UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONMA DE MXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLAN

LICENCIATURA DE QUMICO FARMACUTICO BILOGO

MICROBIOLOGA FARMACUTICA

TRABAJO DE INVESTIGACION

PRODUCCIN INDUSTRIAL DE AMINOCIDOS

PROF: SOTO GUEVARA ALBERTO NATAHLIEL

GRUPO: 1906

EQUIPO 7: MELISSA GARCA BALDERAS HERNNDEZ PATLN DANIEL SOLS CRUZ BRUNO

| | 23 DE NOVIEMBRE DEL 2009

NDICE

I. II. III. IV. V. VI.

INTRODUCCIN AMINOCIDOS PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS AMINOCIDOS APLICACIN DE LOS AMINOCIDOS A NIVEL FARMACUTICO EMPRESAS QUE PRODUCEN O COMERCIALIZAN CON AMINOCIDOS MTODOS DE PRODUCCIN Sntesis qumica Extraccin de aminocidos a partir de hidrolizados de protena Produccin microbiolgica Fermentacin directa de aminocidos Conversin de productos intermediarios Uso de enzimas o clulas inmovilizadas PUNTOS CRTICOS DEL PROCESO DE AMINOCIDOS CONTROL DEL PROCESO DE FERMENTACIN CEPAS UTILIZADAS EN LA PRODUCCIN MICROBIOLGICA DE AMINOCIDOS Mutantes auxotrofos Mutantes regulatorios Recombinacin gentica Fagos Plsmidos vectores Fusin de protoplastos RECUPERACIN DE PRODUCTOS Extraccin con disolventes Electrodilisis Precipitacin PRUEBAS DE SEGURIDAD DE LOS AMINOCIDOS Inmunogenicidad REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFA

VII. VIII. IX.

X.

XI.

XII.

I.

INTRODUCCIN

Las propiedades estimuladoras del sabor del cido glutmico se descubrieron en Japn en 1908, pero no fue sino hasta 1957 que se descubri el cido glutmico como producto en el medio de cultivo utilizado durante el crecimiento de Corynebacterium glutamicum, convirtindose este microorganismo en la fuente principal de glutamato sdico e inmediatamente despus comenz la produccin comercial de glutamato sdico a partir de hidrolizados cidos de trigo y protena de soja. Este descubrimiento fue un enorme impulso para la industria de fermentacin en Japn, de tal manera que los procesos fermentativos para la produccin de aminocidos han sido casi exclusivamente desarrollos japoneses. Los aminocidos se utilizan habitualmente como materias primas en diversos procesos de la industria qumica, alimentaria, cosmtica y farmacutica. Aproximadamente el 66% de los aminocidos producidos se utilizan en la industria de alimentos, el 30% como aditivos de piensos (forrajes y herbajes) y solamente el 4% restante en medicina y cosmtica as como material de partida en la industria qumica. En la industria de alimentos los aminocidos se utilizan solos o en combinacin para aumentar el sabor. Muchos aminocidos se utilizan en medicina como ingredientes de soluciones de infusiones en el tratamiento post-operatorio (nutricin enteral). En la industria qumica los aminocidos son utilizados como material de partida para la produccin de copolmeros, como son las fibras de polialanina o las resinas de isocianato de lisina. El cido urnico, utilizado como agente bronceador, se produce por biotransformacin de la histidina. Otro aminocido, la glicocola, se utiliza como material de partida para la produccin del herbicida glifoxato. En general, la produccin industrial de aminocidos se realiza principalmente por fermentacin microbiana, biosntesis o bien mediante la hidrlisis de protenas. En todos los casos se obtienen aminocidos a bajas concentraciones en disoluciones acuosas diluidas y en presencia de un elevado nmero de compuestos qumicos similares, por lo que su separacin y posterior purificacin utilizando mtodos tradicionales, tales como intercambio inico, cromatografa, adsorcin, extraccin lquido-lquido o evaporacin es un proceso muy complejo, cuyo coste puede llegar a alcanzar hasta el 50% del coste total de produccin. Actualmente pueden originarse aumentos adicionales en la produccin de aminocidos debido a las siguientes innovaciones: El aislamiento de cultivos de produccin mejorada por el aislamiento de cepas derreprimidas mediante el aporte de tcnicas de DNA recombinante y de fusin de protoplastos a los mtodos actualmente utilizados de mutacin. La combinacin de sntesis qumica con procesos microbianos y enzimticos. La adaptacin de los procesos existentes para la utilizacin de materiales de partida ms baratos. La optimizacin de las condiciones de salto de escala.

II.

AMINOCIDOS

Los aminocidos, pptidos y protenas, componentes importantes de los alimentos, proporcionan los elementos necesarios para la sntesis proteica. Las protenas constituyen uno de los grupos de molculas de mayor transcendencia en los seres vivos, esenciales en funciones biolgicas de biocatlisis (enzimas), de participacin en mecanismos de defensa (anticuerpos), genticos (nucleoprotenas) y de neurotransmisin, en procesos de transporte (hemoglobina, citocromos), en el almacenamiento de molculas o iones (ferritina), y adems las membranas celulares estn formadas fundamentalmente por agregados de lpidos y protenas con una organizacin determinada y especfica. Asimismo, las protenas son fundamentales en la estructura del hueso, el cartlago, la piel y otros tejidos conectivos en los que el colgeno es la protena ms abundante. Algunas protenas actan como hormonas y son liberadas por glndulas especficas y la albmina participa en el mantenimiento del balance hidroelectroltico. Se ha determinado que el cincuenta por cien del peso seco de las clulas lo constituyen las protenas. Los aminocidos son los componentes principales de las protenas, aproximadamente veinte aminocidos constituyen comnmente las protenas. Los aminocidos de las protenas estn unidos por enlaces covalentes (enlaces peptdicos) en un orden predeterminado genticamente. Desde el descubrimiento y caracterizacin en 1806 del primer aminocido, la L-asparagina, tuvieron que pasar ms de cien aos hasta que en 1935 se aisl el vigsimo, la L-treonina, aminocido de elevada importancia nutricional por estar asociado al crecimiento. En general, las protenas influyen directamente en las propiedades fsicas de los alimentos por su alta capacidad para formar o estabilizar geles, espumas, masas, emulsiones y estructuras fibrilares. Mientras que los aminocidos y pptidos contribuyen directamente en el sabor de los alimentos y son precursores de los componentes aromticos y las sustancias coloreadas formadas por reaccin trmica y enzimtica que tienen lugar en la obtencin, preparacin, maduracin y almacenamiento de los mismos. Adems, se utilizan como suplemento alimentario para diabticos, hipertensos o pacientes que presentan insuficiencia digestiva a las protenas (Belitz, 1997). Tradicionalmente, los aminocidos se obtienen a partir de las protenas, as, por hidrlisis cida se obtienen los hidroxilados (por ejemplo 4-hidroxiprolina) y los n-metilados (por ejemplo n-metilhistidina), y en la descarboxilacin espontnea de molculas de protenas con cido g-carboxiglutmico aparece el L-glutamato (Kirk, 1992). Los aminocidos son molculas nitrogenadas simples con cadenas hidrocarbonadas de bajo peso molecular. Todos los aminocidos, a excepcin de la glicina, tienen dos formas estructurales o estereoismeros: L y D. La frmula general de un -aminocido se puede escribir como:

Donde el asterisco significa la existencia de un carbono asimtrico y por lo tanto todos los aminocidos, excepto la glicina, tienen dos ismeros enantimeros pticamente activos designados por D y L. Los aminocidos de las protenas son todos de la forma L, debido a que las clulas poseen enzimas estereoespecficas que sintetizan nicamente estos estereoismeros, eliminndose si existen los estereoismeros D va renal, y evitando as, una posible sntesis de pptidos txicos. A pesar de todo, en las clulas existe una cierta cantidad de D-aminocidos aunque nunca formando parte de las protenas. Otra caracterstica importante es su carcter anfotrico, las molculas de aminocidos tienen dos cargas elctricas iguales, de signo opuesto debidas al grupo amino y al carboxilo. La cadena lateral de los aminocidos, R, puede ser desde un protn como en el caso del aminocido ms sencillo la glicina, hasta un resto aliftico, aromtico o heterocclico portador de otros grupos funcionales. La cadena lateral es decisiva para las interacciones intra- e inter-moleculares de las protenas y segn las caractersticas de esta se puede realizar la siguiente clasificacin: Los valores nutricionales de una protena estn controlados por el balance cuantitativo y cualitativo de cada aminocido esencial, estos valores se pueden mejorar agregando los aminocidos que la protena posea en baja concentracin. Todos los aminocidos de las protenas estn disponibles comercialmente y su inters comercial es creciente, principalmente debido a su uso como potenciadores del sabor y edulcorantes en la industria alimentaria. El desarrollo reciente de nuevos frmacos y antibiticos ha fomentado el consumo de aminocidos tales como el cido glutmico, cido asprtico, fenilglicina, etc. Los aminocidos son molculas nitrogenadas simples con cadenas hidrocarbonadas de bajo peso molecular. Todos los aminocidos, a excepcin de la glicina, tienen dos formas estructurales o estereoismeros: L y D. En las protenas animales todos los aminocidos presentes pertenecen a la serie L. Sin embargo, en ciertos casos el animal dispone de la capacidad enzimtica precisa para aprovechar la forma D, previa transformacin a la forma L correspondiente.

Acido glutmico Es el aminocido de mayor consumo a nivel mundial; la sal sdica del acido glutmico, el glutamato monosdico (GMC) se usa como aditivo alimentario. Se producen aproximadamente por fermentacin 370 000 toneladas anuales. El acido L-glutmico se produce por fermentacin; para obtener la sal, el acido se neutraliza con hidrxido de sodio. Se obtienen 87 g/Lt de acido glutmico, lo que da un rendimiento de conversin azcar-acido glutmico de 42.3 %, en tanto la conversin de acido glutmico a glutamato monosdico (GMS) es de 92%.

L-treonina La L-treonina se obtiene preferentemente mediante un proceso fermentativo por microorganismos. Tambin puede obtenerse por aislamiento a partir de hidrolizados de protena para uso farmacutico. Metionina Este aminocido se usa principalmente en la formulacin de alimentos balanceados tpicamente en dietas de maz y soya que tienen bajas concentraciones de Metionina y lisina. Para este fin, es utilizada la mezcla racmica D, L-metionina obtenida por sntesis qumica. Triptfano El triptfano es el segundo aminocido limitante del maz y el tercero en los alimentos balanceados de cerdos y pollos, pero debido a su alto costo su uso ha sido restringido. Sin embargo, los avances en el proceso de fermentacin y en el desarrollo de rutas de produccin alternativas, permiten suponer que su precio baje. L-lisina La produccin de L-lisina se inicia simultneamente a la de DL-metionina; por efecto de la devaluacin e inflacin creciente hubo, a partir de 1976, un desfasamiento en las inversiones y consecuentemente en la produccin. La unidad diseada para producir 3 000 toneladas por ao logro satisfacer las necesidades del mercado durante los dos aos siguientes al inicio de su operacin comercial. En 1991 se estim que se alcanzo 15 000 toneladas, exportndose 30% de la produccin. Su principal mercado es en alimentos balanceados consumindose 70 000 toneladas anuales de grado alimenticio. La fabricacin de L-lisina por fermentacin es un proceso tpicamente biotecnolgico, este se inicia en el laboratorio, en donde se desarrolla el cultivo a partir de un liofilizado de Corynebacterium glutamicum. La bacteria se resiembra varias veces para preparar el inoculo que se enva a la planta, en donde es transferido a diferentes unidades hasta llegar al fermentados de 120 000 Lt de capacidad. El caldo de fermentado que contiene 90 g/Lt de L-lisina se acidifica y se pasa a travs de resina de intercambio inico. La lisina se eluye, concentra y neutraliza con HCl para obtener el monoclorhidrato, y se cristaliza. Los cristales se lavan, secan y pulverizan. En este proceso se tiene un rendimiento del 33% en relacin con la fuente de carbono utilizada (mieles incristalizables de caa de azcar). L-leucina La l-leucina es otro aminocido que se produce en el pas y que se utiliza como materia prima en la elaboracin de L-lisina; se adiciona al medio de cultivo en una proporcin de 20 Kg/Lt de L-lisina este proceso tambin se lleva a cabo por fermentacin y el rendimiento de conversin de azcar a L-leucina es de 14-16 %, obtenindose 21 g/Lt de

medio de cultivo. El mtodo de produccin es similar al de L-lisina, de hecho se usa el mismo equipo. En la fabricacin de L-lisina, la leucina se utiliza tal como viene de los procesos de fermentacin, no requiere de purificacin; el medio de cultivo se alimenta directamente despus de su esterilizacin. La capacidad de produccin de L-leucina es, actualmente de 120 ton/ao. Existen posibilidades de un mercado mayor en la medida en que aumente la produccin de L-lisina. Este aminocido solo se produce en Japn, EUA y Mxico. Su potencial de desarrollo estriba en la exportacin, los problemas tcnicos por resolver son, principalmente, la separacin y la cristalizacin, operaciones necesarias para lograr la forma en que deber llegar al mercado. Las expectativas en la demanda de leucina por el mercado externo pueden alcanzar volmenes de 500 y 600 ton/ao, siendo factible duplicar este consume en corto plazo.

III.

PRINCIPALES APLICACIONES DE LOS AMINOCIDOS

Los aminocidos tienen amplias aplicaciones industriales. Los aminocidos se utilizan como materias primas en la industria alimentaria, farmacutica, qumica y cosmtica. Aproximadamente el 66% de los aminocidos producidos se utilizan en la industria de los alimentos, el 31% como aditivos de piensos (alimento elaborado para animales) y solamente el 4% en medicina y cosmtica, adems de material de partida para la industria qumica. En la industria alimentaria se han utilizado los aminocidos y sus derivados para edulcorar, salar, modificar o aumentar el sabor de los alimentos. Cada aminocido y derivados tiene un sabor caracterstico: dulce, amargo, agrio, salado. El D-glutamato es inspido y los steres de metil o etil glicina poseen un sabor muy salado. La glicina y L-alanina son dbilmente dulces pero el aspartame (ster de metil L-aspartil-L-fenilalanina) es 200 veces ms dulce que la sacarosa, utilizndose como edulcorante artificial. Recientemente ha aumentado el consumo de L-fenilalanina y cido L-asprtico como materias primas para la sntesis de este ster. Tambin la D-alanina junto con el cido asprtico forma un edulcorante 12 veces ms dulce que el aspartame. Adems, muchos piensos domsticos no contienen los aminocidos esenciales necesarios para el crecimiento equilibrado de los animales, y normalmente, es necesario introducir en la dieta suplementos alimenticios que contengan los aminocidos esenciales, los ms frecuentes son: DLmetionina, L-lisina, Ltreonina. En la industria de cosmticos, los aminocidos y sus derivados se utilizan para controlar o neutralizar las variaciones de pH en la piel y los efectos bacterianos. Por ejemplo, la serina se utiliza en cremas o lociones faciales y el glutamato de glucosa se emplea en champs y cremas como compuesto humectante del pelo y de la piel (Kirk, 1992). En la industria qumica los aminocidos se emplean en campos muy diversos. Actualmente en relacin a la proteccin del medioambiente, se presta especial atencin a los poli aminocidos, que son polmeros biodegradables. Entre otras utilidades estos polmeros se utilizan en la produccin del cuero sinttico y los polmeros biodegradables poli-(L-cido asprtico-co-PEG) con aplicacin en el campo de la biomedicina. Algunos derivados de aminocidos se emplean como agentes de limpieza por ejemplo en la eliminacin de aceites de efluentes industriales se est empleando un derivado del cido glutmico. Los aminocidos estn teniendo una creciente demanda en la industria qumica. A medida que sus precios bajan, su uso es ms diversificado, en la manufactura de polmeros sirven como materias primas, tal es el caso de las fibras de polialanina o bien las resinas de isocianato de lisina; el poli-gama-metilglutamato es usado como una capa superficial de la piel sisntetica, la glicina es la materia prima inicial para la produccin del herbicida glifosato y la treonina para el aztreonam (antibitico). La produccin comercial de aminocidos se resume en la siguiente tabla. Se han desarrollado procesos de fermentacin para todos los aminocidos a excepcin de glicina y L-cistena.

Produccin mundial de aminocidos. Procesos de produccin y aplicaciones. Produccin anual (toneladas mtricas)
130 700

Aminocido
D, L-alanina L-alanina

Mtodos de produccin
- Uso de enzimas o clulas inmovilizadas - Extraccin de hidrolizados de protenas - Sntesis qumica - Fermentacin directa - Extraccin de hidrolizados de protenas - Uso de enzimas o clulas inmovilizadas - Extraccin de hidrolizados de protenas - Extraccin de hidrolizados de protenas - Sntesis qumica - Extraccin de hidrolizados de protenas - Uso de enzimas o clulas inmovilizadas - Uso de enzimas o clulas inmovilizadas - Sntesis qumica - Fermentacin directa - Extraccin de hidrolizados de protenas - Fermentacin directa - Extraccin de hidrolizados de protenas - Fermentacin directa - Fermentacin directa - Uso de enzimas o clulas inmovilizadas - Sntesis qumica - Uso de enzimas o clulas inmovilizadas - Fermentacin directa - Uso de enzimas o clulas inmovilizadas - Fermentacin directa - Uso de enzimas o clulas inmovilizadas - Fermentacin directa - Transformacin microbiana de precursores - Fermentacin directa - Fermentacin directa - Fermentacin directa - Uso de enzimas o clulas inmovilizadas - Extraccin de hidrolizados de protenas - Uso de enzimas o clulas inmovilizadas - Fermentacin directa - Uso de enzimas o clulas inmovilizadas

Aplicacin
Potenciador del sabor Potenciador del sabor (Produccin de bebidas) Infusiones Terapia (enfermedades del hgado) Cosmticos Terapia Potenciador del sabor Produccin de aspartame Terapia Produccin de pan Antioxidante Terapia (bronquitis) Potenciador del sabor Terapia (ulcera) Componente de los edulcorantes Terapia (ulcera) Infusiones Infusiones Aditivo de piensos Infusiones Aditivo de piensos Terapia Terapia del hgado Infusiones Produccin de aspartame Infusiones Cosmticos Aditivo de piensos Infusiones Infusiones Precursor de la sntesis de L-DOPA Infusiones

L-arginina

1000

cido L-asprtico L-asparagina L-cistena cido Lglutmico L-glutamina Glicina L-histidina L-isoleucina L-leucina L-lisina D, L-metionina L-metionina L-ornitina L-fenilalanina L-prolina L-serina L-treonina L-triptfano L-tirosina L-valina

4000 50

700 370000 500 5000-6000 200 150 150 70000 7000 150 50 3000 100 50 160 200 100 150

IV.

APLICACIN DE LOS AMINOCIDOS A NIVEL FARMACUTICO

Los aminocidos pticamente puros, compuestos que presentan una pureza del cien por cien de una de sus variedades D L, poseen una elevada importancia biomdica debido a sus numerosas posibilidades. Entre sus mbitos de aplicacin destaca la industria farmacutica, ya que estn ligados a la fabricacin de sueros, aditivos alimentarios, antibiticos, antitumorales y reactivos de aplicacin en la sntesis orgnica, entre otros compuestos. En medicina, en pre- y post-operatorios, se estn utilizado transfusiones de aminocidos para mantener el nivel de nitrgeno necesario para el funcionamiento metablico. Adems, se han desarrollado distintas mezclas de aminocidos especiales para el tratamiento de muchas enfermedades (Kirk, 1992). En la industria farmacutica se utilizan con distintos fines. La L-glutamina y sus derivados se utilizan como remedio en lceras de estmago o duodenales, el L-DOPA (L-3-(3,4dihidroxifenil) alanina) es una droga muy efectiva en el tratamiento del Parkinson, el Ltriptfano y el 5-hidroxi-L-triptfano se emplean como antidepresivos, el aspartato de potasio se utiliza para mejorar el equilibrio salino del metabolismo y el aspartato de calcio para suplir las deficiencias de calcio en el organismo. La p-hidroxi-D-fenilglicina, Dfenilglicina, D-cisteina y el cido D-asprtico son importantes como precursores de antibiticos de las familias de penicilinas o cefalosporinas (Kirk, 1992). En concreto el aminocido -fenilglicina se emplea como precursor en la sntesis de antibiticos lactmicos, como las cefalosporinas. Estos antibiticos son, dentro de los productos farmacuticos, uno de los grupos con mayor volumen de produccin. Tabla 1. Produccin en cultivos sumergidos de aminocidos de inters farmacutico Aminocido
L-arginina L-citrulina L-ornitina L-histidina L-homoserina L-glutamina L-isoleucina L-leucina L-fenilalanina L-prolina L-treonina L-valina L-cistena

Inters a nivel farmacutico

Alivio de hiperamonemia (aumento agudo o crnico del amonio sanguneo) y trastornos hepticos mediante la estimulacin de la arginasa

Estimula secrecin de insulina Alivio de hiperamonemia y trastornos hepticos mediante la estimulacin de la arginasa Estimula secrecin de insulina Alivio de hiperamonemia y trastornos hepticos mediante la estimulacin de la arginasa Estimula secrecin de insulina Deficiencia vitamnica B6 en el embarazo Enfermedades carenciales Deficiencia vitamnica B6 en el embarazo Tratamiento de ulceras gstricas Enfermedades carenciales Enfermedades carenciales Enfermedades carenciales Enfermedades carenciales Tratamiento del sobrepeso Enfermedades carenciales Tratamiento de bronquitis e inyeccin intravenosa post-operatoria

Uno de los mayores problemas reside en su produccin. El mtodo empleado con mayor eficiencia, denominado proceso de la hidantoinasa, se reduce a la sntesis de tan slo dos compuestos, la D-fenilglicina y D-parahidroxifenilglicina, que permiten la elaboracin de los antibiticos ampicilina y amoxicilina, respectivamente. Con el objetivo de mejorar la produccin de aminocidos, actualmente se ha adaptado este limitado proceso a la fabricacin de cualquier D-aminocido pticamente puro. El aspecto ms innovador del descubrimiento reside en el desarrollo de un nuevo organismo recombinante capaz de producir las tres enzimas necesarias en la sntesis de cualquier Daminocido pticamente puro con una eficacia del 100%. El proceso consiste en introducir en la bacteria Escherichia coli un ADN plasmdico (material gentico extracromosmico procedente de la bacteria parasitaria de plantas Agrobacterium tumefaciens) con el objetivo de incorporar los genes responsables de producir las enzimas (Martnez, 2009). En el ao 2002, ya se haba logrado producir cualquier D-aminocido pticamente puro con una eficiencia similar a la actual. Pero su elaboracin precisaba de tres organismos, cada uno de ellos responsable de aportar una enzima, y cuatro biorreactores. Tres de ellos eran empleados en la obtencin de las clulas productoras de las enzimas perseguidas; luego, stas eran mezcladas en un cuarto reactor donde se aada el sustrato necesario para la reaccin y se obtenan los compuestos deseados. Gracias al desarrollo de este nuevo mtodo que se ha patentado, se ha conseguido reducir el costo, tanto material como tiempo, de la fabricacin de D-aminocidos pticamente puros al ser necesario un nico organismo y, por tanto, un solo biorreactor. Actualmente este sistema de coexpresin enzimtica para la produccin de D-aminocidos se utiliza para la obtencin de D-aminocidos, pero se tiene la intencin de adaptarlo a la fabricacin de otros dos tipos (los L- y pticamente puros). Entre otras aplicaciones, estos ltimos destacan por su ya reconocido efecto antitumoral. Este descubrimiento tiene una gran importancia a nivel farmacutico ya que este sistema, similar para la produccin de -aminocidos, puede aplicarse en el desarrollo de precursores de medicamentos antitumorales o en el tratamiento del Parkinson. Esto es debido a que la creacin de un sistema enzimtico capaz de producir un nmero ms o menos amplio de este tipo de -aminocidos es muy interesante para la biomedicina. Una de las enzimas que se ha caracterizado, y que forma parte del sistema para la produccin de -aminocidos, es la amidohidrolasa N-carbamoilbeta-alanina. Se ha publicado en Applied and Envirionmental Microbiology, que la -alanina se distribuye de forma significativa en el sistema nervioso y acta como anlogo de diferentes inhibidores de neurotransmisores, por lo que podra estar vinculada a la transmisin sinptica.

V.

EMPRESAS QUE PRODUCEN O COMERCIALIZAN CON AMINOACIDOS

En Mxico existe una gran tradicin en cuanto a la utilizacin de los seres vivos, sus productos o sus partes para la produccin de satisfactores sociales y tambin en cuanto a la investigacin de los sistemas biolgicos. Un anlisis general revel que las empresas biotecnolgicas identificadas presentan las siguientes caractersticas: Tienen una dependencia tecnolgica casi total del extranjero y, en particular, a lo que se refiere a la infraestructura de investigacin y desarrollo. En su mayora son empresas identificadas dentro de la industria de alimentos, particularmente en la elaboracin de productos lcteos, levadura para panificacin y bebidas fermentadas. Los procesos que utilizan estas empresas son en su mayora de fermentacin o enzimticos. La investigacin y desarrollo que se realiza est asociado en gran medida al control de calidad de sus productos. Un grupo importante de empresas son las ubicadas en la industria qumicofarmacutica, entre las que predominan las productoras de antibiticos. Los procesos utilizados son fermentativos y/o enzimticos; destacan en esta industria, empresas mexicanas como Cibiosa, S.A. de C.V. Sin embargo, en la industria farmacutica la mayor parte de las empresas son transnacionales que realizan su investigacin fundamental y desarrollo en su casa matriz (Upjohn, Abbott Laboratories de Mxico, S.A. de C.V., etctera). Productos como las enzimas son elaborados por empresas como: Enmex, S.A., Quimorgan, Efensa, S.A. de C.V., entre las ms importantes; su actividad en investigacin es realizada con sus socios en el extranjero. Tambin hay empresas productoras de aminocidos tales como Fermentaciones Mexicanas, S.A. de C.V. y Enzimloga; esta ltima produce aspartame bajo licencia de Searle; sus actividades de I-D estn relacionadas con el desarrollo de innovaciones en productos y/o procesos. Sinbiotik Internacional Aminas y Derivados Bioteksa Box de Mxico Laboratorios Pisa Danamart Chemicals de Mxico Qumica Foliar Alltech y Aplied Science para Mxico Productos Tecnoqumicos Dorubiel Rosales America Alimentos Canamex Especialidades Qumicas Laboratorios Avilab Baja-Ital Bio-Zoo Difac Global Health Care International Cyanamid de Mxico

VI.

MTODOS DE PRODUCCIN

Entre los productos obtenidos por fermentacin destaca el mercado que ocupan los aminocidos. Se han desarrollado procesos de fermentacin para todos los aminocidos excepto para glicocola, L-cistena y L-cistina, pero no todos estos procesos de fermentacin se encuentran en uso a nivel comercial. En la fabricacin comercial de aminocidos existen tres procesos: 1. Sntesis qumica. La produccin de glicocola, D, L-alanina, D, L-metionina y D, Ltriptfano siempre implica sntesis qumica. La sntesis qumica es ms barata que la produccin microbiana pero el producto qumico es la mezcla pticamente inactiva de los ismeros D y L. Por ello se han establecidos procesos enzimticos para la resolucin ptica. La aminoacilasa es la enzima que presenta mayores ventajas en la obtencin de L-aminocidos, ya que se cataliza la siguiente reaccin:

2. Extraccin de aminocidos a partir de hidrolizados de protena. Este mtodo se utiliza para obtener L-cistena, L-cistina, L-leucina, L-asparragina y L-tirosina.

3. Produccin microbiolgica. Dentro de esta existen tres enfoques: a. Fermentacin directa de aminocidos utilizando diferentes fuentes de carbono, como glucosa, fructosa, melazas, hidrolizados de almidn, n-alcanos, etanol, glicerol, acetato, propionato, obtenindose altos rendimientos. Como ya se menciono, prcticamente existen para todos los aminocidos procesos de fermentacin desarrollados, pero en todos los casos se producen comercialmente por esa va. Acido L-glutmico La produccin de L-glutmico se realiza principalmente por fermentacin. Se conocen numerosos microorganismos capaces de producirlo a partir de diferentes fuentes de carbono. La ruta biosinttica para la obtencin del acido glutmico es conocida, a partir de glucosa como fuente de carbono utilizando la ruta metablica Embden-Meyerhof y el ciclo pentosa-fosfato se canalizan al ciclo de cidos tricarboxilicos. Las cepas comerciales son mutantes en el ciclo tricarboxilico, con un bloqueo de la alfacetoglutarato deshidrogenas, lo cual permite acumulacin de acido glutmico. La estequiometria de la reaccin con base a glucosa es de 1 mol de aminocidos por 1 mol de glucosa. Un proceso de fermentacin tpico de esta fermentacin se presenta a continuacin. En estos casos se logra que la bacteria convierte del 50 al 60 % de la fuente de carbono a acido L-glutmico, alcanzndose concentraciones de ms de 100 g/Lt, con una productividad del orden de 20 toneladas por metro cubico de fermentacin por ao.

Acido L-asprtico El acido L-asprtico se produce industrialmente a partir de acido fumrico y amonio por los mtodos de fermentacin o enzimtico, empleando la reaccin de la aspartasa:

Inicialmente se utiliz aspartasa de E. coli inmovilizadas para operar un proceso continuo; sin embargo, debido a que el precio del acido asprtico es bajo se buscaron otros mtodos alternativos. Como resultado de estas investigaciones se inmovilizaron clulas de E. coli con alta actividad de aspartasa en gel de poliacrilamida. Este proceso se comercializ operando en continuo con columnas empacadas de clulas inmovilizadas. Desde un punto de vista econmico este proceso es ms barato que la fermentacin y los procesos enzimticos en lote. Posteriormente la poliacrilamida fue sustituida por la K-carragenina como material de inmovilizacin de las clulas.

Inhibicin por retroalimentacin en la biosntesis de lisina y treonina

L-alanina Este aminocido se produjo en su inicio en un proceso lote a partir de acido L-asprtico usando la enzima L-aspartato 4-descarboxilasa de Pseudomona dacunhae.

Posteriormente las clulas de P. dacunhae fueron inmovilizadas en K-carragenina pudindose tener un proceso continuo ms eficiente. Con propsito de aumentar la productividad del sistema se inmovilizaron conjuntamente clulas E. coli con actividad de aspartasa y de P. dacunhae con actividad de 4-descarboxilasa alimentando como sustrato al reactor una solucin de fumarato de amonio. Las clulas contienen la enzima L-aspartato descarboxilasa y el reactor se opera a alta presin con el objeto que se disminuya la liberacin del CO2 que se forma como subproducto. En una columna de 1 metro cubico se pueden obtener 5.1 toneladas mensuales de L-alanina y 9.5 de acido D-asprtico. Esta productividad del acido D-asprtico es 6 veces ms alta que la de un reactor con aminoacilasa inmovilizada. L-serina La enzima serina hidroximetiltransferasa convierte reversiblemente la glicina y el formaldehido en L-serina en presencia del cofactor, acido tetrahidrofbico, de acuerdo con la siguiente reaccin:

Con el objeto de tener una cepa hiperproductora de la enzima se tradujeron copias mltiples del gene de la enzima de E. coli en Klebsiella aerogenes, logrndose que 10 % de la protena total de la bacteria fuese la enzima. La produccin de la enzima alcanzo los valores ms altos de actividad especfica cuando la fermentacin se realizo manteniendo bajas concentraciones de oxigeno disuelto. El biocatalizador se prepara con clulas completas permeabilizadas o bien con lisados celulares. Se obtuvo una productividad de 10 g de Lserina por litro de biorreactor por hora con una conversin molar de 80 % de glicina a Lserina. La relacin en concentraciones finales entre L-serina y la glicina residual es de 12:1, permitiendo la recuperacin de la L-serina por cristalizacin fraccionada y reciclando la glicina al reactor. Alternativamente el efluente del reactor puede ser usado como sustrato en la produccin de L-triptofano. L-triptfano El aminocido esencial triptfano puede ser producido por sntesis qumica, fermentacin a partir de azucares y mtodos enzimticos usando la triptofanasa o la triptfano sintetasa. La mayor parte de los mtodos qumicos producen mezclas D-L triptfano y aun cuando hay resolucin enzimtica se requieren pasos adicionales de proceso que incrementaba los costos. Se han descrito numerosas fermentaciones microbianas para la biosntesis de triptfano incluyendo el uso de cepas modificadas por ingeniera gentica. Por esta tcnica se ha incrementado la productividad de la fermentacin, pero la concentracin al final de la fermentacin continua siendo baja, 15 a 17 g/Lt.

Produccin enzimtica de aminocidos.

Aminocido
L-alanina cido L-asprtico

Enzima
Aspartato descarboxilasa Aspartasa Cistena desulfidrasa

Microorganismo productor de la enzima

Pseudomonas dacunhae E. coli

Reaccin
L-asp L-ala + CO2 Fumarato + cido L-asprtico -Clor-L-alanina + Na2S L-cistena + NaCl + NaOH Pirocatecol + Piruvato + NH4+ L-DOPA + H2O cido -cetoisocaproico + NH4+ + NADH Lleucina + H2O + NAD+ NH4+

Rendimiento (g/Lt)
600 560

Eficiencia (%)
100 99

L-cistena L-DOPA (L-3,4 Dihidroxifenilalan ina) L-leucina

Bacillus sphaericus

70

80-85

Tirosinasa L-leucina deshidrogenasa D-amino caprolactama racemasa L-amino caprolactama hidrolasa L-fenilalanina deshidrogenasa Acetamidocinna mato amido hidrolasa Fenilalanina amonio liasa Aspartato fenilalanina transaminasa Dhidroxicaproato deshidrogenasa Lhidroxicaproato deshidrogenasa L-fenilalanina deshidrogenasa Serinhidroximet il transferasa Serinhidroximet il transferasa Triptofanasa Serinhidroximet il transferasa -tirosinasa

Erwinia herbicola

59 42

95 Mx. 99.7

Bacillus sphaericus Achromobacter obae Cryptococcus laurentii Brevibacterium sp.

L-lisina

D,L aminocaprolactama + H2O L-lisina Fenilpiruvato + NH4+ L-fenilalanina + H2O cido acetamidocinamico L-fenilalanina cido Trans-cinmico + NH4+ L-fenilalanina L-aspartato + Fenilpiruvato Lfenilalanina + Oxalacetato D,L Fenillactato Fenilpiruvato Fenilpiruvato + NH4+ L-fenilalanina + H2O Glicina + HCHO Lserina Glicina + HCHO Lserina L-serina + Indol Ltriptfano + H2O Glicina + HCO L-serina L-serina + Fenol Ltirosina + H2O

100

100

37 8 94

Bacillus sphaericus Rhodotorula glutinis E. coli

18 30

70 98

L-fenilalanina

Lactobacillus casei Lactobacillus confusus Rhodococcus sp. Klebsiella aerogenes Klebsiella aerogenes E. coli Klebsiella aerogenes Erwinia herbicola

28 450

88 95 basado en indol

L-serina

L-triptfano

200

L-tirosina

26

61 basado en glicina

b. Conversin de productos intermediarios baratos, va biosntesis. Por ejemplo, la glicocola que es barata, puede ser convertida en L-serina. c. Uso de enzimas o clulas inmovilizadas, a veces en procesos continuos que implican reactores de enzimas unidas a membranas para la separacin de una mezcla racmica. En la siguiente tabla se muestran varios de los principales sistemas inmovilizados (enzimas o clulas) utilizados en la produccin de aminocidos.

Las ms comunes reacciones de este tipo son: La utilizacin de amino acilasas especificas de Aspergillus oryzae para cortar selectivamente un D, L aminocido sintetizado qumicamente, que haba sido qumicamente acetilado. De esta forma la forma L del aminocido es liberada selectivamente.

Pueden producirse L--aminocidos a partir de -cetocidos utilizando aminocidos deshidrogenasas. La deshidrogenasa ms utilizada es una enzima de cepas de Bacillus, como B. megaterium que requiere NADH como coenzima.

La D, L-5-hidantoinas monosustituidas que son producidas qumicamente con facilidad pueden ser convertidas mediante cortes enzimticos estereoespecficos en aminocidos Do L pticamente activos. El corte de hidantoina por Do Lhidantoinasa conduce a la produccin de D o L-N-carbamoilaminocidos. El residuo carbamoilo es eliminado qumica o enzimticamente con la carbamoilasa correspondiente. Las L-hidantoinasas han sido encontradas solamente en unas pocas bacterias, por ejemplo, Flavobacterium ammoniagenes, mientras que las Dhidantoinasas se encuentran en numerosas bacteritas, actinomicetos, levaduras y algunas cepas de Aspergillus. Adems del uso de este enfoque para la produccin de L-aminocidos puede tambin ser utilizado para la fabricacin de D-N-carbamoil aminocidos y Daminocidos que tienen un papel importante como precursores para la produccin de penicilinas y cefalosporinas.

En la siguiente tabla se muestra un resumen de los metodos industriales para la obtencion de aminoacidos. Tecnologa Proceso
Hidrlisis cida de protenas animales

Fecha de Aplicacin
Mediados del siglo XIX

Fundamento Tcnico-cientfico
Ataque de las protenas con cidos fuertes descomponindolas en pptidos y aminocidos.

Materias Primas Utilizadas

Residuos de mataderos. Subproductos industrias lcteas.

Productos Obtenidos
Pptidos y aminocidos. Alto contenido de impurezas procedentes de los cidos. Pptidos y aminocidos derivados. Difcil control del proceso y de los productos. Solo nueve aminocidos. Difcil eliminacin de toxinas del caldo de cultivo. Se obtienen aminocidos puros no biolgicamente activos en cantidades pequeas, gran pureza y muy caros. Todos los aminocidos fundamentales. Muy puros y biolgicamente activos. Oligopptidos similar a los Factores de Transcripcin Celular.

Observaciones Ventajas / Inconvenientes

Baratos. Uso muy limitado. Tecnologa Rudimentaria.

Hidrlisis enzimtica de protenas vegetales

En la dcada de 1970

Desintegracin de las protenas por medio de enzimas.

Residuos Vegetales. Protenas Vegetales.

Relativamente baratos. Peligro de alteraciones en las clulas.

Sntesis Microbiana Cultivo de microorganismos manipulados genticamente Sntesis qumica

1960

Activacin de microorganismos capaces de sintetizar aminocidos. Tecnologa japonesa.

Microorganismos. - Brevibacterium. - Corinobacterium manipulados genticamente.

Aminocidos baratos para alimentacin ganadera. No apto para uso agrcola o mdico. Uso como patrones en cromatografa. Su elevado coste impide su uso en otras reas.

1850 (A. Strecker 1956)

Reacciones qumicas. Unin de los elementos qumicos.

Diversos componentes qumicos.

Ingeniera biolgica

1982 Proceso INAGROSA

Rutas biosintticas celulares. Qumica del estado slido. Cromatografa HPLC.

Similares a las de pre sntesis celular (piruvatos).

Muy puros, biolgicamente activos y estables. Uso Universal: agricultura, medicina, cosmtica, etc. Precio Competitivo.

VII.

CONTROL DEL PROCESO DE FERMENTACIN

La produccin de aminocidos se lleva a cabo en procesos discontinuos durante 2-4 das en fermentadores que contienen hasta 450 m3. Se han desarrollado mtodos que utilizan procesos continuos pero no han sido todava implementados en plantas comerciales. Debido a la alta velocidad de degradacin de los azcares y a la alta actividad respiratoria durante la fermentacin se produce un gran requerimiento de oxigeno. Las velocidades ptimas de aireacin para cada proceso individual dependen de las cepas, el sustrato y la va biosinttica. El exceso de calor debe ser disipado simultneamente ya que el proceso que se lleva a cabo a temperaturas de entre 28 y 38C. El pH se mantiene constante entre 6.8 y 8.0, dependiendo del proceso; frecuentemente se utiliza NH3 gaseoso para el control del pH y se metaboliza simultneamente como fuente de nitrgeno. Durante el proceso de fermentacin de aminocidos los parmetros crticos como la velocidad de aireacin, la temperatura, el pH y la dosis de antiespumante son todos regulados automticamente y en unos pocos casos estn bajo el control de un ordenador (Crueger, 1993). Se han desarrollado biosensores que permiten la medida continua de la concentracin de aminocidos en el fermentador. Por ejemplo, se ha preparado un sensor de cido glutmico utilizando como enzima glutamina sintetasa obtenida de la bacteria termfila Bacillus stearothermophilus. Se han desarrollado varios mtodos para la evaluacin de los aminocidos en el caldo de cultivo. Estos mtodos incluyen el anlisis qumico, cromatografa en papel, anlisis colorimtricos, cromatografa gas-lquido, espectrometra de masas, espectroscopia de infrarrojo de intercambio inico y la cromatografa lquida de alta resolucin. Tambin se han descrito mtodos de cromatografa en papel utilizando un sistema disolventes compuesto por n-butanol, cido actico y agua en una proporcin de 2:1:1.

VIII.

PUNTOS CRTICOS DEL PROCESO DE PRODUCCIN DE AMINOCIDOS PORM FERMENTACIN

Un proceso industrial se desarrolla con xito cuando se pasa de manera adecuada desde la idea original, que se prueba a nivel de laboratorio, hasta el proceso a gran escala. Ello no consiste, simplemente en aumentar la cantidad de materia calculada para el proceso original, sino que se debe de tener en cuenta otros parmetros que consideren los problemas que surgen al trabajar a gran escala. Ello lleva consigo que las tcnicas y materiales que se utilizan el proceso industrial son bastante diferentes de los utilizados en el sistema original a pequea escala. Los fenmenos biolgicos, por su parte, ofrecen un problema por s solos, ya que operan a concentraciones muy diluidas tanto de los sustratos como de los productos aun despus de intensificar el proceso. Para el desarrollo de los procesos biolgicos el trabajo se centra principalmente en tres reas: el desarrollo del organismo, el desarrollo del medio y la ingeniera de la fermentacin. La ingeniera de la fermentacin es la rama de la tecnologa que estudia el desarrollo, construccin y operacin de la planta y el equipo utilizado en los procesos biolgicos a escala industrial. Las condiciones ambientales existentes dentro de un fermentador puede considerarse bajo tres aspectos diferentes: biolgicas, qumicas y fsicas. El medio biolgico es favorable para un proceso biolgico cuando nicamente los organismos que contribuyen al proceso en cuestin se encuentran presentes, mientras que los no productivos, destructivos o no deseados se encuentran excluidos llevan consigo lo llevan tambin consigo que los organismos deseados se encuentran presentes en cantidades suficientes para llevar a cabo el proceso deseado a un ritmo que sea rentable, aunque se asume normalmente que ello de deriva, simplemente, de mantener unas condiciones ambientales adecuadas. Un sistema que contenga solamente el organismo deseado se dice que es asptico. La asepsia se consigue en la prctica eliminando todos los organismos vivos, es decir, esterilizando, e introduciendo despus el organismo deseado. Alcanzar las condiciones aspticas es caro, lo mismo que es mantenerlas, por lo que el diseo, construccin y operacin de la planta no deber de ser ms riguroso de lo que sea estrictamente indispensable. Se deber de tener en cuenta, por tanto, el riesgo de contaminacin del proceso as como los costos que la contaminacin trae consigo y el de prevencin de la contaminacin para obtener el balance ms adecuado. La infeccin debida a bacterifagos puede causar prdidas considerables en la produccin. Para evitar la infeccin fgica pueden ser utilizados mutantes resistentes a fagos y agentes qumicos que inhiben la reproduccin de fagos. Una investigacin intensa sobre el mantenimiento de cultivos puros (esterilizacin del equipo, medio y aire) se sta llevando a cabo; la esterilizacin de las soluciones de nutrientes tiene lugar generalmente en forma continua. El medio fsico se refiere fundamentalmente a la temperatura del sistema que hace que su control se tenga muy en cuenta cuando se disea un fermentador. Este requerimiento y la

necesidad de mantener la uniformidad de las condiciones a lo largo del fermentador, lleva consigo la necesidad de una buena agitacin, lo que a su vez provoca la ruptura de los organismos y sus agregados. Debe sealarse que cuando se mantiene un ambiente favorable, los parmetros ambientales no tienen que parecer constantes a lo largo del tiempo. La fermentacin por cargas pasa por diferentes fases de crecimiento que tienen diferentes condiciones optimas, de modo que la fermentacin parece estar programada de acuerdo con la disponibilidad de los nutrientes, que cambian a lo largo del tiempo, el pH o la temperatura, para que aparezcan, de acuerdo con estos cambios las sucesivas fases de crecimiento. Dentro del fermentador se deben de mantener un ambiente controlado y debidamente cerrado, al mismo tiempo que se mantenga una estrada y salida asptica tanto para el medio del nutriente como para el aire y los fluidos de control, as como para los sistemas de calefaccin, enfriamiento y agitacin. Las reglas bsicas para el diseo y construccin de plantas de funcionamiento asptico se basan en el principio de que los microorganismo son muy pequeos, de un tamao mucha menor que las tolerancias normales en ingeniera. Ello quiere decir que lo que se considera un cierre hermtico en un sistema no biolgico, puede permitir el paso libre de microorganismos. La aplicacin estricta de las normas para el trabajo asptico repercute en el costo y en la dificultad de construccin, operacin y mantenimiento de la planta y deber aplicarse solamente despus de un estudio realista de los riesgos y costos resultantes en la contaminacin. Cuando se opera de una forma estrictamente anaerbica debe de mantenerse la integridad mecnica de la planta. Los puntos de entrada a las zonas aspticas de la planta, tales como las uniones de cierre mecnicos de los ejes de los agitadores y bombas, los cierres de las vlvulas, los puntos de entrada para la toma de muestra, constituyen posibles puntos de contaminacin y deber de limitarse su nmero lo ms posible. La estructura deber sellarse en su totalidad sin cierres mecnicos tales como los cierres apretados o con tornillos que deben de sustituirse por uniones soldadas. Los problemas de mantenimiento que resultan de este tipo de instalaciones, en donde quitar o reemplazar un componente exige cortar y volver a soldar se justifican con los menores riesgos de contaminacin debido a que las juntas mecnicas se sueltan por la vibracin, o la expansin y contraccin trmica que acompaa a los ciclos de esterilizacin. Cuando estos sierres no puedan sustituirse se debe rodear por una camisa de vapor. Todas las conexiones con la zona asptica de la plata deben estar protegidas con vapor, lo que incluye a los vstagos de la vlvula utilizadas para controlar el flujo del lquido en las tuberas y el flujo de vapor que va a los sistemas de salida de vapor, de la misma manera que no deben existir conexiones directas entre la zona estril y no estril de la planta. Las tuberas se deben de mantener bajo presin de vapor cuando no se usen y deben construirse con una pendiente que las haga verter sobre un determinado punto, de manera que no se acomode el lquido en su interior. El vapor se introduce en la parte superior de la pendiente de manera que la condensacin se pueda drenar al final de la tubera. En algunas operaciones el drenaje se mantiene abierto para que fluya continuamente, aunque este vapor pueda crear una atmosfera enrarecida en la planta. El diseo de la plata en general debe

evitar zonas de estanco, espacios muertos, bolsas, ramificaciones en las tuberas y ranuras que, no solo recolecten lquido estancado y microorganismos, sino tambin dificultan el proceso de fermentacin aumentando tambin el riesgo de correccin.

El material que se utiliza para la construccin de los fermentadores de gran tamao es el acero inoxidable de la calidad adecuada. Dependiendo de su formulacin, el acero inoxidable posee diferentes propiedades mecnicas, de resistencia a la corrosin, facilidad de fabricacin, disponibilidad y costo. Las vlvulas se requieren para regular el flujo lquido y debe resistir lquidos calientes y fros que contengan partculas solidas en suspensin y vapor de agua. Puesto que estas son puntos de unin o cierre mecnico representan un cierto grado de infeccin y/o contaminacin. Las vlvulas de diafragma se emplean ampliamente en la fermentacin mientras que, para las condiciones estrictamente aspticas, se emplean las vlvulas de pistn con vstago sellado al vapor. Las bombas deben evitarse, en lo posible, debido a que implica componentes mviles que aumentan el riesgo de contaminacin, aunque puede limitarse el riesgo interponiendo un punto de esterilizacin entre la bomba y la zona estril. El movimiento del fluido debe realizarse mediante gravedad o por presin de gas estril. Las bombas centrifugas se emplean en la industria biolgica siendo la unin del eje mvil el punto de mayor riesgo, por lo que en los casos de condiciones estrictamente aspticas se deben utilizar bombas de pistn cerradas al vapor. Para facilitar la operacin, las diferentes secciones de la planta deben esterilizarse independientemente, aunque estn conectadas a travs de una vlvula de presin para impedir que la zona no estril de la planta entre en contacto con la estril. Las vlvulas se protegen mediante vapor que pasa a travs de los vstagos, mientras que las tuberas que unen las unidades y se mantienen estriles pasando vapor a travs de las vlvulas y disponiendo de una salida para que salga el lquido procedente del vapor condensado. Una planta de gran tamao puede tener un nmero elevado de sistemas de cierre de este tipo, de manera que la esterilizacin de las distintas unidades y la transferencia de material a travs

de la planta implican cientos de operaciones con vlvulas, instrumentos y bombas. Las condiciones de asepsia estricta se controlan continuamente, lo mismo que se controla el estado fsico de la planta, las secuencia de operaciones, el grado de preparacin de operador, los riesgos de la planta y la integridad tcnica de estar mediante un sistema de choque continuo. Ello implica comprobaciones de los cierres estriles, perdidas en los cierres, vlvulas y soldaduras, sumidero de vapor, registro de temperatura, anlisis de los riesgos de la esterilidad y mantenimiento. Esterilizacin del aire. La esterilizacin del aire que proporciona el oxigeno en un proceso aerbico, adems de ser vital, representa una demanda de energa muy importante. Un fermentador tpico necesita varias toneladas de aire que deben, en principio, estar libre de microorganismos. Aunque durante la compresin del aire se produce una esterilizacin parcial, el mtodo ms utilizado es la filtracin, en el que el aire pasa a travs de una almohadilla de material fibroso. El efecto del espesor de la almohadilla es logartmico con respecto a la eliminacin de partculas ya que cada unidad de espesor del filtro elimina la misma proporcin de partculas que pasan a travs de l. Esto quiere decir que, aunque los filtros ms espesos eliminan ms partculas, se necesitara un espesor infinito para eliminar todas las partculas del aire. El filtro se esteriliza normalmente pasando a travs de l una corriente de vapor o bien calentndolo elctricamente. Para conseguir una esterilizacin absoluta de aire habra que pasarlo a travs de filtros con poros o aperturas suficientemente pequeas para que impidan el paso de partculas tan pequeas como una fraccin de una micra, que atrapara a las esporas microbianas o a las partculas de virus. No obstante, tales filtros son caros, se obstruyen fcilmente y requieren ser sustituidos con frecuencia, lo que provoca una fuerte cada de presin. Los materiales que se utilizan para los filtros de esta naturaleza son el papel, la cermica no viriada y el papel de parafina o los tapones de plstico poroso.

IX.

CEPAS UTILIZADAS EN LA PRODUCCIN MICROBIOLGICA DE AMINOCIDOS

En 1908 se aisl el cido glutmico de un alimento autctono oriental por lo que se empez a producir comercialmente a partir de la hidrlisis de protenas. En 1957 se asla una cepa microbiana capaz de producir y secretar al medio aproximadamente 1 g/ Lt de cido glutmico. Desde entonces se aislaron muchas cepas capaces de acumular ms de 30 g/Lt del aminocido. Se utiliza un cierto nmero de bacterias Gram positivas, dependientes de biotina, de los gneros Corynebacterium, Brevibacterium, Arthhrobacterium y Microbacterium. Estos gneros no esporulados, inmviles y con forma de coco o cocobacilo estn taxonmicamente relacionados (contenido en guanosinacitosina del DNA 51.2 54.4 moles %) y se conocen como bacterias de cido glutmico. Pueden emplear glucosa, acetato o etanol como fuentes de carbono. No crecen en metanol pero algunas cepas lo hacen en alcanos (Wiseman, 1986). Las cepas productoras de cido glutmico se caracterizan por: Su requerimiento de biotina (auxotrofas) Por poseer una muy baja actividad de la enzima -ceto glutarato deshidrogenasa. Predominio de las vas anapleroticas Cuando se cultivan estas bacterias dependientes de biotina en un medio limitante de biotina en biotina tiene lugar un descenso en el contenido de fosfolpidos de la membrana celular. La disminucin que se produce en la permeabilidad de la membrana facilita la secrecin de cido glutmico. La permeabilidad puede aumentarse mediante la adicin de penicilina y agentes surfactantes al medio, hasta el extremo de que a veces la produccin puede tener lugar en presencia de un exceso de biotina.

Regulacin de la sntesis de lisina en Brevibacterium flavumn y Corynebacterium glutamicum. La represin impide la biosntesis de la enzima, mientras que la retroinhibicin interrumpe la actividad de la enzima.

Corynebacterium glutamicum es una bacteria Gram-positiva del suelo que ha sido modificada para producir grandes cantidades de aminocidos. Desde hace varias dcadas, esta bacteria se utiliza en los procesos de fermentacin industrial y proporcionar la totalidad de L-glutamato y L-lisina, de la produccin mundial (cerca de 1.45 x 106 toneladas por ao) (Bayan, 2003). C. glutamicum tambin se utiliza para producir otros aminocidos de menor importancia industrial. C. glutamicum pertenece al suborden de las Corynebacterineae, un suborden de los actinobacterias que incluye micobacterias, corinebacterias, nocardia y rhodococcus. Aunque los microorganismos que excretan cido glutmico se encuentran fcilmente en la naturaleza ha sido ms difcil obtener aislados naturales que excreten otros aminocidos para la produccin a gran escala. Se ha llevado a cabo una intensa bsqueda para el aislamiento de solamente unas pocas cepas que excreten D, L-alanina y D-valina. Los microorganismos aislados naturalmente rara vez excretan estos aminocidos, ya que el metabolismo celular regula su produccin. En el desarrollo de cepas existen varios mtodos para eliminar el control por regulacin: a. El uso de mutantes auxotrofos que ya no pueden formar efectores o co-represores (generalmente productos finales) y excretan los intermediarios de la va biosinttica que se encuentran justo por delante del bloqueo. b. El uso de mutantes regulatorios. Por ejemplo, si se produce un exceso de producto al final de una va biosinttica ramificada pueden ser seleccionados mutantes con una enzima clave insensible a la autorregulacin, bien a partir de cepas resistentes a antimetabolitos o a partir de una poblacin de revertientes procedentes de auxotrofos. c. El uso de recombinacin gentica para combinar mutantes auxotrofos o regulatorios a partir de diferentes cepas en una cepa hibrida nica. Estas cepas mutantes pueden obtenerse:

Usando fagos

Si dos fagos infectan a una misma bacteria, se dan las condiciones propicias para poder obtener entrecruzamientos y recombinacin en el genoma vrico. Este fenmeno suele denominarse coinfeccin. Se obtienen en la progenie virus que poseern el fenotipo parental y otros individuos que sern recombinantes. Cuando ocurre la coinfeccin, si los genomas no mantienen contacto, entonces no podr darse entrecruzamiento. Se pueden hacer mapas segn los datos de recombinantes que se obtengan.

Usando plsmidos vectores

Los plsmidos son molculas de ADN circulares, presentes en el citoplasma de las bacterias que pueden extraerse de las mismas e incorporarse a otras, a travs del proceso de transformacin. Los plsmidos han sido modificados para ser empleados como vectores. As, el gen de inters puede insertarse en el plsmido-vector e incorporarse a una nueva clula. Para seleccionar las bacterias que reciben el plsmido, ste lleva, adems del gen de inters (el gen para la produccin de un aminocido especfico), un gen marcador de seleccin (por ejemplo resistencia a un antibitico), que le otorga a la bacteria que lo lleva la capacidad de sobrevivir en un medio de cultivo selectivo (medio con antibitico, en este ejemplo). Las clulas que sobreviven se dividen y generan colonias, formadas por bacterias idnticas. Estas bacterias se denominan recombinantes o genticamente modificadas. El plsmido recombinante puede aislarse de estas colonias y transferirse a otras clulas.

Usando fusin de protoplastos para combinar cepas con caractersticas deseables (Genome shuffling)

La tcnica de fusin de protoplastos surge como especialidad o aplicacin a partir de las tcnicas de aislamiento y cultivo de protoplastos, que permiten la obtencin de clulas desprovistas de pared celular gracias a la accin de enzimas lticos (celulasas, pectinasas) obtenidos de microorganismos (Aspergillus sp.; Trichoderma viride; Rhizopus sp.), y su posterior crecimiento (divisin celular, formacin de microcallos y regeneracin de plntulas por va organognica o embriognica). Una de las principales dificultades para lograr la sobreproduccin de aminocidos por fermentacin es que los aminocidos son productos de vas multienzimticas, por lo tanto, es preciso tener un gran conocimiento de la regulacin de la va para identificar la enzima que debe clonarse (Garca, 2004). Los experimentos inciales se llevaron a cabo en E. coli. La siguiente etapa del desarrollo de metodologas recombinantes para hiperproduccin de aminocidos es para lela al desarrollo de los sistemas de clonacin en corinebacterias. Inicialmente, se introdujeron genes de E. coli para tratar de incrementar el nmero de copias. Por otra parte, el desarrollo de vectores propios y de sistemas de transformacin de protoplastos ha logrado hasta triplicar la produccin de aminocidos en Brevibacterium.

Fusin de protoplastos para cepas que pueden recombinar en forma mittica.

En la siguiente tabla se presenta una lista de cepas que se utilizan para la produccin microbiana de aminocidos, sus caractersticas genticas y los rendimientos obtenidos.

Produccin de aminocidos por fermentacin Aminocido

D, L-alanina L-alanina L-arginina cido Lasprtico cido Lglutmico

Cepa utilizada
Microbacterium ammoniaphilum Pseudomonas Nr. 483 Serratia marcescens AT 428 (aru argR2 argA2) Escherichia coli Ki1023* Corynebacterium glutamicum Brevibacterium flavum Arhrobacter paraffineus Corynebacterium glutamicum Serratia marcescens L120 (pSH 368) Brevibacterium flavum Brevibacterium lactofermentum B. lactofermentum AJ 11204 B. flavum

Caractersticas genticas
Arginina hidroxamato Cepa silvestre Transduccin Canavanina

Rendimiento (g/Lt)
60 17.5 50 56 100

Fuente de carbono
Glucosa Glucosa Glucosa cido fumrico Glucosa Acetato n-alcanos Glucosa, con alta biotina y contenido en NH4Cl Sacarosa Acetato Glucosa Glucosa Acetato Glucosa Glucosa

Cepa silvestre

98 82 58

L-glutamina

Cepa silvestre

L-histidina L-isoleucina L-leucina

rDNA Etionina Isoleucina Metionina 2-tiazolalanina S-(-aminoacetil)-Lcistena Alanina Homoserina Treonina Treonina Etionina Metionina hidroxamato Arginina 5-metiltriptfano p-fluorofenilalanina Decoyinina Tirosina Metionina Mutante no caracterizado Sulfaguanina rDNA rDNA p-fluorofenilalanina p-aminofenilalanina p-aminotirosina Tirosina hidroximato 2-tiazolalanina

40 30 28 70 75 2 26

L-lisina

L-metionina L-ornitina

C. glutamicum KY 9276 C. glutamicum

L-fenilalanina

B. lactofermentum

25

Glucosa

L-prolina L-serina L-treonina L-triptfano L-tirosina L-valina

C. acetoacidophilum B. lactofermentum E. coli VL344 (pYN7) E. coli JP4114 C. glutamicum Pr-20 B. lactofermentu Nr. 487

108 4.5 55 23.5 18 31

Glucosa + cido glutmico Glucosa Sacarosa Glucosa Glucosa Glucosa

*Mtodo utilizado para la produccin de cido L-asprtico entre 1960-1973.

X.

RECUPERACIN DE PRODUCTOS

Los aminocidos se encuentran presentes en caldos de fermentacin o en corrientes de procesado en baja concentracin y en presencia de otros compuestos qumicos similares. Su separacin y purificacin son etapas cruciales en la optimizacin del proceso productivo de las industrias biotecnolgicas. El nmero de etapas necesario para la recuperacin de aminocidos y bioproductos depende de la materia prima utilizada, de la concentracin y propiedades fsico-qumicas del producto y del grado de purificacin necesario (Blanch, 1996). Las operaciones unitarias de recuperacin de aminocidos pueden agruparse en las siguientes categoras: Etapas inciales. Se realiza la separacin de materiales insolubles tales como la biomasa celular, las protenas agregadas y los nutrientes insolubles, empleando como operaciones de separacin la sedimentacin, centrifugacin y filtracin. Etapas intermedias. Hacen referencia al aislamiento del producto de inters, eliminando las impurezas. En esta categora se emplean operaciones de extraccin, ultrafiltracin, intercambio inico, cromatografa, dilisis y electrodilisis. Purificacin final. Los productos farmacuticos, teraputicos y alimentarios requieren una pureza elevada. En esta etapa se requieren operaciones de cristalizacin y precipitacin, llevadas a cabo por modificacin del pH del medio, adicin de sales o de disolventes orgnicos, que producen una variacin drstica de la solubilidad del aminocido. El proceso de purificacin finaliza con el secado del producto.

A continuacin se describen brevemente alguna de las tcnicas ms utilizadas para la separacin y purificacin de aminocidos:

1. Extraccin con Disolventes La extraccin es una tcnica muy utilizada en la separacin de aminocidos. La extraccin reactiva de aminocidos con disolventes conlleva la transferencia desde los caldos de fermentacin o corrientes de procesado hacia una fase orgnica, que contiene generalmente un extractante selectivo, seguida de la reextraccin y concentracin del producto en una fase acuosa de reextraccin, donde se obtiene el producto concentrado. La recuperacin final normalmente se lleva a cabo mediante precipitacin, cristalizacin o evaporacin (Escalante, 1998). Otra aplicacin de la extraccin con disolventes es la extraccin mediante micelas inversas. Las micelas inversas son micro gotas de disolucin acuosa, dispersas en una fase orgnica continua y estabilizada por un surfactante. Esta tecnologa ha sido aplicada a la extraccin de protenas y de aminocidos (Dzygiel, 2000).

Las unidades de proceso donde se realiza convencionalmente la extraccin son bateras de mezcladores-sedimentadores o torres de extraccin. Uno de los requisitos necesarios en estos equipos es la existencia de una diferencia de densidades entre las fases en contacto para que se produzca la separacin de las mismas. La extraccin con disolventes por contacto directo de las fases presenta la limitacin de la formacin de emulsiones estables que evitan la posterior separacin de las fases, provocando la prdida del producto de inters en la formacin de terceras fases. En las torres de extraccin, adems, existen problemas relacionados con la inundacin de la torre y la formacin de caminos preferentes. Como alternativa a los procesos convencionales se pueden utilizar procesos hbridos de extraccin con membranas con diferentes tecnologas: Microfiltracin / Ultrafiltracin de emulsiones y soluciones coloidales

Se fundamenta en la accin de tamizado impuesta por la membrana para separar el permeado, formado por la fase de refinado, del retenido, formado principalmente por la fase de extracto. En el caso de la microfiltracin se utilizan membranas de estructura simtrica, con tamao de poro comprendido entre 0,05 m y 10 m, y la diferencia de presin intermembranal suele ser inferior a 2 bar. Las membranas de ultrafiltracin son asimtricas, con tamao de poro entre 0,05 m y 1 nm. La diferencia de presin transmembranal suele ser inferior a 5 bar. Las tcnicas de filtracin con membranas tienen como principales inconvenientes el ensuciamiento de la membrana y la polarizacin por concentracin. Membranas lquidas

Las membranas lquidas consisten en una pelcula lquida que separa dos fases entre s. Estas fases pueden ser bien lquidas o gaseosas. La fuerza impulsora del transporte es un gradiente de potencial qumico. La separacin de los distintos componentes se va a producir debido a diferencias de solubilidad y difusividad en la membrana lquida (Mulder M., 1991).

2. Electrodilisis En este proceso se utilizan membranas intercambiadoras de iones para eliminar solutos cargados de disoluciones acuosas. Entre el nodo y el ctodo se colocan de forma alterna un nmero determinado de membranas intercambiadoras de aniones y de cationes. Estos sistemas utilizan una corriente elctrica para transportar los iones a travs de la membrana. La electrodilisis se aplica a la separacin de aminocidos debido a su carcter anfotrico, a pH alto los aminocidos tienen carga negativa y migrarn hacia el nodo y a pH bajo los aminocidos cargados positivamente migrarn hacia el ctodo. Si el pH es igual al punto isoelctrico del aminocido, el aminocido no migrar. As los diferentes aminocidos pueden ser separados ajustando el pH de la disolucin que los contiene.

Esta tecnologa ha sido aplicada a la separacin de cido glutmico, metionina y L-lisina utilizando dos tipos de membranas cargadas inicamente (Kikuchi, 1995). El principal inconveniente de la electrodilisis es que las membranas tienden a presentar problemas de hinchamiento permitiendo, as, el paso de solutos a travs de las membranas por mecanismos de difusin. Otro problema habitual es el inherente a la electrolisis del agua, disminuyendo la eficacia de la separacin. Adems las membranas deben tener elevada conductividad elctrica junto con una buena resistencia mecnica, lo que eleva los costos del proceso.

3. Precipitacin La precipitacin es una tcnica comnmente utilizada en la purificacin de protenas, aminocidos, antibiticos y biopolmeros. La tendencia de los aminocidos y protenas a precipitar depende de varios factores, como son el disolvente, concentracin de sal, constante dielctrica, pH, la temperatura, la forma, tamao y carga de la protena (Blanch, 1996). Una de las estrategias ms comunes de producir la precipitacin de aminocidos y protenas es alterando las propiedades del disolvente. Los mtodos de precipitacin ms comunes se describen a continuacin: Variacin del pH del medio

El pH del medio es un factor decisivo en la solubilidad. Para valores de pH superiores o inferiores al punto isoelctrico, la molcula de aminocido se encuentra cargada y las molculas de agua reaccionan con estas cargas favoreciendo la solubilizacin. Cuando el pH del medio se encuentra prximo al punto isoelctrico las interacciones con el agua y sus cargas netas son mnimas, pudiendo conducir a su precipitacin. La etapa final de recuperacin de aminocidos puede llevarse a cabo por precipitacin, llevando la disolucin a pHs cercanos al punto isoelctrico, donde la solubilidad es mnima, y el aminocido precipita. Salting-out

La adicin de sales a disoluciones de protenas tiene un efecto significativo sobre la solubilidad de las protenas. A bajas concentraciones la solubilidad aumenta por efecto salting-in y disminuye para elevadas concentraciones, por efecto salting-out. Las sales neutras tienen, en general una doble influencia sobre la solubilidad. A concentraciones bajas actan disminuyendo las interacciones electrostticas aminocido-aminocido y aumentado la solubilidad. A concentraciones ms altas, las sales neutras disminuyen la solubilidad de los aminocidos y protenas como consecuencia de la tendencia de los iones salinos a la hidratacin. Al igual que las protenas, la solubilidad de los aminocidos es funcin de la concentracin.

Reduccin de la constante dielctrica del medio

Uno de los mtodos de precipitar aminocidos y protenas ha sido mediante adicin de disolventes orgnicos, como etanol y acetona, los cuales disminuyen su solubilidad. La capacidad del etanol para precipitar aminocidos y protenas se debe a los cambios que produce en la constante dielctrica del medio, aumentando las interacciones electrostticas al disminuir la constante dielctrica debido a la adicin de etanol (Cohn, 1943). Este aumento de las interacciones electrostticas se ha relacionado con el aumento de las interacciones aminocido-aminocido, lo que conduce a su precipitacin

XI.

PRUEBAS DE SEGURIDAD DE LOS AMINOCIDOS

Los aminocidos obtenidos por fermentacin microbiana no son otra cosa que productos biolgicos. A estos productos se les llama de esta manera porque han sido elaborado con materiales de partida de origen biolgico, tales como microorganismos, rganos y tejidos de origen vegetal o animal, clulas o fluidos de origen humano o animal y diseos celulares (sustratos celulares, sean o no recombinantes - incluidas las clulas primarias) as como otros de origen biotecnolgico que se obtienen a partir de una protena o cido nucleico por tecnologa de ADN recombinante. Este tipo de productos biolgicos son extremadamente ms complejos que la mayora de los medicamentos convencionales ya que tienen un peso molecular mucho ms alto y una complejidad mayor; pueden ser mezclas de muchas especies moleculares que tienen perfiles de impureza nicos, los cuales invariablemente dependen del proceso de manufactura. Por otro lado, la respuesta de los productos biolgicos depende de los materiales con los que se haya comenzado su produccin; stos estn hechos a partir de sistemas vivos que inherentemente son variables. Cualquier cambio en el proceso de manufactura por menor que sea, conlleva a cambios en el producto que no necesariamente son detectables por la tecnologa actual, pero pueden tener impacto potencial en la calidad, seguridad, y/o eficacia del producto. Para asegurar la consistencia en las caractersticas de los productos finales as como en los perfiles de seguridad y eficacia, tanto la fuente del material como los procesos de manufactura, la formulacin y las condiciones de almacenaje deben ser cuidadosamente seguidos y controlados de acuerdo a las especificaciones que se necesitan para su aprobacin regulatoria. Como ya vimos, los aminocidos que deben de tener un control sobre su seguridad ms riguroso son aquellos cuyo propsito es ayudar a restablecer la salud de los seres humanos a partir de terapias deficitarias. Por los motivos descritos en los prrafos anteriores, se puede inferir que para efectuar el registro de productos biolgicos/biotecnolgicos no deberan aplicarse los criterios estndares de cualquier medicamento comn o suplementos alimenticios, tal como se lo conoce en la normativa actual de diferentes pases; dichos criterios deben limitarse a los productos obtenidos por sntesis qumica. Sin embargo, este tipo de productos deben cumplir en criterios tanto de calidad, como de seguridad y eficacia tanto a niveles clnicos como no clnicos. Aunque la principal preocupacin en los productos biolgicos es la seguridad, es importante que tanto en los estudios clnicos como en el seguimiento de frmaco vigilancia post-comercializacin se observen problemas potenciales como la inmunogenicidad y posterior falta de eficacia.

Para establecer con un razonable nivel de certeza, que las diferencias en los procesos de produccin del producto no afectarn la seguridad y/o eficacia del producto para los pacientes, no es suficiente tener slo la experiencia en la elaboracin de dicho producto sino que se requieren los siguientes controles: Control durante el proceso de produccin. Estudios de toxicidad. Estudios de inmunogenicidad, ya que pequeas variaciones en la molcula pueden generar reacciones alrgicas severas y de consecuencias imprevisibles. Lo ms importante: estudios clnicos que demuestren la eficacia.

Inmunogenicidad Los problemas de inmunogenicidad son quiz, las razones ms convincentes para la imposicin de pruebas clnicas humanas. (Salinas, 2007). Todas las protenas tienen un potencial inmunognico; esto implica la posible aparicin de anticuerpos dirigidos contra las molculas biolgicas con el fin de desactivarlas incluso, la produccin de anticuerpos que atacan el producto biolgico original. De igual forma, es posible la aparicin de una enfermedad autoinmune. La ruta de administracin, es un factor potencial en la provocacin de anticuerpos: la va intravenosa produce menos inmunogenicidad que la ruta subcutnea intramuscular. An el mismo producto elaborado en diferentes lugares, ocasiona considerables diferencias en la inmunogenicidad - sin mostrar diferencias en las caractersticas fsico-qumicas. La calidad del bioproducto influencia la inmunogenicidad: un producto con grumos induce a que las clulas B produzcan anticuerpos, mientras que un producto soluble de alta calidad mantiene la tolerancia. Los factores que afectan la inmunogenicidad estn bsicamente relacionados con el producto y son principalmente: la secuencia de aminocidos, glicosilacin, pureza, excipientes, estabilidad, dosis y vas de administracin, intervalo de dosis, sistema inmune del husped y el almacenaje. Se ha demostrado, por ejemplo, que impurezas y contaminantes son la causa principal de la inmunogenicidad en la hormona de crecimiento humano y en la insulina. La importancia de la inmunogenicidad La inmunogenicidad se refiere al proceso mediante el cual, el cuerpo humano se encarga de generar una respuesta a la introduccin de una protena u otra sustancia extraa. La respuesta humana en estos casos, es producir anticuerpos que se ligan a las protenas extraas, desactivndolas y formando un complejo antgeno-anticuerpo que puede llevar a serias complicaciones y efectos adversos (Salinas, 2007). La inmunogenicidad representa la preocupacin actual de seguridad ms importante relacionada con los productos biolgicos; principalmente se asume que es imposible de caracterizar, en ausencia de pruebas clnicas en humanos.

XII.

REFERENCIAS Y BIBLIOGRAFA CONSULTADA

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