Sintesis dan Sifat oligodeoxynucleotides membawa 2-Aminopurine

Di susun oleh : Dina Kartika Yulis 3335090276

FAKULTAS TEKNIK UNIVERSITAS SULTAN AGENG TIRTAYASA 2012

ABSTRAK

Penggunaan

peroxide,kelompokisobutyryl

dan

dimethylaminomethylidene

untuk

perlindungan aminoexocyclic fungsi 2-aminopurine selama sintesis oligonukleotida telah diteliti. Hasil terbaik dalam sintesis diperoleh dengan monomer dari 2-aminopurine dilindungi dengan kelompok isobutyryl. Kata kunci: perlindungan Amino, 2-aminopurine, DNA, mutagenesis, oligonukleotida, solid-fase sintesis

Kata pengantar

Bismilllahirrahmannirrahim Segala puji dan syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT atas rahmat dan karuniaNya sehingga kami dapat menyelesaikan tugas ini yang merupakan tugas dari mata kuliah kimia organik tepat pada waktunya. Pada kesempatan yang berbahagia ini penulis ingin mengucapkan terimakasih kepada seluruh pihak yang telah membantu selama penyusunan dan penulisan makalah ini, Penulis menyadari bahwa terdapat kekurangan dan keterbatasan pengetahuan yang

dimiliki, sehingga tugas ini memiliki banyak kekurangan. Untuk itu penulis mengharapkan masukan berupa saran dan kritik yang membangun demi sempurnanya tugas ini. Penulis berharap semoga laporan tugas ini dapat bermanfaat bagi penulis sendiri serta semua pihak yang membutuhkannya.

Cilegon, Maret 2012

Penulis

Daftar Isi
halaman HALAMAN JUDUL. ABSTRAK. KATA PENGANTAR DAFTAR ISI.. DAFTAR GAMBAR. DAFTAR TABEL.. BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang. 1.2 Rumusan Masalah 1.3 Tujuan Percobaan 1.4 Ruang Lingkup Percobaan BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Oligonukleotida... 2.2 2-Aminopurine... 2.3 Sintesis Oligonukleotida. BAB III METODE PERCOBAAN 3.1 Flow Chart... 3.2 Alat dan Bahan .. 3.3 Prosedur Percobaan..

Daftar Gambar
Halaman Gambar 2.1 2-aminopurine.. Gambar 2.2 Skema sintetis yang digunakan untuk persiapan isobutyryl dilindungi 2-aminopurine phosphoramidite... Gambar 2.3 Skema sintetis yang digunakan untuk penyusunan dukungan solid membawa dimethylformamidine dilindungi 2-aminopurine.

Daftar Tabel
Halaman Tabel 2.1. Suhu lebur (Tm, C) dari kopel Mengandung 2-aminopurine dalam 0,1 M Natrium Fosfat Penyangga. Self-Complemantary Urutan: 5'-LKP XAA TTY GCC-3'..

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Oligonukleotida membawa non-alami basis penting alat untuk penentuan dasar molekul mutagenesis. Selanjutnya, sifat khusus mereka digunakan untuk penentuan struktur asam nukleat dan protein yang mengikat asam nukleat. 2-Aminopurine adalah suatu isomer dari adenin yang gugus amino exocyclic terletak pada posisi 2 bukan posisi 6, dapat membentuk dua ikatan hidrogen pasangan basa dengan timin yang mirip dengan Watson-Crick J: T dasar pasangan. Manfaat dari 2-Aminopurine adalah untuk sebagai menyelidiki struktur asam nukleat dan dinamika. 2-Aminopurine juga dapat membentuk pasangan basa dengan adenin dan sitosin tetapi tidak dengan guanin. Pembentukan 2 aminopurine, sitosin hasil mutasi pasangan basa dalam transisi selama replikasi DNA 1.2 Rumusan Masalah Adapun rumusan masalah dalam percobaaan ini adalah metode yang digunakan pada perbobaan ini dan pengaruh setiap senyawa yang melindungi 2-aminopurine. 1.3 Tujuan Percobaan Adapun tujuan dari percobaan ini adalah mengetahui penyusunan isobutyryl turunan 2aminopurine-2'-deoxyriboside menggunakan Rute sintetis McLaughlin dan membandingkan penggunaan yang Bz (benzoil), Ibu (isobutyryl) dan dimethylaminomethylidene (DMF) melindungi kelompok untuk fungsi amino dari 2-aminopurine.

1.4 Ruang Lingkup Percobaan Adapun ruang lingkup untuk perbobaan ini meliputi variable bebas dan variable terikat, adapun variable bebas dari percobaan ini adalah konsentrasi,suhu,waktu. Sedangkan variable terikat adalah isobutyryl turunan 2-aminopurine-2'-deoxyriboside dan Oligonukleotida

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Oligonukleotida Oligonukleotida adalah polimer asam nukleat pendek, biasanya dengan dua puluh atau lebih sedikit basa. Meskipun mereka dapat dibentuk oleh pembelahan ikatan segmen lagi, mereka sekarang lebih sering disintesis oleh polimerisasi prekursor nukleotida individu. Synthesizer otomatis memungkinkan sintesis oligonukleotida sampai dengan 160-200 basa. Karena oligonukleotida mudah mengikat mereka masing nukleotida komplementer, mereka sering digunakan sebagai probe untuk mendeteksi DNA atau RNA. Oligonukleotida terdiri dari DNA (oligodeoxyribonucleotides) sering digunakan dalam reaksi berantai polimerase, sebuah prosedur yang sangat dapat memperkuat hampir setiap bagian kecil DNA.Ada, oligonukleotida ini disebut sebagai primer, yang memungkinkan DNA polimerase untuk memperpanjang oligonukleotida dan meniru rantai komplementer. Oligonukleotida antisense adalah untai tunggal DNA atau RNA yang komplementer dengan urutan yang dipilih. Dalam kasus antisense RNA mereka mencegah translasi protein tertentu RNA untai utusan dengan mengikat mereka. Antisense DNA dapat digunakan untuk target, khusus pelengkap (coding atau non-coding) RNA. Jika mengikat mengambil tempat ini DNA / RNA hibrida dapat terdegradasi oleh enzim RNase H. 2.2 2-Aminopurine 2-Aminopurine (2-AP) adalah analog adenin terbukti menyebabkan sel untuk memotong bahan kimia dan radiasi penangkapan siklus sel melalui mekanisme yang belum dikenal. 2-AP juga telah ditunjukkan untuk bertindak sebagai inhibitor kinase. Dalam aminopurine 2-: pasangan basa timin, salah satu ikatan hidrogen terjadi dalam alur kecil, bukan di alur utama. Beberapa perbedaan untuk mengkarakterisasi DNA-protein interaksi dan DNA lentur. Karena sifat neon dari 2-aminopurine, nucleobase ini adalah probe lokal berguna untuk mempelajari enzim yang berinteraksi dengan DNA, seperti DNA polimerase, helicases,

methylases DNA dan lain sebagainya. serta dalam studi DNA struktural 2-Aminopurine juga dapat membentuk pasangan basa dengan adenin dan sitosin, tetapi tidak dengan guanin. Pembentukan 2-aminopurine sitosin hasil mutasi pasangan basa dalam transisi selama replikasi DNA. Studi NMR menunjukkan bahwa 2-aminopurine: pasangan basa sitosin mengadopsi geometri pada pH netral dan tinggi.

Gambar 2.1 2-aminopurine 2.3 Sintesis Oligonukleotida Penyusunan oligonukleotida membawa 2-aminopurine pertama kali dijelaskan oleh Eritja dkk. Dalam metode 2-aminopurine-2'-deoxyribonucleotide disiapkan enzimatis dari basa bebas, dan fungsi amino dilindungi dengan kelompok isobutyryl (Ibu) dengan analogi dengan 2'deoxyguanosine (dG). Setelah itu, sintesis dari 2-aminopurine phosphoramidite dilindungi dengan kelompok benzoil (Bz) digambarkan mulai dari dG. Di metode ini dG dilindungi dengan kelompok Bz, dikonversi untuk turunan 6-hydrazino yang berkurang dengan perak(I) oksida. Metode ini mudah skala up. Kelompok Bz adalah juga dipilih untuk perlindungan fungsi 2amino selama sintesis oligoribonucleotides mengandung 2 - aminopurine. Sintesis turunan Ibu dari 2 - aminopurine-2'-deoxyriboside telah dijelaskan oleh pengurangan dari 6-chloroguanosine dan thioguanosine. Selain itu, oligodeoxynucleoside methylphosphonates mengandung 2aminopurine disusun dengan menggunakan basis-labil phenoxyacetyl (PAC) kelompok untuk perlindungan amino fungsi 2-aminopurine. stabilitas yang tinggi menjadi amonia dari turunan Bz dilindungi dari 2-aminopurine, persiapan oligonukleotida mengandung
15

N-2-aminopurine telah

digambarkan menggunakan 2-fluoropurine-2'-deoxynucleoside sebagai nukleosida konversi. Namun, metode ini sulit untuk skala-up karena enzimatik persiapan dari turunan 2fluoropurine.Turunan guanin yang memiliki kelompok hydrazino di posisi 6 dengan oksida

perak.Penyusunan turunan 6-hydrazino dilakukan oleh aktivasi posisi 6 dengan 2,4,6 triisopropylbenzenesulfonyl (TPS) kelompok, diikuti oleh nukleofilik perpindahan dengan hidrazin. Selama reaksi ini, yang 3'-5'-hidroksil dan kelompok dan kelompok 2-amino dilindungi dengan kelompok Bz. Setelah reaksi oksida perak 3'-, 5'-benzoat adalah ester dihidrolisis secara selektif memberikan turunan N-2-benzoylate. Turunan N2-Bz terlalu stabil untuk oligonukleotida sintesis, skema reaksi N2-Ibu-2- aminopurine-2'-deoxyriboside seperti pada Gambar 2.2. Semua reaksi untuk turunan Bz,memberikan produk utama yang baik.Data NMR intermediet sesuai dengan struktur. Para isobutyryl dilindungi intermediet yang stabil di bawah kondisi reaksi. reaktan awal membawa dua kelompok yang dibutuhkan untuk oligonukleotida sintesis yaitu DMT dan kelompok Ibu. Selama pengaktifan posisi 6 dengan TPSCl, yang bebas 3hidroksil dilindungi dengan kelompok trimetilsilil. Namun kehadiran DMT besar dan membuat kelompok di posisi 5 ' dan menbuat reaksi menjadi lambat, dan produk yang dihasilkan rendah. Ibu kelompok hilang selama reaksi dengan oksida perak, karena waktu yand diperlukan lama untuk reaksi ini dan, 5'-O-DMT-2-aminopurine deoxyriboside seperti pada gambar 2.3, diisolasi agar selain turunan 2-aminopurine yang membawa DMT dan kelompok ibu. Senyawa 5 merupakan bahan awal untuk persiapan dari turunan 2-aminopurine membawa kelompok DMF. Ini sebagai kelompok melindungi dari fungsi 2-amino dalam sintesis oligonukleotida dG, Karena lebih labil dibandingkan kelompok ibu.

Gambar 2.2 Skema sintetis yang digunakan untuk persiapan isobutyryl dilindungi 2-aminopurine phosphoramidite

Gambar 2.3 Skema sintetis yang digunakan untuk penyusunan dukungan solid membawa dimethylformamidine dilindungi 2-aminopurine Baru-baru ini phosphoramidite turunan 2-aminopurine membawa DMF kelompok telah ada, reaksi senyawa 5 dengan dimetilformamida dimetil asetal menghasilkan senyawa 6,serta pengolahan dengan anhidrida suksinat. Hemisuccinate yang dihasilkan digabungkan ke kontrol kaca pori yang difungsikan dengan gugus amino. 2-2'-aminopurine deoxyriboside derivatif membawa kelompok DMT pada posisi 5 'yang succinylated yang melekat pada kaca pori kontrol. Stabilitas melindungi yang berbeda dari kelompok ammonia yang bereaksi dengan amonia terkonsentrasi di tempat reaksi untuk mensimulasikan kondisi sintesis oligonukleotida. Sebelumnya reaksi amonia dengan 3% trikloroasetat acid (TCA) solusi untuk menghilangkan 5'-DMT. Setelah itu dengan terkonsentrasi larutan amonia pada suhu kamar selama satu jam untuk menghidrolisis suksinil dan disaring keluar. Solusi dibiarkan pada suhu kamar dan 55 C untuk satu hari.Efisiensi eliminasi diikuti dengan analisis HPLC. DMF kelompok ditemukan kelompok yang melindunginya labil, diikuti oleh kelompok Ibu. Kedua kelompok dapat eliminasi pada suhu kamar meskipun kelompok DMF benar-benar eliminasi dalam 2 jam, sementara kelompok Ibu dibutuhkan 8 jam. Pada standar deprotection kondisi oligonukleotida (55 C,minimal 6 jam) baik Ibu dan kelompok DMF benar-benar dihapus. Akhirnya, kelompok Bz adalah kelompok yang paling stabil, meskipun mungkin eliminasi pada 55 C jika waktu deprotection diperpanjang untuk 1 atau 2 hari. Namun, pada suhu ruangan kelompok Bz telah eliminasi sangat lambat (20% dalam

24jam). Parameter lain yang penting dalam evaluasi dilindungi nukleosida untuk sintesis oligonukleotida adalah stabilitas untuk depurination selama eliminasi dimethoxytrityl. Reaksi samping mungkin penting dengan 2-aminopurine turunan, untuk menganalisis sejauh mana reaksi depurination, dinukleotida mengandung dilindungi 2-aminopurine 5'-TP-3' disusun dengan menggunakan dukungan membawa senyawa 3 (Ibu) dan 5 (DMF). Mendukung dinukleotida diobati dengan 3% TCA solusi dalam diklorometana selama waktu yang berbeda (sampai sampai 7hari) dengan terkonsentrasi amonia. Fase-balik HPLC menunjukkan penampilan produk samping yang ditandai dengan UV spektrometri, enzim pencernaan dan spektrometri massa sebagai produk depurination. Produk ini diukur dalam hubungan dengan dinukleotida mengandung 2-aminopurine oleh membaca UV pada 260 nm. Para dinukleotida membawa DMF dilindungi 2-aminopurine ditemukan menjadi lebih sensitif terhadap depurination (waktu paruh 2 hari) dari dinukleotida mengandung Ibu yang dilindungi 2-aminopurine (38% depurination setelah 7 hari). kelompok DMF lebih mudah untuk eliminasi, tapi, oligonukleotida mengandung 2-aminopurine dengan kelompok Ibu berada di minimal 4 kali lebih stabil untuk depurination dari oligonukleotida membawa 2-aminopurine dengan kelompok DMF. Oligonukleotida Sintesis, Serangkaian diri komplementer dodecamers membawa 2 aminopurine (P) residu P / C: (5'-LKP PAA TTC GCC-3 ');P / A: (5'-LKP PAA TTA GCC-3 '); P / T: (5'-LKP PAA TTT GCC-3 '); dan C / P: (5'-LKP CAA TTP GCC-3') disusun menggunakan Ibu yang dilindungi 2-aminopurine phosphoramidite derivatif.oligonukleotida diperoleh pada hasil yang baik. Selain itu,kinerja DMF dan Ibu yang dilindungi 2-aminopurine phosphoramidites selama kondisi sintesis oligonukleotida dianalisis untuk skala besar sintesis dari urutan singkat mengandung 2-aminopurine. Urutan A (5'-CGT AGP GAT GC-3 ') dipersiapkan dua kali pada 10 mol-besaran. Di sintesis pertama, Ibu yang dilindungi 2aminopurine phosphoramidite digunakan dan dalam sintesis kedua, dmfprotected 2-aminopurine phosphoramidite dari komersial sumber yang digunakan. Efisiensi kopling yang sama untuk baik sintesis (99% per langkah). Kelompok DMT terakhir yang tersisa selama deprotection amonia untuk menggunakan hidrofobik yang kelompok ini untuk mengisolasi urutan full-length dari urutan dipotong oleh fase terbalik HPLC. Setelah yang pertama HPLC pemurnian, perbedaan dalam jumlah panjang oligonukleotida diperoleh. Menggunakan Ibu yang dilindungi phosphoramidite, 363 kepadatan optik (OD) unit pada 260 nm (sekitar 3,6 mol) dari DMToligonukleotida diperoleh saat menggunakan DMF dilindungi phosphoramidite, 156 unit pada

OD 260 nm (sekitar 1,6 mol) dari urutan yang diinginkan adalah terisolasi. Selain itu, puncak ekstra setelah salah satu yang diinginkan DMT-oligonukleotida diamati hanya dalam pemurnian HPLC berasal dari sintesis mana DMF yang dilindungi 2-aminopurine phosphoramidite digunakan. Perbedaan-perbedaan dapat untuk 2-aminopurine depurination dengan

mempertimbangkan sensitivitas yang lebih tinggi dari DMF dilindungi 2 -derivatif untuk asam dijelaskan pada aminopurine. Namun demikian,beberapa reaksi samping lain seperti tidak sempurnanya pembelahan DMF kelompok atau modifikasi dilindungi 2-aminopurine selama capping kondisi atau yodium oksidasi dapat terjadi.Secara keseluruhan, penggunaan kelompok Ibu untuk perlindungan dari 2 -aminopurine tampaknya menguntungkan untuk sintesis skala besar. Berikut ini merupakan table 2.1 Tabel 2.1 Suhu lebur (Tm, C) dari kopel Mengandung 2-aminopurine dalam 0,1 M Natrium Fosfat Penyangga. Self-Complemantary Urutan: 5'-LKP XAA TTY GCC-3 '

BAB III METODE PERBOBAAN

3.1 flow chart

3.2 Alat dan Bahan 3.2.1 Alat yang digunakan Adapun alat yang digungkan adalah oven gelas, coevaporation, kromatografi silika gel, icecooled, Celite, pengadukan magnetik, gelas kimia. Pemanas, spektrofotometer. 3.2.2 Bahan yang digunakan Adapun bahan yang digunakan adalah DCM, CHCl3, NaHCO3, NaCl jenuh, Na2SO4, 2'deoxyguanosine, piridin anhidrat, anhidrida isobutryc, DMAP, 3',5'-O-N2-Triisobutyryl-2'deoxyguanosine, 2,4,6-triisopropylbenzenesulfonyl klorida (TPS),Ag2O, THF, NaI, N2Isobutyryl-9-(-D-2'-deoxyfuranosyl)-2-amino purin 2, tetra hydrofurane, DMAP, anhidrida suksinat, deNaH2PO4, larutan penyangga sodium fosfat 3.3 Prosedur Percobaan Semua reaksi dilakukan dalam oven gelas kering, dibawah suasana nitrogen atau argon, Bahan awal dikeringkan dengan penguapan,pelarut kering yang akan digunakan untuk reaksi. Setelah reaksi selesai, seyawa yang terkonsentrasi hingga kering dan residu dilarutkan dalam DCM atau CHCl3. senyawa organik yang dihasilkan dicuci dengan air 5% NaHCO3 dan NaCl jenuh berair. Fase organik kering (Na2SO4) dan pelarut dibuang. a. 3',5'-O-N2-triisobutyryl-2'-deoxyguanosine 2'-deoxyguanosine (4 g, 14,9 mmol) dikeringkan oleh coevaporation dengan piridin anhidrat. 50 mL anhidrat piridin dan 2,35 g anhidrida isobutryc (14,9 mmol) dan 0,52 g DMAP (4,26 mmol) ditambahkan untuk residu. campuran dipanaskan pada 50 C

sampai 12 jam dan mendingin pada suhu kamar. Kemudian, 30 mL zat NaHCO3 5% air ditambahkan dan campuran diaduk selama 1 jam pada suhu kamar dan dipekatkan untuk kering. Residu dilarutkan dalam CHCl3 dan dicuci mengikuti standar kerja-up dijelaskan di atas. Produk dimurnikan dengan kromatografi kolom (silika gel) dielusi dengan gradien MeOH 0-4% dalam CHCl3. b. 3',5'-O-N2-triisobutyryl-9-(-D-2'-deoxyfuranosyl)-2-aminopurine(1) 3',5'-O-N2-Triisobutyryl-2'-deoxyguanosine diubah ke 3',5'-O-N2-triisobutyryl-9-(-D2' deoxyfuranosyl) -2 -aminopurine mengikuti langkah yang sama dengan untuk turunan benzoil, 3',5'-O-N2-triisobutyryl-2'-deoxyguanosine (6,5 g, 13,7 mmol) direaksikan dengan 2,4,6-triisopropylbenzenesulfonyl klorida (TPS) (27,4 mmol), DMAP (6,85 mmol) dan diisopropylethylamine (54,2 mmol) dalam 85 mL DCM selama 2 jam pada suhu kamar. Kemudian, larutan terkonsentrasi untuk dikeringkan dan turunan TPS diinginkan diisolasi dari reaksi campuran dengan kromatografi silika gel dengan 0-5% metanol gradien di DCM.Hidrazin hidrat (53,6 mmol) ditambahkan ke icecooled solusi dari turunan TPS dalam THF dan campuran dibiarkan bereaksi selama 2 jam pada suhu kamar.Campuran reaksi terkonsentrasi, dilarutkan dalam etil asetat dan dicuci mengikuti langkah kerja-up standar.hydrazino derivatif diisolasi yield 86% oleh silika gel kromatografi dengan gradien MeOH 0-2% pada DCM. Akhirnya, turunan hydrazino (11,2 mmol) adalah dilarutkan dalam 250 ml THF dan dipanaskan sampai mendidih. Ag2O (101,8 mmol) ditambahkan pada larutan dalam 3 porsi setiap 30 menit. Setelah menyelesaikan proses, reaksi itu direfluks selama 2 jam. Kemudian, campuran reaksi adalah terkonsentrasi sampai kering sebelum sampai kerja. yang dihasilkan residu dirawat dengan etil asetat dan 10% air NaI. Campuran disaring melalui Celite dan fase organik itu tertuang. Fase organik dicuci dengan 10% NaI diikuti dengan natrium tiosulfat 10% dan air. Produk dimurnikan dengan kromatografi silika gel dengan gradien MeOH 0-5% di DCM. c. N2-isobutyryl-9-(-D-2'-deoxyfuranosyl)-2-aminopurine(2) Untuk larutan 3',5'-O-2-N-triisobutyryl-9-(-D-2'-deoxyfuranosyl)-2-aminopurine 1 (1,8 g,3,9 mmol) dalam anhidrat piridin (45 mL) dan MeOH (6 ml) didinginkan sampai-20C, 5,4 mL larutan 2 M NaOH yang ditambahkan. Reaksi Campuran diaduk 30 menit pada 20 C. Setelah solusinya adalah dinetralkan dengan Dowex 50W x 4 (pyridinium garam)

sampai pH = 7. Dowex disaring dan dicuci dengan larutan H2O: piridin: MeOH (03:01:01). Para filtrat diuapkan sampai kering dan residu dimurnikan pada kolom silika gel dengan gradien MeOH 0-10% dalam CHCl3. d. 5'-O-DMT-N2-isobutyryl-2-aminopurine-2'-deoxyriboside-3'-O-(N,N-diisopropil)-2cyanoethylphosphoramidite(4) N2-Isobutyryl-9-(-D-2'-deoxyfuranosyl)-2-amino purin 2 (1,2 g, 3,7 mmol) direaksikan dengan DMT-Cl dalam piridin sebagai dijelaskan sebelumnya. DMT-N2-Ibu-9-(-D-2'deoxyfuranosyl)-2-amino purin (3, 860 mg, 2,66 mmol) direaksikan dengan 0,58 ml (2,66 mmol) 2-cyanoethoxy-N, N-diisopropylamino chlorophosphine 1,4 mL (10,64 mmol) diisopropylethylamine. e. 5'-O-Dimethoxytrityl-9-(-D-2'-deoxyfuranosyl)-2-aminopurine(5) Ketika prosedur McLaughlin dilakukan dengan 5'-O-dimethoxytrityl-N2-Ibu-2'-

deoxyguanosine para kelompok Ibu di posisi 2 hilang selama oksidasi perak. 5'-ODMTN2-Ibu-2'-deoxyguanosine (2g, 3,1mmol) dilarutkan dalam DMF dan 0,8 mL hexamethyldisilazane.Setelah 3jam pengadukan magnetik campuran itu terkonsentrasi untuk kekeringan dan DMF sisa dihilangkan oleh diulang penguapan dengan toluena. Minyak yang dihasilkan dilarutkan dalam 30 mL DCM dan direaksikan dengan 2,4,6 triisopropylbenzenesulfonyl (TPS) klorida (6,2 mmol),DMAP (1,55 mmol) dan diisopropylethylamine (11,8 mmol) selama 2 jam pada suhu kamar. Larutan ini dipekatkan sampai kering dan turunan TPS diinginkan diisolasi dari campuran reaksi pada kolom silika gel dielusi dengan sebuah MeOH gradien 0-5% di DCM.Menghasilkan 1,64 g (61%). Untuk sebuah zat yang dingin dari turunan TPS dalam 20 mL tetra hydrofurane, NH2-NH2.H20 (3,2 mmol) ditambahkan dan campuran dibiarkan semalam pada suhu kamar. Reaksi campuran dipekatkan, kemudian dilarutkan dalam etil asetat dan dicuci mengikuti protokol kerja-up standar. hydrazino derivatif diisolasi pada hasil 49% oleh silika gel kromatografi dielusi dengan gradien metanol 0-15% pada DCM. Akhirnya, hydrazino derivatif (0,4 g, 0,67 mmol) dihilangkan dengan Ag2O (0,81 mmol) dan campuran direfluks semalam. Campuran reaksi dipekatkan untuk dikeringkan sebelum bekerja-up. Residu dihilangkan dengan etil asetat dan larutan NaI air 10%. Campuran disaring melalui Celite dan fase organik itu tertuang. Fase organik dicuci

dengan 10% diikuti dengan NaI 10% natrium tiosulfat dan air. Produk dimurnikan pada kromatografi silika gel dielusi dengan MeOH 0-10% gradien di DCM. f. 5'-O-Dimethoxytrityl-N2-dimethylaminomethyliden-9-(-D-2'-deoksi-furanosyl)-2aminopurine(6) Senyawa 5 (100 mg, 0,22 mmol) dilarutkan dalam 2mL dan 0,2 mL DMF (0,24 mmol) N, Ndimethylformamide dimetil asetal ditambahkan. Setelah 48jam pengadukan magnetik, larutan terkonsentrasi untuk dikeringkan dengan hasil 120 mg (91%) dari produk yang diinginkan untuk digunakan pada langkah berikutnya tanpa pemurnian lebih lanjut. Upaya pemurnian silika gel tidak menghasilkan yang diinginkan majemuk. g. DMT-N2 yang dilindungi (Bz, ibu, DMF) -9 - (-D-2'-deoxyfuranosyl)-2-aminopurine derivatif (0,15 mmol) dilarutkan dalam 6 mL DCM kering. Untuk zat ini 23,2 mg DMAP (0,19 mmol) dan 19 mg anhidrida suksinat (0,19 mmol) ditambahkan. Campuran itu diaduk pada suhu ruang selama semalam.kemudian campuran diencerkan dengan DCM dan dicuci dengan 0,1 M deNaH2PO4 pH = 5. Fase organik dikeringkan dan dipekatkan untuk kekeringan. Residu dilarutkan dalam DCM dan kemudian diendapkan pada 50 ml (1:1) campuran heksana dan etil eter. Serta DMT-N2-dilindungi-9-(-D-2'deoxyfuranosyl) -2 aminopurine 3'-O-succinates direaksikan dengan amino-LCAA-CPG (500 , memuat 98 umol / g). nukleosida beban adalah sebagai berikut: N2-Bz: 34 mol / g; N2-Ibu: 52 mol / g; N2-DMF: 48 mol / g. h. Oligonukleotida P / C, P / A, P / T dan C / P dilarutkan dalam larutan penyangga sodium fosfat 0,1 M di berbeda pH. Solusi dipanaskan pada 80 C dan dibiarkan dingin perlahan-lahan sampai 4 C. Spektra serapan UV dan mencair percobaan (Absorbansi vs suhu) dicatat dalam 1 cm jalan panjang sel dengan spektrofotometer, yang memiliki suhu kontroler dengan peningkatan suhu diprogram dari 0,5 deg min-1. Kurva denaturasi termal dijalankan pada duplex konsentrasi 4 M pada 260 nm.