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Introduction :

Les protines sont des macromolcules composes d'acides amins relis par des liaisons peptidiques, prsentent chez les organismes vivants et essentielles leur fonctionnement. Dcouvertes en 1838, les protines sont le principal composant des cellules, reprsentant plus de 50 p. 100 de leur poids sec. Le mot protine vient du grec proteios qui signifie premier . La forme des protines est trs variable : elle va des longues fibres prsentes dans les tissus conjonctifs et les cheveux aux globules compacts et solubles capables de traverser la membrane des cellules Outre leur rle dans la croissance et l'entretien des cellules, les protines sont galement responsables de la contraction des muscles. Les enzymes digestives sont des protines, de mme que l'insuline et la plupart des autres hormones, ainsi que les anticorps du systme immunitaire et l'hmoglobine. Les chromosomes, qui transmettent toutes les caractristiques hrditaires sous forme de gnes, sont constitus d'acides nucliques et de protines (histones).

La membrane plasmique est la membrane qui entoure toutes les cellules, procaryotes (bactries) ou eucaryotes. Elle est constitue d'une double couche de phospholipides o sont insres des molcules de cholestrol, et la surface de laquelle affleurent des protines. Les protines qui traversent la membrane de part en part sont dites transmembranaires. Les protines membranaires assurent une multitude de fonctions. Les protines de transport, canaux ou pompes, assurent le passage d'un ct ou de l'autre de la membrane de grosses molcules hydrosolubles comme les sucres et certains acides amins. Les glycoprotines, protines associes des rsidus glucidiques, jouent un rle dans l'identification de la cellule par le systme immunitaire. Pour ce TP dextraction et de purification des protines on va choisir le foie de souris comme un organe exprimental (organe riche en protines et facile le brouiller avec le mortier) et aprs les protines sont extraites et solubilises par des dtergents puis doser par la mthode du Biuret. Les dtergents sont des molcules amphiphiles qui ont largement contribu lanalyse des membranes cellulaires, il existe des dtergents ioniques dites forts qui dtruisent les liaisons non covalentes et dnaturent les protines, et des dtergents non ioniques dites doux le cas de notre TP afin de purifier les protines membranaires sans les dnaturer, pour cela on a utilis le dtergent triton X100 .

Figure1 : Structure chimique du dtergent


Triton X100 .

Triton X100 : Le triton X100 est un agent tensioactif non-ionique, soluble en milieu aqueux et contenant en moyenne 10 moles d'oxyde d'thylne. Ces caractres chimiques permettent au Triton dentourer les protines en interagissant avec ses parties hydrophobes et les dchausser en les recouvrant de charges. Par la suite Les protines sont transfres de la membrane une sorte de micelle, et donc mises en suspension sans dnaturation

Le biuret

Le biuret est un compos obtenu par condensation de l'ure, quivalent deux molcules d'ure moins une d'ammoniac. Dans les conditions normales de temprature et pression, il apparat sous forme d'un solide blanc, soluble dans l'eau chaude et se dcomposant 186189 C. Le compos peut tre prpar en chauffant l'ure au-del de son point de fusion, laquelle temprature l'ammoniac est expuls. 2 CO(NH2)2 H2N-CO-NH-CO-NH2 + NH3 Le ractif du biuret est utilis dans le test au biuret pour mesurer les protines, non Par ce que le ractif contiendrait un biuret, mais parce que les protines ragissent de la mme faon que les biurets en rponse au cuivre.
But : Extraction des protines hpatiques de souris, et dosage des protines totale. Principe : Utilisation de la capacit du dtergent solubiliser les protines membranaires du tissu hpatique Evaluation de la concentration protique partir dune courbe talon grce aux Do obtenues laide du ractif de biuret.

I.

Matriel et mthode :

A/ Extraction des protines :

Le matriel de dpart est un tissus prlever dun organe ou dune cultures cellulaires , dans notre tp nous avons extrait nos proteine du foie dune souris. Une tape de lyse consiste rompre la membrane plasmique en recourant notamment des actions mcaniques (crasement, french press, sonication) le materielle utiliser dans un but dhomoginisation au cours de notre tp est le mortier mecanqiue. Filtrer et centrifuger lhomognat. Rcupration du surnageant. Des agents solubilisants (dtergents) et d'autres adjuvants d'extraction (des inhibiteurs de protases, des antibiotiques, des chlatants, pour protger les protines d'intrt et permetre leur extraction et leur isolment . Une tape de solubilisation consiste rendre les protines solubles, gnralement en phase aqueuse. Ceci est typiquement ralis par des dtergents, comme le Triton X-100 ou agents chaotropiques (Ure), ceci en gnral conjointement la lyse.

a. Prparation des Solutions de dtergent : Prparation de 4 solutions dilues dune solution mre de dtergent (le triton X 100 10%) : Tube 1 : ci=10% ci.vi=cf .vf Tube 2 : ci=10% ci = 0.1 g/ml ; cf=0.1% vi= cf .vf /ci cf=0.001g/ml ; vf= 3 ml ; vi.1=? mlmlml. cf=0.003 g/ml ; vf= 3 ml ; vi.2=? vi.1=0.03 ml vi.1 =0.001*3/0.1

ci = 0.1 g/ml ; cf=0.3%

Donc vi.2 =0.003*3/0.1 Tube 3 : ci=10%

Donc vi.3 =0.004*3/0.1 Tube 4 : ci=10%

mlmlml. ci = 0.1 g/ml ; cf=0.4%

vi.2=0.09 ml cf=0.004 g/ml ; vf= 3 ml ; vi.3=?

mlmlml. ci = 0.1 g/ml ; cf=0.5% mlmlml.

vi.3=0.12 ml cf=0.005 g/ml ; vf= 3 ml ; vi.4=?

Donc vi.4=0.005*3/0.1

vi.4=0.15 ml

Triton X 100
0.03ml 0.09 ml 0.12 ml 0.15 ml

On complte le volume (3 ml) dans les 4 tubes par le H2OD. 0n rajoute 0.5ml dextrait du foie dans les 4 tubes. 1 2 3 4 Utiliser le spectrophotomtre pour lire les densits optiques pour chaque tube.
Concentration de dtergent (g/ml)
(*)

0.001

0.003

0.004

0.005 0,078

DO nm 0,090 /(*) 0,098 : Le tube sest cass en cours de la manipulation.

B/ Dosage des protines par la mthode du Biuret : 1. Calcul des concentrations finales de BSA dans les 5 tubes : Tube 1 : ci=0.1% ci.vi=cf .vf cf1= ci .vi/vf ci = 0.001 g/ml ; vi=10 l =0.01 ml ; vf =1.5ml ; cf1=? cf1=0.001*0.01/1.5 gggggg/mlmlml ci = 0.001 g/ml ; vi=20 l =0.02 ml ; vf =1.5ml ; cf2=? ml. cf2=1.33*10-5 g/ml gggggg/mlmlml ci = ml. 0.001 g/ml ; vi=30 l =0.03 ml ; vf =1.5ml ; cf3=? cf3=0.00002 g/ml gggggg/mlmlml Tube 4 : ci=0.1% cf4=0.001*0.04/1.5 ml. ci = 0.001 g/ml ; vi=40 l =0.04 ml ; vf =1.5ml ; cf4=? cf4=2.67*10-5 g/ml gggggg/mlmlml ml. cf1=6.66*10-6 g/ml

Tube 2 : ci=0.1% cf2=0.001*0.02/1.5 Tube 3 : ci=0.1%

cf3=0.001*0.03/1.5

Tube 5 : ci=0.1%

cf5=0.001*0.05/1.5 2. Gamme talon :

ci = 0.001 g/ml ; vi=50 l =0.05ml ; vf =1.5ml ; cf5=? cf5=3.33*10-5 g/ml gggggg/mlmlml

ml. On a 6 tubes (1 tmoin). Tubes BSA (0.1%) en l H2OD (l) Ractif de biuret (ml) Tmoin 0 500 1 1 10 490 1 2 20 480 1 3 30 470 1 4 40 460 1 5 50 450 1

La courbe talon donnant la densit optique en fonction des concentrations de BSA (g/l) :
BSA (0.1%) en g/l DO 540nm

0 0

6.66*10-3

0.004

1.33*10-2 0.002

0.02 0.016

2.67*10-2 0.05

3.33*10-2 0.06

a. dduction des concentrations des solutions : T0, T1 et T2 partir de la gamme talon (DO = f [concentration de BSA en mg/ml]. (1ml de biuret)

Spectrophotomtre

(0.5ml) T0

T1

T3

DO = - 0.0103 + 1.9379 x
Solutions T0 T1 T2 DO 540nm 0.370 0.088 0.142

II. Extraction :

Rsultat et discussion :

Concentration de dtergent (g/ml)

0.001 0,090

0.003 /(*)

0.004 0,098

0.005 0,078

DO nm

Graphe ? Conclu : Dapr le graph le tube 3 contient la concentration idale du dtergent pour une solubilisation optimal. Interprtation du graph

Elaboration de la courbe talon :


BSA (0.1%) en g/l DO 540nm

0 0

6.66*10-3

0.004

1.33*10-2 0.002

0.02 0.016

2.67*10-2 0.05

3.33*10-2 0.06

Nuage de Points (Feuille de donnes1 10v*6c) DO 540 nm = -0,0103+1,9379*x

0,060 0,050

DO 540 nm

0,016

0,000

-0,005

0,000

0,005

0,010

0,015

0,020

0,025

0,030

0,035

0,040

BSA (0,1%) en g/l

A partir de la courbe etalon on deduit la loi suivante :

DO = - 0.0103 + 1.9379 x x=Do +0,0103 /1,9379

x est la concentration de protein

Dduction de la concentration des protines selon la courbe talon :

La densit optique (do) du tube 3 tant la plus significative, on utilise celle-ci pour dduire la concentration des protines prsentent dans lchantillon , la do du tube 3 etant 0,098 nm selon la courbe etalon la concentration de proteine est 0,0558 g/l

-deduction de la concentration des different tube (T0 ,T1 ,T2) selon la courbe etalon Solutions T0 T1 T2 DO 540nm 0.370 0.088 0.142 Concentration en protines (mg/ml) 0.196 0.051 0.079