ABNOVA

Penggunaan ELISA Bcl-2 manusia adalah pemeriksaan immunoasorbent terkait enzim untuk deteksi kuantitatif dari Bcl-2 manusia. Pemeriksaan ini hanya ditujukan untuk penelitian saja, dan bukan untuk prosedur diagnostic dan terapi.

Latar Belakang BCL-2 mengawali serangkaian gen yang terlibat dalam pengaturan kematian sled an survival tanpa mempengaruhi proliferasi sel. Regulasi dan pemeliharaan yang tepat dalam hal keseimbangan proliferasi sel dan kematian sel pada organism multiselular adalah sangat penting untk homeostasis jaringan. BCl-2 yang dikodekan oleh protooncogen protein intraselular terkait membrane yang befungsi menghambat kematian sel yang terprogram. Ekspresi BCl-2 telah dilaporkan terlibat dalam sle hematopoetic, epitel non neoplastik dan epitel malignansi. Level Bcl-2 sangat rendah atau bahkan tidak terdeteksi pada sel endotel. Gen Bcl-2 memiliki fungsi unik diantara onkogen mamalia yaitu sebagai regukator negative apoptosis. Gen ini pertama kali ditemukan karena keterlibatannya dalam translokasi kromosom yang lazim dijumpai pada limfoma. Terlebih lagi, BCl-2 terlibat dalam stem cell yang berfungsi dalam hal differensiasi dan morfogenesis. Penurunan level BCl2 berakibat pada kematian sel secara apoptosis. Overekspresi Bcl-2 sebaliknya, akan melindungi sel dari kematian, tetapi tetap tidak bisa membuat sel normal menjadi abadi, dan tidak pula dapat menyebabkan sel yang abadi mengalami transformasi tumorgenik. Ekspresi heterogen dari BCl2 dalam malignansi menunjukkan bahwa gen tersebut diregulasi secara berbeda-beda. Terlebih lagi, ekspresinya pada lesi prekanker menunjukkan peranannya dalam tahap awal tumorgenesis. Beberapa homolog BCL-2 telah ditemukan baru baru ini, yang beberapa diantaranya berperan sebagai inhibitor kematian sel dan lainnya berperan sebagai promoter apoptosis yang melawan fungsi protein BCl-2. Protein BCL-2 memainkan peran penting dalam oncogenesis dan resistansi obat kanker. LEbih jaub lagi, ekspresi BCL-2 memiliki prognostic yang signifikan pada beberapa kasus malignansi seperti Non Hodgkin Lymphoma, SCC, karsinoma mammae, karsinoma kandung empedu dan timoma. Disregulasi ekspresi Bcl-2 telah terbukti pada multiple myeloma dan pasien AML. Bcl 2

telah dilaporkan sebagai marker penting untuk terapi IL-2 yang adekuat seperti pada pasien AIDS.

Prinsip Pemeriksaan BCL-2 anti human menyelubungi antibody akan diadsoprpsi kedalam mikrowell BCl-2 manusia ditemukan pada sampel atau standard akan berikatan denagn antibody yang diadsorbsi kedalam mikrowell. Antibodi Bcl-2anti-human yang terkonjugasi dengan biotin ditambahkan dan akan berikatan dengan Bcl-2 manusia dan akan ditangkap oleh antibody yang pertama. Mengikuti inkubasi antibody BCL-2 antihuman yang terkonjugasi biotin akan dilepaskan selama tahap pencucian. Streptavidin-HRP ditambahkan dan berikatan dengan antibody BCL-2 antihuman yang terkonjugasi biotin Selama inkubasiStreptavidin-HRP yang teidak berikatan akan terlepas selama pencucian, dan larutan substrat reaktif dengan HRP ditambahkan ke dalam dinding tersebut Produk berwarna akan terbentuk dengan proporsi terhadap BCL-2 manusia yang terdapat pada sampel atau standard. Reaksi akan terhenti denagn penambahan asam dan absorbance diukur pada 450 nm.Kurva standard disiapkan dari pengenceran 7 human standard BCL-2, dan konsentrasi sampel BCL 2 manusia dapat diukur.

Instruksi Penyimpanan Simpan set reagen pada suhu 2-8 derajat celcius. Segera setelah digunakan, reagen yang tersisa harus kembali disimpan pada lemari pendingin sushu 2-8 derajat celcius. Tanggal kadaluarsa tercantum pada set reagen. Kadaluarsa produk akan terjamin sepanjang produk disimpan sesuai petunjuk dan jika produk tidak terkontaminasi setelah pemakain yang berulang ulang.

Bahan Bahan Yang Dibutuhkan Tetapi Tidak Disediakan 5 ml dan 10 ml pipet graduasi 5 ul sampai 1000ul mikropipet tunggal dengan ujung yang bisa dibuang 50 ul sampai 300 ul mikropipet ganda dengan ujung yang bisa dibuang

Reservoir mikropipet ganda Penampung, flasks, silinder yang dibutuhkan untuk persiapan reagen Peralatanuntuk persiapan larutan air ( terbuat dari botol cuci atau sistem pencucian otomatis) Pembaca strip mikrowell yang dapat membaca hingga 450 nm (lebih baik lagi 620 nm) Wadah terditilasi denga air deionisasi Kalkulator statisitik dengan program untuk analissi regresi Tindakan pencegahan dalam Penggunaan Semua bahan-bahan kimia dapat berpotensi membahayakan. Karena itu kami menyarankan produk ini digunakan oleh orang-orang yang sudah terlatih dalam teknikteknik laboratorium dan penggunaannya sesuai dengan prinsip-prinsip praktis laboratorium yang baik. Gunakan pakaian yang sesuai seperti jubah laboratorium, kacamata pengaman dan sarung tangan. Hindari kontak dengan kulit atau mata. Jika terjadi kontak dengan kulit atau mata segera bilas dengan air. Lihat materi lembaran data pengaman dan/atau pernyataan tentang keamanan untuk saran yang lebih spesifik. Regensia dimaksudkan hanya untuk penelitian dan jangan digunakan untuk prosedur diagnostik dan tn campur terapi. Jangannsia dengan mencampurkan atau mensubsitusi regensia dengan benda lain atau sumber lain. Jangan gunakan regensia di atas tanggal kadaluarsa pada label Regensia tidak boleh terkena cahaya yang kuat selama masa penyimpanan atau inkubasi Jangan menyedot menggunakan mulut Jangan makan maupun merokok dalam area dimana regensia ataupun sampel sedang dikerjakan Hindari kontak kulit atau membran mukosa dengan regensia atau spesimen Gunakan sarung tangan karet sekali pakai ketika bekerja dengan regensia atau spesimen Hindari kontak dengan larutan substrat dengan agen pengoksidasi dan metal Hindari cipratan aerosol Untuk menghindari kontaminasi mikroba atau kontaminasi silang dari regensia atau spesimen, tes yang menggunakan ujung pipet dan/atau pipet sekali pakai dapat dibatalkan. Gunakan tempat regensia yang bersih dan yang digunakan hanya untuk regensia tersebut untuk mengeluarkan konjugat dan regensia substrat Paparan terhadap zat-zat asam akan menginaktivasi konjugat Persiapan regensia sebaiknya menggunakan air yang terdistilasi dalam gelas atau terdeionisasi Larutan substrat harus digunakan dalam ruangan dengan temperature yang sesuai

Dekontaminasi atau buang spesimen dan semua material yang berpotensi terkontaminasi karena barang-barang itu dapat mengandung agen infeksius. Metode yang lebih disukai untuk dekontaminasi adalah dengan autoklaf selama minimum 1 jam pada suhu 121.5C. Limbah cair yang tidak mengandung asam dan limbah yang bersifat netral dapat dicampur dengan sodium hipoklorit dalam volume yang sedemikian sehingga campuran akhir mengandung 1.0% sodium hipoklorit. Biarkan selama 30 menit untuk dekontaminasi yang efektif. Limbah cair yang mengandung asam harus dinetralisir sebelum penambahan sodium hipoklorit.

Pembatasan Karena kondisi yang sesungguhnya dapat bervariasi dari pengujian yang satu ke pengujian yang lain, harus ditetapkan sebuah kurva standar untuk setiap pengujian. Kontaminasi bakteri atau jamur dari sampel atau regensia atau kontaminasi silang di antara regensia-regensia dapat menimbulkan hasil yang salah/eror. Ujung pipet, botol atau benda pecah belah sekali pakai lebih disukai, barang pecah belah yang dipakai berkali-kali harus dicuci dan dicuci dengan teliti menggunakan deterjen sebelum digunakan. Pencucian yang tidak sesuai atau tidak memenuhi standar pada setiap fase prosedur pencucian dapat menghasilkan hasil positif palsu atau negatif palsu. Kosongkan sumber air dengan komplit sebelum mengeluarkan larutan pencuci yang segar, isi dengan Wash Buffer karena diindikasikan untuk setiap siklus pencucian dan jangan biarkan sumber air tidak terbungkus atau menjadi kering selama periode yang diperpanjang. Penggunaan radioimunoterapi secara signifikan meningkatkan jumlah pasien dengan human anti-mouse IgG antibodies (HAMA). HAMA dapat mengganggu pengujian menggunakan antibodi monoklonal murine sehingga terjadi hasil positif palsu atau negatif palsu. Sampel serum yang mengandung antibodi atau immunoglobulin murine masih dapat dianalisa pada pengujian dimana immunoglobulin murine (serum, cairan bersifat asam, atau antibody monoclonal dalam spesifisitas yang tidak relevan) ditambahkan pada sampel.

Protokol Analisis Persiapan Reagen Konsentrat buffer harus disimpan di temperature ruangan dan harus didilusikan sebelum memulai prosedur percobaan. Jika Kristal terbentuk dalam konsentrat buffer, hangatkan hingga Kristal larut. Wash Buffer

Tuangkan seluruh kandungan (50 ml) konsentrat wash buffer (20x) dalam 1000 ml graduated cylinder. Hingga volume akhir 1000 ml dengan glass-distilled atau air yang dideionisasi. Campur perlahan untuk menghindari busa. Pindahkan ke botol yang bersih dan simpan pada suhu 20 sampai 250 C. Harap diingat bahwa wash buffer stabil selama 30 hari. Wash buffer dapat juga dipersiapkan sesuai keperluan seperti pada table berikut Jumlah Strip 1-6 1-12 Konsentrat wash buffer 20x Distilled water (ml) (ml) 25 475 50 950

Assay Buffer (1x)

Tuangkan seluruh kandungan (5 ml) dari konsentrat assay buffer (20x) pada 100 ml graduated cylinder. Hingga volume akhir 100 ml dengan distilled water. Campur dengan perlahan untuk menghindari pembentukan busa. Simpan pada suhu 20 hingga 80 Celcius. Harap diingat bahwa assay buffer (1x) stabil selama 30 hari Jumlah strip 1-6 1-12 Konsentrat assay buffer 20x (ml) Distilled water (ml) 2.5 47.5 5.0 95.0

Lysis Buffer

Tuangkan seluruh kandungan (15 ml) konsentrat lysis buffer (10 x) ke dalam 150 ml graduated cylinder. Hingga volume akhir 150 ml dengan distilled atau air yang dideionisasi dan campur perlahan. Simpan pada suhu ruangan. Harap diingat bahwa lysis buffer stabil selama 30 hari. Biotin-conjugate

Harap diingat bahwa konjugat biotin harus digunakan dalam 30 menit setelah dilarutkan. Buat pelarutan 1:100 dari konsentrat konjugat biotin terhadap assay buffer (1x) dalam tube plastic yang bersih menurut kepada table berikut Jumlah strip 1-6 1-12 Biotin-conjugate (ml) 0.03 0.06 Assay Buffer (1x) (ml) 2.97 5.94

Streptavidin-HRP

Harap diingat bahwa streptavidin-HRP seharusnya digunakan dalam 30 menit setelah pelarutan. Buat pelarutan 1:1000 dari konsentrat larutan streptavidin-HRP terhadap assay buffer (1x) dalam tube plastik yang bersih menurut kepada table di bawah ini Jumlah strip 1-6 1-12 Streptavidin-HRP 0.06 0.12 Assay buffer (1x) (ml) 5.94 11.88

Human Bcl-2 Standard

Rekonstitusi human Bcl-2 standard dengan menambahka distilled water. Volum rekonstitusi dicatat dalam label vial standard. Campur dengan perlahan untuk memastikan solubilisasi berlangsung secara komplit dan homogen (konsentrasi dari standard rekonstitusi =64 ng/ml). biarkan standar berekonstitusi selama 10-30 menit. Campur perlahan untuk memastikan dilusi. Setelah penggunaan, standard sisa tidak dapat disimpan dan harus dibuang. Pelarutan standard dapat dipersiapkan secara langsung dalam piring microwell. Pelarutan Standard Eksternal Beri label 7 tube, satu untuk setiap poin standard S1, S2, S3, S4, S5, S6,S7 Kemudian persiapkan dilusi serial 1:2 untuk setiap kurva standard sebagai berikut: Pipet 225 l sampel diluen ke dalam setiap tube Pipet 225 l standard rekonstitusi (konsentrasi = 64 ng/ml) ke dalam tube pertama, dilabel sebagai S1 dan campur (konsentrasi standard 1 = 32 ng/ml) Pipet 225 l dari pelarutan ini ke dalam tube kedua, dilabel sebagai S2 dan campur sebelun pemindahan berikutnya Ulangi serial dilusi 5 kali lagi sehingga menciptakan kurva standard Gambar 6 (ambil dan tambahkan 225 l) (standar bcl 2 manusia yang mau diubah) (sampel yang dicairkan) (smapel yang dibuang 225 l) Reagen pemberi warna Zat pewarna biru, zat pewarna hijau, zat pewarna merah

Untuk mencegah adanya kekeliruan dalam mentiter abnova ELISA, alat kami dapat digunakan untuk memonitor penambahan bahkan volume terkecil larutan sekalipun terhadap tabung reaksi melalui perubahan warna dalam setiap proses ELISA. Prosedur ini merupakan opsional, tidak mengganggu hasil yang didapat, dan didesain untuk membantu dalam melakukan tes ELISA, tapi bisa saja dihilangkan, ikuti saja prosedur yang terdapat dalam buku petunjuk. Sebagai alternatif, larutan pemberi warna tersedia (biru dan hijau) dapat ditambahkan dalam reagen dengan petunjuk berikut: Pelarut: sebelum pelarutan standard dan sampel, tambahan zat warna biru dengan perbandingan 1:250 (lihat tabel berikut) ke larutan yang sudah dilarutkan 1X. sesudah ditambahkan zat warna biru, lanjutkan tes sesuai buku petunjuk. 5 ml pelarut sampel 12 ml pelarut sampel 50 ml pelarut sampel 20 l zat warna biru 48 l zat warna biru 200 l zat warna biru

Streptavidin HRP: sebelum pelarutan konsentrat Streptavidin HRP, tambahkan zat warna merah dengan perbandingan 1:250 ke larutan penguji yang digunakan untuk pelarutan akhir Streptavidin HRP. Lanjutkan proses sesudah penambahan zat warna merah sesuai buku petunjuk: persiapan Streptavidin HRP. 6 ml larutan penguji (1X) 12 ml larutan penguji (1X) Biotin konjugat Biotin konjugat: sebelum pelarutan konsentrat biotin konjugat, tambahkan zat warna hijau dengan perbandingan 1:100 pada larutan penguji (1X) yang digunakan untuk pelarutan akhir larutan konjugat. Lanjutkan proses sesudah penambahan zat warna hijau menurut buku petunjuk: persiapan konjugat biotin. 3 ml larutan uji (1X) 6 ml larutan uji (1X) 30 l zat warna hijau 60 l zat warna hijau 24 l zat warna merah 48 l zat warna merah

 Persiapan sampel Cell lysates, serum dan plasma di uji dengan pengujian ini. Sampel biologis lainnya mungkin dapat diuji dengan pengujian ini. Buang serum atau plasma dari clot atau sel segera setelah terjadi clotting dan pemisahan. Sampel yang terlihat ada endapan harus diklarifikasikan terlebih dahulu sebelum digunakana dalam pengujian. Jangan gunakan specimen yang banyak terdapat darah atau lemak. Sampel sebaiknya aliquoted dan disimpan pada suhu -20C untuk mencegah hilangnya bioactive human Bcl-2. Jika sampel akan digunakan dalam 24 jam, maka dapat disimpan dalam 2 8 C. Hindari siklus pembekuan-pencairan berulang kali. Sebelum pengujian , sampel sebaiknya dibawa ke temperature ruangan dan dicampurkan dengan hati-hati. Persiapan sampel protocol cell lysate Banyak protokol ekstraksi yang dapat digunakan. Protokol berikut merupakan salah satu yang dapat digunakan, tapi sebaiknya tidak ditafsirkan satu-satunya protokol yang tersedia. Suspensi sel: lakukan sentrifugasi, lalu singkirkan supernatant dan kemudian tambahkan larutan pelisis. Sel-sel yang melekat: singkirkan supernatant dari sel, cuci sel dengan PBS, ambil sel dengan dikeruk dan disentrifugasi dengan lembut, aspirasi PBS, menyisakan pellet yang intak (pellet ini dapat disimpan pada suhu -80C dan dilisiskan untuk penggunaan kemudian hari) dan kemudian ditambahkan larutan pelisis. Penambahan larutan pelisis: tambahkan pellet ke dalam larutan pelisis (1X)

(direkomendasikan menggunakan konsentrasi 5 x 106 sel/ml), diinkubasi 60 menit dalam suhu ruangan dengan kocokan yang lembut dan pindahkan ekstraksi ke tuba mikrosentifugasi dan disentrifugasi 1000 x g selama 15 menit. Aliquot lysate untuk membersihkan tuba mikrosentrifugasi dan teruskan prosedur test (lysate dapat saja disimpan pada suhu -80C dan diuji kemudian hari. Lysate kemudian dibagi menjadi beberapa aliquot kecil untuk mencegah siklus pembekuan pencairan)

Prosedur pengujian 1. untuk melisis sel, dapat diikuti protokol cell lysate.

2. hitung jumlah strip di microwell strips yang dibutuhkan untuk menjalankan test dan jumlah sampel dan jumlah wells yang dibutuhkan untuk blanko dan standard. Setiap sampel, standar, blanko, dan opsional sampel control sebaiknya diuji beberapa kali. Singkirkan ekstra mikrowell strips dari holder dan simpan dalam foil bag kering dengah suhu 2 8 C ditutup rapat. 3. cuci mikrowell strips 2 kali dengan 400 l larutan pembersih tiap well dengan aspirasi yang cermat dari isi meikrowell setiap kali dicuci. Biarkan larutan pembersih didalam well selama 10 15 detik sebelum aspirasi Pada tahap pencucian terakhir, kosongkan wells , tepuk strip pada mikrowell pada kain pengasorpsi atau handuk untuk menghilangkan buffer pencuci. Gunakan strip mikrowell secepatnya setelah membilas. Sebagai gantinya strip mikrowell bisa pindahkan ketas dan kebawah dari kertas pengasopsi tidak lebih 15 menit jangan sampai well sampai kering. 4. delusi standar pada plate mikrowell ( sebagai ganti delusi standar bisa dipersiapkan dalam tube). Tambahkan 100mul sampel deluen pada semua wells standar. Pipet 100mul dari standar yang disiapkan ( kosentrasi 64 ngram/ml) diperbanyak pada kedalam well A1 dan A2. Campiurkan isi dari well A1 dan A2 dengan mengaspirasi dan mengejeksikan secara berulangulang( kosentrasi standar 1, S1 = 32 ngram /ml) dan pindahakan 100 mcl pada well B1 dan B2. Hati hati untuk tidak menggores permukaan dalam mikrowell. Lakukan prosedur ini sebanyak 5 kali. Buat 2 kolom dari Bcl-2 manusia dengan range standar pengenceran 32,0 samapi 0,5 ng/ml. buang 100 mcliter isi dari mikrowell terkhir (G1,G2) yang digunakan

Figure 7

Dalam hal pengenceran standar eksternal, pipet 100 mcliter dari standar yang sudah diencerkan ( S1-S7) pada well standar ditempat plate tersebut 5. Tambahkan 100mcliter dari deluet sampel diperbanyak pada well yang kosong tambahkan 80 mcliter pengencer pada well yang kosong 6. tambahkan 80 mcliter pengencer ke dalam sampel well 7. tambahkan 20 mcliter dari masing-masing sampel sebagai duplikat kedalam sampel well 8. siapkan bioton Conjugate 9. tambahakan 50 mcliter biotin konjugate kesemua well

10. tutup dengan menggunakan film pelengket dan inkubasikan pada suhu ruangan (18-25 derajat celcius) selama 2 jam. Jika tersedia letakkan mikroplate shacker dengan kecepatan 100rpm 11. siapka streptavidin HRP 12. pindahakn film perekat dan well yang kosong. Cuci lemberan mikrowell 3 kali seperti pada point 3. Kemudian proses seperti langkah berikutnya. 13. tambahkan 100 mcliter pelarut streptavidin HRP ke semua wel, termasuk pada well yang kosong 14. tutup dengan film perekat dan inkubasikan pada suhu ruangan selama 1 jam. Jika tersedia letakkan mikroplate shacker dengan kecepatan 100rpm. 15. pindahkan film perekat dan well yang kosong. Cuci lembaran mikrowell 3 kali seperti pada point 3. Kemudian proses seperti langkah berikutnya. 16. teteskan 100mcliter larutan TBM substrate pada semua well 17. inkubasikan lemberan mikrowell pada suhu ruangan selama 10 menit. Hindari pajanan lansung sinar matahari. Perubahan warna pada plate harus dimonitor dan reaksi substrate dihentikan ( lihat point berikutnya). Sebelum percobaan positif terlalu lama terjadi . penentuan waktu yangpaling ideal untuk peruabahn warna harus dilakukan secara individual pada masing-masing warna. Hal ini dilakukan untuk menambahakan pelarut penghenti ketika standar tertinggi berkembang menjadi biru tua. Secara alternatif perkembangan warna dapat dimonitor dengan menggunakan pembaca ELISA pada 620nm. Reaksi substre harus dihentikan segera mungkin ketika standar 1 mencapai OD 0,9-0,95. 18 hentikan reaksi enzim dengan meneteskan 100mcliter pelarut penghenti secara cepat pada tiatiap well. Hal ini penting karena pelarut penghenti dapat menyebar secara cepat dan searah melalui mikrowell. Untuk menginaktivasi enzim secara lengkap. Hasilnya harus dibacakan segera setelah pelarut penghenti ditambahkan atau dalam satu jam setelah lembaran mikrowell tersimpan pada suhu 2-8 derjat celcius ditempat yang gelap 19. baca absorbance pada maasing masing mikrowell pada spectro photo meter denan panjang gelombang 450nm ( sebagai pilihan panjang 620nm ; 610nm-650nm dapat diperguanakan) Pengosongan plate pembaca tergantung pada intruksi pabrik dengan menggunakan well kosong. Tentukan penyerapan dari kedua sampel dan standar

Note: pada kasus inkubasi tanapa shaking O.D dinilai lebih rendah dari yang diindiaksikan, jika tidak hasilnya kurang valid. Analisis Data Perhitungan Hasil Kalkulasikan nilai rata-rata penyerapan untuk setiap duplikat standard dan sample. Duplikat harus dalam 20 % dari setiap nilai mean Buatlah standard curva dengan memplot mean absorban dari tiap standard konsentrasi ordinat terhadap konsentrasi Bcl-2 manusia pada abcis. Gambarlah curva yang cocok untuk grafik point (curva 5 parameter ) Untuk menentukan konsentrasi sirkulasi manusia Bcl-2 dari setiap sample, pertama temukan nilai mean absorban dan extensikan ke garis horixontal ke kurva standard. Pada point interseksi, extensikan garis vertical menuju ke abcis dan lihat ioresponden konsentrasi manusia Bcl-2 Jika instruksi dari protocol ini telah diikuti sample telah dilusikan menjadi 1:5 (20l sample + 80l dilusien sample), konsentrasi dibaca dari kurva standard harus di multiplikasi melalui factor dilusi. Kalkulasikan sample dengan konsentrasi standard 1 akan mengahsilkan hasil yang tidak benar, lebel manusia Bcl-2 yang rendah (efek Hook). Beberapa sample memerlukan predilusi external yang lebih jauh sesuai untuk nilai manusia Bcl-2 yang diharapkan dengan sample diluents untuk mendapatkan kuantitas level manusia Bcl02 yang tepat Dianjurkan untuk setiap test fasilitas menetapkan sample kontol untuk konsentrasi manusia Bcl-2 dan melakukan kontrol tambahan untuk tiap assay. Jika nilai yang didapatkan tidak sesuai dengan kontrol yang diharapkan, hasil assay tidak valid. Kurva standard yang representative ditunjukkan pada figure 8. Kurva ini tidak boleh digunakan untuk hasil test. Setiap laboratory harus menyiapkan kurva standard dari setiap grup dari assay strip microwell. Figure 8 Kurva standard yang representative dari ELISA manusia Bcl-2. Bcl-2 manusia dilusikan dalam 2 tahap lipatan diluen sample. Jangan menggunakan kurva standard hasil test. Kurva standard harus dicpai untuk grup assay strip microwell.

Tabel 1 Data menggunakan ELISA Bcl-2 manusia Pengukuran panjang gelo,bang 450 nm

Panjang gelombang referensi 620 nm Nilai OD standar kurva bervariasi menurut kondisi performans assay. Selain itu pengaturan alat dapat berpengaruh pada aktivitas enzimatis dan intensitas warna. Nilai yang diikur tetap valid

Karakteristik performans Sensitivitas Deteksi batas Bcl-2 manusia didapatkan dari analisi konsentrasi yang menghasilkan nilai tinggi absorban dibandingkan dengan mendium dilusi , ditentukan dari <0,5 ng/ml Reproduksibilitas Intra assay Reproduksibilitas dalam assay dievaluasi dalam 3 experiment independent. Setiap assay dibuat dalam 6 replikasi dalam 8 sample yang berisi konsentrasi yang berbeda dari Bcl-2 manusia. 2 standard kurva dilakukan di tiap plate. Data dibawa menunjukkan konsentrasi manusia Bcl-2 dan koefisien dari varias sample. Kalkulasi dari seluruh intra assay coeffisent bervariasi sampai 8,6% Inter-assay Pegujian demi pegujian di dalam 1 laboratorium dievaluasi dalam 3 percobaan yang berbeda. Setiap pegujian diambil 6 replika dari 8 sampel yang mengandung konsentrasi berbeda dari Bcl2 manusia. 2 kurva standar diperiksa di tiap plate. Data di bawah menunjukkan rata-rata konsenstrasi Bcl-2 manusia dan variasi koefision dihitung dalam 18 determinasi tiap sampel. Kalkulasi dari keseluruhan pengujian dengan variasi koefisien sekitar 12%.

Spike recovery Spike recovery dievaluasi dengan menambahkan 4 tingkat dari BCL-2 manusia ke buffer lisis. Recoveries dideterminasi dalam 3 percobaan yang berbeda dengan 4 replika masing-masing. Nilai rata2 recovery sekitar 71 %.

Dillution Paralelism 4 sampel dengan tingkat yang berbeda dari BCL-2 manusia dianalisis pada 2 tabung dilusi serial dengan 4 replika masing2. Recovery sekitar 85%-123% dengan nilai recovery keseluruhan 102%.

Sample Stability Freeze-Thaw Stability Aliquots dari sampel disimpan dalam suhu -20oC dan dicairkan 5x dan tingkat BCL-2 manusia dideterminasi. Tidak ada kehilangan yang signifikan dari BCL-2 manusia immunoreaktif yang dideteksi dengan pembekuan dan pencairan.

Stabilisasi Penyimpanan Aliquots sampel disimpan di -20o, 2-8oC, suhu ruangan dan 37oC dan BCL-2 manusia dideterminasi setelah 24 jam. Tidak ada kehilangan yang signifikan dari BCL-2 manusia immunoreaktif yang dideteksi selama penyimpanan dengan -20oC dengan kondisi di atas. Terdapat kehilangan yang signifikan dari BCL-2 immunoreaktif selama penyimpanan pada 4oC (30%), pada Suhu ruangan (45%), dan 37oC (70%) setelah 24 jam.