue du gne en cause nest pas clairement tabli. Dans ces cas l, on cherche identifier lallle li la maladie par des marqueurs gntiques qui caractrisent les diffrents allles du gne : polymorphismes, microsatellites de longueur variable, ... Un seul de ces marqueurs nest pas suffisant pour reprer exactement chaque allle, puisque plusieurs allles peuvent avoir un marqueur en commun. Mais en associant plusieurs marqueurs on arrive caractriser de faon prcise chacun des allles transmis dans la famille jusqu ce quun de ces allles apparaisse comme exactement li lapparition de la maladie. Les allles ainsi caractriss par plusieurs marqueurs gntiques sont appels des haplotypes. Sur ce tableau sont indiqus les principaux haplotypes du groupe de gnes des apolipoprotines du chromosome 11, caractriss par quatre polymorphismes de restriction (Taq I, Msp I, Pst I et Sst I) situs de 5 en 3 dans un des deux brins de ce groupe de gnes. La prsence (+) o labsence (-) de chaque site de restriction est indique : ainsi un allle caractris par la prsence des 3 premiers sites et labsence du site Sst I est prsent chez 45 % des sujets de cette population, alors que celui qui ne possde que le seul site Msp I nest retrouv que chez 9 % des sujets.

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10.4 Cartes de restriction

BG 79 Les marqueurs gntiques peuvent aussi caractriser les ADN responsables des maladies hrditaires grce aux cartes de restriction. LADN du malade est digr par de nombreuses enzymes de restriction isolment ou associes entre elles. Les fragments de restriction sont reconnus par une sonde spcifique du gne responsable de la maladie. Il en rsulte un grand nombre de fragments possibles dont les longueurs (en kilobases) sont mesures par lectrophorse cot dun marqueur de masse molculaire. Ainsi, le DNA dun malade atteint dune dyslipoprotinmie et celui dun tmoin sain ont t digrs par BamH I : le sujet sain montre un seul fragment long de 11,65 kb reconnaissable par la sonde du gne de lapoA-I, alors que lADN du malade en montre deux de 7,5 et 10,25 kb. Le fragment BamH I du sujet tmoin peut encore tre digr par dautres enzymes donnant chaque fois deux fragments (Dde I) ou trois (Hind III) ou quatre (Pst I). Les fragments peuvent tre compars comme les morceaux dun puzzle pour obtenir une carte des emplacements des sites de restriction sur lADN. La mme carte, chez le sujet malade, montre les mmes sites de restriction aux deux extrmits du fragment BamH I, mais il apparat une insertion de 6 kb au milieu du gne de lapoA-I avec des sites nouveaux : BamH I, EcoR I, Pst I non retrouvs chez le tmoin. Cette insertion est responsable dune absence dexpression de lapoA-I ce qui se traduit par une dyslipoprotinmie.

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Chapitre 11 Expression

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11.1 Vecteur (dfinition)

BG 80 Un vecteur est un transporteur capable de conduire une molcule pntrer dans une cellule alors quelle nest pas capte spontanment par cette cellule. Les vecteurs sont principalement tudis pour transporter des mdicaments dans un type dtermin de cellules de lorganisme dun malade, tout en mettant ce mdicament labri des enzymes de dtoxification du sujet. En biologie molculaire, certains vecteurs sont tudis pour faire entrer un acide nuclique dans une cellule et permettre la rplication ou lexpression de cet acide nuclique dans la cellule qui le reoit. Les plasmides bactriens, les bactriophages et de nombreux virus sont des vecteurs naturels permettant la transfection de diffrents types de cellules-htes. Dautres vecteurs encore plus performants ont t obtenus artificiellement partir de ceux-l grce des manipulations gntiques.

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11.2 Cellules-htes

BG 81 Les cellules qui sont habituellement transfectes par des vecteurs contenant des fragments dADN, sont destines permettre damplifier ce vecteur en mme temps que leur croissance. Des bactries comme Escherichia coli sont utilises pour recevoir des plasmides. Certaines souches de cette espce sont plus particulirement dveloppes pour permettre la transfection de certain vecteurs : souche DH5 pour les plasmides pUC18 ou pUC19, HB 101 pour le plasmide pBR322, souche JM 109 dpourvue dopron lactose pour les vecteurs -galactosidase. Des levures comme Saccharomyces cerevisiae (levure de bire) ou Pichia pastoris sont utilises pour des vecteurs eucaryotiques, ainsi que des vgtaux : Spodoptera frugiperda ou Trichoplusiani. Les cellules animales en culture du hamster dor : CHO (Chinese hamster ovaries) ou BHK (baby hamster kidneys) ou de la souris : ligne 3T3 peuvent recevoir des vecteurs spcifiques. Certaines lignes de cellules humaines en culture (cellules HeLa) peuvent aussi tre employes. Certains vecteurs sont employs pour exprimer des gnes commands par des promoteurs spcifiques : promoteur des mtallothionnes, rpondant la prsence de mtaux lourds (Cd par exemple) ou promoteur induit par lecdysone (hormone strode des Insectes).

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11.3 Cycle du phage

BG 82 Le gnome du bactriophage dans les particules virales est reprsent par un ADN doublebrin de 48,5 kb, dont les extrmits sont cohsives entre elles (bouts collants). Le virus entre dans les cellules bactriennes par un rcepteur (lamB) qui sert normalement au transport du maltose. Lexpression de ce rcepteur est induite par le maltose et rprime par le glucose. Ds quil pntre dans la bactrie, lADN du phage se circularise par hybridation de ses extrmits et la DNA ligase de la bactrie achve de fermer les brches. Lvolution se poursuit dans deux directions diffrentes en fonction des promoteurs activs de lADN du phage. La plupart du temps, lexpression des premiers gnes dclenche la rplication intense de lADN du phage et lexpression de protines permettant la synthse de particules virales. La bactrie meurt, clate et libre environ 200 nouvelles particules virales (cycle lytique). Beaucoup plus rarement, le promoteur activ au dpart transcrit le gne cI, qui rprime le cycle lytique et commande la transposition de lADN du phage dans le chromosome de la bactrie o il reste peu exprim (prophage), mais rpliqu chaque division de la cellule-hte (cycle lysognique). Une lvation de la temprature dclenchera nouveau lexcision du prophage et sa rplication comme dans le cycle lytique.

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11.4 Phage

BG 83 LADN du phage est un ADN linaire de 48502 paires de nuclotides. Aux deux extrmits les brins sont ingaux mais leurs squences sont complmentaires (bouts collants) de telle sorte que lADN du phage peut devenir circulaire. Les gnes transcrits partir de cet ADN sont dsigns par des lettres de lalphabet : de A J du ct 5 terminal et de N R dans la partie 3 terminale. Il existe plusieurs promoteurs activs dans le cycle lytique : R1 qui transcrit de 5 vers 3 les gnes O Q, R2 qui transcrit de S J lorsque lADN est circulaire et que les brches ont t rpares, ou bien dans le cycle lysognique les promoteurs L1 et L2 qui transcrivent sur lautre brin les gnes de la partie centrale. Le gnome du phage ( gt10) peut tre modifi en supprimant le gne du represseur du cycle lytique dans la partie centrale, ce qui favorise la rplication du phage, et en ajoutant le gne de la -galactosidase aprs le gne J ( gt11)

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11.5 Clonage (I)

BG 84 Un plasmide est utilis pour insrer un ARN messager spcifique. Une extrmit bouts francs a t prolonge par une queue poly(dT) grce la terminal transfrase. Cet oligo(dT) en shybridant avec la queue poly(A) du messager, fournit un site dinitiation une DNA polymrase pour synthtiser un cDNA complmentaire du messager initial. A lextrmit 3OH de ce fragment, une nouvelle queue poly(dC) est encore ajoute par une terminal transfrase. Le montage est alors digr par Hind III qui hydrolyse un site lautre extrmit du plasmide (digestion). On prpare aussi un chanon de ligation pourvu dune queue poly(dG) par la terminal transfrase et digr de lautre ct par Hind III. En incubant ensemble ces deux fragments dADN on forme un ADN circulaire (annalisation) par hybridation des deux extrmits Hind III et des queues oligo(dC) et oligo (dG). LADN circulaire ainsi obtenu sera enfin incub avec la DNA ligase pour fermer les deux brches du site Hind III et la liaison entre lextrmit 3 de la queue poly(dC) et le chanon intermdiaire (ligation).

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11.6 Clonage (II)

BG 84/1 On est alors en prsence dun ADN circulaire comportant droite la squence du plasmide dont le site Hind III a t referm et une insertion comprenant un mRNA (en vert) entre la fin de loligo(dG) et la fin de la queue poly(A) et le DNA complmentaire (cDNA, en jaune) entre le dbut de loligo(dT) et la fin de loligo(dC). LARN insr est alors digr par la RNase H, spcifique des hybrides RNA:DNA. Cette digestion cre une brche qui sera comble par une DNA polymrase et enfin ferme par la DNA ligase. On obtient alors un plasmide fonctionnel dADN circulaire dans lequel est insr un ADN double brin correspondant la squence du messager. Ce plasmide est utilis pour transfecter une souche comptente de bactries-htes auxquelles il confre un gne de rsistance lampicilline. La culture de cette bactrie, en prsence de lantibiotique, permet de rcuprer une grande quantit de cet ADN circulaire qui peut tre utilis ensuite pour caractriser, squencer ou exprimer la squence clone du messager de dpart.

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11.7 EMBL

BG 85 Les phages EMBL3 et EMBL4 sont aussi des phages modifis. Leur ADN fait 42364 paires de bases. Des emplacements spcifiques ont t prpars dans ces phages pour pouvoir y introduire des fragments dADN amplifier. Pour EMBL3, un de ces emplacements se situe aprs le gne J et comprend les uns la suite des autres trois sites de restriction : Sal I, BamH I et EcoR I ; lautre emplacement se situe sur le brin antiparallle et comprend les mmes sites de restriction. Pour EMBL4 lorganisation est la mme mais les sites de restriction sont dans lordre inverse : EcoR I, BamH I et Sal I. Lintrt de tels sites est de permettre lincorporation dun ADN en contrlant le sens de la transposition. Imaginez un fragment dADN limit dun cot par Sal I et de lautre par EcoR I. En digrant le phage par les mmes enzymes puis en recombinant le phage avec ce fragment dADN on obtiendra une transposition dans un sens pour EMBL3 et dans lautre sens pour EMBL4 (clonage directionnel).

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11.8 Polylinker

BG 86 Lavantage de ce clonage directionnel ne peut tre obtenu quavec des sites de restriction uniques et bien placs dans le fragment dADN quon veut transposer dans le vecteur. Afin de disposer dun maximum de possibilits, on construit des vecteurs dits de clonage, qui comportent des domaines riches en sites uniques de restriction et placs dans lordre inverse pour chaque paire de vecteurs. Ces domaines permettant des liaisons sur de multiples sites sont appels polylinkers . Ainsi la paire de plasmides M13mp18 et M13mp19, comporte dans leur structure des domaines forms de lassociation successive de dix sites de restriction dans un sens et dans lautre.

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11.9 Clonage directionnel

BG 87 Linsertion dun fragment dADN dans un polylinker permet dorienter le fragment par rapport au vecteur et dobtenir par exemple le squenage dun fragement dans chaque sens. Supposons un fragment dADN double brin digr successivement par les enzymes Sal I et BamH I de telle faon que les extrmits soient cohsives (bouts collants de chacun de ces sites de restriction). On utilise pour faire le clonage une paire de vecteurs pourvu dun polylinker dans un sens pour le vecteur 1 et en sens inverse pour le vecteur 2. Lors de la recombinaison le fragment dADN vient sinsrer dans un sens sur le vecteur 1 et dans lautre sur le vecteur 2. Aprs la croissance bactrienne on dispose de colonies nayant un insert que dans un seul sens. Grce des amorces spcifiques de lADN du vecteur on peut alors squencer le brin dADN spcifiquement dans le sens o il est insr. Cette technique est utilise principalement pour effectuer le squenage des gnes sur les deux brins, la squence antiparallle et complmentaire permettant de contrler la squence dun premier brin.

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11.10 Carte du plasmide pBR322

BG 88 Le plasmide pBR322 est un ADN circulaire double brin de 4361 paires de bases. Par convention le nuclotide n1 est situ au milieu du site de restriction EcoR I en direction du gne tetr. Il contient un origine de rplication (2535), un gne de rsistance la ttracycline (tetr 861276) et un gne de rsistance lampicilline (ampr 4153-3293). Le gne ampr code pour une protine (-lactamase) de 286 acides amins capable de cataboliser cet antibiotique. Le plasmide contient de nombreux sites de restriction rpartis sur toute la squence. Beaucoup de ces sites sont uniques, permettant de transformer lADN circulaire en ADN linaire. Exemple, le site BamH I (position 375) au dbut du gne tetr. La digestion par BamH I permet de recombiner le vecteur avec un fragment de digestion par BamH I dun ADN cloner. La ligase du bactriophage T4 permet de recirculariser lADN du plasmide. Les cellules transfectes avec un tel plasmide recombinant feront la rplication du plasmide au cours de leur croissance. Elles nexpriment plus le gne tetr, mais restent rsistantes lampicilline ce qui permet de les slectionner et disoler lADN du plasmide ainsi clon.

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11.11 Carte des plasmides pUC18/19

BG 89 Les plasmides pUC18 et pUC19 sont des ADN circulaires double brin de 2696 paires de bases (pb). Ils ont t construits par recombinaison dun fragment de pBR322 (2250 pb) et dun fragment de M13 double brin (446 pb) : M13mp18 pour pUC18 et M13mp19 pour pUC19. LADN issu de pBR322 contient le gne ampr qui permet la slection par la rsistance lampicilline. LADN issu de M13 contient le promoteur du gne lacZ suivi dune squence modifie comprenant un polylinker (voir BG 86, section 11.8 page 155) et la squence de la partie NH2 terminale du gne de la -galactosidase. Cette squence est indispensable pour que la bactrie hte puisse faire la raction de cette enzyme (phnomne d-complmentation, voir BG 44 section 6.1 page 74). Le polylinker, hydrolys par une des enzymes de restriction, peut recevoir une squence dADN lie par recombinaison. Dans ce cas, lexpression du peptide complmentaire de la galactosidase est interrompue et la bactrie ne pourra plus digrer le X-Gal, ce qui lempchera de prendre la couleur bleue caractristique. Les colonies rsistantes lampicilline et de couleur blanche sont donc transfectes par le vecteur recombinant.

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11.12 Cycle de M13

BG 90 Le bactriophage M13 est un phage dont la forme libre est constitue dune membrane entourant un ADN simple brin de 6,4 kilobases. La transfection des bactries par M13 et lexpression du virus dpendent de la prsence dun chromosome surnumraire bactrien (pisome F) : la prsence de cet pisome permet le cycle normal du phage : synthse dun brin dADN complmentaire, rplication et en fin de cycle synthse spcifique dun seul des deux brins de lADN (brin +) qui sera pourvu dune membrane et scrt hors de la cellule. Lorsque lpisome ne contient pas les gnes permettant ce cycle (pisome F), lADN du phage sincorpore sous la forme dun ADN double brin capable dexprimer les gnes quil contient ou quon a insr dans sa structure, par exemple la -galactosidase. Les bactries avec lpisome F sont des varits commercialises pour permettre lexpression des gnes clons dans le phage M13. Le phage M13 existant sous la forme dun ADN simple brin, il est possible dy insrer des brins dADN dun gne particulier prsent ltat htrozygote chez lhomme : dans ce cas chaque phage ne peut insrer quun seul des deux allles et les deux allles se retrouvent dans des colonies spares.

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11.13 Carte du M13

BG 90/1 Le bactriophage M13 est constitu dun ADN simple brin. On a construit des vecteurs en introduisant dans la squence une forme tronque du gne de la -galactosidase dEscherichia coli (gne LacZ). Lensemble a une longueur de 7249 paires de bases (pb). Le gne lacZ code pour la partie NH2 terminale du gne de la -galactosidase. Cette squence (peptide de complmentation) est indispensable pour que la bactrie hte puisse faire la raction de cette enzyme (phnomne d-complmentation, voir BG 44 section 6.1 page 74). Les codons 5 18 de ce gne lacZ forment dans M13mp18 un ensemble de squences spcifiques denzymes de restriction (sites de restrictions dans lADN double brin) quon nomme polylinker ou site de clonage multiple. Dans M13mp19 les mmes sites de restriction se trouvent dans lordre inverse. Le polylinker, hydrolys par une des enzymes de restriction, peut recevoir une squence dADN lie par recombinaison. Dans ce cas, lexpression du peptide complmentaire de la galactosidase est interrompue et la bactrie ne pourra plus digrer le X-Gal, ce qui lempchera de prendre la couleur bleue caractristique. Les colonies rsistantes lampicilline et de couleur blanche sont donc transfectes par le vecteur recombinant.

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Le gnie gntique

Partie IV Le gnie gntique


Rappel des objectifs Dfinir1 les termes suivants : vecteur, clonage, polylinker, plasmide. Dcrire les tapes de linsertion dun fragment dADN dans un plasmide. Expliquer les tapes (sur un exemple emprunt au cours, aux T.P. ou votre exprience personnelle) des techniques ayant permis : une mutagnse, la transposition dun gne dans une bactrie, la cration dun animal ou dune plante transgnique. Expliquer le principe de la construction dun vecteur : cet objectif servira tester la facult pour ltudiant(e) de faire une synthse des connaissances de lensemble des chapitres prcedents.

1. Dfinir : prciser dans une phrase concise lessence dun objet ou les limites dun concept en excluant toute notion trangre et en comprenant toutes les variations possibles de lobjet ou du concept cern.

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Mutagnse

Chapitre 12 Mutagnse

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12.1 Cration dun site de restriction

BG 91 Le polymorphisme des fragments de restriction est une des faons les plus simples de mettre en vidence une mutation dans lADN. Mais il arrive que la mutation ne modifie aucun des sites de restriction de lADN du gne. La mutation Arg3500Gln de lapolipoprotine B en est un exemple. Pour permettre lidentification dune telle mutation on va faire lamplification grce des amorces modifies pour crer un polymorphisme parmi les fragments de digestion de lADN amplifi. Pour amplifier le fragment de lapoB on synthtise une amorce (ct 5) complmentaire du brin antisens sauf pour lextrmit 3OH qui est ACCC au lieu de ACAC. Le misappariement entre le C de lamorce et le T du brin antisens nest pas suffisant pour empcher lhybridation et donc la PCR se fait partir de cette amorce : ACCCGGTCTTCA... Il apparat donc dans lADN amplifi un site CCGG reconnu par lenzyme Msp I qui digrera lADN cet endroit. Si lamplification se fait partir de lADN mut : ACCCAGTCTTCA... le site Msp I napparat pas, il ny a donc pas dhydrolyse cet endroit et le fragment digr par Msp I est plus long que dans lADN normal.

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Mutagnse

12.2 Mutagnse par PCR

BG 92 La cration dune mutation artificielle peut tre obtenue dans un gne par le jeu des amplifications partir damorces modifies. On prpare lamplification du gne ou du cDNA grce deux amorces places en amont et en aval de la squence dintrt. On prpare aussi par synthse des oligonuclotides conformes aux squences des deux brins du gne autour du codon qui doit tre modifi mais dont les bases sont volontairement changes pour quelles permettent la synthse dun brin complmentaire comprenant la substitution (ou la dltion...) souhaite. On fait une premire amplification entre chacune des amorces modifies et les amorces des extrmits. En runissant ces deux amplifications et en dnaturant lADN, on conduit une renaturation entre les fragments au niveau des amorces centrales modifies. Cette hybridation fait apparatre des extrmits 3OH do llongation (Taq polymrase) peut se poursuivre jusquaux extrmits de la squence dintrt. La poursuite des cycles en prsence des amorces amont et aval conduit lamplification de cette squence complte dans laquelle le codon mut a t insr.

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Transposition - recombinaison

Chapitre 13 Transposition recombinaison

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Transposition - recombinaison

13.1 Transposition (dfinition)

BG 93 Au cours de lvolution des espces, le gnome sagrandit continuellement par suite de duplications de gnes et de transpositions. Les duplications se produisent en tandem, une squence se trouvant rpte deux fois dans le gnome la suite de la duplication. Cette duplication permet chacune des copies de la squence dvoluer pour son propre compte ce qui augmente les chances de produire des caractres nouveaux. Les transpositions rsultent de lincorporation dacides nucliques synthtiss hors du gnome : soit par incorporation du DNA dun virus, soit par transcription rverse dun RNA de la cellule ou dun virus, au moyen dune transcriptase rverse qui produit un DNA complmentaire (cDNA) et dune transposase qui lincorpore au gnome de la cellule.

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13.2 Protine rec-A

BG 94 La protine recA, expression du gne du mme nom, joue un rle essentiel dans le processus de recombinaison homologue, qui permet la rparation de lADN chez Escherichia coli. La protine recA a pour effet de dissocier les deux brins dun ADN normal pour permettre lexcision dune squence destine complter une brche dun ADN dont les deux brins sont lss irrversiblement. Ainsi au cours de la rplication si un des deux ADN produits est anormal et ne contient plus dinformation, lautre ADN, dissoci par recA, dtachera un de ses brins pour le recombiner avec lautre ADN : de sorte quil y aura de chaque ct un brin porteur de linformation et que les enzymes de rparation pourront complter les deux doubles hlices avec la mme information. Le gne recA est rprim par la protine LexA, mais ds que le taux dADN simple brin augmente dans la cellule, le catabolisme de cette protine LexA provoque lexpression de recA pour permettre la rparation des fragments dADN lss (systme SOS).

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13.3 Transposition (mcanisme)

BG 94/1 La transposition est linsertion dune squence entire dADN, provenant dun ADN viral ou dun ARN cytoplamique rtrotranscrit. Les transposons des virus sont des fragments dADN double brin termins par des squences rptes inverses (la mme squence de 53 dun ct et de 35 de lautre ct). Les rtrotransposons sont obtenus par la transcriptase rverse des rtrovirus partir dARN cytoplamiques : les cDNA obtenus seront transposs dans lADN de la cellule hte. Dans les deux cas lADN du site de transposition sera ouvert par deux brches sur les brins de lADN dcales de dix vingt nuclotides, crant ainsi une coupure brins ingaux. Le transposon va sinsrer entre ces deux extrmits, les vides laisss aux extrmits de lADN de lhte seront combls par la DNA polymrase et les brches restantes lies par la DNA ligase. Ainsi, lADN au niveau dun transposon viral prsente deux rptitions de mme sens en dehors du transposon proprement dit qui est encadr par deux autres rptitions de sens inverse. Au niveau dun rtrotransposon, on rencontre aussi deux rptitions de mme sens en dehors du transposon proprement dit qui est termin par une partie poly(dA:dT) issue de la rtrotranscription de la queue poly(A) de lARN dorigine.

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13.4 Recombinaison simple (mitose)

BG 94/2 Lorsque un brin dADN est ls et quil est impossible pour la DNA polymrase de synthtiser lautre brin, il persiste une lacune. Lexistence dun autre chromosome porteur de la mme information gntique, est une source dinformation pour permettre la reconstitution du gne altr. Une protine de recombinaison (analogue de recA) va permettre lexcision dun des brins du gne sain et la recombinaison du fragment excis avec le gne prsentant une lacune. En mme temps le brin ls sera dtruit par les nuclases. A ce stade il y aura deux gnes porteurs dune information complte sur un seul de leurs brins dADN. Les enzymes de rparation vont alors reconstruire les brins opposs et refermer les brches, ce qui conduit une situation normale. Ce type de rparation nest parfait que pour autant que le gne ls soit le mme sur les deux chromosomes (homozygotie). En cas dhtrozygotie, le fait de reconstituer les deux gnes partir du mme allle peut conduire une perte dhtrozygotie , quelquefois source de pathologies nouvelles pour des affections rcessives donc inapparentes ltat htrozygote.

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13.5 Modle Holliday

BG 94/3 Louverture dune brche dans un brin de DNA et le droulement de la double hlice permet des fragments de DNA simple brin de shybrider de faon anormale. Lexistence de squences homologues sur lautre chromosome de la mme paire peut conduire ce brin libre shybrider avec la squence complmentaire du chromosome homologue (1). Dans ce cas les brches au bout des deux brins changs peuvent tre refermes par la DNA ligase (2). Une telle structure avec entrecroisement de brins de deux DNA homologues est appele structure Holliday (du nom de son dcouvreur en 1964). Cette structure est mobile et lchange peut se propager par glissement de la structure le long des deux hlices en allant dans le mme sens (3). On peut reprsenter la structure Holliday en sparant les hlices en forme de croix. Cela permet de voir quil y a deux faons de sparer les deux hlices : soit en coupant horizontalement (flche rouge) et on obtient alors un change de fragment dADN entre les deux chromosomes (4), soit en coupant verticalement (flche jaune) et on aboutit alors un change complet des ADN des deux chromosomes au del du point de croisement (5).

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13.6 Crossing-over

BG 94/4 Les changes entre chromosomes homologues peuvent conduire des changes de fragments ou des changes de brins entiers de DNA. Au cours de la miose en particulier, de tels changes se produisent frquemment entre les chromosomes dorigine paternelle ou maternelle de telle sorte que les gnes des chromosomes des cellules filles (gamtes) sont une recombinaison htrogne de fragments des deux origines. Le rsultat implique un mlange de caractres hrditaires des deux parents qui constituent le patrimoine du nouvel individu, bien que lhomologie des changes garantisse le maintien de chaque gne sur chaque locus avec un allle (homozygote) ou deux (htrozygote).

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Construction de vecteurs

Chapitre 14 Construction de vecteurs

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14.1 Carte du virus SV40

BG 95 Le virus SV 40 est rpliqu trs activement par certaines cellules eucaryotes. Au bout de 3 ou 4 jours la cellule contient 10000 copies de cet ADN et meurt. Les vecteurs drivs de ce virus permettent donc une expression abondante mais transitoire des gnes quils transportent. Le gnome du virus est un ADN double brin circulaire de 5243 paires de bases (pb). LADN viral est transcrit en un messager prcoce qui par pissage alternatif donne deux antignes T qui sont des facteurs trans-activateurs de la rplication du virus. Aprs la rplication du virus un autre promoteur conduit la transcription des messagers tardifs qui codent pour 3 protines de la capside virale.

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Construction de vecteurs

14.2 Construction dun vecteur

BG 96 Le clonage de la -globine dans un vecteur eucaryote a t dcrit par Mulligan, Howard et Berg (Nature 1979; 277: 108-114). Le DNA du virus SV 40 a t digr partiellement par Hind III, de faon ne produire quune brche la position 1708, qui correspond au site dinitiation de la traduction de la protine virale VP1. Puis le produit a t digr nouveau par BamH I qui na quun seul site en 2469 proche du site poly(A) du messager de cette protine. Le produit est un vecteur dexpression nomm SVGT-5 de 4,2 Kb. Le gne de la -globine du lapin a t isol. On a fait des bouts francs grce la nuclase S1 et la DNA polymrase de E.coli. Sur ces bouts francs on a li avec la DNA ligase de T4, un chainon dADN double brin, bouts francs, de squence CCAAGCTTGG, comportant un site de restriction pour Hind III (chanon Hind III). LADN ainsi construit a t digr par cette enzyme de restriction pour produire des bouts collants Hind III. Le plasmide pBR322 a t galement digr par Hind III en un site unique et le clonage de lADN de globine prpar ci-dessus a t fait dans cette ouverture Hind III. Le plasmide obtenu a servi transfecter des colonies de E. coli K12 (HB 101) quon a fait pousser en prsence dampicilline. On a slectionn ensuite des colonies qui ntaient plus rsistantes la ttracycline : en effet le plasmide recombin pBR322-Gb confre la rsistance lampicilline mais ne confre plus la rsistance la ttracycline. On rcupre linsert amplifi en digrant les plasmides par Hind III et par Bgl II, cette dernire enzyme possdant un site unique la fin de lADN de la -globine. Enfin on a pu recom-

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biner cet ADN de globine avec le vecteur SVGT-5 parce que les bouts collants des enzymes BamH I (g/gatcc) et Bgl II (a/gatct) ont la mme squence.

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Construction de vecteurs

14.3 Vecteurs hybrides

BG 97 La recombinaison de lADN permet de construire des vecteurs artificiels qui associent les proprits des phages et celles dautres vecteurs. Les phagmides sont des constructions associant lADN dun phage et celui dun plasmide bactrien. Pour permettre linsertion de fragments dADN de grande longueur, on utilise des cosmides, construits partir de phage et de plasmides ou bien , dans le cas des cellules eucaryotes, des YAC (Yeast Artificial Chromosome = chromosome artificiel de levure). Lorsque la manipulation comporte le passage dune amplification chez un procaryote suivi dune expression chez un eucaryote, on peut utiliser des vecteurs-navettes capables de transporter linsert dune cellule lautre.

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Transgnse

Chapitre 15 Transgnse

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Transgnse

15.1 Vecteurs de thrapie

BG 98 La gntique molculaire, lorsquelle tudie la pathologie humaine, a bien sr pour objectif de pallier les consquences des lsions gntiques hrditaires et pathognes : cest le domaine de la thrapie gnique. Lorsquun gne nest pas exprim dans les cellules dun individu, on a pour objectif de transfecter ses cellules avec un vecteur qui apportera le gne normal dans un environnement permettant son expression et la rgulation de cette expression. Les vecteurs utilisables pour transfecter des fragments dADN, in vivo chez un malade, sont de plusieurs catgories : des rtrovirus ARN, pourvus dune transcriptase rverse capable de transposer le cDNA de leur gnome dans les chromosomes humains ; des adnovirus ADN, qui font exprimer prfrentiellement leur gnome dans les cellules infectes ; le virus de lherps, maladie bnigne due un virus qui peut servir de vecteur ; des liposomes, sortes de sphres limites par une membrane lipidique artificielle, qui sont capts spcifiquement par certaines cellules, grce des rcepteurs de particules lipidiques.

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Transgnse

15.2 Souris knock out

BG 99 Ltude des fonctions engendres par lexpression dun gne peut se faire en supprimant le gne du patrimoine gntique dun animal dexprience. Une souris ainsi prive du gne de lapolipoprotine B est appele souris knock-out pour le gne apoB (Li-Shin Huang : J.Clin.Invest. 1995; 96: 2152-61). LADN vis pour supprimer lexpression de lapoB est le dbut du gne de cette protine, en particulier les quatre premiers exons qui sont compris dans un fragment EcoR I de 8,5 Kb. On prpare un vecteur (pPNT modifi) qui comprend un promoteur, un gne reporter (thymidine kinase = TK) et un gne de rsistance la nomycine (Nor) et une partie du gne de lapoB (jusqu lexon 4). Ce vecteur est amplifi dans des cellules J1 ES, teste pour la prsence de lactivit thymidine kinase et la rsistance la nomycine. Des ufs fconds de souris, au stade blastocyste (aprs 3,5 jours de dveloppement) sont transfects par le vecteur. LADN du vecteur partiellement homologue du gne de lapoB, va se transposer la place de ce gne sur une longueur de 5,5 Kb, pour donner un gne recombinant dans lequel le gne de rsistance la nomycine a remplac les premiers exons du gne de lapoB. Les ufs sont rimplants dans un utrus de la mre et la gestation se poursuit. Le gne apoB modifi ne sera plus exprim et il en rsultera une absence totale de lipoprotines de basse densit chez les souris qui auront subi cette transposition.

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