EL ESTRS CRNICO COMO ELEMENTO POTENCIADOR DE LA DEGENERACIN DE LAS NEURONAS DEL HIPOCAMPO INDUCIDA POR INFLAMACIN.

POSIBLE IMPLICACIN EN ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

AUTORA: ANA MARA ESPINOSA OLIVA

EL ESTRS CRNICO COMO ELEMENTO POTENCIADOR DE LA DEGENERACIN DE LAS NEURONAS DEL HIPOCAMPO INDUCIDA POR INFLAMACIN. POSIBLE IMPLICACIN EN ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS

ANA MARA ESPINOSA OLIVA

EDITA: CSIF ENSEANZA SEVILLA

 Ana Mara Espinosa Oliva email: espinosaoliva@hotmail.com Diseo de portada e imgenes: Ana Mara Espinosa Oliva. Todas las imgenes que aparecen en esta obra han sido elaboradas por el autor o son de dominio pblico. EDITA: CSIF Enseanza Sevilla. Impreso en Espaa Printed in Spain ISBN: 978-84-693-3572-7 Depsito Legal: SE 4175-2010
Reservados todos los derechos. Queda rigurosamente prohibida, sin la autorizacin escrita del autor, la reproduccin total o parcial de esta obra por cualquier medio o procedimiento, bajo las sanciones establecidas en las leyes, incluidos la reprografa y el tratamiento informtico.

PRLOGO

Los resultados publicados en este libro han sido la base de mi tesis doctoral, realizada en el Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Sevilla. La tesis, dirigida por el Doctor D. Alberto Machado de la Quintana y codirigida por las Doctoras D. Roco Martnez de Pablos y D. Ruth Fernndez Villarn, fue defendida el 30 de enero de 2009 y obtuvo una calificacin de sobresaliente cum laude por unanimidad. Adems, estos resultados han sido publicados en la revista Neurobiology of Aging, y presentados en el XIII Congreso de la Sociedad Espaola de Neurociencia celebrado en Tarragona. El punto de partida de este libro son las evidencias de que la neuroinflamacin juega un papel crtico en la progresin de la enfermedad de Alzheimer, patologa que se caracteriza por un patrn claro de cambios neuropatolgicos que incluyen la activacin de astrocitos y microglia y el aumento de citoquinas proinflamatorias. De las diferentes reas del cerebro afectadas en esta enfermedad, el hipocampo juega un papel central por la degeneracin de sus neuronas. Sin embargo, se ha demostrado que el hipocampo es altamente resistente a la muerte celular inducida por inflamacin, por lo que sera necesario algn otro factor para el desarrollo de esta enfermedad. En este libro se presenta el estudio realizado para ver si el estrs crnico variable podra aumentar la susceptibilidad del hipocampo a la inflamacin inducida por el lipopolisacrido (LPS) de membrana de las bacterias Gram (-). Los resultados obtenidos muestran que el estrs crnico interacta sinrgicamente con el estmulo inflamatorio para llevar finalmente a la muerte celular, pudiendo conferir mayor susceptibilidad al dao neuronal en pacientes que sufren enfermedad de Alzheimer. Esto indica que el estrs puede ser un factor de riesgo importante para el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas que tengan como base la prdida de neuronas del hipocampo, como es el caso de la enfermedad de Alzheimer.

Ana Mara Espinosa Oliva Doctora en Ciencias Biolgicas por la Universidad de Sevilla

A mis padres

ABREVIATURAS

Ach AchE ACTH AINEs Akt AMPA APOE AVP A BDNF CaMKII CE COX CPF CREB CRH CRH-R DA DE DMSO EA EAE EAF ECSIT EP ERK GABA GAD GCs GFAP HPA i.p. IL

Acetilcolina Acetilcolinesterasa Hormona adrenocorticotropa Agentes antiinflamatorios convencionales no esteroideos Protena kinasa B cido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolpropinico Apolipoprotena E Arginina-Vasopresina Pptido -amiloide Factor neurotrfico derivado de cerebro Protena kinasa dependiente de Ca2+-calmodulina tipo II Corteza entorrinal Ciclooxigenasa Corteza prefrontal Protena de unin al elemento de respuesta al AMPc Factor liberador de corticotropina Receptor del factor liberador de corticotropina Dopamina Desviacin estndar Dimetilsulfxido Enfermded de Alzheimer Enfermedad de Alzheimer espordica. Enfermdad de Alzheimer familiar Intermediario evolutivo conservado de seales en la va Toll Enfermedad de Parkinson Kinasas reguladas por seales extracelulares cido -aminobutrico cido glutmico descarboxilasa Glucocorticoides Protena cida fibrilar de gla Eje hipotalmico-pituitario-adrenal Intraperitoneal Interleukina

iNOS IB JNK KDO LB LBP LTD LTP LPS MAPKs NeuN NF-B NMDA NO NPV PBS PK PLA2 PLC POMC PPA PPT PSEN RG RLO RM s.c. SMA SN SNC SSC T6BP TAB TAK

xido ntrico sintasa inducible Protena de inhibicin del NF-B Proteinkinasas del factor de transcripcin c-jun cido 2-ceto-3-desoxioctanoico Medio de crecimiento Luria Protena de unin al LPS Depresin a largo plazo (del ingls Long-term depression) Potenciacin a largo plazo (del ingls Long-term potentiation) Lipopolisacrido Protenas kinasas activadas por mitgenos Ncleos neuronales Factor nuclear B N-metil-D-aspartato xido ntrico Ncleo paraventricular Tampn fosfato salino Proteinkinasas Fosfolipasa A2 Fosfolipasa C Proopiomelanocortina Protena precursora amiliode Protenfosfatasas Presenilina Receptor de glucocorticoide Radicales libres de oxgeno Receptor mineralocorticoide subcutneo Eje simptico-mdulo-adrenal Sustancia negra Sistema nervioso central Citrato sdico salino Protena de unin a TRAF6 Protenas de unin a TAK-1 Kinasa activada por el factor de crecimiento transformante

TBS TK TLRs TNF TRAF-6 TTBS

Tampn Tris salino Tirosinkinasas Receptores Toll Factor de necrosis tumoral Factor 6 asociado al receptor de TNF Tampn Tris salino con Tween

INDICE

INTRODUCCIN 1. El sistema lmbico. 1.1. Historia. 1.2. Anatoma. 1.3. Funcin. 1.4. Principales sistemas neurotransmisores relacionados con el sistema lmbico. 2. El hipocampo. 2.1. Anatoma. 2.1.1. Capas hipocampales. 2.1.2. Subcapas hipocampales 2.2. Circuito bsico hipocampal. 2.3. Funciones del hipocampo. 2.3.1. Papel en la memoria general. 2.3.2. Papel en la memoria espacial y en la navegacin. 3. Enfermedades neurodegenerativas. 4. Enfermedad de Alzheimer. 4.1. Tipos de EA: familiar y espordica. 4.2. Placas seniles y ovillos neurofibrilares. 4.2.1. Las placas seniles. 4.2.2. Los ovillos neurofibrilares. 4.3. Hiptesis de la cascada amiloide. 4.4. Inflamacin y enfermedades neurodegenerativas. 4.5. Asociacin entre S100, interleukina 1 y la EA. 4.5.1. Efecto del S100. 4.5.2. Efecto de la IL-1. 4.6. El tratamiento farmacolgico de la EA. 5. Modelos de neurodegeneracin. El lipopolisacarido. 5.1. Estructura del LPS. 5.2. Interaccin entre el LPS y protenas solubles de membrana.

1 1 2 4 6 9 11 11 12 15 16 19 21 25 26 29 30 32 33 34 35 37 39 39 40 42 48 49 50

5.3. Transduccin de seal inducida por el LPS. 5.4. LPS como modelo de enfermedad de Parkinson y de sepsis. 6. El estrs y su historia. 6.1. Caractersticas de los estmulos estresantes. 6.2. Respuesta al estrs. 6.3. El eje hipotalmico-pituitario-adrenal. 6.3.1. El hipotlamo. 6.3.2. La hipfisis. 6.3.3. Las glndulas adrenales. 6.4. Receptores corticosteroides. 6.5. Mecanismo de retroinhibicin de los glucocorticoides. 6.6. Estrs crnico y adaptacin. 6.7. Cambios en el hipocampo relacionados con el estrs. 6.8. Neurobiologa del estrs y neuroinflamacin.

51 54 56 59 61 66 66 67 69 71 73 75 77 80 83 87 87 87 88 89 89 89 89 90 90 92 92 93

OBJETIVOS

MATERIALES Y MTODOS 1. Animales. 2. Operaciones quirrgicas. 3. Tratamientos. 3.1. Controles. 3.2. Controles con estrs. 3.3. Tratamiento con LPS. 3.4. Tratamiento con LPS y estrs. 3.5. Tratamiento con LPS, estrs y RU486. 4. Modelo de estrs. 5. Perfusin de los animales. 6. Medida de los niveles de corticosterona y progesterona en sangre. 7. Inmunohistoqumica.

7.1. Inmunohistoqumica de OX-6, GFAP y NeuN 7.2. Anlisis de los datos obtenidos por inmunohistoqumica. 8. Fluoro Jade B. 9. Hibridacin in situ. 9.1. Obtencin de la ribosonda. 9.2. Reaccin de hibridacin. 9.3. Anlisis y cuantificacin de la seal de hibridacin. 10. Deshidratacin y montaje de las secciones. 11. Cuantificacin relativa de PCR a tiempo real. 12. Anlisis de protenas por Western blot. 13. Anlisis estadstico. 14. Reactivos.

93 94 95 96 96 97 99 100 101 102 105 105 109 109 110 112 113 118 125 128 130 131 138

RESULTADOS 1. Cambios en el peso corporal. 2. Cambios en los niveles de corticosterona y progesterona en sangre. 3. Efecto del LPS y el estrs en la microgla. 4. Efecto del LPS y el estrs en la astrogla. 5. Efecto del LPS y el estrs en las poblaciones neuronales. 6. Efecto del LPS y el estrs en la expresin del ARNm de BDNF. 7. Efecto del LPS y el estrs en los niveles totales y fosforilados de JNK, p38, ERK, Akt, CREB y GSK-3. 8. Efecto del LPS y el estrs en los niveles de TNF- e IL-1. 9. Efecto del LPS y el estrs en los niveles de iNOS y nNOS.

DISCUSIN 1. Efectos del estrs en las caractersticas inflamatorias inducidas por la inyeccin intrahipocampal de LPS. 2. Efectos del estrs y accin de los glucocorticoides sobre el

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cerebro. 3. Prevencin del dao producido por el estrs. 4. Posibles explicaciones al efecto sinrgico del estrs y la inflamacin en los daos producidos en el hipocampo. 5. Posible relacin entre el estrs y la enfermedad de Alzheimer.

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CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA

INTRODUCCIN

Introduccin

1. EL SISTEMA LIMBICO.

En nuestro cerebro hay varias estructuras primitivas que nos dan importantes habilidades necesarias para la supervivencia de las especies. Sistema lmbico es el nombre que se le da a este conjunto de estructuras localizadas encima y alrededor del tlamo y bajo la corteza cerebral (ver imagen de localizacin del sistema lmbico en el cerebro en http://en.wikipedia.org/wiki/Limbic_system). Es la parte ms interna del cerebro y est cubierto por el fluido cerebroespinal y varios grupos de materia blanca, que no juegan un importante papel en la cognicin. Al sistema lmbico se le llama el sistema mamfero viejo o el cerebro mamfero en el popular modelo de cerebro triple, que divide al cerebro en tres partes dependiendo de su localizacin y funciones. Las otras partes son el cerebro reptil o el tallo cerebral y la corteza cerebral o neocorteza. El sistema lmbico es el centro de las emociones y las motivaciones (particularmente aquellas que estn relacionadas con la supervivencia, como el miedo, la clera y las emociones relacionadas con el comportamiento sexual), los sentimientos de placer, la regulacin de memorias, la interfase entre los estados emocionales y las memorias de estmulos fsicos, los reguladores fisiolgicos autnomos, las hormonas, las respuestas del tipo luchar o huir, la excitacin sexual, los ritmos circadianos y algunos sistemas de decisiones. Entre las estructuras que forman parte del sistema lmbico se incluyen el hipocampo, la amgdala, el giro cingulado, el frnix, el hipotlamo, el cuerpo mamilar, el epitlamo, el ncleo accumbens, la corteza orbitofrontal, el giro parahipocampal y el tlamo. Algunas de estas estructuras y su localizacin se muestran en la imagen en

Introduccin

http://www.stanford.edu/group/hopes/basics/braintut/ab5.html.

Pueden

encontrarse

estructuras anlogas en casi todos los mamferos como perros, gatos y ratones. No sucede lo mismo en el caso de los reptiles, los cuales tienen solamente un grupo cerebral. Encima del sistema lmbico est la corteza cerebral, el cerebro pensante; el tlamo acta como un enlace entre ellos dos. La evolucin de la corteza fue dependiente del sistema lmbico, ya que ste estuvo presente antes. Cada adaptacin beneficiosa en la neocorteza tuvo que interoperar eficientemente con el sistema lmbico para justificar su propia retencin, mejorando la buena forma general del organismo. Al ser nuestro cerebro de la emocin, el sistema lmbico es vulnerable a enfermedades en la qumica del cerebro y en la actividad elctrica cerebral. Algunas de estas enfermedades son de origen gentico y otras son adquiridas al desarrollarse un dao cerebral (por ejemplo, las drogas o el alcohol usados durante el embarazo, o un nacimiento difcil). Una enfermedad en el cerebro de la emocin puede producir emociones que estn fuera de control como actos extremos de violencia, comportamiento suicida, agitacin y cambios de humor.

1.1. Historia
Desde una perspectiva histrica, el conocimiento de la anatoma regional del hemisferio cerebral nos ha ayudado a entender los substratos anatmicos de la emocin, el aprendizaje y la memoria. En el siglo XIX, el neurlogo francs Pierre Paul Broca fue el primero en sealar que las estructuras en forma de C de la superficie cerebral medial desempeaban un papel importante en las emociones. En 1878 Broca denomin a esta regin del cerebro le grande lobe limbique (Broca, 1878), porque estas estructuras rodeaban el diencfalo y bordeaban as la corteza (en latn, limbos significa borde).

Introduccin

Tambin en el siglo XIX, el neuroanatomista alemn Alois Alzheimer haba reconocido ya cambios patolgicos caractersticos en el encfalo que estaban asociados a la demencia. Estos cambios eran especialmente notables en la formacin hipocampal. As, durante este perodo, se establecieron las bases que implicaban a ciertas estructuras del lbulo lmbico en diversas funciones cerebrales, tales como el pensamiento, la memoria y aspectos de nuestra personalidad. Pero la mayora de su papel funcional en la emocin fue desarrollado en 1937 cuando el neuroanatomista americano James Papez describi su modelo anatmico de emocin, el circuito de Papez (Papez, 1995). En exmenes post mortem de los cerebros de vctimas de enfermedades psiquitricas, Papez observ cambios degenerativos en estructuras tales como el hipocampo y los cuerpos mamilares, as como en el tlamo y la corteza cingulada. A partir de estos estudios y otras consideraciones Papez propuso que la emocin no era una funcin de un centro del cerebro especfico (como era considerada anteriormente por Cannon-Bard) sino de un circuito que implicaba cuatro estructuras bsicas, interconectadas a travs de haces nerviosos: el hipotlamo con sus cuerpos mamilares, el ncleo talmico anterior, el giro cingulado y el hipocampo. Este circuito sera responsable de las funciones centrales de la emocin y de sus expresiones perifricas. Ms recientemente, Paul D. Maclean, aceptando las bases esenciales de la propuesta de Papez, cre la denominacin de sistema lmbico y aadi nuevas estructuras al circuito: las cortezas orbitofrontal y medialfrontal (rea prefrontal), el giro parahipocampal e importantes agrupaciones subcorticales como la amgdala, el ncleo talmico medial, el rea septal, el ncleo basal prosenceflico (el rea ms anterior del cerebro) y una pocas formaciones del tallo cerebral (Maclean, 1952).

Introduccin

Desde que el trmino fue introducido por MacLean en 1952, el concepto del sistema lmbico ha sido ampliado y desarrollado por Nauta, Heimer y otros, aunque an queda mucha controversia sobre el uso de dicho trmino. Cuando se acu por primera vez, fue planteado como el centro emocional del cerebro, mientras que por el contrario, la cognicin era tarea de la corteza. Sin embargo, esto inmediatamente fue un problema cuando se mostr que un dao en el hipocampo, una estructura lmbica primaria, daba como resultado un dficit cognitivo severo. As que, desde su principio, los lmites del sistema lmbico se han cambiado una y otra vez por la comunidad cientfica. Recientemente se han hecho intentos para salvar el concepto a travs de una definicin ms precisa, pero todava no hay un criterio aceptado de forma general para definir sus partes. Por esto, al ser un concepto basado ms en la tradicin que en los hechos, muchos cientficos han sugerido que el concepto sea abandonado (Ledoux, 2003).

1.2. Anatoma.
El sistema lmbico incluye muchas estructuras de los hemisferios cerebrales, el diencfalo y el mesencfalo. Como se ha visto anteriormente, existe mucha controversia a la hora de definir sus componentes. Cada autor considera unos u otros componentes, pero los que s son comunes en todos los autores son la amgdala, el hipocampo y la corteza de asociacin lmbica. En la tabla 1 se exponen las funciones que desempearan las estructuras que son, o han sido consideradas, parte del sistema lmbico.

Introduccin

Amgdala

Juega un importante papel en la mediacin y control de las principales actividades afectivas como amistad, amor y afecto, en la expresin de humor y, principalmente en el miedo, clera y agresin. Tambin es responsable de determinar qu memorias son almacenadas y donde se almacenan en el cerebro. Particularmente implicado en el fenmeno de la memoria, especialmente es requerido para la formacin de la memoria a corto y largo plazo Papel en la formacin de la memoria espacial y es parte del hipocampo Funciones autnomas que regulan la velocidad del corazn, la presin sangunea y el proceso cognitivo y de atencin. Tambin participa en la reaccin emocional ante el dolor y en la regulacin del comportamiento agresivo. Lleva seales desde el hipocampo a los cuerpos mamilares y al ncleo septal Regula el sistema nervioso autnomo mediante la produccin y liberacin de hormonas. Afecta y regula la presin sangunea, la velocidad del corazn, el hambre, la sed, la excitacin sexual y los ciclos del sueo Es la estacin de relevo a la corteza cerebral. Juega un papel importante en la regulacin del comportamiento emocional por sus conexiones con otras estructuras del sistema lmbico Importante para la formacin de la memoria Secreta hormonas que regulan la homeostasis. Se piensa que contribuye a las nuevas memorias y regula la felicidad. Reciben aferencias del sistema olfativo Ncleo de entrada sensorial olfativo Implicado en recompensa, placer y ambicin. Requerida para tomar decisiones

Hipocampo

Giro parahipocampal

Giro cingulado

Frnix

Hipotlamo

Tlamo Cuerpo mamilar Glndula pituitaria Giro dentado Cortezas entorrinal y piriforme Bulbo olfativo Ncleo accumbens Corteza orbiofrontal

Tabla 1. Estructuras que son, o han sido consideradas, parte del sistema lmbico y sus funciones.

Introduccin

1.3. Funcin.
La funcin de las estructuras denominadas colectivamente sistema lmbico es clave para la conducta humana normal. Las diversas funciones del sistema lmbico incluyen importantes papeles en la memoria, la emocin, el control de las funciones viscerales y la olfacin. El hecho de que seamos tal como somos (con nuestros recuerdos, nuestra propia personalidad, nuestros pensamientos) depende en gran medida de las funciones de las distintas regiones cerebrales que forman el sistema lmbico. De hecho, la disfuncin de muchas de estas estructuras subyace a prcticamente la totalidad de las enfermedades psiquitricas. El sistema lmbico es difcil de estudiar, en parte por el nmero increblemente grande de interconexiones entre sus muchas estructuras. Opera por influencia del sistema endocrino y del sistema nervioso autnomo. Est altamente interconectado con el ncleo accumbens, el centro del placer del cerebro, que juega un papel en la excitacin sexual y la debida a drogas. Estas respuestas son moduladas por las proyecciones dopaminrgicas desde el sistema lmbico. El sistema lmbico est tambin fuertemente conectado con la corteza prefrontal (CPF). Algunos cientficos sostienen que esta conexin est relacionada con el placer obtenido tras la resolucin de problemas. Para curar enfermedades emocionales severas, esta conexin fue cortada quirrgicamente por un procedimiento de psicociruga llamado lobotoma prefrontal. Los pacientes que experimentaron este procedimiento a menudo llegaron a ser pasivos y carentes de motivacin. Veamos con ms detalle estas conexiones entre componentes del sistema lmbico y los sistemas efectores. Cul podra ser la funcin de las incontables interconexiones que existen dentro del sistema lmbico? Muchas de las conexiones del

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sistema lmbico guardan relacin con la expresin conductual de las emociones. En ltima instancia, unas complejas vas polisinpticas vinculan las estructuras del sistema lmbico con los tres sistemas efectores para la expresin conductual de la emocin: los sistemas motores endocrino, autnomo y somtico (Fig. 1).

A. Control neuroendocrino Amgdala (central, corticomedial) Hipotlamo medial (ncleo medial ventral) Hipotlamo periventricular (ncleo arqueado)

Hipfisis anterior

B. Control autnomo Hipotlamo (medial y lateral) Tronco enceflico y ncleos autnomos espinales

Amgdala (central)

rganos diana perifricos

Neuronas postganglionares

C. Control motor somtico Amgdala (central) Sustancia gris periacueductal Hipotlamo lateral Formacin reticular

Musculatura esqueltica

Mdula espinal

Fig. 1. Relaciones entre el sistema lmbico y los sistemas efectores.

Introduccin

Las vas por las que el sistema lmbico podra influir en la secrecin de la hormona hipofisaria implican conexiones indirectas entre la amgdala y el hipotlamo periventricular. Una de estas vas, por ejemplo, implica la proyeccin desde la amgdala corticomedial al ncleo ventromedial. Este ncleo, a su vez, proyecta a un componente clave del sistema neurosecretorio parvocelular, el ncleo arqueado. Las consecuencias viscerales de las emociones estn mediadas por conexiones directas e indirectas a ncleos del sistema nervioso autnomo. El ncleo amigdaloide central proyecta directamente al tronco enceflico y a centros autnomos espinales. La amgdala afecta tambin indirectamente a la funcin autnoma, a travs de proyecciones al hipotlamo. Las conexiones con el hipotlamo lateral influyen en la funcin autnoma a travs de diversos mecanismos, incluidos los circuitos neurales de la formacin reticular y otras partes del hipotlamo. La mayora de los signos conductuales de la emocin que se manifiestan, como las reacciones de lucha o huda, estn mediados por las acciones del sistema lmbico sobre los sistemas motores somticos, especialmente los tractos reticuloespinales. Por ejemplo, hay proyecciones directas (e indirectas) desde el hipocampo, los ncleos septales y la amgdala al hipotlamo lateral el cual, a su vez, puede influir en el sistema reticuloespinal. Estas conexiones podran ser importantes para desencadenar reacciones estereotipadas de defensa. Estudios experimentales con animales han demostrado igualmente que la sustancia gris periacueductal media conductas motoras que son tpicas de especies concretas, tales como el gruido y el silbido de los carnvoros. La sustancia gris periacueductal recibe aferencias del ncleo central de la amgdala, as como del hipotlamo. El sistema lmbico puede influir igualmente en las funciones motoras somticas, en formas mucho ms complejas y flexibles conductualmente, a travs del circuito lmbico de los ganglios basales, que incluye al estriado ventral, al 8

Introduccin

globo plido ventral y al tlamo dorsal medial. Las aferencias corticales de este circuito provienen de reas lmbicas de asociacin y de la formacin hipocampal. La salida del circuito lmbico se dirige a las reas lmbicas de asociacin del lbulo frontal.

1.4. Principales sistemas neurotransmisores relacionados con el sistema lmbico.

Mientras que la mayora de las regiones del cerebro reciben inervacin por parte de uno o ms de los principales sistemas de neurotransmisores de regulacin, la inervacin del sistema lmbico parece ser particularmente importante para el pensamiento, el estado de nimo y la conducta normal. Se establece esta conclusin debido a que muchas de las drogas utilizadas para tratar enfermedades psiquitricas, trastornos del pensamiento y estados de nimo, afectan selectivamente a uno de los sistemas neurotransmisores. Estos sistemas neurotransmisores tienen conexiones directas y amplias con el sistema lmbico: Las proyecciones dopaminrgicas del mesencfalo se originan en el rea ventral tegmental y la parte compacta de la sustancia negra (SN). Desplazndose a travs del haz prosenceflico medial y del tracto nigrostriatal, las fibras dopaminrgicas sinaptan con neuronas en el rea de asociacin prefrontal, la corteza de asociacin lmbica del lbulo frontal medial, la circunvolucin del cngulo, el estriado, la amgdala y la formacin hipocampal. Muchas drogas antipsicticas bloquean a los receptores de la dopamina (DA), y una excesiva concentracin de dopamina en las estructuras lmbicas podra contribuir a la esquizofrenia. Las proyecciones serotoninrgicas a estructuras del sistema lmbico del telencfalo y el diencfalo se originan en el ncleo del rafe dorsal y medio.

Introduccin

Recorriendo tres tractos, el fascculo medial del prosencfalo, el fascculo longitudinal dorsal y el fascculo longitudinal medial, la proyeccin serotoninrgica ascendente sinapta con neuronas de la amgdala, la formacin hipocampal, el estriado y la corteza. Las drogas que bloquean los mecanismos de recaptacin de la serotonina son efectivas para tratar los trastornos del estado de nimo, incluidos los trastornos de ansiedad y obsesivo-compulsivos. La proyeccin noradrenrgica, que se origina en el locus coeruleus, influye en toda la corteza, incluidas las reas de asociacin lmbica, as como en las estructuras lmbicas y otras estructuras subcorticales. Junto con el serotoninrgico, este sistema podra desempear un papel en la depresin. La proyeccin colinrgica se origina en grandes neuronas localizadas cerca de la superficie telenceflica ventral. Las neuronas se hallan en el ncelo basal, el ncleo septal medial y el ncleo de la banda diagonal (de Broca). Hay grupos adicionales de clulas colinrgicas, con proyecciones corticales amplias, en el tronco enceflico, cerca del ncleo tegmental pedunculopontino y el hipotlamo lateral. Las dianas de esta proyeccin incluyen toda la neocorteza (incluida la corteza de asociacin lmbica), la amgdala y la formacin hipocampal. La enfermedad de Alzheimer (EA), caracterizada por una demencia progresiva, se inicia con una prdida de estas neuronas colinrgicas del prosencfalo basal. A medida que avanza la enfermedad, resultan tambin afectados otros sistemas de neurotransmisores.

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Introduccin

2. EL HIPOCAMPO.

En 1564, el anatomista italiano Giulio Cesare Aranzi fue el primero en utilizar el trmino hipocampo para describir una zona cerebral que guardaba gran semejanza fsica con el caballito de mar. Este rgano se relacion inicialmente con el sentido del olfato, ms que con su conocida funcin en la adquisicin de la memoria, por su localizacin prxima a la corteza olfativa. El ruso Vladimir Bekhterev ya seal la importancia del hipocampo en la memoria alrededor de 1900, basndose en observaciones sobre un paciente con un problema grave de amnesia. Sin embargo, durante muchos aos, el conocimiento convencional del hipocampo era que, como el resto del sistema lmbico, era responsable de la emocin. El hipocampo es una de las partes filogenticamente ms antiguas y, como se discutir ms adelante, juega un papel principal en la memoria a corto y largo plazo y en la navegacin espacial. En la EA, es una de las primeras regiones del cerebro en sufrir dao; problemas de memoria y de desorientacin aparecen entre los primeros sntomas. El dao al hipocampo puede resultar tambin por la falta de oxgeno (anoxia), encefalitis o epilepsia del lbulo temporal.

2.1. Anatoma.
El hipocampo es una parte del cerebro localizada en la regin inferior del lbulo temporal. Tiene una apariencia generalmente similar a travs de la gama de especies mamferas. Los humanos y otros mamferos tienen dos hipocampos, uno a cada lado del cerebro. En los roedores, donde se ha estudiado ms extensamente, el hipocampo tiene forma de un par de bananas unidas por los cabos; mientras que en los humanos tiene

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Introduccin

forma curvada y convoluta que recordaba a los primeros anatomistas a un caballo de mar. De hecho, el nombre deriva de la palabra griega que significa caballo de mar (hippos = caballo; campos = monstruo del mar). Su forma tambin se ha comparado con los cuernos del dios egipcio Amun, de la mitologa griega, quien tena la cabeza de un carnero.

2.1.1. Capas hipocampales. El hipocampo est compuesto por mltiples capas y subcapas. Aunque la terminologa vara entre los autores, los trminos ms frecuentemente utilizados son giro dentado y el cornu ammonis (literalmente cuernos de Amun, abreviado CA). El giro dentado contiene la fascia dentata y el hilus (tambin denominado CA4), mientras que el CA se diferencia en capas CA1, CA2 y CA3 (ver imagen en http://wapedia.mobi/es/Hipocampo_(anatom%C3%ADa)?t=3). Cortado en seccin transversal, el hipocampo es una estructura en forma de C que, como ya se ha mencionado, se parece a los cuernos de un carnero. El aspecto en forma de cuerno del hipocampo es causado por las diferentes densidades celulares y por la existencia de diferentes grados de fibras neuronales. Como se muestra en la imagen anterior, la estructura es curvada y, a lo largo de ella, se definen subcapas o regiones que van desde CA4 hasta CA1. Las regiones CA estn todas llenas de clulas piramidales densamente empaquetadas parecidas a las de la corteza, y estn tambin estructuradas en estratos o capas claramente definidos (ver atlas de cerebro de Paxinos y Watson, 1986):

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Introduccin

El alveus es la capa ms superficial y contiene los axones de las neuronas piramidales que se dirigen hacia la fimbria/frnix, una de las principales eferencias del hipocampo. Stratum oriens (str. oriens) es la siguiente capa debajo del alveus. Los cuerpos celulares de las clulas cesta inhibitorias y las clulas trilaminares horizontales estn localizados en este estrato. Las dendritas basales de las neuronas piramidales se encuentran tambin aqu, donde reciben aferencias de las otras clulas piramidales, de fibras septales y de fibras comisurales del hipocampo contralateral. En roedores los dos hipocampos estn altamente conectados, pero en primates esta conexin comisural es mucho ms escasa. Stratum pyramidale (str. pyr.) contiene los cuerpos celulares de las neuronas piramidales que son las principales neuronas excitatorias del hipocampo, y tambin los cuerpos celulares de muchas interneuronas, incluyendo las clulas axo-axnicas, las clulas biestratificadas y las clulas trilaminares radiales. Este estrato tiende a ser uno de los ms visibles a simple vista. Stratum lucidum (str. luc.) es uno de los estratos ms finos en el hipocampo. Las fibras musgosas de las clulas granulares del giro dentado pasan a travs de este estrato en CA3, aunque tambin se pueden encontrar sinapsis de estas fibras en la regin CA3. Stratum radiatum (str. rad.), como el str. oriens, contiene fibras septales y comisurales. Contiene tambin fibras colaterales de Schaffer que son la proyeccin de CA3 a CA1. Algunas interneuronas que se encuentran en capas ms superficiales tambin se pueden encontrar aqu, incluyendo las clulas en cesta, las clulas biestratificadas y las clulas trilaminares radiales.

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Introduccin

Stratum lacunosum (str. lac.) es un estrato delgado que contiene fibras colaterales de Schaffer, as como fibras de la va perforante de las capas superficiales de la corteza entorrinal (CE). Debido a su pequeo tamao, a menudo se agrupa con el stratum moleculare en un stratum nico llamado stratum lacunosum-moleculare (str. l-m.). Stratum moleculare (str. mol.) es el estrato ms profundo en el hipocampo. Aqu las fibras de la va perforante forman sinapsis con las dendritas distales, apicales de las clulas piramidales. El surco hipocampal (sulc.) o fisura es una regin libre de clulas entre la CA1 y el giro dentado.

El giro dentado es realmente una estructura separada, una capa empaquetada de pequeas clulas granulares envueltas alrededor del final del propio hipocampo, formando una cua puntiaguda en algunas secciones, y un semicrculo en otras. Est compuesto tambin por una serie de estratos similares: La capa polimrfica es la capa ms superficial del giro dentado y a menudo se considera una subcapa separada (ver CA4/hilus ms abajo). Esta capa contiene muchas interneuronas y los axones de las clulas granulares dentadas pasan a travs de este estrato hasta la CA3. Stratum granulosum (str. gr.) contiene los cuerpos celulares de las clulas granulares del giro dentado. Stratum moleculare 1/3 (str. mol. 1/3) es por donde las fibras comisurales del giro dentado contralateral discurren y forman sinapsis y all donde las aferencias del septum medial terminan, ambos en las dendritas proximales de las clulas granulares.

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Stratum moleculare 2/3 (str. mol. 2/3) es el ms profundo de los estratos, hallndose justo superficial a la fisura hipocampal a travs del stratum moleculare en las capas CA. Las fibras de la va perforante corren a travs de este estrato, haciendo sinapsis excitatorias en las dendritas apicales distales de las clulas granulares.

2.1.2. Subcapas hipocampales. La fascia dentata es la etapa ms temprana del circuito hipocampal. Sus neuronas principales son diminutas clulas granulares que dan origen a axones desmielinizados llamados fibras musgosas. La fascia dentata de la rata contiene aproximadamente 1.000.000 de clulas granulares. sta y el hilus forman el giro dentado. Regin CA4 es llamada a menudo hilus o regin hilar cuando se considera parte del giro dentado, ya que las neuronas aqu no tienen morfologa piramidal como las de las reas CA1 y CA3 (sugerido por Lorente de No, 1934, y verificado por David G. Amaral, 1978). Esta regin contiene clulas musgosas que primeramente reciben aferencias de las clulas granulares localizadas cerca del giro dentado en forma de fibras musgosas. Regin CA3 contiene clulas piramidales, de las que aproximadamente hay unas 200.000 en cada hemisferio de la rata. Regin CA2 es una pequea regin localizada entre CA3 y CA1. En la rata recibe aferencias de la capa II de la CE, pero no recibe fibras musgosas del giro dentado. Sus clulas piramidales son ms similares a las de CA3 que a las de CA1, por lo que se agrupa como una regin separada. Debido a su pequeo tamao, es a menudo ignorada en las discusiones del hipocampo, pero su alta resistencia al dao epilptico la hace notable.

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Regin CA1 es la primera regin en el circuito del hipocampo que produce una ruta de eferencia significativa, la cual va a la capa V de la CE. Tambin enva una eferencia significativa hacia el subiculum. En la rata, CA1 contiene aproximadamente 250.000 clulas piramidales. El subiculum es el punto final del circuito del hipocampo. Como CA1, manda eferencias a la capa V de la CE.

2.2. Circuito bsico hipocampal.

Empezando por el giro dentado atravesaremos una serie de zonas estrechas. A continuacin del giro dentado vienen una serie de reas CA: primero CA4 (que se sita bajo el giro dentado), luego CA3, luego una zona muy pequea llamada CA2, y a continuacin CA1. Despus de CA1 viene un rea llamada el subiculum, tras la cual vienen un par de reas mal definidas llamadas presubiculum y parasubiculum, y a continuacin una transicin a la propia corteza (principalmente al rea entorrinal de la corteza). La mayora de los anatomistas usan el trmino propio hipocampo para referirse a las cuatro capas CA, y formacin hipocampal para referirse al propio hipocampo ms el giro dentado y el subiculum (Amaral y Lavenex, 2006). Las principales vas de sealizacin que fluyen a travs del hipocampo se combinan para formar un lazo (Fig. 2). La aferencia ms externa viene desde la CE contigua, a travs de los axones de la llamada va perforante (llamada as porque los axones penetran a travs del subiculum y el espacio que lo separa del giro dentado). Estos axones surgen de las capas II/IV (principalmente de la capa II) de la CE y terminan en las clulas granulares del giro dentado y en las clulas piramidales de la regin CA3. Hay tambin una va distinta desde las capas III/V de la CE directamente a

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las clulas piramidales de CA1 y al subiculum. La va perforante se puede dividir en vas lateral y medial, dependiendo de si las fibras surgen de la CE medial o lateral. Fue en esta va donde se descubri por primera vez la potenciacin a largo plazo o LTP. Las clulas granulares del giro dentado mandan sus axones (llamados fibras musgosas) a las clulas piramidales de CA3, formando su principal aferencia. Las clulas piramidales de CA3 combinan esta aferencia con seales de la capa II de la CE y mandan sus axones (llamados colaterales de Schaeffer) a la regin CA1. Las clulas piramidales de CA1 mandan sus axones al subiculum y a las capas profundas de la CE, formando la principal eferencia del hipocampo. La conexin desde CA1 al subiculum permite una disposicin anatmica estricta: el final distal de la regin CA1 proyecta al final proximal del subiculum, es decir, aquellas clulas ms cerca de la unin CA1-Sub estn conectadas, y aquellas ms lejanas estn conectadas. Las proyecciones a la CE permiten un modelo similar, de tal manera que CA1 distal/Sub proximal proyectan a la CE lateral, mientras que CA1 proximal/Sub distal proyecta a la CE medial. La aferencia a estas clulas de la CE permite el mismo modelo, es decir, CA1 distal/Sub proximal recibe aferencia de la CE lateral mientras que CA1 proximal/Sub distal recibe aferencia de la CE medial. El subiculum es la etapa final en la va y es tambin responsable de la eferencia del hipocampo: las neuronas subiculares combinan la informacin de la proyeccin de CA1 y de la capa III de la CE y mandan sus axones principalmente a la CE (a la capa V), pero tambin proyecta a muchas otras reas, incluyendo el ncleo accumbens, el ncleo talmico anterior, el ncleo mamilar medial, el septum lateral y el presubiculum.

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CA1 CS

Sb

CE FM GD CA3 VP

Fig. 2. Esquema representativo de las aferencias y eferencias del hipocampo. CE, corteza entorrinal; GD, giro dentado; VP, va perforante; FM, fibras musgosas; CS, colaterales de Schaeffer; Sb, subiculum.

Dentro de este circuito bsico existen otras muchas proyecciones al hilus, a CA2 y conexiones recurrentes en CA1 y CA3 (conexiones que salen de una capa y terminan en la misma capa). Es esencialmente una va continua que empieza en la corteza sensorial, atraviesa el hipocampo y regresa a la corteza sensorial. De esta manera, en algn lugar, nace la memoria. Adems de la CE, el hipocampo tambin recibe un nmero de aferencias subcorticales, proyecciones monosinpticas directas del ncleo cerebellar fastigial (Heath y Harper, 1974) y aferencias GABArgicas y colinrgicas desde el septum medial y la banda diagonal de Broca. La va perforante que va al giro dentado, de ah a CA3 y luego a CA1 recibi el nombre de circuito trisinptico por Per Andersen, quien anunci que se podan cortar capas delgadas del hipocampo perpendiculares a lo largo de su eje, de manera que se conservan todas estas conexiones. Esta observacin fue la base de su hiptesis lamelar, 18

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que propuso que se puede pensar en el hipocampo como una serie de tiras paralelas, que operan de una manera funcionalmente independiente (Andersen y col., 1971). El concepto lamelar es considerado todava a veces como un principio de organizacin til, pero se ha modificado sustancialmente por datos ms recientes que muestran las extensas conexiones longitudinales dentro del sistema hipocampal (Andersen y col., 2000).

2.3. Funciones del hipocampo.

Como ya se ha mencionado anteriormente, quizs la idea ms temprana fue que el hipocampo estaba implicado en el sentido del olfato, pero actualmente esta idea se ha abandonado. En todos los aos, tres ideas principales de la funcin del hipocampo han dominado la literatura: inhibicin, memoria y espacio. La teora de la inhibicin conductual fue muy popular en los aos 60. Su fuerza deriv mucho de dos observaciones: primero, los animales con dao en el hipocampo tienden a ser hiperactivos; segundo, los animales con dao hipocampal tienen a menudo dificultades para aprender a inhibir respuestas que les han sido enseadas previamente. Jeffrey Gray desarroll esta lnea de pensamiento en una teora del papel del hipocampo en la ansiedad (Gray y McNaughton, 2000). Sin embargo, la teora de la inhibicin no es muy popular en la actualidad. La segunda lnea importante de pensamiento relaciona al hipocampo con la memoria. Aunque tiene precursores, la principal fuerza de esta idea deriv de un informe muy conocido de Scoville y Milner (Scoville y Milner, 1957) sobre los resultados de la destruccin quirrgica del hipocampo en el paciente H.M. A este

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paciente se le eliminaron, de forma bilateral, varias estructuras del lbulo temporal medial (incluyendo la eliminacin de su hipocampo) para aliviarle los frecuentes ataques epilpticos que sufra. A partir de esta intervencin, H.M. sufri deterioros de memoria antergrada (prdida de la habilidad de formar nuevos recuerdos) y retrgrada (prdida del acceso a los recuerdos anteriores al dao) parcialmente graduada (tales deterioros son el tema de la pelcula Memento). De particular importancia fue el hecho de que HM fue todava capaz de aprender tareas procedimentales (las cuales estn asociadas con el estriado) y tena un coeficiente intelectual por encima de la media, por lo que HM demostr una impresionante disociacin entre inteligencia y memoria declarativa. Este caso ocasion tal inters que H.M. es conocido hoy en da como el caso mdico ms intensamente estudiado en la historia. En los siguientes aos, otros pacientes con niveles similares de dao hipocampal y amnesia (causados por accidente o enfermedad) han sido tambin estudiados, y miles de experimentos han estudiado la fisiologa de la plasticidad neuronal en el hipocampo. Actualmente hay un acuerdo casi universal de que el hipocampo juega alguna clase de papel importante en la memoria episdica o autobiogrfica (formacin de nuevos recuerdos asociados a la experiencia); sin embargo, la naturaleza exacta de este papel permanece en extenso debate (Squire y Schacter, 2002; Eichenbaum y Cohen, 1993). La tercera lnea importante de pensamiento relaciona al hipocampo con el espacio. La teora espacial fue defendida originalmente por OKeefe y Nadel, quienes fueron influenciados por las teoras de Edward Chace Tolman acerca de los mapas cognitivos en humanos y animales. OKeefe y su estudiante Dostrovsky descubrieron, en 1971, neuronas en el hipocampo de la rata que parecan mostrar actividad confinada con la localizacin de la rata dentro de su ambiente. OKeefe y sus colaboradores, especialmente Lynn Nadel, continuaron investigando esta cuestin, en una lnea de 20

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trabajo que finalmente les llev en 1978 a su influyente libro llamado El hipocampo como un mapa cognitivo (OKeefe y Nadel, 1978). Como con la teora de la memoria, actualmente no hay un acuerdo universal de esta funcin del hipocampo, pero los detalles son extensamente debatidos.

2.3.1. Papel en la memoria general. Debido a la falta de consenso sobre el papel exacto del hipocampo en la memoria, algunos investigadores prefieren considerar al hipocampo como parte del lbulo temporal medio, un sistema ms grande responsable de la memoria declarativa (memorias que pueden invocarse de forma explcita; stas incluiran, por ejemplo, la memoria semntica de hechos adems de la memoria episdica) (Squire, 1992). Algunas evidencias apoyan la idea de que, aunque los recuerdos a menudo permanecen toda una vida, el hipocampo deja de desempear un papel crucial en la retencin de la memoria despus de pasado el perodo de consolidacin de la misma (Squire y Schacter, 2002); por lo que esta permanencia de memorias ms viejas lleva a la idea de que la consolidacin en el tiempo implica la transferencia de memorias fuera del hipocampo a otras partes del cerebro. Segn esto, el hipocampo es crtico para la formacin de nuevas memorias, por lo que puede que funcione como una puerta para la memoria, a travs de la cual las nuevas memorias deben pasar antes de entrar en el almacn permanente en el cerebro. Por tanto, el dao al hipocampo puede resultar en amnesia antergrada, es decir, en una prdida de la habilidad para formar nuevas memorias, aunque las memorias ms viejas pueden ser salvadas. As, alguien que sufre un dao en el hipocampo puede tener una buena memoria de su niez y de los aos antes del dao, pero relativamente poca memoria de todo lo que ocurri a partir del dao. Pero el dao al hipocampo normalmente tambin puede afectar al acceso a los 21

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recuerdos anteriores al dao (amnesia retrgrada), por lo que su papel en el mantenimiento de estas viejas memorias permanece incierto. El dao al hipocampo no afecta a algunos aspectos de la memoria tales como la capacidad de aprender nuevas habilidades (tocar un instrumento musical, por ejemplo), lo que sugiere que tales habilidades dependen de un tipo diferente de memoria (memoria procesal) y de diferentes regiones del cerebro. Dado que las neuronas se comunican va sinapsis qumicas y que las memorias se creen que se almacenan en estas sinapsis, hoy en da se consideran dos procesos como los mecanismos moleculares que subyacen en el aprendizaje y la memoria. Estos procesos son: 1) la potenciacin a largo plazo (LTP) y 2) la depresin a largo plazo (LTD), proceso opuesto de la LTP. 1) LTP. El sistema nervioso necesita modificar continuamente su estructura y su funcin para adaptarse a las necesidades del medio ambiente. Estas modificaciones es lo que se denomina plasticidad neuronal. Un aspecto de la plasticidad neuronal es el aprendizaje, que se puede definir como la modificacin de la conducta del organismo debido a la experiencia previa. Durante el aprendizaje, se producen cambios en las sinapsis, tanto funcionales como anatmicas. Estos cambios consisten, en gran parte, en que las sinapsis cuya actividad presinptica se asocia con la activacin postsinptica, se hacen ms potentes. A esta potenciacin sinptica que puede durar un tiempo prolongado (horas o das), es a lo que se le denomina LTP. Este tipo de LTP se denomina asociativa, porque precisa de la asociacin entre la activacin de la terminacin presinptica y de la neurona postsinptica. Tambin se denomina potenciacin de tipo hebbiano, por D.O. Hebb que en 1949 predijo la

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existencia de este fenmeno y propuso que podra ser el mecanismo subyacente en el aprendizaje y la memoria. Aunque la LTP fue descrita por primera vez en el hipocampo en 1973, posteriormente se ha demostrado en otras regiones del cerebro, incluyendo zonas neocorticales. Sin embargo, donde se ha estudiado ms extensamente es en tejidos del hipocampo. Actualmente no se poseen todos los datos necesarios que permitan perfilar una imagen clara del proceso que subyace al fenmeno de la LTP, pero s existen consensos generales que permiten dar una descripcin de este mecanismo: lo que parece que sucede es que cuando los axones que hacen conexiones con las neuronas piramidales del hipocampo son expuestos a un estmulo de alta frecuencia, la amplitud del potencial excitatorio medido en estas neuronas aumenta por un largo perodo (durante varias semanas). El neurotransmisor liberado en estas sinapsis es el glutamato. ste se une a varios subtipos diferentes de receptores en la neurona postsinptica. Dos de estos subtipos, los receptores AMPA (acido a-amino-3-hidroxi-5-metil-4isoxazolpropinico) y NMDA (N-metil-D-aspartato), son especialmente importantes en la LTP. El receptor AMPA est emparejado con un canal inico, de manera que cuando el glutamato se une a este receptor, este canal permite la entrada de iones sodio en la neurona postsinptica. Este influjo de sodio hace que la dendrita postsinptica se despolarice localmente, y si esta despolarizacin alcanza el nivel crtico para desencadenar un potencial de accin, el impulso nervioso se transmite a la prxima neurona. El receptor NMDA tambin est emparejado con un canal inico, pero este canal admite la entrada de iones calcio en la clula postsinptica. Cuando esta clula est en potencial de reposo, el canal de calcio est bloqueado por iones magnesio, de manera 23

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que incluso si el glutamato se une al receptor, el calcio no puede entrar en la neurona. Para que estos iones magnesio se retiren del canal, el potencial de membrana de la dendrita debe estar despolarizado. Y qu es exactamente lo que sucede durante la estimulacin de alta frecuencia que causa el LTP? Que la neurona postsinptica se despolariza por la activacin sostenida de sus receptores AMPA. El magnesio entonces se retira del receptor NMDA y permite que entre un gran nmero de iones de calcio a la clula. Esta concentracin aumentada de calcio en la dendrita hace que se den varias reacciones qumicas que hacen a esta sinapsis ms eficiente durante ms tiempo. Estos iones de calcio son mensajeros intracelulares extremadamente importantes que activan muchas enzimas alterando la conformacin de stas. Una de estas enzimas es la calmodulina, que se activa cuando se le unen 4 iones Ca2+, formndose el principal segundo mensajero para la LTP: la Ca2+-calmodulina. sta activa a otras enzimas que juegan papeles claves en este proceso, tales como la adenilato ciclasa y la protena kinasa dependiente de Ca2+calmodulina tipo II (CaMKII). Estas enzimas modifican la conformacin espacial de otras molculas, normalmente aadindoles un in fosfato, por lo que el resultado final es la fosforilacin de otras protenas, algunas de las cuales hacen que los receptores AMPA permanezcan abiertos durante ms tiempo o dan lugar a la creacin de nuevos receptores AMPA, y otras son translocadas al ncleo (Dudai, 1989) de modo que se activan determinados genes, los cuales codifican a protenas destinadas a modificar (de forma transitoria o permanente), la constitucin de la clula. Todo esto contribuye a aumentar la eficiencia de las sinapsis (ver imagen del mecanismo responsable de la LTP en http://thebrain.mcgill.ca/flash/a/a_07/a_07_m/a_07_m_tra/a_07_m_tra.html). Para permitir la entrada de calcio a la clula, el receptor NMDA debe ser activado por glutamato y sometido a despolarizacin simultneamente. La necesidad de 24

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estas dos condiciones simultneas da a este receptor propiedades asociativas. Esto le permite detectar la coincidencia de dos sucesos y hacerlo el elemento clave en la LTP. Pero si este receptor es bloqueado por una droga o si el gen implicado en su construccin no es vlido, la LTP no puede suceder.

2) LTD. En el hipocampo se piensa que el papel de la LTD es volver las sinapsis que han sido potenciadas por LTP a niveles normales y as poderse almacenar nueva informacin. La LTD parece presentarse en respuesta a un incremento ms pequeo de calcio en la clula postsinptica, por una activacin de la neurona presinptica a baja frecuencia, lo que se acompaa por una sensibilidad menor en los receptores de la membrana. En este caso se activan fosfatasas que desfosforilan a los receptores AMPA. En el hipocampo, el efecto de esta desfosforilacin de los receptores AMPA sera reducir la amplitud del potencial postsinptico al nivel normal al que estaba antes de que sucediera la LTP. En resumen, sucede lo opuesto a lo que suceda en el caso de la LTP (ver imagen del mecanismo responsable de la LTD en

http://thebrain.mcgill.ca/flash/a/a_07/a_07_m/a_07_m_oub/a_07_m_oub.html).

2.3.2. Papel en la memoria espacial y en la navegacin. Las evidencias sugieren que el hipocampo almacena y procesa la informacin espacial. Ciertas clulas del hipocampo, silenciosas la mayor parte del tiempo, presentan dosis de descarga elctrica repentinas cuando el animal se encuentra en ciertos emplazamientos de su entorno. Estas son las clulas de lugar, cuya actividad elctrica est relacionada con la posicin del animal en el espacio. Algunas de estas clulas 25

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presentan descargas elctricas cuando el animal se encuentra a s mismo en una ubicacin en particular, sin tener en cuenta la direccin del recorrido; mientras que la mayora son al menos parcialmente sensibles a la direccin de la cabeza y del recorrido. Actualmente se han visto clulas de lugar en humanos implicadas en encontrar su camino en una ciudad de realidad virtual. Los encuentros resultaron de la investigacin con individuos con electrodos implantados en sus cerebros como una parte diagnstica de un tratamiento quirrgico para epilepsias serias. El descubrimiento de las clulas de lugar llev a la idea de que el hipocampo podra actuar como un mapa cognitivo, una representacin neural de la disposicin del entorno. Una evidencia reciente ha lanzado la duda de esta perspectiva, indicando que el hipocampo podra ser crucial para procesos ms fundamentales dentro de la navegacin. A pesar de todo, estudios con animales han demostrado que se requiere un hipocampo intacto para las tareas de memoria espacial simple (por ejemplo, encontrar el camino de vuelta a una meta oculta). Sin un hipocampo completamente funcional, los humanos no podran recordar dnde han estado ni cmo conseguir llegar a donde van. Los investigadores creen que el hipocampo desempea un papel particularmente importante en encontrar atajos y nuevas rutas entre lugares familiares. Algunas personas exhiben ms destreza en esta clase de navegacin que otras, y las imgenes del cerebro muestran que estos individuos tienen los hipocampos ms activos al navegar.

3. ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS.

En medicina, los trastornos de las funciones cognitivas se asocian generalmente con las llamadas demencias degenerativas primarias, de especial importancia por su

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alta frecuencia y prevalencia en las poblaciones con un ndice de envejecimiento creciente, tpicas de los pases desarrollados. Se trata de un grupo heterogneo de enfermedades caracterizadas por un deterioro mental progresivo que incluye combinaciones variables de prdida de memoria, alteraciones del juicio, el clculo, el lenguaje, la orientacin, las habilidades y la conducta, y trastornos psiquitricos. Los hallazgos anatomopatolgicos de este grupo de enfermedades consisten en la prdida de neuronas, localizadas preferentemente en la corteza cerebral, junto con cambios degenerativos de las neuronas supervivientes, inclusiones proteicas y alteracin vascular y de la gla. La localizacin de la prdida neuronal y la naturaleza de los cambios degenerativos y de las inclusiones son los factores que diferencian a las distintas afecciones (Bird y Miller, 2005). Ejemplos de este grupo de enfermedades degenerativas seran las demencias frontotemporales, la demencia con cuerpos de Lewy difusos y la EA. Esta ltima es el prototipo de enfermedad demenciante neurodegenerativa por excelencia, al ser la ms frecuente y la mejor estudiada (Sarasa, 2006). Sin embargo, a medida que el inters por el estudio de las funciones intelectuales ha ido aumentando, se ha comprobado que existen alteraciones cognitivas en otras enfermedades neurolgicas degenerativas cuyas manifestaciones cardinales consisten en un trastorno del movimiento, como las ataxias cerebelosas, las enfermedades de las motoneuronas o las distrofias musculares, y que engloban a la enfermedad de Parkinson (EP) (Campos-Romo, 2008; Ostrosky-Sols, 2000), el temblor esencial (Benito-Leon y col., 2006), la enfermedad de Huntington (Garca-Ramos y col., 2007; Ward y col., 2006), la parlisis supranuclear progresiva (Millar y col, 2006), las ataxias hereditarias (Mantovan y col., 2006), la esclerosis lateral amiotrfica (Garca-Moreno y col., 2001) y las miopatas (DAngelo y Bresolin, 2006). 27

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Es de destacar que prcticamente todas las enfermedades neurolgicas adquiridas o secundarias del sistema nervioso, incluidas las traumticas, vasculares, infecciosas, inflamatorias, desmielinizantes, tumorales, iatrognicas, txicas,

metablicas o psiquitricas, se han asociado con deterioro intelectual o demencia (Caselli, 2004). Tambin algunas enfermedades sistmicas, como el dolor crnico (Branca, 2006) o las afecciones reumticas (Hanly y col., 2005) y digestivas (Lackner y col., 2006a, b), se han asociado con la disfuncin cognitiva. Por lo tanto, la ubicuidad de la disfuncin intelectual en la patologa humana, junto con el hecho de que la alteracin cognitiva es siempre una causa importante de incapacidad para el paciente, y de estrs y sobrecarga para los familiares, los cuidadores y la sociedad en general, subraya la importancia del problema y la necesidad de profundizar en el conocimiento de las causas, los mecanismos patognicos y el tratamiento de estos trastornos. Pese al espectacular avance de las tcnicas y los conocimientos en neuroimagen, neuroqumica, neurogentica, neuropsicologa, neurofisiologa y neurofarmacologa, la investigacin con pacientes presenta importantes limitaciones que hace imprescindibles los estudios experimentales con modelos animales de los distintos tipos de disfuncin. El hipocampo es particularmente vulnerable a varias enfermedades entre las que se incluyen la isquemia (que es cualquier obstruccin del flujo sanguneo o deprivacin de oxgeno), la EA y la epilepsia. Estas enfermedades atacan selectivamente a la regin CA1, por lo que cortan el circuito hipocampal. Pero debe haber un dao bilateral de los hipocampos para que la memoria se afecte. Por lo tanto, solamente situaciones que reduzcan el flujo sanguneo o de oxgeno al cerebro entero producirn un dficit de memoria. La epilepsia del lbulo temporal severa parece muy similar al dao isqumico. La EA, aunque afecta al cerebro entero, es particularmente dura sobre la regin CA1.

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4. ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.
En 1901 ingres una paciente de 51 aos de edad en el hospital de Francfurt con un llamativo cuadro clnico de 5 aos de evolucin que tras comenzar con un delirio celotpico haba sufrido una rpida y progresiva prdida de memoria, alucinaciones, desorientacin espaciotemporal, paranoia, trastornos de la conducta y un grave trastorno del lenguaje. Alois Alzheimer, neurlogo alemn de finales del siglo XIX, estudi las caractersticas clnicas de la enfermedad que sufra la paciente y adems, una vez fallecida sta, realiz estudios histolgicos del cerebro. En ese estudio describa en la paciente lo que l denomin degeneracin neurofibrilar. El nombre enfermedad de Alzheimer fue acuado posteriormente por Kraepelin, maestro de Alois, en su Manual de Psiquiatra escrito en 1910. La EA fue considerada durante muchas dcadas una anomala rara de escasa presencia en la poblacin. Este concepto sobre la EA se mantuvo durante casi 70 aos. Al cabo de ese tiempo se observ que la demencia que afectaba a la mayora de personas de edad avanzada con declive cognitivo global era equivalente clnica y patolgicamente a la descrita por Alois Alzheimer. Hoy en da la EA es la forma ms comn de demencia; concretamente, del 50% al 70% de los casos de aparicin tarda de demencia se deben a esta enfermedad. Clnicamente se puede definir como una enfermedad neurodegenerativa progresiva, de aparicin tarda, dependiente de la edad, caracterizada por un empeoramiento de las funciones cognitivas y por cambios en el comportamiento y la personalidad (Selkoe, 2001; Mattson, 2004; Reddy y McWeeney, 2005; Tanzi y Bertram, 2005). La alteracin de la memoria es una caracterstica necesaria para el diagnstico de sta o de cualquier otro tipo de demencia. Tambin se deben presentar cambios en una de las siguientes

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reas: lenguaje, capacidad de toma de decisiones, juicio, atencin y otras reas de la funcin mental y la personalidad. Est causada por una degeneracin progresiva y bastante especfica de ciertas poblaciones neuronales del sistema nervioso central. Patolgicamente se caracteriza por la presencia de un gran nmero de placas neurticas y de ovillos neurofibrilares. Un hecho esperanzador es que es la enfermedad mejor conocida, con mayores avances de la clave patolgica. Sin embargo, a pesar de estos avances no se conoce la razn fundamental para la degeneracin de las neuronas y conexiones sinpticas que conducen a la demencia. La prevalencia de la enfermedad es difcil de determinar de forma definitiva porque la medida depende de varios factores, pero aproximadamente es del 1% en las personas entre 65 y 69 aos y del 40-50% entre personas de 95 aos o ms (Hy y Keller, 2000). Sin embargo, tambin puede afectar a gente ms joven.

4.1. Tipos de EA: familiar y espordica.

Clsicamente se distinguen dos tipos de EA segn la edad de inicio. Cuando la enfermedad aparece antes de los 65 aos de edad se denomina EA de inicio temprano o precoz (presenil), mientras que la forma de EA de inicio tardo (senil) se da en pacientes mayores de 65 aos (Fig. 3). En la forma de inicio precoz se produce un deterioro cognitivo acelerado en comparacin con la de inicio ms tardo. Existen casos de EA presenil que presentan herencia autosmica dominante. A esta forma de EA se le denomina EA familiar (EAF). Se han identificado tres genes con una prevalencia cercana al 100% cuyas mutaciones causan la EAF. Estos genes codifican para la protena precursora amiloide (PPA), la presenilina 1 (PSEN 1) y la presenilina 2 (PSEN 2). La PPA es una protena integral de membrana cuya funcin no

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se conoce muy bien. Las presenilinas son las unidades catalticas del complejo enzimtico -secretasa, el cual cataliza la proteolisis de la PPA para generar el llamado pptido -amiloide (A). De todas formas este tipo de EAF slo representa el 5% del total de los casos de EA (Shastry y Giblin, 1999). La mayora de los casos de EA son no familiares de inicio tardo que se presentan de forma espordica. Este tipo de EA espordica (EAE) muestra una etiologa compleja debida a factores ambientales y genticos que individualmente seran insuficientes para desarrollar la enfermedad. El gen de la apolipoprotena E (APOE) se ha identificado como el mayor factor de riesgo para estas formas complejas de EA, aunque slo el 50% de los casos no familiares de EA son portadores del alelo 4, la variante gentica que predispone a padecer la EA (Fig. 3).

PSEN 25-60 aos EAF Presenil (<65 aos) EA No Familiar EA EAF senil Senil (>65 aos) EA espordica Alelo 4 APOE Factores no identificativos PPA 40-65 aos PSEN 45-84 aos

Fig. 3. Tipos de EA. La EA se clasifica en senil o presenil segn la edad de inicio. Los genes descritos han permitido la caracterizacin de la EA familiar (EAF). PSEN, presenilina; PPA, protena precursora amiloide; APOE, apolipoprotena E. Esquema adaptado a partir del de St George-Hyslop 2000.

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No existen rasgos clnicos o patolgicos que distingan la EAF de la EAE, exceptuando la edad de inicio. Esta falta de rasgos distintivos indica que la influencia de diferentes factores ocasiona un proceso patognico similar.

4.2. Placas seniles y ovillos neurofibrilares.

Las dos caractersticas patolgicas fundamentales del cerebro de un paciente con EA son las placas seniles y los ovillos neurofibrilares. Estas dos agregaciones proteicas permiten un diagnstico definitivo de la EA en la autopsia. El papel de las placas y de los ovillos en la etiologa de la EA no est totalmente aclarado, pero juntos constituyen los marcadores clsicos de la enfermedad. Las placas y los ovillos se hallan predominantemente en los lbulos temporal y frontal, incluyendo el hipocampo. En casos muy avanzados de EA estas modificaciones se extienden a otras regiones de la corteza, incluyndose entonces los lbulos parietal y occipital. La patofisiologa de la enfermedad es compleja, sobretodo en su forma espordica, y muy probablemente implica diferentes vas de dao neuronal que se solapan. La prueba de que este hecho puede ser as es que adems de las placas y ovillos, el cerebro de un paciente con EA muestra en mayor o menor medida otra serie de alteraciones: prdida sinptica, gliosis, activacin de microgla, seales de inflamacin y dao oxidativo (Masliah, 2000). La neurodegeneracin y la prdida sinptica caractersticas de la EA se observan principalmente en las regiones que contienen gran cantidad de placas y ovillos (Ray y col., 1998).

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4.2.1 Las placas seniles. Las placas seniles son depsitos extracelulares insolubles formados por la agregacin del pptido A. Las placas seniles pueden ser difusas o clsicas; las difusas son agregados amorfos de pptido A que no se encuentran asociados con neuronas distrficas o neuritas anormales. Las placas neurticas clsicas contienen densos agregados fibrilares de pptido A y generalmente estn asociadas a degeneracin y prdida de clulas neuronales. Tambin se ha indicado que estos dos tipos de placas reflejan el estadio de la enfermedad: las placas difusas se encuentran en estados iniciales de la enfermedad y las clsicas son placas maduras, consecuencia del avance de la enfermedad (Behl, 1999). El pptido A es una combinacin heterognea de pptidos que van de 39 a 43 aminocidos de tamao, siendo los de 42 y 43 aminocidos las especies primarias del pptido amiloide depositado en las placas seniles. El pptido A deriva del procesamiento de la PPA llevado a cabo por una serie de proteasas, las secretasas y (Hutton y col., 1998). En condiciones normales una proteasa llamada secretasa, corta la PPA de manera que libera un fragmento extracelular, soluble, de unos 695 aminocidos. La parte que queda integrada en la membrana es procesada despus mediante la accin de una segunda enzima, la secretasa, que libera la parte carboxilo terminal de la protena, posiblemente dentro de vesculas lisosomales para su posterior degradacin. Esta va es conocida como la va no amiloidognica, porque la accin de la secretasa previene la formacin del pptido A, con lo que impide la formacin de depsitos. Sin embargo, una parte de la PPA es procesada de manera diferente. Otra secretasa, la secretasa, corta la PPA liberando un fragmento carboxilo terminal ms largo, que tras ser procesado por la secretasa, libera el pptido A. La clave en esta ruta de procesamiento es la posicin en donde la secretasa corta, pues puede dar como 33

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resultado un pptido A40 corto con poca capacidad para formar agregados, o un pptido A42-43 largo bastante ms insoluble que el otro. Por ello la secretasa parece ser la responsable directa del origen del pptido A de 42-43 aminocidos que tiene gran importancia patognica, puesto que puede formar agregados fibrilares txicos insolubles cuya acumulacin da lugar a las placas seniles (ver imagen de la representacin esquemtica del procesamiento de la APP en

http://svneurologia.org/fc/app.htm). La agregacin del pptido A es considerada por muchos autores la principal causa de la EA. El papel del pptido A parece ser fundamental en la EA y es objeto de las principales hiptesis que explicaran su desarrollo. Al menos en la EAF su contribucin parece decisiva, ya que los genes descritos se encuentran implicados en los mecanismos de produccin del pptido A. Sin embargo, el mecanismo por el cual el pptido A causara la neurodegeneracin est en discusin. En la figura 4 se muestra la hiptesis de la cascada amiloide que explicara el proceso de neurodegeneracin a partir de la acumulacin del pptido A. Por otro lado la controversia sobre si las placas y los ovillos son causa o efecto ha propiciado diversas teoras, como la que propone que la acumulacin de pptido A en la EAE sera una respuesta protectora al dao oxidativo originado por una disfuncin mitocondrial (Smith y col., 2002). 4.2.2. Los ovillos neurofibrilares. Son depsitos intracelulares compuestos principalmente por la protena asociada a microtbulos tau (Strittmatter y col., 1996). Los ovillos se forman debido a la hiperfosforilacin de tau mediante mecanismos que provocan la disociacin de tau de los microtbulos y la formacin espontnea de depsitos de filamentos insolubles. Se

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han podido inducir marcadores antignicos de hiperfosforilacin de tau y depsitos limitados de tau en neuronas in vitro mediante tres vas diferentes: aumento de la concentracin intracelular de calcio, reduccin de la energa disponible y aumento de la concentracin de glutamato. Para los autores esto indica que los ovillos aparecen secundariamente al estrs neuronal (Mattson, 1994).

4.3. Hiptesis de la cascada amiloide.

Muchos procesos celulares se rompen en la EA. Estos procesos son iniciados por diferentes eventos. Cualquier hiptesis que explique la EA tiene que incorporar la idea de mltiples lesiones primarias para llegar a un nico modo de patognesis. Por ello se propuso la hiptesis de la cascada amiloide en 1991 por John Hardy y David Allsop. Esta hiptesis explicara el proceso de neurodegeneracin a partir de la acumulacin del pptido A. Por ello esta hiptesis sugera que las mutaciones en los genes PPA, PSEN1 o PSEN2 produciran el metabolismo errneo de la APP, el cual era el evento inicial para la patognesis de la EA, que provocara el aumento y la acumulacin del pptido A; esto a su vez provocara la oligomerizacin del pptido A con efectos sutiles de los depsitos en la sinapsis, lo que a su vez producira la activacin microglial y astroctica que ira causando lesiones sinpticas y neurticas progresivas; stas causaran una homeostasis inica neuronal alterada y dao oxidativo, con actividades kinasa/fosfatasa alteradas (formacin de ovillos), producindose una amplia disfuncin neuronal/neurtica y la muerte celular que finalmente desencadenara la demencia caracterstica de la EA (Hardy y Allsop, 1991).

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Mutaciones en los genes PPA, PSEN1 o PSEN2 Aumento en la produccin y acumulacin pptido A42 Oligomerizacin del pptido A42 y deposicin en placas difusas Efectos sutiles de los depsitos en las sinapsis Activacin microglial y astroctica (factores del complemento, citoquinas, etc) Lesiones sinpticas y neurticas progresivas Homeostasis inica neuronal alterada; dao oxidativo
Ovillos

Actividades kinasa/fosfatasa alteradas

Amplia disfuncin neuronal/ neurtica y muerte celular

Demencia-EA

Fig. 4. Hiptesis de la casacada amiloide.

Desde que el pptido A fuera identificado por primera vez en 1984 como el principal componente de las placas amiloides (Glenner y Wong, 1984), las evidencias acumuladas sugieren que este pptido es de hecho el dao primario neuropatolgico en la EA. Un punto importante en esta hiptesis es la observacin de que la mayora de las mutaciones implicadas en la EA familiar incrementan la cantidad de A42 fibrilognico. Adems, los modelos de ratones transgnicos que expresan mutaciones patognicas de APP (Hsiao y col., 1996) y de PSEN1 incrementan los niveles de A y de placas amiloides. Adems, los individuos con la trisoma 21 (Sndrome de Down) tienen 3 copias de APP y normalmente desarrollan una EA avanzada en la cuarta dcada de su vida. 36

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4.4. Inflamacin y enfermedades neurodegenerativas.

Los procesos patolgicos de la neurodegeneracin observados tanto en la EA como en la EP van acompaados por una reaccin inflamatoria que parece contribuir a su patognesis (Akiyama y col., 2000). Existen claras evidencias de la implicacin de las reacciones inflamatorias en la degeneracin del sistema negro-estriado que lleva a la EP (Castao y col., 1998; Herrera y col., 2000; Castao y col., 2002). Esta reaccin inflamatoria est precedida por una fuerte activacin microglial en la SN sugiriendo la posible relacin entre ambos procesos. De igual manera existen evidencias de la existencia de una reaccin inflamatoria crnica y especialmente intensa en los cerebros de pacientes con Alzheimer (McGeer y McGeer, 2004) que cursa con toda la complejidad de una respuesta inflamatoria perifrica. En los cerebros de enfermos de Alzheimer las neuronas y neuritas daadas, los grandes depsitos de pptidos A altamente insolubles y los ovillos neurofibrilares proporcionan un estmulo obvio para la inflamacin. Como estos estmulos son discretos y estn microlocalizados y presentes desde fases preclnicas tempranas hasta estadios terminales de la EA, la estimulacin local del complemento, de citoquinas, de protenas de fase aguda y de otros mediadores inflamatorios es tambin discreto y crnico y est microlocalizado. En la EA se ha observado gliosis, que se manifiesta por una gran activacin de astrocitos y microgla que se encuentran en abundancia cerca de las neuronas y de las placas. Esta caracterstica ya se vio en 1911 cuando se describi la EA por primera vez. Esto sugiere que la inflamacin podra estar implicada en la EA, puesto que las clulas gliales median la respuesta de inmunidad innata en el sistema nervioso central. Cuando se produce la activacin, los astrocitos y la microgla liberan

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varias molculas de sealizacin proinflamatoria, incluyendo citoquinas S100, que se produce por los astrocitos, e interleukina 1 (IL-1) que es principalmente producida por la microgla activada. Trabajos recientes sugieren que la activacin de la microgla en respuesta al dao, a la enfermedad, a la edad o a otras causas inicia una cascada de eventos que puede caracterizarse como un proceso inflamatorio. Esta cascada es mediada inicialmente por la citoquina proinflamatoria interleukina 1, que se sobreexpresa en la microgla activada. A travs de varias rutas la interleukina 1 causa la muerte neuronal, la cual activa ms microgla, que a su vez libera ms interleukina 1 en un proceso automantenido y autoamplificado. Se cree que la acumulacin durante muchos aos de daos directos y de los mecanismos inflamatorios en los cerebros con EA exacerban significativamente los procesos patognicos que dieron origen a dicha enfermedad, destrozndose suficientes neuronas para causar las seales clnicas de la EA. Por lo tanto, los modelos animales y los estudios clnicos, aunque todava en estadios iniciales, sugieren que la inflamacin en la EA contribuye a la patognesis de dicha enfermedad. Con este descubrimiento han surgido nuevos retos y nos hemos formulado nuevas preguntas, de las que slo estamos comenzando a encontrar la respuesta. Son los mecanismos inflamatorios los causantes del dao en la EA o slo estn presentes para retirar los detritos y no como un proceso patolgico primario? Se podran

considerar los antiinflamatorios una opcin teraputica viable para la EA? Existen evidencias directas e indirectas del papel de la neurodegeneracin en los procesos inflamatorios producidos en la EA proporcionadas por estudios e investigaciones clnicas; aunque todava inconclusos, en ellos se sugiere que los

frmacos antiinflamatorios convencionales no esteroideos (AINEs) podran retrasar la aparicin y enlentecer la progresin de la EA. Una mejor comprensin de los procesos 38

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inflamatorios e inmunoreguladores de la EA es necesaria para el desarrollo de acercamientos antiinflamatorios que, aunque no curasen la EA, probablemente ayudaran a retrasar su progresin o retrasar la aparicin de esta devastadora enfermedad.

4.5. Asociacin entre S100, interleukina 1 y la EA.

4.5.1. Efecto del S100. Bajo circunstancias normales, S100 promueve el crecimiento de las neuritas, estimula la proliferacin de los astrocitos e incrementa las concentraciones de calcio libre tanto en neuronas como en astrocitos. Sin embargo, la sobreexpresin de S100 podra tener consecuencias deletreas, incluyendo un excesivo crecimiento de las neuritas distrficas que caracterizan las placas neurticas -amiloides cuya presencia ayudan al diagnstico de la EA. Marshak y col, en 1992 informaron que S100 se sobreexpresa en los cerebros de los pacientes con EA, especialmente en el lbulo temporal, donde las placas neurticas estn concentradas. Se ha visto que la expresin de S100 muestra una elevada correlacin con el nmero de neuritas distrficas encontradas en las placas en diferentes estadios de evolucin. Finalmente, diversos estudios han concluido que la activacin de los astrocitos y la expresin de S100 estn implicadas en la induccin y el mantenimiento de las neuritas distrficas en los depsitos amiloides.

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4.5.2. Efecto de la IL-1. La IL-1 es una citoquina proinflamatoria muy bien caracterizada que est implicada en diversos procesos de enfermedades crnicas neurodegenerativas, incluyendo el desarrollo de arteriosclerosis y artritis reumatoide. En la EA est asociada tanto con las placas -amiloides como con la formacin de neuritas distrficas. Segn algunos experimentos, la IL-1 contribuye a la rpida sobreexpresin de A despus de un traumatismo craneoenceflico. Adems sabemos que en la EA, las placas con neuritas y neuronas que contienen tau se encuentran en las mismas reas del cerebro en donde tambin se encuentra microgla expresando IL-1. Curiosamente, la presencia de astrocitos activados que expresan S100 tambin se correlaciona con la microgla activada que expresa IL-1. Mientras las placas se desarrollan, el nmero de microgla activada que expresa IL-1 asociada a cada placa tambin cambia y sigue un patrn similar al seguido por los astrocitos que expresan S100. Estos resultados forman una evidencia poderosa aunque circunstancial del desarrollo y la progresin de la EA. Sin embargo, para demostrar que es la fuerza impulsora en la EA y no simplemente una consecuencia del desajuste neuronal se debera demostrar que la inflamacin precede al desarrollo de las placas. Las evidencias sealan hacia un papel central de la inflamacin en la EA, mediada por citoquinas proinflamatorias, de manera que se crea una interaccin crnica automantenida entre microgla activada y astrocitos, neuronas estresadas y placas amiloides. Un factor de iniciacin clave parece ser la sobreexpresin de IL-1, que podra ser el resultado de varios eventos, incluyendo enfermedad, traumatismos, polimorfismos genticos o simplemente el desgaste generado con la edad.

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Una vez que la IL-1 est presente en exceso, comienza la cascada de eventos que incluyen varios ciclos de retroalimentacin, resultando finalmente en un ciclo de autosustentacin que lleva hasta una progresiva muerte neuronal. La IL-1 activa los astrocitos, por lo que produce un incremento de la expresin de S100. La sobreexpresin de S100 causa crecimiento de neuritas distrficas, que estimula a las neuronas a producir APP (que estimula la expresin de S100). Esto incrementa las concentraciones de calcio intracelular, lo cual conlleva al dao celular. Por otro lado la sobreexpresin de S100 tambin induce la expresin de IL-6 y promueve la expresin de IL-1. Por su parte la IL-1 estimula directamente la sntesis neuronal de APP, lo que lleva a la produccin de -amiloide que a su vez activa directamente a la microgla e incrementa la expresin de IL-1. Finalmente, la IL-1 promueve directamente la proliferacin microglial e incrementa la expresin de IL-1 e IL-6. Todos estos procesos actan para incrementar el estrs en las neuronas (estimulndolas a producir todava ms PPA), lo que termina por retroalimentar el ciclo. Esta es la deletrea y poderosa interaccin entre las citoquinas, neuronas y gla que se ha denominado ciclo de la citoquina. Sin embargo, la gran cantidad de funciones de la IL-1 no se detiene aqu. Un elemento central en la EA es la disfuncin colinrgica, que se ha atribuido al incremento, inducido por estrs, de la actividad de la enzima acetilcolinesterasa (AChE). Estos incrementos son de hecho la diana para la nica terapia establecida posible para la EA, los bloqueantes de la AChE. Diversos estudios han mostrado que la AChE se sobreexpresa en las neuritas de las placas en la EA y regula el procesamiento de APP, lo que sugiere una relacin entre la AChE y la formacin de las placas. Existen estudios in

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vitro e in vivo que demuestran que la IL-1 esta implicada en la raz de la disfuncin colinrgica en la EA. La IL-1 tambin est implicada en la hiperfosforilacin de tau, principal componente de los ovillos neurofibrilares que son tan caractersticos de la EA. Todo esto nos trae de vuelta al ciclo de la citoquina: la disfuncin neuronal y la muerte dan como resultado la prdida cognitiva y la demencia, elementos caractersticos de la EA, y tambin perpeta el ciclo mediante la estimulacin de la sobreexpresin de IL-1 por la microgla activada. Esto coloca de nuevo a la IL-1 como centro de la patognesis de la EA. Pero la IL-1 no solamente causa dao neuronal, sino que de forma directa e indirecta potencia su automantenimiento y se llega a un crculo vicioso. Estimula directamente su propia produccin; el -amiloide, producido desde el APP, estimula tambin su produccin; S100 estimula su produccin; y finalmente, la muerte de las neuronas dirigen al incremento de la activacin microglial y todava producen ms expresin de IL-1.

4.6. El tratamiento farmacolgico de la EA.

Hoy por hoy no existe ningn tratamiento que pueda curar la EA. La enfermedad progresa de forma ms o menos rpida, hacia un deterioro severo que precisa de ayuda para todas las actividades bsicas. Sin embargo, en algunas personas en las fases tempranas y medias de la enfermedad, algunos medicamentos pueden prevenir el empeoramiento de algunos sntomas durante un tiempo limitado. El

uso de frmacos para tratar los sntomas o para evitar el progreso de la EA se inici en la dcada de los 90 con la comercializacin de los inhibidores de la enzima

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colinesterasa. Estos medicamentos aumentan la concentracin de acetilcolina (Ach) en el cerebro. Los cuatro frmacos comerciales ms usados actualmente (tacrina, donepezilo, galantamina y rivastigmina) se basan en este principio. El inconveniente de estos tratamientos es que su administracin no puede proporcionar la solucin definitiva al problema (Palmer, 2002) y, adems, tienen efectos secundarios importantes. Estos compuestos representan tratamientos sintomticos que han demostrado que contribuyen a mejorar la funcin cognitiva, el estado general y la realizacin de actividades de la vida diaria. El cese en su administracin provoca el empeoramiento clnico. No existen datos clnicos convincentes que indiquen que estos frmacos son capaces de modificar el desarrollo de la enfermedad. Tambin se han usado como tratamiento especfico la memantina, la selegilina y la vitamina E (antioxidante): La memantina acta evitando la muerte neuronal. Se trata de un antagonista no competitivo de los receptores NMDA, y acta unindose en ellos al mismo lugar que fisiolgicamente lo hace el magnesio, pero con mayor afinidad. Esto bloquea la entrada masiva de calcio que se produce en las clulas nerviosas cuando existe una excesiva actividad del glutamato que provoca el desplazamiento del magnesio. La indicacin aprobada actualmente de manera oficial es en los casos moderados, graves y moderadamente graves, pero ya hay estudios en marcha para conseguir su aprobacin para los casos leves. La selegilina y la vitamina E han demostrado eficacia en producir un cierto retraso en la evolucin de la enfermedad, retrasando asimismo la institucionalizacin de los pacientes. Ninguno de estos dos agentes ha demostrado producir mejoras en el plano cognitivo.

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Otras alternativas farmacolgicas son las siguientes: Terapia de complementacin: el cerebro de un paciente con EA presenta una serie de deficiencias (hormonas, neurotransmisores, factores trficos, etc.), las cuales suponen una diana para la complementacin farmacolgica. Componentes anti-apoptticos: uno de los mecanismos que se encuentra activado en la EA es la apoptosis. El conocimiento y comprensin de esta cascada bioqumica debera conducir a la determinacin de sustancias capaces de bloquear la apoptosis. Las caspasas se encuentran en primera lnea de investigacin, en particular la caspasa-3, que siempre est presente en las placas seniles y en los ovillos. Sustancias anti-amiloides: el concepto farmacolgico para el tratamiento de la EA consiste en disminuir la sntesis del pptido A42, o promover su eliminacin, papel que deberan llevar a cabo los macrfagos y clulas microgliales, o prevenir su depsito y agregacin (Esiri, 2001). Otra aproximacin es la dirigida a estimular respuestas inmunolgicas contra antgenos especficos. Schenk (2006) observ que la aparicin de los depsitos amiloides poda prevenirse mediante la vacunacin con pptido sinttico A, de tal manera que el sistema inmunolgico crea anticuerpos que eliminan las formas modificadas de esta protena. Aos antes se haban realizado pruebas con otra vacuna en humanos. Los resultados obtenidos fueron los esperados tras la fase de experimentacin, es decir, se redujo el nmero de placas amiloideas en los pacientes. Pero tuvo que abandonarse la aplicacin de esta vacuna debido a que en un grupo reducido de pacientes se presentaron casos de meningoencefalopata e inflamacin cerebral, con la consecuente muerte de algunos de estos pacientes. Parece ser que el fracaso de esta vacuna fue la utilizacin de una protena natural que desencaden una fuerte respuesta

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inmune. A pesar de mantenerse en continua investigacin, la utilizacin de este tipo de vacunas parece esperanzadora para la lucha contra esta devastadora enfermedad. Inhibicin de la agregacin proteica: las protenas que se agregan en las enfermedades neurodegenerativas adoptan una estructura en hoja- que las hace insolubles. Ciertas isoformas de Apo E pueden actuar estabilizando la disposicin espacial en hoja- del pptido A. Actualmente existen pocos frmacos que impidan la formacin de hojas-. La molcula quinacrina, con efectos sobre la estructura tridimensional de ciertas protenas, es objeto de evaluacin en la EA. Frmacos que reducen la cantidad de lpidos: los vnculos entre el colesterol y la EA se han estrechado gracias al descubrimiento del factor de riesgo Apo E4. Est demostrado que las estatinas, compuestos que disminuyen el colesterol, reducen el riesgo de desarrollar la EA a travs de mecanismos que deben ser independientes del colesterol. Sustancias con impacto en la mitocondria: resolver la disfuncin mitocondrial es tambin un objetivo para el desarrollo de futuros medicamentos para tratar la EA. Existen algunos medicamentos que de una forma ms o menos directa normalizan o restauran la funcin mitocondrial. Estos compuestos no txicos se prescriben frecuentemente en pacientes de edad avanzada y promueven el metabolismo energtico a travs de vas intermedias que favorecen la disponibilidad de oxgeno y glucosa en la mitocondria. Tratamiento de los sntomas psicolgicos y conductuales: existen tratamientos que ayudan a controlar los sntomas psicolgicos y conductuales que aparecen con esta enfermedad, mejorando la calidad de vida de los pacientes y su relacin con el medio.

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La depresin aparece con frecuencia en las fases iniciales de la enfermedad y puede responder a tratamiento antidepresivo. Tambin deben controlarse otros sntomas como el insomnio, la agitacin o las alucinaciones, con lo que se usan neurolpticos o benzodiacepinas.

Terapias antiinflamatorias para la EA: la existencia de una reaccin

inflamatoria crnica y especialmente intensa en los cerebros de pacientes con Alzheimer, di pie a pensar que el tratamiento de la inflamacin con agentes antiinflamatorios podra tener algn efecto beneficioso sobre esta enfermedad. Los agentes antiinflamatorios pueden ser de dos tipos: esteroideos y no esteroideos (conocidos como AINES). - Agentes antiinflamatorios esteroideos: en el caso de los agentes antiinflamatorios esteroideos (glucocorticoides, como la prednisona), aunque tienen propiedades que podran ser tiles para el tratamiento de la inflamacin de la EA (son antiinflamatorios muy potentes), tambin tienen propiedades que podran hacerles menos adecuados para la administracin a pacientes con EA (como por ejemplo, efectos proinflamatorios, como se ver ms adelante, y graves efectos secundarios cuando se utilizan durante perodos de tiempo largos). Globalmente, la exposicin crnica a glucocorticoides (GCs) durante un estrs prolongado produce efectos adversos, tales como inmunosupresin, infertilidad y neurodegeneracin. La situacin podra ser peor en pacientes con EA, por las interacciones especficas de los esteroides con alteraciones bioqumicas, sistmicas y de comportamiento ya existentes. Otros estudios han mostrado que los GCs hacen a las neuronas ms vulnerables a una variedad de agentes neurotxicos, entre los que se incluyen el glutamato y el

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kainato (Sapolsky, 2000; Lu y col, 2003) y, ms importante an, al pptido A (Behl y col., 1997b). Tambin se han observados otras relaciones negativas entre la EA y los GCs. Recientemente se ha mostrado que el estrs y los GCs promueven la deposicin amiloide y la acumulacin de tau en modelos de EA en ratones transgnicos (Green y col. 2006; Jeong y col., 2006). Ms recientemente, Sotiropoulos y col. han observado que el tratamiento con GCs llevaba a un mal procesamiento de la APP y a una menor degradacin y acumulacin de tau (Sotiropoulos y col., 2008). Por todo esto, al no tener efectos beneficiosos para tratamientos a largo plazo, los GCs no son del todo aconsejables para tratar la EA (Sorrells y Sapolsky, 2006). - AINES: como alternativa a los agentes antiinflamatorios esteroideos se est

probando el uso de los AINES. Evidencias epidemiolgicas sugieren que los AINES deben proteger contra la EA. Sin embargo, los estudios teraputicos con ellos no han confirmado tal evidencia epidemiolgica. La aparente incongruencia puede ser debida al hecho de que la evidencia epidemiolgica est basada en estudios anteriores a la aparicin de las manifestaciones clnicas de la EA, mientras que los estudios teraputicos se han llevado a cabo en personas que sobrepasan el umbral de deteccin clnica. Por esto, es concebible que las estrategias teraputicas administradas durante la demencia temprana o moderada no puedan ser efectivas de una forma ptima. La accin primaria de los AINES es la inhibicin de las enzimas ciclooxigenasas (COX). Estas enzimas se presentan en forma inducible (COX-2), que est elevada en los cerebros de pacientes con EA, y en una forma constitutiva (COX-1). Ambas estn implicadas en numerosas actividades inflamatorias adems de en funciones neuronales. In vitro se ha demostrado que los inhibidores no selectivos de COX pueden disminuir 47

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preferentemente los niveles del pptido A42. Estudios recientes con AINES no selectivos en modelos de EA en ratones indicaron que la frecuencia de los depsitos de este pptido en el cerebro de estos animales puede ser significativamente reducida por el tratamiento con el ibuprofeno (inhibidor no selectivo de la COX). Sin embargo, la aspirina o el naproxeno, que pertenecen a la misma familia, no poseen este efecto protector. Estos estudios y los datos epidemiolgicos apoyan una terapia potencial para los AINES en el tratamiento de la EA. Sin embargo, dado el gran nmero de candidatos antiinflamatorios, sus actividades ampliamente divergentes y los importantes efectos secundarios, es esencial optimizar la seleccin de la droga y el modelo de estudio. Un mejor entendimiento de la influencia de la actividad antiinflamatoria en la EA y la identificacin de los mecanismos especficos que juegan un papel temprano en la progresin de la enfermedad, mejorar mucho la probabilidad de xito en los esfuerzos por encontrar una estrategia de tratamiento antiinflamatoria efectiva (Pasinetti, 2002). Por todo ello, el uso de los AINES para tratar la EA se encuentra todava en continua investigacin.

5.

MODELOS

DE

NEURODEGENERACIN.

El

LIPOPOLISACRIDO.

Existen diversos modelos que permiten mimetizar las caractersticas neuroqumicas e histolgicas que acompaan a los procesos inflamatorios cerebrales. Entre ellos se encuentra el lipopolisacrido (LPS) o endotoxina que representa el

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principal componente de la membrana externa de las bacterias Gram-negativas y juega un papel clave en el desarrollo de infecciones y sepsis (Rietschel y Brade, 1992; Schletter y col., 1995). El LPS fue descubierto aproximadamente hace unos 100 aos por Richard Pfeiffer y al contrario que la exotoxina segregada por la bacteria del clera, es estable al calor (Ulmer y col., 2002).

5.1. Estructura del LPS.

Aunque existe una gran variacin en la composicin del LPS de diversas cepas bacterianas, todos ellos muestran una estructura comn. Se trata de molculas anfipticas consistentes en una parte polisacrida e hidroflica que va unida covalentemente a un componente lipdico e hidrofbico, denominado lpido A (ver imagen de la estructura qumica y variabilidad del LPS en

http://pathmicro.med.sc.edu/fox/lps.jpg). El heteropolisacrido comprende dos regiones: la cadena O-especfica tambin llamada Antgeno O, formada por unidades repetitivas de oligosacrido; y la regin central o core. ste a su vez se subdivide en core externo (formado por hexosas), mediante el cual se une al antgeno O; y el core interno (formado por heptosas). El lpido A se compone en general de un disacrido fosforilado, unido a dos Dglucosaminas en posicin 1, 6 y que porta un mximo de seis o siete residuos acilo. Se une al core interno mediante un residuo llamado KDO (cido 2-keto-3-deoxioctanoico). Existen variaciones en la longitud, posicin y nmero de cidos grasos que componen el lpido A. ste constituye el principio endotxico del LPS, mientras que los efectos biolgicos son reproducidos por la parte del lpido A libre.

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5.2. Interaccin entre el LPS y protenas solubles de membrana.

Un requisito previo para la activacin de las clulas por el LPS es su interaccin con molculas especficas de unin al LPS en la superficie de sus clulas diana. Se han descrito varias estructuras de unin al LPS, pero slo se ha demostrado una relevancia fisiolgica para algunas de ellas (Bermejo y Duarte, 2003). La protena de la superficie celular ms destacada relacionada con la unin al LPS y a su activacin celular es la glicoprotena de 55kDa CD14 (Tanaka y col., 2000). sta existe como una protena en de las membrana clulas (CD14m) monocticas, anclada en a un

glicosilfosfatidilinositol

(GPI)

leucocitos

polimorfonucleares, en algunos linfocitos B (Gu y col., 1998) y en clulas epiteliales. La unin del LPS al CD14m en los monocitos es necesaria para la estimulacin de estas clulas, lo cual lleva a la produccin y liberacin de mediadores inmunes. La unin del LPS al receptor CD14 est fuertemente incrementada por una glicoprotena srica de 60kDa denominada protena de unin al LPS (LPS-binding protein o LBP) (Staal y Sonsalla, 2000). Durante la respuesta de fase aguda, la concentracin de LBP se incrementa desde 5-10 g/ml hasta 200 g/ml. El LBP reduce la concentracin de LPS requerida para la activacin de los monocitos formando complejos LBP-LPS, que son reconocidos por el CD14. Adems del CD14m, existen distintos tipos de CD14 solubles (de 48, 53 y 55 kDa) presentes en concentraciones de alrededor de 2-6 g/ml en el suero (Frey y col., 1992) que son liberados por monocitos o bien secretados por formas libres de GPI (Alam y col., 1997a, b; McNaught y Olanow, 2003). Se sabe que el LPS se une directamente a las formas solubles del CD14 (CD14s), un proceso altamente facilitado

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por el LBP, a pesar de que esta protena no est presente en los complejos de LPSCD14s (Andrew y col., 1993). Los complejos LPS-CD14s permiten la activacin sin CD14m de algunas clulas, como clulas endoteliales, fibroblastos y clulas del msculo liso que produciran citoquinas (Benveniste, 1992; Good y col., 1992; Wang y col., 2002). As, se ha postulado la existencia de un receptor especfico para los complejos de LPS-CD14s que se expresara en estas clulas y que mediara la activacin por el LPS de las clulas sin CD14. En conclusin, el CD14 jugara un papel extremadamente importante como receptor soluble de membrana en el reconocimiento molecular del LPS en varias clulas. Sin embargo, parece que la activacin celular requiere molculas de membrana adicionales.

5.3. Transduccin de seal inducida por el LPS.

En los ltimos aos se ha identificado en humanos y ratones una familia de protenas denominadas receptores semejantes a Toll (Toll-like receptors o TLRs). Se trata de protenas transmembrana con un dominio extracelular con repeticiones ricas en leucina (LRR) y un receptor citoplasmtico Toll/IL-1 (TIR) con un dominio de gran semejanza estructural con el del receptor de IL-1 (ONeill y Greene, 1998; Anderson, 2000). Existen evidencias que sugieren que estos TLRs son las molculas de reconocimiento de patgenos ms importantes y que se utilizan diferencialmente en el inicio de las cascadas de sealizacin en respuesta a infecciones con diferentes clases de patgenos. Una vez que el LPS estimula las clulas diana, ocurren una serie de eventos intracelulares. El ms importante y mejor caracterizado es la activacin del NF-B, que

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juega un papel central en la regulacin de las respuestas inflamatorias e inmunes (Ghosh y col., 1998; May y Ghosh, 1998). El NF-B representa un grupo de protenas relacionadas estructuralmente, incluidas la p65, p50, p52, RelB y c-Rel. En condiciones normales, el NF-B se encuentra secuestrado en el citosol como una forma inactivada homo o heterodimrica, con interacciones no covalentes con sus protenas de inhibicin, denominadas IBs. Tras la estimulacin con el agonista apropiado, el IB es fosforilado, ubiquitinizado y degradado. As, el NF-B es liberado y se trasloca al ncleo iniciando la expresin gnica. Dentro de los genes diana del NF-B se incluyen aquellos que codifican para citoquinas, quimioquinas, molculas de adhesin, protenas de fase aguda, pptidos antimicrobianos, la xido ntrico sintasa inducible (iNOS) y la COX-2. En conjunto, estos mediadores proporcionan proteccin inmediata al husped e inducen el desarrollo de la respuesta inmune adaptativa (Ghosh y col., 1998; May y Ghosh, 1998). En los ltimos aos se ha producido una importante expansin de nuestro conocimiento sobre los mecanismos de sealizacin por los que el LPS induce la activacin del NFB. De hecho, se han descubierto varios de los componentes moleculares implicados en este proceso (Bermejo y Duarte, 2003; Zhang y Ghosh, 2000). El TLR4 es un receptor primario transmembrana de sealizacin para el LPS. Una vez que el LPS se ha unido al CD14, el LPS debe transferirse al TLR4, resultando en la homodimerizacin del TLR4 y en un cambio conformacional en el dominio citoplasmtico. Posteriormente, se recluta sobre el receptor una protena adaptadora llamada MyD88, seguido de la interaccin con la kinasa asociada al IL-1R (IRAK)-1, -2 o M. La IRAK se disocia del complejo del receptor y recluta al factor 6 asociado al receptor de TNF (TRAF6), que finalmente resulta en el ensamblaje y activacin del complejo IKK// y la subsecuente fosforilacin y degradacin del IB y la translocacin al ncleo del NFB. 52

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El mecanismo por el cual el TRAF6 activa a las IKKs no se conoce bien actualmente, aunque hay evidencias que muestran que el TRAF6 podra interaccionar con molculas adicionales que ayudaran a activar a protenas kinasas en cascada, lo cual llevara a la fosforilacin y activacin de las IKKs. Se han identificado tres protenas TRAF6, denominadas intermediario evolutivo conservado de seales en la va Toll (ECSIT), protenas de unin a TAK-1 (kinasa activada por el factor de crecimiento transformante -2, TAB2) y protena de unin al TRAF6 (T6BP) (Zhang y Ghosh, 2000). Existen otras vas de transduccin de seal del LPS. En diversos estudios in vitro con monocitos y fibroblastos se han implicado protenas G y pequeas protenas G que pueden participar en la activacin de tirosinkinasas (TK) (Tanke y col., 1991; Mayeux, 1997), la fosfolipasa C (PLC) y A2 (PLA2) (Chang y col., 1990; Fleming y col., 1996), as como la calmodulina (Nakano y col., 1993; Mattsson y col., 1996). Tambin se ha atribuido el papel de segundo mensajero a la esfingomielasa (SM), que hidrolizara la esfingomielina en ceramida, la cual activara diferentes protenfosfatasas (PPT) y proteinkinasas (PK), como la PK activada por ceramida (CAK) (Joseph y col., 1994), que podra intervenir en la seal del LPS activando o inhibiendo diversas enzimas como la PKC, las fosfolipasas PLC y PLA2, y la COX inducible (COX-2) (Hayakawa y col., 1996; Liu y col., 1999). Otra va es la formada por las PK, en la cual estn implicados varios grupos: las serin-treonin PK A (PKA) y C (Shapira y col., 1994; Kozak y col., 1997) y un gran conjunto de TK (Ruetten y Thiemermann, 1997). El conjunto de las TK activadas por mitgenos, MAP kinasas (MAPKs) tambin participa en gran medida en las seales intracelulares del LPS. Esta gran familia consta de PKs que fosforilan restos de serinatreonina y tirosina-treonina. Segn diferentes estudios in vitro realizados en macrfagos, 53

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otros leucocitos, clulas endoteliales, clulas musculares lisas y otros tipos celulares (Arditi y col., 1995; Downey y Han, 1998; Baydoun y col., 1999), existen al menos cuatro subgrupos de MAPKs, de los cuales se ha descrito que tres estn relacionados con las respuestas inducidas por el LPS. Uno de estos subgrupos est formado por las kinasas reguladas por seales extracelulares (ERK) y otro, por las kinasas llamadas p38. Se sabe que ERK est implicado en la produccin de xido ntrico (NO), la expresin de iNOS y la secrecin de TNF- estimuladas por LPS. p38 induce la produccin de TNF- e IL-1, adems de la expresin de otras protenas/ mediadores inflamatorios entre los que se incluyen iNOS, COX-2, IL-6 e IL-8. Las otras vas relacionadas con las MAPKs incluyen el conjunto de protenas que forman la subfamilia de PK del factor de transcripcin c-jun, llamadas JNK, cuya activacin induce la expresin de proteasas y citoquinas especficas.

5.4. LPS como modelo de enfermedad de Parkinson y de sepsis.

Como ya se ha mencionado anteriormente, el LPS es un componente de la pared celular de las bacterias Gram-negativas. Es eliminado de la circulacin sistmica principalmente por las clulas de Kupffer, los macrfagos residentes del hgado. En el SNC es un eficaz activador inmune. La cintica de la reaccin inflamatoria que sigue a la inyeccin intracerebral de LPS ya se describi en el SNC de ratones (Anderson y col., 1992) y rata (Bourdiol y col., 1991; Montero-Menei y col., 1994, 1996; Szczepanik y col., 1996). Estudios previos de nuestro grupo de investigacin nos han hecho considerar que el LPS puede proporcionar un interesante modelo para estudiar los efectos especficos de la inflamacin en los procesos degenerativos del sistema dopaminrgico, los cuales podran jugar un papel importante en la aparicin de la EP.

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De forma resumida, estos estudios demostraron que una nica inyeccin de LPS produce una fuerte respuesta inflamatoria en la SN lo que lleva al dao de las neuronas dopaminrgicas sin afectar a otros tipos neuronales. Esta neurodegeneracin se dispara en el cuerpo neuronal, lo que est de acuerdo con Patt y col. (1991) que sugieren que en la EP la lesin se inicia en la SN. El dao es permanente, al menos en el perodo de tiempo estudiado (1 ao) y se acompaa por el dao en las terminales dopaminrgicas en el estriado. El modelo descrito permitira determinar en qu medida est implicada la activacin glial en la progresiva degeneracin nigral caracterstica de la EP y tambin en qu medida los factores derivados de la gla, como las citoquinas o la deprivacin de factores neurotrficos, clsicamente asociados con una importante muerte neuronal in vivo, estn implicados en la degeneracin dopaminrgica. El LPS se ha utilizado tambin como un modelo animal de inflamacin crnica y sepsis (Yang y Lee, 2008). Es un potente inductor de inflamacin sistmica (Ulevitch y Tobias, 1995) y puede daar mltiples rganos a dosis muy bajas. Activa a los fagocitos mononucleares circulantes y no circulantes que producen y liberan citoquinas como el TNF- y la IL-1, las cuales median el dao y la mortalidad observados durante la exposicin al LPS. Tambin induce varias reacciones patolgicas locales y sistmicas, adems de anormalidades en la coagulacin de la sangre. Es especialmente utilizado en estudios del tronco respiratorio para ver la respuesta local de los pulmones al estmulo patognico. Cuando se inhala causa fiebre, enfriamientos y broncoconstriccin segn la dosis. Estos sntomas se acompaan de una respuesta proinflamatoria en el esputo y el fluido broncoalveolar, con elevacin de neutrfilos, macrfagos y ciertas

citoquinas/quimioquinas (Kharitonov y Sjbring, 2007). La administracin de una dosis letal de LPS a las ratas resulta en una hipotensin severa y en un fallo multiorgnico. El

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dao en el hgado y el pulmn normalmente aparece dentro de las 8 horas y las ratas suelen morir por fallo respiratorio en 12-24 horas.

6. EL ESTRS Y SU HISTORIA.

Sin duda alguna, el concepto de estrs sera difcil de entender sin los conceptos desarrollados por los fisilogos Claude Bernard y Walter Cannon. El primero introdujo el concepto de medio interno (Millieu Interieur) y el americano Walter Cannon introdujo el trmino homeostasis para definir el conjunto de mecanismos fisiolgicos que permiten mantener la constancia del medio interno, gracias a la puesta en marcha de sistemas que de manera cooperativa contrarrestan los factores de origen interno o externo que tienden a modificarlo. Basndose en los conceptos previamente desarrollados por Bernard y Cannon, Hans Selye acu en los aos 30 el trmino estrs para designar el conjunto de cambios observados en ratas cuando investigaban el efecto de distintos extractos de glndulas sobre la fisiologa de estos animales. Entre estos cambios destacan la prdida de peso corporal, la hipertrofia adrenal, la inhibicin tmica y la ulceracin gstrica. Al conjunto de todos estos procesos Selye lo denomin sndrome general de adaptacin (Selye, 1946). Selye defini el trmino estrs como la respuesta no especfica del organismo frente a cualquier demanda sobre l, destacando la activacin cortico-adrenal como el aspecto fisiolgico ms relevante del estrs. Posteriormente introdujo las palabras stressor para designar el estmulo que provocaba este sndrome y stress para definir la respuesta al estmulo. Selye centr su concepto de estrs en la caracterstica de las respuestas fisiolgicas emitidas por los organismos.

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John W. Manson argument en contra del concepto de respuesta no especfica de Selye, considerando que la aparente inespecificidad de la respuesta sera una consecuencia de la activacin emocional provocada por estmulos estresantes fsicos (Manson, 1974). Su argumento se basaba en el hecho de que la respuesta al estrs se reduca cuando se minimiza o elimina la componente psicolgica asociada a la exposicin al estmulo. Tras otros experimentos adems sugiri que la aparente no especificidad de la respuesta neuroendocrina al estrs era debida a la reaccin emocional causada por la exposicin a todos los estmulos estresantes. Pueden exponerse dos argumentos en contra de esta idea (Mart y Armario, 1998): (a) la respuesta neuroendocrina al estrs se presenta tambin en animales y en humanos bajo anestesia general (Dallman y Jones, 1973; Lilly, 1994; Udelsman y col., 1986), condiciones bajo las cuales no hay activacin emocional; (b) un incremento gradual de la intensidad del estmulo fsico lleva al animal a adaptarse a la situacin sin que ste represente una amenaza para l. Por lo tanto, el animal no interpreta la situacin como peligrosa y no responde como si se encontrara frente a una situacin estresante. Parece por tanto evidente que algunos estmulos especficos son capaces de activar los sistemas endocrinos asociados al estrs actuando en reas del sistema nervioso central no involucradas en el control de emociones. As como Manson plante el estudio de la respuesta al estrs desde una perspectiva psicosomtica, Weiss, aos ms tarde (1972), estudi los efectos psicolgicos y fisiolgicos de la capacidad de control sobre las situaciones estresantes (Weiss, 1972). Aplicando choque elctrico a las ratas observ que muchos de los dficits comportamentales y de los cambios neuroqumicos asociados a esta situacin estresante eran debidos a la falta de control sobre la situacin y no al castigo fsico per

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se. Por lo tanto, la ausencia de control sobre la situacin es el principal factor desencadenante de muchos efectos negativos de la exposicin al estrs. Richard Lazarus en los aos 60 aport una nueva visin sobre el problema del estrs. Plante la existencia de diferencias individuales, en tanto que una misma situacin poda afectar de manera diferente a personas distintas. Puesto que determinadas situaciones pueden ser estresantes para unos y no para otros, no es posible establecer una relacin causal simple entre estmulo estresante y respuesta al estrs. Por tanto, Lazarus propuso la existencia de factores motivacionales y cognitivos que podran diferir de un individuo a otro. Destac la importancia de la evaluacin cognitiva de la situacin que, segn su criterio, determinara su valor emocional y las estrategias de afrontamiento que se pueden poner en marcha para hacer frente a la situacin (Lazarus, 1993). El estudio de las tcnicas de afrontamiento de las situaciones estresantes y sus variaciones entre individuos es especialmente relevante en el comportamiento humano y debe tenerse en cuenta para el estudio de las consecuencias fisiolgicas o patolgicas del estrs. Algunos factores psicolgicos subyacen a la capacidad de control y la predictibilidad de la situacin puede influir en la activacin del eje hipotalmicopituitario-adrenal (HPA). La capacidad de control hace referencia al control que tendra el organismo sobre la aparicin del estmulo aversivo, es decir a la capacidad de poner fin o disminuir su intensidad, duracin o frecuencia (Weiss, 1972). Por lo tanto, es evidente que el estrs implica procesos cognitivos que pueden afectar a la magnitud y direccin de las respuestas fisiolgicas caractersticas, incluyendo la del eje HPA. A pesar de que en las ltimas dcadas se han publicado innumerables artculos cientficos sobre el estrs, la definicin de estrs sigue siendo compleja, controvertida y algo ambigua, de manera que no se ha podido encontrar una definicin universalmente 58

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aceptada. Pero como definicin se podra aceptar la de Milan Vigas (1980): El estrs es el estado creado en un organismo enfrentado a agentes real o simblicamente nocivos para su integridad, estado que desencadenara una serie de respuestas no especficas, desarrolladas en el curso de la filogenia y conservadas gracias a su valor adaptativo frente a estos agentes.

6.1. Caractersticas de los estmulos estresantes.

Podramos agrupar los estmulos estresantes en tres categoras principales: Estmulos sistmicos: estmulos de carcter interno o externo de naturaleza tanto fsica como qumica. Entre los de naturaleza fsica podemos mencionar las perturbaciones provenientes del medio ambiente (fro, calor, radiaciones) y tambin heridas, fracturas y quemaduras entre otras. Entre los de naturaleza qumica, las sustancias irritantes o dolorosas, as como los contaminantes del agua (metales pesados) que causan daos funcionales a los animales acuticos. Estmulos emocionales: son aquellos que no causan un dao real al organismo, pero son interpretados por el individuo como potencialmente peligrosos. En este tipo de situaciones es muy importante la valoracin que cada individuo pueda hacer de la situacin. Esta clase de estmulos estresantes est asociada a una componente emocional que generalmente presenta caractersticas negativas para el individuo (Lazarus, 1993). Podemos citar entre ellos el miedo, la ansiedad, la frustracin o la exposicin a un ambiente desconocido. Estmulos mixtos: la caracterstica fundamental de esta clase de estmulos estresantes es que poseen componentes tanto sistmicos como emocionales, dado que algunos estmulos fsicos pueden causar dolor, miedo o ansiedad, adquiriendo as una

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cualidad emocional. Esta clase de estmulos son muy frecuentes; entre ellos podramos mencionar el choque elctrico, la natacin forzada y la inmovilizacin en tabla. Los estmulos estresantes no slo difieren cualitativamente; otro parmetro a determinar es la intensidad del estmulo, lo que nos puede permitir predecir su impacto medio en una poblacin de individuos. Slo algunas variables endocrinas son capaces de reflejar la intensidad de la situacin estresante y por lo tanto pueden ser consideradas como marcadores de estrs: la hormona adrenocorticotropa (ACTH), la adrenalina, la prolactina y la glucosa. Un buen marcador de estrs debera permitir cuantificar objetivamente el grado de estrs experimentado por el individuo, y para ello el individuo debera responder a los estmulos estresantes de manera consistente, unidireccional y proporcionalmente a la intensidad del estmulo. En relacin al eje simptico-mdulo-adrenal (SMA), la adrenalina es mejor marcador de intensidad del estrs que la noradrenalina, lo que permite explicar que la hiperglucemia inducida por el estrs, que viene sobre todo regulada por la adrenalina, sea un buen marcador de estrs. De las hormonas del eje HPA, la ACTH es mejor marcador de estrs que la corticosterona. Los GCs pueden ser un buen ndice de la intensidad del estrs cuando las situaciones son de una intensidad suave y moderada, pero no cuando las situaciones son ms severas. Al menos en la rata, la capacidad de la corteza adrenal para sintetizar GCs se satura con niveles moderados de ACTH, de tal manera que una liberacin superior de ACTH no se reflejara en la liberacin de GCs. Otra hormona adenohipofisaria capaz de reflejar la intensidad del estrs es la prolactina, que parece responder proporcionalmente a la intensidad de los estmulos estresantes tanto en ratas (Kant, 1983; Armario y Joln, 1989) como en humanos. Sin embargo, la liberacin de prolactina es sensible a estmulos emocionales y no a estmulos estresantes de tipo fsico. 60

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La frecuencia y duracin del estmulo son parmetros que hacen referencia al curso temporal de exposicin a la situacin estresante. As, hablamos de estmulos agudos, presentados una sola vez, que pueden diferir en la duracin de la exposicin (segundos, minutos u horas), y estmulos crnicos, los cuales pueden ser intermitentes si se repiten diariamente durante un determinado nmero de das o crnicos continuos si el individuo est permanentemente expuesto al mismo (Mart y Armario, 1997).

6.2. Respuesta al estrs.

Ante las situaciones estresantes el ser humano moviliza sus recursos fisiolgicos con el fin de responder a estas situaciones, lo que se denomina como reaccin o respuesta de estrs (Carlson, 1996). En estas situaciones de grave amenaza intervienen una serie de variables que pueden condicionar de algn modo la respuesta del individuo ante las mismas. Entre las variables implicadas se destacan los agentes de estrs o estresares (segn el tipo, la gravedad o la repeticin de los acontecimientos), los factores individuales (como la vulnerabilidad, la estabilidad emocional y los estilos de afrontamiento) y las variables ambientales. De la interaccin de estos factores podemos encontrar diversas respuestas de estrs desde el punto de vista fisiolgico, en las que intervienen la activacin cerebral (procesamiento de la informacin), autonmica (sistema de respuesta rpida) y neuroendocrina (sistema de respuesta lenta o tarda). Todas estas respuestas retroalimentan constantemente al organismo para incrementar, mantener o disminuir la respuesta de estrs. Aunque son sistemas individuales, en la prctica sus funciones se solapan en algn momento.

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Activacin nerviosa central (procesamiento de la informacin): inicialmente un estmulo aversivo excita a un receptor conduciendo dicha informacin hacia el cerebro bajo la forma de impulsos nerviosos. La informacin sensorial se proyecta en los ncleos asociativos del tlamo quien cumple funciones como estacin de relevo sensitivo. Los impulsos nerviosos hacen una escala a nivel talmico, estableciendo sinapsis antes de proseguir su recorrido hacia la corteza cerebral (Ganong, 1992). Luego pasan a la corteza cerebral que se encarga de modular la fidelidad del procesamiento sensorial e identificar si se trata de un estmulo amenazante o no. La activacin es promovida por la accin de la formacin reticular quien pone en marcha la excitacin general (Humber, 1986). Entre otras cosas, la corteza cingulada cambia las prioridades de la atencin y de la concentracin. La corteza frontal genera el plan de prioridades para las capacidades de atencin y memoria de trabajo (Medina y col., 2002). Si no es valorada como estresante, la respuesta del organismo implicara la puesta en marcha de los mecanismos homeostticos normales, especficos y apropiados para la situacin particular. Si es considerada estresante, se activaran los mecanismos de emergencia que constituyen la respuesta de estrs (activacin de los ejes SMA, activacin autonmica, y HPA, activacin neuroendocrina). La respuesta de emergencia puede iniciarse porque el estmulo sea cualitativamente estresante para todos los individuos de una especie en particular o porque rebase un cierto valor umbral de intensidad.

Activacin autonmica: cuando la activacin nervioso-central parece haber alcanzado su punto mximo, tiene lugar la activacin autonmica, la cual acta por medio del sistema SMA, encargado de preparar al organismo para afrontar la situacin,

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de manera que se mantenga el medio interno en estado uniforme (homeostasis) y de facilitar respuestas de lucha o huda, de distinto significado emocional (Valds y de Flores, 1990; Carlson, 1996). Este sistema est compuesto por el sistema nervioso simptico (que cumple funciones activadoras o de alerta) y por la mdula suprarrenal. Una vez que la formacin reticular ha iniciado el proceso de activacin general (habindose realizado ya los procesos cognitivos que fueron atribuidos o evaluados como peligrosos, a travs de la corteza cerebral y el tlamo), se excita el hipotlamo (Humber, 1986). El hipotlamo se encarga de controlar las funciones del sistema nervioso autnomo y del sistema endocrino; organiza las conductas de supervivencia tales como pelear, alimentarse, huir y reproducirse (Carlson, 1996). Tras la llegada de la informacin al hipotlamo, esa respuesta primaria y veloz provocar la liberacin, a partir del hipotlamo y por va simptica, de las catecolaminas noradrenalina y adrenalina. La noradrenalina es segregada a nivel de la mdula suprarrenal y de estructuras cerebrales como el hipotlamo, el sistema lmbico, el hipocampo y la corteza cerebral. Se ha observado que las situaciones estresantes aumentan su liberacin en algunas zonas del cerebro tales como el hipotlamo, la corteza frontal y el cerebro frontal basal lateral (Valds y de Flores, 1990; Funk y Stewart, 1996), aunque, de acuerdo a Valds y de Flores (1990), en principio el hipotlamo es la nica estructura nervioso-central que utiliza noradrenalina, aunque es bien sabido que su produccin se da en todo el cerebro. Tanto la estimulacin de los nervios simpticos como las situaciones de estrs fsico, agudo o crnico, en estados de clera (Ax, 1953), de agresividad, de interaccin social difcil y en conductas de alto riesgo, aumentan su produccin (Valds y de Flores, 1990). La noradrenalina se ha usado como indicador de la capacidad adaptativa, de manera que

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sus concentraciones fluctan segn las apreciaciones que hace el organismo de la situacin y de los recursos para afrontarla. La adrenalina es producida en su mayor parte por la mdula adrenal. Se ha considerado el indicador bioqumico de la actividad emocional del sujeto. Se incrementa en el estrs y en los estados de ansiedad, impredecibilidad e incertidumbre (Ax, 1953). La disminucin rpida de los niveles de adrenalina se ha relacionado con el bienestar fsico y psicolgico (Valds y de Flores, 1990). Estas catecolaminas son las encargadas de poner el cuerpo en estado de alerta preparndolo para luchar o huir. Algunas de las consecuencias fisiolgicas observables incluyen taquicardia, incremento de la presin arterial, sudoracin y dilatacin de las pupilas (Ursin y Olff, 1993).

Activacin neuroendocrina: la respuesta neuroendocrina es relativamente lenta puesto que se pone en marcha al cabo de segundos o minutos, dura entre quince minutos y una hora y adems decrece con el tiempo cuando es repetida ante estmulos que promueven una activacin estresante (Valds y de Flores, 1990). Se le denomina neuroendocrina porque su activacin depende del SNC y su funcin, entre otras, es excitar la totalidad del sistema nervioso incrementando la funcin de algunos rganos y la disposicin a la percepcin y a la reaccin (Humber, 1986). La activacin neuroendocrina se inicia cuando las neuronas en el ncleo paraventricular del hipotlamo segregan un pptido llamado factor liberador de corticotropina (CRH) que es la hormona que inicia la cadena de neurotransmisores. El CRH y otras hormonas relacionadas entran en el sistema circulatorio privado que une el hipotlamo con la pituitaria anterior y en apenas segundos, activan la pituitaria que se

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encarga de liberar ACTH (Carlson, 1996; Leng y Russel, 1998). Una vez liberada la ACTH se introduce en el flujo saguneo y, a travs del sistema circulatorio, estimula a la corteza suprarrenal para que libere GCs: cortisol, hidrocortisona y corticosterona. Tambin se liberan mineralocorticoides, como la dexoxicorticosterona y la aldosterona, y hormonas sexuales como la progesterona. La liberacin de GCs en situaciones de estrs persigue elevar el nivel de glucosa en la sangre, ayuda a que las grasas se conviertan en energa, aumenta el flujo sanguneo, estimula las respuestas conductuales al tiempo que inhibe actividades vegetativas innecesarias en tales momentos como la digestin, crecimiento, reproduccin y sistema inmunitario (Stratakis y Chrousos, 1995; Carlson, 1996), de tal forma que lo que se intenta es preparar al organismo para hacer frente a la situacin de emergencia. Los efectos de los GCs ante la respuesta al estrs son importantes y necesarios; sin embargo, su activacin a largo plazo puede generar efectos dainos en la salud tales como aumento en la presin sangunea, dao en el tejido muscular, diabetes esteroide, infertilidad, inhibicin del crecimiento, de las respuestas inflamatorias e inmunolgicas (Carlson, 1996) e incluso daos en estructuras cerebrales como el hipocampo (Sapolsky, 1986; McEwen, 1999). Por ltimo, esta excitacin vegetativa general y la simultnea tensin nerviosa (nivel de comportamiento motor) vuelven ahora al centro (el cerebro) iniciando la retroalimentacin sobre el estado de los receptores internos del cuerpo. Esta retroalimentacin puede tener como consecuencia un incremento adicional de la excitacin general (estimulacin del sistema simptico) y, a la inversa, una relajacin (estimulacin del sistema parasimptico), al disminuir la excitacin o al influir correspondientemente sobre todo el proceso.

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6.3. El eje hipotalmico-pituitario-adrenal.

Dada la importancia fisiopatolgica y psicolgica del eje HPA en la respuesta al estrs, son innumerables los estudios y aproximaciones experimentales que se han desarrollado para esclarecer por qu los GCs parecen ser esenciales para la supervivencia en muchas situaciones de estrs. El eje HPA consta principalmente de tres estructuras claves: hipotlamo, hipfisis y glndulas adrenales.

6.3.1. El hipotlamo. Dentro del hipotlamo, el ncleo implicado en este sistema es el NPV. ste se encuentra en una posicin rostral del hipotlamo, a lo largo del borde del tercer ventrculo, y puede dividirse en distintos subterritorios segn su aspecto citoarquitectnico, citoqumico y de conexiones con otras zonas (Swanson y Sawchenko, 1983). Funcionalmente pueden diferenciarse dos grandes divisiones: la magnocelular y la parvicelular. La divisin magnocelular posee grandes neuronas neurosecretoras que sintetizan principalmente los neuropptidos arginina-vasopresina (AVP) y oxitocina (Antoni, 1993). Estas neuronas proyectan sus axones al lbulo posterior de la hipfisis desde donde liberan sus productos de secrecin en la circulacin perifrica. La divisin parvicelular puede subdividirse en cinco subregiones bien delimitadas. Las neuronas parvicelulares (zona hipofisiotrfica) sintetizan CRH y sus axones alcanzan la lmina externa de la eminencia media, donde liberan CRH que entra en el sistema portal-hipofisario y se distribuye por la hipfisis anterior, actuando sobre las clulas corticotropas.

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Se han descrito dos clases de receptores para el CRH que difieren entre si por su distribucin anatmica y perfil farmacolgico: el receptor tipo I (CRH-R1) de 415 aa y el tipo 2 (CRH-R2), que presenta dos isoformas de 431 aa. El CRH adems de interactuar con sus receptores, puede unirse con alta afinidad a una protena de unin al CRH, la cual inhibe de esta manera la actividad biolgica del CRH (Lowry y col., 1996). Este neuropptido no tiene como nico papel la estimulacin y liberacin de ACTH, sino que tambin juega un papel importante en la integracin de una gran parte de las respuestas fisiolgicas y conductuales al estrs.

6.3.2. La hipfisis. La hipfisis, tambin llamada glndula pituitaria, es una glndula pequea que se ubica en la silla turca en la base del cerebro y se conecta con el hipotlamo mediante el tallo pituitario. Fisiolgicamente puede dividirse en la hipfisis anterior, tambin conocida como adenohipfisis, y la hipfisis posterior, llamada tambin neurohipfisis. Entre ellas existe una zona pequea avascular, denominada pars intermedia, que est prcticamente ausente en el ser humano mientras que es de tamao mayor y mucho ms funcional en algunos animales inferiores. Las clulas que producen y sintetizan la ACTH en la adenohipfisis y en la pars intermedia son denominadas corticocotropas y representan del 7 al 10% del total de las clulas (Childs, 1992). Se han descrito tres posibles subtipos de clulas corticotropas en base a la respuesta diferencial de sus principales secretagogos (Schwartz y col., 1994): clulas que responden nicamente al CRH, clulas que responden nicamente a la AVP y clulas que responden al CRH/AVP.

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La ACTH pertenece a una familia de pptidos derivados de una protena precursora comn, la proopiomelanocortina (POMC) (Chretien y Seidah, 1981). El gen que codifica para esta protena se expresa en la hipfisis anterior y en la pars intermedia y en menores cantidades tambin en cerebro y tejidos perifricos. En la adenohipfisis la POMC es fragmentada en molculas de ACTH de 1-39 residuos de aminocidos, lipotropina y pequeas cantidades de -endorfina (Jones y Gillham, 1988). La ACTH viaja en la circulacin a la corteza adrenal donde estimula la sntesis y secrecin de GCs, aldosterona (aunque no es el secretagogo principal) y andrgenos adrenales, actuando mediante su interaccin con un receptor especfico de membrana. El receptor para la ACTH pertenece al grupo de receptores conocidos como receptores de melanocortinas. El de la ACTH en concreto pertenece al subtipo 2, el cual es activado selectivamente por la ACTH y es expresado principalmente en las clulas adrenocorticales (Penhoat y col., 2000). En respuesta al estrs, la liberacin de ACTH se multiplica entre 5-100 veces los niveles basales, alcanzando un mximo entre los 1015 min, dependiendo de la duracin e intensidad del estmulo estresante. Una vez liberada a la circulacin general la ACTH parece tener una vida media de entre 6-7 min (Lopez y Negro-Vilar, 1988). La ACTH tiene un efecto trfico y sensibilizante sobre la corteza adrenal, lo que permite aumentar la respuesta a la subsiguiente estimulacin (Dallman y Jones, 1973; de Souza y Van Loon, 1982; Keller-Wood y Dallman, 1984). Cuando los animales son expuestos de manera regular a dosis fijas de ACTH, se observa un incremento en la respuesta de los GCs a lo largo del tiempo (Johnson y col., 1992), seguramente como resultado de la hipertrofia adrenal. Lo mismo ocurre durante el estrs crnico. Contrariamente, si la secrecin de ACTH disminuye o es eliminada, la respuesta de los GCs a la ACTH se reduce en paralelo con la aparicin de una atrofia adrenal. 68

Introduccin

6.3.3. Las glndulas adrenales. Las glndulas adrenales estn encima de los riones y estn compuestas por dos tipos de tejido, funcional y embriolgicamente distintos: corteza y mdula. La mdula est situada en la parte ms interna de la glndula y est formada por clulas cromafines. Tiene un origen embrionario similar al del sistema nervioso simptico por lo que sus productos de secrecin son las catecolaminas: adrenalina y, en menor proporcin, noradrenalina. La corteza adrenal est a su vez dividida en tres zonas histolgicamente distintas: zona externa, llamada glomerular, situada debajo de la capa de tejido conjuntivo, que secreta principalmente el mineralocorticoide aldosterona, esencial para el equilibrio de sodio y osmtico; zona fascicular, la capa intermedia y la ms ancha de las tres, que secreta GCs (en el hombre y otras especies el GC principal es el cortisol y en los roedores, la corticosterona); y la zona reticular, la ms interna y delgada, secreta hormonas sexuales (andrgenos y estrgenos), pero normalmente en cantidades pequeas con poco efecto sobre la funcin reproductora. Todas las hormonas esteroideas derivan de un precursor comn, el colesterol (ver imagen de la transformacin del colesterol en hormonas esteroideas en http://themedicalbiochemistrypage.org/spanishimages/adrenalsteroidsynthesis-sp.jpg) que proviene mayoritariamente de la circulacin general. El colesterol es convertido a pregnenolona, precursor de todos los esteroides y por lo tanto de la corticosterona y la aldosterona. El paso limitante en la ruta biosinttica de los GCs se encuentra en el paso del colesterol a pregnenolona, que tiene lugar en la mitocondria. Los GCs se liberan desde las glndulas adrenales a la circulacin general, alcanzndose un mximo entre los 15 y 30 min en situaciones de estrs. Los GCs presentan una naturaleza lipoflica, lo cual hace que tengan poca difusibilidad en un 69

Introduccin

medio acuoso como la sangre. Se ha descrito que en condiciones basales una alta proporcin del cortisol circulante est unido a una protena plasmtica que facilita su transporte (Hammond, 1990). Se trata de una glicoprotena cida llamada transcortina que se sintetiza en el hgado. La fraccin unida de corticosteroides se considera biolgicamente inactiva y la pequea fraccin libre representa la fraccin biolgicamente activa de la hormona y por lo tanto la que ejercer sus acciones fisiolgicas (Siiteri y col., 1982). La corticosterona o cortisol unido podra ser una reserva circulante de la hormona biolgicamente activa. Al igual que la ACTH, los GCs no se secretan de modo continuo, sino que su secrecin es intermitente durante periodos cortos de tiempo (minutos) y la separacin entre los picos puede durar incluso horas. El nmero y la duracin de los picos secretores varan a lo largo del da, teniendo en el hombre un mximo entre las 4 y la 8 h de la maana y un mnimo entre las 8 y las 12 h de la noche. Estos cambios en la frecuencia y amplitud de la secrecin son los que dan lugar al ritmo circadiano, que vara en funcin de los ritmos de actividad del individuo. En la rata, la secrecin de corticosterona presenta niveles bajos durante el da (basales), comenzando a incrementar por la tarde y presentando su pico de secrecin justo antes del anochecer que es cuando inicia su mayor actividad (Scheving y Pauly, 1966; Krieger y Hauser, 1978; De Boer y Van der Gusten, 1987). Los procesos regulados por los GCs son muy variados, puesto que actan prcticamente en todos los tejidos. Segn su lugar de actuacin, podramos clasificar sus funciones en metablicas, inmunitarias, sobre el sistema cardiovascular y renal, esqueleto, tracto gastrointestinal, diferenciacin y desarrollo, SNC y finalmente su efecto sobre otras hormonas. Perifricamente los GCs afectan al metabolismo celular incrementando durante el estrs la energa disponible para el organismo y por lo tanto, 70

Introduccin

inhibiendo los procesos anablicos. Por eso podemos decir que la funcin principal sera preparar al organismo para hacer frente a situaciones adversas como el estrs. Bajo variadas condiciones estresantes, incluyendo ejercicio, trauma, ansiedad y depresin, los niveles de cortisol se elevan, llevando a una cadena de eventos que en ltima instancia proveen rpidamente de energa al organismo y mantienen al individuo alerta a travs de la estimulacin del sistema adrenrgico (la tpica reaccin de huida o respuesta de lucha o huida). Sin embargo, cuando el cortisol se hipersecreta de forma crnica, pueden producirse secuelas fisiolgicas deletreas, tales como el incremento de la presin arterial, diabetes, ateroesclerosis, supresin inmunolgica, reabsorcin sea (osteoporosis) y atrofia muscular.

6.4. Receptores corticosteroides.

Las acciones genmicas de los corticoides sobre el SNC son mediadas por dos clases de receptores: receptor glucocorticoide tipo II (RG) y receptor mineralocorticoide tipo I (RM) (De Kloet y col., 1987, 1993), que difieren entre s por su especificidad y afinidad por los ligandos, por su localizacin y por su funcin. Los RG no activados tienen una localizacin predominantemente citoplasmtica. El receptor libre forma un complejo con un sistema de protenas chaperonas (las protenas de choque trmico o hsp90, hsp70, hsp40) o con las inmunofilinas FKBP52 (Rajapandi y col., 2000;

Galigniana y col., 2001; Pratt y col., 2001). Estas protenas confieren a los receptores una alta afinidad por la hormona y se disocian del receptor tras la unin de la misma. No obstante estas protenas parecen estar tambin implicadas en el movimiento del RG desde el citoplasma hacia el ncleo, a lo largo de los microtbulos (Galigniana y col., 2001; Pratt y col., 2001).

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Introduccin

Una vez la hormona se ha unido al receptor se produce un cambio conformacional y el complejo ligando-receptor se torna activo lo que le permitira unirse a secuencias especficas de ADN en zonas reguladoras o promotoras de los genes denominados CRE (elementos de respuesta a los GCs). De esta manera, los GCs controlan la expresin gnica activando o inhibiendo determinados genes. Los RM se unen principalmente a un GC como la corticosterona y a mineralocorticoides como la aldosterona presentando una alta afinidad por ambos, mientras que los RG presentan una afinidad relativamente baja por la corticosterona y mayor afinidad por el cortisol (aunque menor que la afinidad de los RM) y por diversos GCs sintticos como la dexametasona. Los RM estn presentes en rganos diana para los mineralocorticoides como el rin, el intestino y las glndulas salivales, regulando el equilibrio osmtico y el consumo de sal. A nivel central, los RM se expresan particularmente en el hipocampo, el septum, la amgdala, el bulbo olfatorio y en regiones de la corteza cerebral (De Kloet y col., 1993). Dentro de la formacin hipocampal, abundan en las reas CA1, CA3 y en el giro dentado. Tambin se ha encontrado en menor cantidad en el ncleo del tracto solitario. Los RG en cambio tienen una distribucin ms generalizada ya que pueden encontrarse en todos los tipos de tejido. Dentro del SNC se encuentra en gran abundancia en el sistema lmbico (hipocampo y septum), en el NPV y en reas monoaminrgicas del tronco enceflico. Se han detectado niveles moderados en muchos ncleos talmicos, el estriado, la amgdala central y la corteza (McEwen y col., 1986; Jones y Gillham, 1988; Sapolsky y col., 1990). La diferente afinidad de ambos receptores por la corticosterona determina que muestren un grado de ocupacin distinto entre ellos, en funcin de los niveles circulantes de GCs. As, cuando los GCs estn elevados, como ocurre durante la noche 72

Introduccin

(en ratas) o tras situaciones de estrs, los receptores que se van ocupando son los RG, razn por la cual tienen tanta importancia en el bloqueo de la respuesta del eje HPA. En cambio, los RM cumplen un papel modulador de los niveles basales del eje HPA en la fase diurna (De Kloet y col., 1987) por ser estos receptores los primeros en ser ocupados. A nivel perifrico casi todos los tejidos poseen RG y en menor cantidad RM (Munck y col., 1984). La distribucin diferencial de estos receptores en los tejidos permite a los GCs actuar en diferentes procesos metablicos indispensables para el mantenimiento del organismo.

6.5. Mecanismo de retroinhibicin de los glucocorticoides.

La activacin del eje HPA en situaciones de estrs es contrarrestada por el efecto inhibidor de los GCs, que se ejerce mediante su unin a receptores especficos situados en distintos niveles del SNC (ver imagen del esquema de la regulacin del eje HPA en http://estrescancer.files.wordpress.com/2009/12/hpa.jpg). Estos mecanismos de control participan en la finalizacin de la respuesta al estrs, permitiendo de esta manera restablecer los niveles normales de las hormonas del eje HPA. Sin embargo, los mecanismos de retroinhibicin controlados por los GCs son complejos, quedando actualmente muchos aspectos por comprender. Dallman y Yates (1969) propusieron la existencia de dos mecanismos inhibidores ejercidos por los corticoides, que se caracterizan por tener fases inhibitorias temporalmente distintas. (Dallman y Jones, 1973): Rpido: dependiente de la tasa de incremento de corticosteroides en sangre y de accin rpida (antes de los 30 min.). Se ponen en marcha cuando los niveles de GCs se estn incrementando pero no una vez que estn estabilizados. La rapidez con que se

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produce sugiere que en este mecanismo no est implicada la sntesis de protenas. Su efecto se ejerce sobre la liberacin de la hormona, presumiblemente a travs de receptores de membrana (Keller-Wood y Dallman, 1984). Lento: dependiente de los niveles totales de GCs liberados durante las horas precedentes, o de la dosis total de GCs administrada. Es un mecanismo de actuacin lento y se ejerce a partir de la primera o segunda hora de aplicacin del estmulo estresante. En este caso, los GCs suprimen la sntesis de CRH y ACTH y su mecanismo de accin implica una regulacin genmica. Se ha descrito que los receptores implicados en ambos mecanismos de retroinhibicin podran ser distintos. Como se ha mencionado anteriormente, los efectos genmicos de los GCs se ejercen mediante la unin a dos tipos de receptores que actan como factores de transcripcin: RG y RM. Se desconoce la participacin precisa de estos receptores en los dos mecanismos de retroinhibicin, aunque como ya hemos mencionado, se postula que la retroinhibicin rpida no estara mediada por los RM y RG sino a travs de un mecanismo independiente de la sntesis de protenas (Brann y col., 1995; Falkenstein y col., 2000; Makara y Haller, 2001). En los mecanismos de retroinhibicin ms lentos participaran los RG y RM, actuando a diferentes niveles: -A nivel de hipfisis, inhibiendo la sntesis y liberacin de ACTH. -A nivel hipotalmico, inhibiendo la sntesis y liberacin de CRH. -A nivel de estructuras extrahipotalmicas, principalmente el hipocampo y la amgdala.

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Introduccin

6.6. Estrs crnico y adaptacin.

La exposicin a un estmulo estresante puede durar desde pocos segundos hasta das o semanas, y los efectos del estrs sobre el sistema endocrino son dependientes del tiempo de exposicin. Si la estimulacin estresante es repetida y se prolonga por cierto tiempo es considerada como estrs crnico, y se ha relacionado con importantes patologas psicolgicas y fisiolgicas en humanos. Se ha sugerido que el estrs es un factor importante en el desarrollo de enfermedades gastrointestinales, hipertensin arterial, supresin del sistema inmunitario, disfunciones reproductoras y depresin. Segn la modalidad de presentacin del estrs crnico podemos distinguir entre dos tipos: crnico continuo y crnico intermitente. En el estrs crnico continuo el animal puede ser sometido de manera sucesiva a estrs durante das o semanas, mientras que en el crnico intermitente los animales son expuestos durante un periodo de tiempo de semanas a una situacin estresante con un tiempo de exposicin diario que va desde minutos hasta horas. Como ejemplo de un modelo de estrs continuo podramos mencionar el estrs social en roedores. ste es particularmente notable cuando se potencia el comportamiento agresivo de los machos por la presencia de hembras (Blanchard y col., 1993). El modelo de estrs ms usado experimentalmente es el crnico intermitente, en el que los animales son expuestos diariamente a una situacin estresante. En la literatura, los modelos ms utilizados son la exposicin al fro, la restriccin del movimiento (en un tubo), la inmovilizacin en tabla, la natacin forzada o el choque elctrico en las patas entre otros (Katz y col., 1981; Armario y col., 1984; Armario y col., 1988a; Riccio y col., 1991). Se podra hablar tambin del estrs crnico variable como otro modelo de estrs crnico que comparte caractersticas con las dos clases de situaciones crnicas

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mencionadas anteriormente. En este caso, los animales son expuestos diariamente a diferentes clases de estmulos estresantes de forma aleatoria, dificultando la posibilidad de predecir la llegada de un estmulo en particular y de adaptacin (Katz y col., 1981; Armario y col 1985). La exposicin a situaciones de estrs crnico, tanto contino como intermitente, produce numerosos cambios fisiolgicos y neuroendocrinos. Los cambios observados dependen de la clase de estmulo estresante aplicado, de la intensidad y de la duracin. Con la exposicin repetida a un estrs crnico intermitente de cierta intensidad se observa en la rata una disminucin de la ingesta slida que provoca una disminucin del peso corporal (Mart y col., 1993a). Se observa tambin un incremento en el tamao de las glndulas adrenales con relacin a la prdida de peso corporal. Este aumento podra atribuirse al efecto trfico de liberacin diaria de ACTH, aunque no se descartan otros factores (Armario y col., 1988b). Aunque los niveles basales de ACTH suelen ser normales, los de corticosterona estn incrementados, pero slo en la fase diurna del ritmo circadiano, que es cuando los niveles plasmticos de GCs estn en su nivel ms bajo en el caso de la rata (Mart y col., 1993b). Aunque los niveles de ACTH son normales al da siguiente de la ltima exposicin al estrs crnico intermitente, esto no es indicativo de la ausencia de cambios bioqumicos en el eje HPA a nivel de la hipfisis o a nivel suprahipofisario. A nivel hipofisario se ha podido observar un incremento en la expresin del gen para la POMC y en el contenido de ACTH (Hollt y col., 1986) junto con una mayor respuesta a la administracin exgena de CRH (Uehara y col., 1989; Mart y col., 1993b). La mayor respuesta al CRH coincide con un descenso del nmero de receptores en la hipfisis. Finalmente, a nivel hipotalmico, el estrs crnico produce un incremento de los niveles de ARNm de CRH en el NPV y en el nmero de clulas CRHrgicas capaces de 76

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coexpresar AVP (de Goeji y col., 1991; Mamalaki y col., 1992; Makino y col 1995). No se ha observado que el estrs crnico cambie el nmero de receptores de GCs en la hipfisis o en el hipotlamo, aunque s se observa una disminucin en la formacin hipocampal (Sapolsky y col., 1984; Mart y col., 1994; Gmez y col. 1996). Tomados en conjunto, todos estos datos parecen demostrar que la capacidad potencial de respuesta del eje HPA est notablemente incrementada despus de la exposicin a estmulos estresantes crnicos aunque no se refleja en la actividad basal del eje (tnica). Esta mayor capacidad potencial de respuesta sera necesaria para asegurar en el futuro una respuesta adecuada del eje HPA frente a nuevas demandas, representada por nuevos estmulos estresantes de caractersticas y duracin imprevisibles (Mart y Armario, 1998).

6.7. Cambios en el hipocampo relacionados con el estrs.

El estrs empieza en el cerebro y afecta al cerebro, adems de afectar al resto del cuerpo. Regiones del cerebro tales como el hipocampo, la CPF y la amgdala responden al estrs agudo y al crnico, y muestran cambios en la morfologa y en la qumica. Asimismo, existen numerosas evidencias de que dicha alteracin est mediada en buena medida por los corticoides (Newcomer y col., 1994). En las dcadas recientes, numerosos estudios en neurociencia han mostrado que las experiencias estresantes pueden tener un impacto negativo en ciertas funciones cerebrales como el deterioro en las capacidades de aprendizaje y memoria, el incremento del deterioro cognitivo relacionado con la edad y el aumento de la susceptibilidad de las neuronas del hipocampo a sufrir atrofia o necrosis en respuesta a demandas metablicas. No obstante, conviene recordar que la respuesta aguda al estrs

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(por ejemplo, incremento de la atencin) se considera un mecanismo adaptativo que capacita al organismo para responder de manera efectiva a una amenaza, potencial o real, para su supervivencia. Los principales efectos del estrs sobre el hipocampo son los siguientes: Estrs y memoria hipocampal: el hipocampo es una de las dianas de las hormonas del estrs, con una de las mayores concentraciones de receptores para corticosteroides (RMs y RGs) del cerebro de los mamferos. Como ya se ha visto anteriormente, una funcin neuroendocrina del hipocampo es participar en la terminacin de la respuesta de estrs por medio de una retroalimentacin negativa que inhibe el eje HPA. Los RGs son los principales mediadores de los efectos adversos del estrs en el hipocampo. Estos efectos afectan negativamente al metabolismo neuronal, la supervivencia celular, las funciones fisiolgicas y la morfologa neuronal del hipocampo en las ratas. Numerosos estudios apoyan la idea de que el estrs y las hormonas del estrs deterioran las formas de memoria dependientes del hipocampo, tanto en humanos como en animales. As por ejemplo, los pacientes con trastornos por estrs postraumtico (TEP) presentan atrofia del hipocampo y dficits marcados en las tareas de recuerdo dependientes del hipocampo. Estrs y plasticidad en el hipocampo: en las tres ltimas dcadas, el modelo fisiolgico primario de la memoria ha sido la LTP. Si esta hiptesis de que los cambios en la eficacia sinptica subyacen al almacenaje de la informacin es vlida, entonces el hallazgo de que el estrs deteriora la memoria dependiente del hipocampo predecira que el estrs interferira asimismo con la induccin de la LTP hipocmpica (o procesos relacionados), lo cual ha sido extensamente comprobado en estudios in vivo e in vitro.

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Introduccin

Estrs y morfologa dendrtica: McEwen y col. mostraron que el estrs o la administracin de corticosterona sostenida pueden producir atrofia de las espinas dendrticas en diversas reas del hipocampo (CA3, CA1 y giro dentado). Dicha atrofia puede bloquearse con drogas que: reduzcan la transmisin de aminocidos excitatorios como aspartato y glutamato (por ejemplo, fenitona) reduzcan los niveles extracelulares de serotonina (por ejemplo, tianeptino) reduzcan la excitabilidad general a travs de una estimulacin GABArgica (por ejemplo, benzodiazepinas) Esto pone de manifiesto los mltiples neurotransmisores y sistemas hormonales implicados en la induccin de atrofia en las dendritas del hipocampo. La participacin de los receptores NMDA es crucial y bien conocida en la plasticidad sinptica y la memoria. No obstante, la activacin del receptor NMDA tambin parece ser un elemento central en la manifestacin de los efectos adversos a corto y medio plazo en la morfologa del hipocampo. Por ejemplo, en la muerte celular producida por la corticosterona se producen elevados niveles de Ca2+ que pueden ser reducidos con antagonistas del receptor NMDA. Resulta irnico que las clulas piramidales del hipocampo desplieguen receptores NMDA para almacenar la informacin, aunque el mismo mecanismo, estimulado de forma crnica, puede provocarles su eliminacin. Estrs y neurognesis: el giro dentado es una regin del hipocampo que produce nuevas neuronas (clulas granulosas) an en las personas de edad avanzada (Kempermann y Gage, 1999; Seri y col., 2001). Su significacin funcional an no se comprende del todo, pero parece relacionada con las demandas del aprendizaje y la

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memoria. As por ejemplo, en situaciones de aprendizaje dependientes del hipocampo, su nmero total y la longevidad de las de nueva formacin aumenta. El papel de esta plasticidad tambin puede ser proteger contra el dao permanente. La produccin de clulas granulosas se inhibe por el estrs, agudo o crnico, o con la administracin experimental de corticosterona. Asimismo, la retirada de los corticosteroides endgenos produce la estimulacin de la produccin de nuevas clulas granulosas en ratas jvenes y adultas. El mecanismo subyacente es desconocido, si bien dado que las clulas granulosas carecen de receptores para GCs (ni RMs ni RGs), la influencia debe ser indirecta, quizs por medio de un incremento de la transmisin glutamatrgica. Al igual que el estrs afecta al aprendizaje dependiente del hipocampo y la LTP, por medio de la liberacin de glutamato y la activacin del receptor NMDA, idntico mecanismo inhibe la proliferacin de clulas granulosas. Una vez ms, el receptor NMDA sirve como un sitio de accin comn para los efectos constructivos (aprendizaje y memoria) y destructivos (inhibicin de la proliferacin celular) de los GCs en el hipocampo.

6.8. Neurobiologa del estrs y neuroinflamacin.

La activacin del eje HPA induce una respuesta de fase aguda muy similar en la naturaleza de sus componentes a la respuesta inflamatoria generada en un organismo en respuesta a infeccin o traumatismo agudo: activacin glial, invasin de clulas inmunes, sntesis y liberacin de citoquinas, radicales libres, prostaglandinas y factores nucleares (Lucas y col., 2006; Elenkov y Chrousos, 2002). La estrecha relacin existente entre ambas respuestas se pone de manifiesto en ciertos estudios que demuestran que la exposicin a distintos agentes estresantes

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Introduccin

contribuye decisivamente al inicio, evolucin y resolucin de enfermedades relacionadas con procesos inflamatorios crnicos que afectan a diferentes sistemas orgnicos, como cardiovascular, endocrino, digestivo, inmune, etc. Curiosamente, la relacin inversa tambin tiene lugar, ya que el proceso inflamatorio generado por una infeccin o traumatismo activa el eje HPA y acta como estmulo estresante (Black, 2002). Se ha comprobado que los GCs pueden realizar efectos contrapuestos. Al principio, suprimen la inflamacin perifrica al atenuar la produccin y liberacin de citoquinas, inhiben la actividad de molculas de adhesin vascular y bloquean la actividad de los leucocitos. Los GCs tambin exhiben capacidad antiinflamatoria en el SNC y se utilizan clnicamente por su habilidad para reducir el edema relacionado con ciertos tumores cerebrales, la encefalitis vrica y la meningitis bacteriana. Sin embargo, el tratamiento con GCs no suprime la neuroinflamacin subsiguiente a la exposicin de ciertos estmulos agudos como la isquemia y dao cerebral, e incluso pueden empeorar la muerte celular que tiene lugar en estos escenarios patolgicos. Adems, los GCs pueden exhibir actividad proinflamatoria en el SNC, al regular positivamente la sntesis de molculas proinflamatorias como prostaglandinas y leucotrienos y exacerbar la neuroinflamacin generada por la infeccin con el virus de la inmunodeficiencia humana (Sorrells y Sapolsky, 2006). En relacin con el estrs, Madrigal y col. (2001) demostraron cmo tras la exposicin a estrs por inmovilizacin (una situacin en la que los niveles de GCs endgenos estn elevados), se produce una liberacin y acumulacin de mediadores tpicamente proinflamatorios, como el NO, prostanoides, citoquinas y la activacin del NFkB, lo que genera un estado de neuroinflamacin en el cerebro estresado de la rata que podra contribuir al dao cerebral observado en las neuropatologas estrechamente 81

Introduccin

relacionadas con la exposicin a estrs. Tambin nuestro grupo ha demostrado recientemente por tcnicas inmunohistoqumicas que los GCs secretados tras la exposicin a estrs son capaces de potenciar el proceso neuroinflamatorio generado por la administracin de LPS, al aumentar los grados de micro y astrogliosis (de Pablos y col., 2006). Se han expuesto diversas hiptesis para explicar esta paradoja de los GCs. Los GCs podran ejercer efectos opuestos en funcin del tipo de receptor mayoritariamente ocupado (RM frente a RG), de los niveles fisiolgicos o suprafisiolgicos de GCs alcanzados tras la exposicin al estmulo, del tipo celular del SNC susceptible de poseer receptores para GCs, o del rea cerebral implicada. Desafortunadamente, los mecanismos que subyacen bajo estas discrepancias encontradas en los distintos modelos experimentales de estrs utilizados permanecen desconocidos, pero su elucidacin parece ser de crucial importancia para valorar los beneficios teraputicos de los GCs y su correcta utilizacin.

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OBJETIVOS

Objetivos

La etiologa de enfermedades neurodegenerativas tales como el Parkinson y el Alzheimer an no est bien conocida. Sin embargo, los estudios histolgicos han demostrado desde hace tiempo que la prdida neuronal se encuentra acompaada de procesos inflamatorios, lo que se pone de manifiesto a travs de la activacin de la microgla y la induccin de citoquinas proinflamatorias. Este hecho llev a nuestro grupo a estudiar si estos procesos inflamatorios constituan un efecto secundario del proceso de neurodegeneracin o si por el contrario podran tener algn efecto directo, aunque fuese en la progresin de la neurodegeneracin, ya que estas patologas son crnicas. Con este fin se llev a cabo la induccin de un proceso inflamatorio en distintos centros del SNC mediante la inyeccin directa de LPS, un compuesto proinflamatorio muy usado para inducir inflamacin en los sistemas perifricos. Con este mtodo pudimos demostrar que, a pesar de que se considera que el SNC es un rgano inmunolgicamente privilegiado, la inyeccin directa de LPS poda disparar una respuesta inflamatoria. Un dato de gran inters fue el que no todas las estructuras cerebrales se comportaban de la misma forma, sino que algunas, y de manera especial la SN, presentaba una respuesta inflamatoria mxima, con una fuerte activacin de la microgla, induccin de citoquinas y degeneracin de neuronas. Sin embargo, el resto de estructuras estudiadas presentaron una respuesta circunscrita al tracto de inyeccin y sin degeneracin neuronal aparente. Por este motivo, nuestro grupo se centr, en primer lugar, en el estudio del efecto de esta inflamacin en la SN. Dicho estudio nos permiti desarrollar un modelo de la EP, ya que la neurodegeneracin inducida por la inflamacin era especfica de las neuronas dopaminrgicas, lo que conlleva tambin a la prdida de sus terminales en el estriado. Estos estudios demostraron que al menos en esta estructura la inflamacin es capaz de inducir la degeneracin de las neuronas dopaminrgicas de la SN, por lo que podra 83

Objetivos

actuar como una causa directa (inducida entre otros factores por la acumulacin de protenas modificadas, por ejemplo la -sinucleina) o como causa secundaria de progresin (donde la inflamacin sera una consecuencia del dao o de la muerte neuronal provocada). Estos descubrimientos fueron corroborados a travs de estudios con compuestos antiinflamatorios; el tratamiento con este tipo de frmacos previno la muerte de las neuronas dopaminrgicas de la SN inducida por la inyeccin de LPS. De estos trabajos surgieron tambin dos cuestiones importantes: a) Por qu no son todos los tipos de neuronas de la SN igual de sensibles a la inflamacin, siendo las neuronas dopaminrgicas las nicas que degeneran? b) Teniendo en cuenta que la EA es la enfermedad neurodegenerativa inicialmente relacionada con los procesos inflamatorios y que la CPF y el hipocampo estn principalmente implicados en esta enfermedad, a qu se debe que las otras estructuras estudiadas, entre las que se encuentran la CPF y el hipocampo, sean menos sensibles a la inflamacin inducida por la inyeccin de LPS que la SN? Nuestro grupo de investigacin ha sido capaz de contestar a la primera pregunta, demostrando que la especial sensibilidad de las neuronas dopaminrgicas viene determinada por su contenido en DA. Para contestar a la segunda pregunta se parti de la idea de que la sensibilidad a la inflamacin podra depender de otros factores. Por ello nos pusimos a buscar factores fisiolgicos que pudieran aumentar la sensibilidad a la inflamacin de la CPF y el hipocampo, estructuras antes mencionadas. En la bibliografa exista la idea, no demostrada, de que condiciones como el estrs podran favorecer la aparicin de la EA. Por ello, nos propusimos estudiar la 84

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influencia de un estrs crnico sobre la inflamacin inducida por la inyeccin de LPS en la CPF e hipocampo, estructuras ligada a la EA. En este trabajo nos hemos centrado como principal objetivo en el estudio que el efecto del estrs produce en el hipocampo y su accin sobre la induccin de la inflamacin producida por la inyeccin intrahipocampal de LPS. Para ello utilizaremos animales controles (no estresados) y animales estresados de manera crnica. La induccin crnica e impredecible del estrs es necesaria para que no haya adaptacin a los factores estresantes y que ste permanezca durante un tiempo suficiente para que se puedan estudiar los procesos neurodegenerativos e inflamatorios. Este estudio se llevar a cabo usando al menos cuatro grupos de animales distintos: a) animales inyectados en el hipocampo con solucin salina; b) animales inyectados en el hipocampo con LPS. Estos animales nos permitirn repetir y confirmar los experimentos anteriores en los que demostrbamos la pequea respuesta a este estmulo; c) animales con estrs crnico inyectados con solucin salina en el hipocampo y d) animales inyectados en el hipocampo con LPS y sometidos a estrs crnico. En primer lugar en estos animales se estudiar que se ha producido un estado de estrs mediante estudios comparativos del peso corporal y de los niveles de corticosterona y progesterona en sangre, parmetros que son afectados por este factor, con el fin de asegurar que se ha producido el estado de estrs. Posteriormente, se estudiarn los parmetros de inflamacin en el hipocampo de todos estos grupos de animales, esperando lgicamente que los animales estresados e inyectados con LPS muestren unas seales inequvocas de aumento de la respuesta a la inflamacin mediante el estudio de la activacin de microgla, del efecto sobre los astrocitos y la sntesis de citoquinas y compuestos inflamatorios como TNF e IL-1.

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Objetivos

Una vez demostrado este punto pasaremos a ver el efecto sobre los posibles procesos de neurodegeneracin estudiando muerte y degeneracin neuronal, mediante inmunohistoqumica de NeuN e histofluorescencia con Fluoro Jade B, respectivamente. Por ltimo intentaremos conocer los mecanismos de accin mediante el estudio de MAPKs (que activan rutas de degeneracin por apoptosis o proteccin, dependiendo de su activacin o inhibicin), liberacin de factores de crecimiento como BDNF y de compuestos productores de radicales como iNOS. Tambin intentaremos estudiar la accin de homonas glucocorticoides, mediante el estudio del efecto del antagonista RU486 (mifepristona), usado en la farmacopea. Todos estos datos nos permitirn proponer al estrs como un factor de riesgo para la progresin de una neurodegeneracin que podra ser semejante a la descrita en la EA.

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MATERIALES Y MTODOS

Materiales y Mtodos

1. ANIMALES.

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Guidelines of the European Union Council (86/609/EU), siguiendo las regulaciones espaolas (BOE 67/8509-12, 1998) para el uso de animales de laboratorio y aprobadas por el comit cientfico de la Universidad de Sevilla. En todos los experimentos realizados se usaron ratas albinas macho de la raza Wistar de 3 meses de edad (200-300 g) criadas en nuestro laboratorio. Se mantuvieron 3 4 ratas por caja a temperatura ambiente constante (22 2C) y una humedad relativa del 60%, con ciclos de luz-oscuridad de 12 h y acceso ilimitado a agua y comida (dieta de mantenimiento A.04 de Panlab S.L.).

2. OPERACIONES QUIRRGICAS.

Las operaciones intracerebrales se practicaron mediante trepanacin del crneo previa anestesia con hidrato de cloral (400 mg/Kg de peso; i.p.) y posicionando el animal en un estereotxico (Kopf Instruments, Tujunga, CA, EEUU). Las coordenadas para inyectar en el hipocampo se tomaron siguiendo el atlas de cerebro de Paxinos y Watson (1986). Todas las inyecciones se realizaron en el hipocampo izquierdo a travs de una jeringa Hamilton posicionada a 3.6 mm caudal, 2.0 mm lateral y 3.4 mm ventral con respecto al punto Bregma. Estas coordenadas corresponden al rea hipocampal CA1 en una localizacin que abarca la parte ms baja del stratum oriens y la capa de clulas piramidales de CA1. El flujo de inyeccin fue de 0.5 l/min y el volumen total inyectado de 2 L. Despus de cada inyeccin se esperaron 10 minutos para evitar el

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Materiales y Mtodos

reflujo a lo largo del tracto de inyeccin. Sin embargo, se evidenci alguna difusin de Monastral Blue en el corpus callosum.

3. TRATAMIENTOS.

Se establecieron 5 grupos de animales de acuerdo a los diferentes tratamientos y para cada grupo se usaron al menos 5 ratas. Estos grupos se esquematizan en la figura 5 y se explican a continuacin:

(1)Controles

Vehculo 2l

(2) Controles con estrs

Vehculo 2l

Estrs

(3) LPS

LPS 2g/2l LPS 2g/2l LPS 2g/2l

(4) LPS y estrs

Estrs RU486 Estrs

(5) LPS, estrs y RU486

Da 1

Da 10

Fig. 5. Esquema de los distintos grupos de animales de acuerdo con los tratamientos ensayados.

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3.1. Controles.
Este grupo control recibi una nica inyeccin en el hipocampo izquierdo de 2 L de vehculo (Monastral Blue al 1% en tampn fosfato salino (PBS), utilizado como trazador inerte para localizar el sitio de la inyeccin). Los animales se sacrificaron 10 das despus de la ciruga por perfusin o decapitacin y los cerebros se procesaron para posteriores anlisis.

3.2. Controles con estrs.

Este grupo recibi una nica inyeccin de 2l de vehculo en el hipocampo izquierdo, siendo adems estresados durante 9 das y finalmente sacrificados 10 das despus de la ciruga.

3.3. Tratamiento con LPS.

El grupo tratado con LPS recibi una nica inyeccin intrahipocampal de 2 g de LPS disuelto en 2 L de vehculo. Los animales fueron sacrificados 10 das ms tarde y los cerebros procesados para posteriores anlisis.

3.4. Tratamiento con LPS y estrs.

En este grupo los animales recibieron una nica inyeccin intrahipocampal de 2 g de LPS disuelto en 2 L de vehculo y adems fueron estresados durante 9 das. Finalmente los animales fueron sacrificados 10 das despus de la ciruga.

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3.5. Tratamiento con LPS, estrs y RU486.

El grupo tratado recibi una nica inyeccin intrahipocampal de 2 g de LPS disuelto en 2 L de vehculo, fue estresado durante 9 das y recibi una dosis diaria de RU486 (20 mg/Kg de peso en salino al 20% en dimetilsulfxido (DMSO); s.c.) 1 hora antes del estrs. Los animales se sacrificaron 10 das despus de la ciruga por perfusin y los cerebros procesados para posteriores anlisis.

Las inyecciones de vehculo o LPS en los animales sujetos a los 9 das de estrs crnico variable, se realizaron el da 1 despus de completar el primer estresor (ver tabla 2). La mayora de los parmetros se analizaron a los 10 das despus de la ciruga. Cuando los animales se analizaban a tiempos postlesin ms cortos, el estrs crnico variable se realiz igualmente como se indica en la tabla 2 hasta el da correspondiente al del sacrificio.

4. MODELO DE ESTRS.

El estrs crnico variable fue adaptado de otros modelos de estrs variable (Willner y col., 1987; Konarska y col., 1990; Murua y Molina, 1992; Muscat y col., 1992; Gamaro y col., 2003), pero con algunas variaciones. Los animales se dividieron en dos grupos: el grupo de animales estresados y el grupo de animales no estresados. Los animales no estresados se mantuvieron alejados de cualquier molestia en sus jaulas durante los diez das que dur el tratamiento. Para el grupo de animales estresados se us un ciclo de 9 das de estrs variable. Los estmulos estresantes individuales y el tiempo en que stos eran aplicados cada da se han descrito en la tabla 2. En resumen

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estos estmulos estresantes fueron: (a) 24 h de privacin de comida; (b) 24 h de privacin de agua; (c) 1-3 h de inmovilizacin; (d) 24 h de aislamiento; (e) 1.5-2 h de inmovilizacin a 4C; (f) natacin forzada durante 10 minutos. La aplicacin del estrs empez en diferentes momentos cada da, con objeto de evitar su prediccin. La inmovilizacin se llev a cabo colocando al animal en un tubo de plstico de 21 cm x 6 cm, ajustndolo con una tapadera de plstico por la parte exterior de tal forma que el animal no pudiera moverse y con un orificio al final del tubo que le permitiera respirar. La natacin forzada se llev a cabo colocando al animal en un tanque de cristal de 44 x 33 x 30 cm con 22 cm de profundidad de agua a una temperatura de 23 2 C. El peso corporal de los animales se midi al comienzo y al final del tratamiento como un parmetro indirecto de activacin del eje HPA. Con el mismo fin se midieron tambin los niveles de corticosterona y progesterona en sangre.

Tabla 2. Estmulos utilizados durante el tratamiento de estrs crnico. Da de tratamiento 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Estmulo estresante Natacin forzada Inmovilizacin Privacin de agua Inmovilizacin a 4 C Aislamiento Privacin de comida Privacin de agua Inmovilizacin a 4 C Privacin de comida Duracin 10 min 3h 24 h 1.5 h 24 h 24 h 24 h 2h 24 h

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5. PERFUSIN DE LOS ANIMALES.

Para las tcnicas de inmunohistoqumica, los animales fueron perfundidos bajo profunda anestesia con hidrato de cloral (400 mg/Kg; i.p.) con una solucin de paraformaldehdo al 4% en tampn fosfato, pH 7,4. Los cerebros se separaron y se crioprotegieron sumergindolos en sacarosa en PBS, pH 7,4, primero al 10% durante 24 horas, luego al 20% 24-48 horas y ms tarde al 30% hasta que se hundieron (2-5 das). A continuacin se congelaron en isopentano a 15 C y se cortaron en un criostato en secciones de 25 m. Dichas secciones se montaron en portaobjetos gelatinizados.

6. MEDIDA DE LOS NIVELES DE CORTICOSTERONA Y PROGESTERONA EN SANGRE.

Para extraer la sangre del corazn, las ratas fueron previamente anestesiadas con hidrato de cloral (400 mg/Kg de peso; i.p.). Para preparar las muestras de suero, la sangre extrada de cada animal se pas directamente a tubos de centrfuga. A continuacin se dej coagular la sangre durante 30 minutos a temperatura ambiente. Rpidamente, la sangre coagulada se centrifug a 2.000 x g durante 15 minutos a 42 C. Luego se transfirieron las muestras de suero a tubos separados y se almacenaron a 70C. La concentracin de corticosterona y progesterona en suero se midi usando un kit de enzimoinmunonsayo (Assay Designs Correlate-EIA) para corticosterona y progesterona.

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7. INMUNOHISTOQUMICA.

7.1. Inmunohistoqumica de OX-6, GFAP y NeuN.

Para localizar y cuantificar el dao en las poblaciones astrogliales y neuronales se usaron tcnicas de inmunohistoqumica frente a GFAP y NeuN. En el caso de las poblaciones microgliales se usaron tcnicas de inmunohistoqumica utilizando el anticuerpo OX-6 que reacciona con el determinante monomrfico del complejo mayor de histocompatibilidad clase II presente en la microgla activada. El anticuerpo frente a GFAP es capaz de reconocer a la protena fibrilar cida presente en los astrocitos. El anticuerpo frente a NeuN reconoce a una protena presente en los ncleos y citoplasmas neuronales. Todos los anticuerpos se obtuvieron a partir de suero de ratn. Las inmunohistoqumicas se realizaron sobre secciones de 25 m de grosor de cerebros procedentes de animales perfundidos. Todos los lavados y diluciones se realizaron con tampn Tris salino (TBS) a pH 7,4. Para los tres anticuerpos se sigui un protocolo comn que slo se diferenci en las concentraciones de los distintos anticuerpos primarios (1:200 para el OX-6, 1:300 para el GFAP y 1:1000 para el NeuN). Las secciones se descongelaron y se dejaron secar durante unos minutos a temperatura ambiente. Despus de varios lavados de 10 minutos cada uno se procedi a la desactivacin de la peroxidasa endgena mediante una solucin de H2O2 al 0,3% en metanol. Las secciones se incubaron durante una hora a temperatura ambiente con suero de caballo al 1% en tampn TBS y posteriormente durante 18 horas con una solucin del anticuerpo primario que contena 0,25% de tritn X-100 y 1% de suero de caballo. Las secciones se mantuvieron a 4 C en una cmara con humedad para evitar que se secasen. El resto de la tcnica se realiz a temperatura

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ambiente. Tras otra serie de lavados en TBS las secciones se trataron con una solucin de IgG biotinilado de caballo frente a ratn preparada al 0,5% en tampn TBS con un 0,25% de tritn X-100 durante dos horas. Posteriormente y tras una nueva serie de lavados en TBS las secciones se incubaron durante una hora con una solucin de ExtrAvidin-Peroxidade (Kit ABC) diluido al 1% en TBS. La peroxidasa se visualiz revelando con una solucin estndar de diaminobenzidina/perxido de hidrgeno durante 5 minutos.

7.2. Anlisis de los datos obtenidos por inmunohistoqumica.

La cuantificacin de las clulas NeuN positivas y OX-6 positivas en la regin CA1 del hipocampo fue estimada de acuerdo a una aproximacin estereolgica. En el caso de cada animal, se cortaron en serie secciones de 25 m de espesor. 4 de estas secciones fueron sistemticamente muestreadas al azar empezando por un punto a lo largo del eje antero-posterior de la regin CA1 del hipocampo. De esta manera, la distancia entre las secciones estudiadas fue de 100 m. La regin estudiada tuvo un espesor de 320 m desde el plato nmero 31 al plato nmero 33 del atlas de Paxinos y Watson (1986). Sobre cada seccin se colocaron ventanas de contaje (120 x 90 m) sobre tres sitios igualmente espaciados a lo largo del la extensin medio-lateral de la CA1. El rea de la regin CA1 se estim usando el principio de Cavallieri. Los diferentes tipos de clulas OX-6 positivas (las cuales exhiben diferentes formas dependiendo de su estado de activacin) se contaron solamente en la regin CA1. Todos los datos fueron recogidos y expresados como clulas por mm3.

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8. FLUORO JADE B.

Los animales fueron perfundidos, 48 horas despus de la ciruga, bajo profunda anestesia con hidrato de cloral (400 mg/Kg; i.p.) con una solucin de paraformaldehdo al 4% en tampn fosfato, pH 7,4. Los cerebros se extrajeron y se crioprotegieron sumergindolos en sacarosa en PBS, pH 7,4, primero al 10% durante 24 horas, luego al 20% 24-48 horas y ms tarde al 30% hasta que se hundieron (2-5 das). A continuacin se congelaron en isopentano a 15 C y se cortaron en un criostato en secciones de 18 m. Dichas secciones se montaron en portaobjetos gelatinizados. Antes de usarlas, las secciones se secaron a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuacin se lavaron en etanol 100% durante 3 minutos y luego en etanol 70% durante 1 minuto. Posteriormente se lavaron durante 1 minuto en agua destilada. Las secciones se incubaron en una solucin de 0.06% de permanganato potsico durante 15 minutos, preferiblemente en un agitador para asegurar la eliminacin del ruido de fondo entre ellas. Luego las secciones se lavaron en agua destilada durante 1 minuto. La solucin de tincin se prepar al 0.001% de Fluoro Jade B en cido actico 0.1% a partir de una solucin stock al 0.01% de Fluoro Jade B. La solucin stock una vez almacenada en la nevera era estable durante meses, mientras que la solucin de tincin fue preparada unos 10 minutos antes de su uso y no fue reutilizada. Despus de 30 minutos en la solucin de tincin, las secciones fueron lavadas en agua destilada tres veces, durante 1 minuto cada vez. A continuacin, se colocaron en una placa calefactora a 50 C durante 20 minutos en oscuridad (hasta secarse completamente). Las secciones secas se aclararon por inmersin en xileno durante 6 minutos antes de montar los cubreobjetos con el medio de montaje DPX.

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9. HIBRIDACIN IN SITU.

9.1. Obtencin de la ribosonda.

En nuestro estudio usamos diferentes clones que fueron sembrados en placas de agar con medio de crecimiento Luria (LB) con 100 g/mL de ampicilina como antibitico. Las placas se incubaron a 37 C durante 24 horas para conseguir colonias aisladas. Por cada clon se resembr una colonia, esta vez en 25 mL de LB lquido y con la misma concentracin de ampicilina y se incub a 37 C con agitacin de 200 r.p.m. durante 16 horas. Tras esto se realiz la extraccin del ADN plasmdico utilizando un kit de purificacin de ADN Wizard Plus Maxipreps de Promega. A continuacin se procedi a la linealizacin de los distintos clones, incubando cada uno de ellos a 37 C durante 2 horas con la enzima de restriccin correspondiente para obtener las sondas sentido y antisentido. Por ltimo, el ADN linealizado se fenoliz y precipit con etanol absoluto en fro y acetato sdico 3M (pH 5,3) para eliminar los restos de enzimas y sales remanentes tras las manipulaciones previas. Despus de esto y tras cada paso intermedio, se realizaron electroforesis de alcuotas de 1 L de cada uno de los clones en geles de agarosa teidos con bromuro de etidio, con objeto de visualizar y cuantificar el ADN. Posteriormente se procedi a la transcripcin de este ADN para la obtencin de la ribosonda. La mezcla de reaccin contena: 20 unidades de polimerasa, el tampn proporcionado con sta, ATP, CTP y GTP, cada uno a concentracin de 1 mM, 125 Ci de [35S] UTP 30 M (1300 Ci/mmol), DTT 4 mM y 7,2 unidades de inhibidor de la ribonucleasa. La reaccin de marcaje transcurri a 37 C durante 2 horas y fue parada con EDTA 0.5 M. Seguidamente se separ el istopo incorporado al ARNc del que no

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lo fue mediante columnas de Sephadex y posterior centrifugacin durante 2 minutos a 735 x g. Los clones empleados fueron: 1. Los plsmidos pBluescript SK, que contenan la secuencia ADNc de la cido glutmico descarboxilasa 67 (GAD67) como un inserto de EcoRI de 3.2 kb (clones 14 y 18), fueron amablemente cedidos por el Dr. A. Tobin (UCLA, Los Angeles, EEUU). El ADNc de GAD67 fue aislado de una librera de ADNc 1 gt-11 preparada a partir de ARN poli (A) del cerebro adulto de rata (Erlander y col., 1991). Para preparar el transcrito antisentido de GAD67, el clon 14 fue digerido con SalI y usado como molde con la polimerasa T3. Para preparar el transcrito sentido de GAD67, el clon 18 fue digerido tambin con SalI y usado como molde con la ARN polimerasa T3. 2. Las ribosondas especficas del factor neurotrfico derivado de cerebro (BDNF) fueron transcritas desde un molde de rata de 460-pb del codn de BDNF clonadas en un vector PGEM-4Z (Promega, Madison, WI, USA) que fue amablemente cedido por Genetech (South San Francisco, CA, USA). Los transcritos sentido y antisentido fueron generados usando las polimerasas SP6 y T7 desde los fragmentos HindIII y EcoRI del vector. Las ribosondas sentido y antisentido usadas para la hibridacin in situ se transcribieron en presencia de [35S] UTP (1300 Ci/mmol; Amersham Internacional).

9.2. Reaccin de hibridacin.

Las secciones de 12 m se obtuvieron en un criostato disponindose sobre portaobjetos previamente gelatinizados. Una vez descongeladas fueron post-fijadas en

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paraformaldehdo al 4% durante 30 minutos, continundose con tres pasos de lavado de 10 minutos cada uno en PBS, pH 7,4. Para disminuir las uniones inespecficas las secciones fueron tratadas con 0,1 M trietalolamina pH 8,0 (1 minuto) y con anhdrido actico al 0,25% en 0,1 M trietanolamina (10 minutos). Se continu con un lavado de 1 minuto en citrato sdico salino (SSC) 2X, preparado a partir de SSC 20X (3 M de NaCl y 0,3 M de citrato sdico). A continuacin, las secciones fueron deshidratadas mediante paso por soluciones con concentraciones crecientes de etanol (30, 60, 90 y 100%) y secadas al aire. Posteriormente se procedi a la hibridacin de la sonda de [35S] ARNc con su secuencia complementaria; previamente la sonda se diluy en el tampn de hibridacin y se desnaturaliz a 80 C durante 5 minutos. Dicho tampn se compona de formamida al 50%, 0,002% solucin Denhardt, SSC 1X, 50 mM Tris-HCl, 0,1% pirofosfato sdico, 0,1 mg/mL ARN de levadura, 0,1 mg/mL esperma de salmn, 1mM EDTA y sal sdica de sulfato de dextrano. La hibridacin se llev a cabo durante 3 horas a 50 C, enjuagndose a continuacin en dos soluciones de SSC 2X, una con 20 mM DTT y otra sin DTT. Seguidamente se sometieron a digestin con ribonucleasa (Rnasa) a 37 C (20g/mL de Rnasa A en 0,5M NaCl, 0,01M Tris-HCl y 1mM EDTA, a pH 8,0) durante 30 minutos. Para aumentar la astringencia, las secciones se dejaron en una solucin de SSC 2X con 0,02M -mercaptoetanol a 25 C durante toda la noche, y otra solucin de SSC 0,1X a 60 C durante 1 hora. Finalmente las secciones fueron deshidratadas en etanoles (30, 60, 90 y 100%) con acetato amnico al 0,3M y secadas al aire.

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9.3. Anlisis y cuantificacin de la seal de hibridacin.

Como paso previo a la cuantificacin de la seal, los portaobjetos fueron expuestos a una pelcula de autorradiografa Betamax durante 10 das. Para el estudio de la expresin del ARNm se cuantific tanto la densidad ptica sobre la pelcula de autorradiografa como el nmero de granos de plata sobre neuronas individuales, utilizando un sistema de anlisis de imagen. Las secciones fueron procesadas para la emulsin autorradiogrfica. Los portaobjetos se impregnaron de emulsin LM-1 diluida 1:1 con agua, mantenindose en la oscuridad a 4 C durante 30 das (tres veces el tiempo de exposicin del film). A continuacin, las secciones se revelaron con el revelador D-19 (Kodak) durante 5 minutos a 15 C, se enjuagaron en agua destilada durante 1 minuto y se fijaron durante 4 minutos para teirlas a continuacin con violeta de cresilo al 0,5%, pH 3,8. Posteriormente se deshidrataron y finalmente se montaron con medio de montaje. Las clulas que expresan ARNm de GAD67 se contaron usando 6 secciones de 12 m de espesor por animal. Las secciones fueron cortadas en serie y sistemticamente distribuidas desde un punto a lo largo del eje antero-posterior de la regin CA1. De esta manera, la distancia entre las secciones estudiadas fue de 60 m. La regin estudiada tuvo un espesor de 325 m desde el plato nmero 31 al plato nmero 33 del atlas de Paxinos y Watson (1986). Para cada seccin, se colocaron ventanas de contaje (120 x 90 m) en tres sitios igualmente espaciados a lo largo de la extensin medio-lateral de la regin CA1. El rea de la regin CA1 se estim usando el principio de Cavallieri. Todos los datos fueron recogidos y expresados como clulas por mm3. Para la medida de la expresin del ARNm de GAD67, se cuantificaron las densidades de los granos de plata sobre los cuerpos celulares individuales utilizando el

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sistema de anlisis de imagen AnalySIS. El marcaje se consider especfico cuando la acumulacin de granos sobre las clulas en los ncleos exceda 5 veces el valor del ruido de fondo en la ampliacin 100X. Se especific el rea con alta densidad de granos sobre los cuerpos celulares individuales y se cont el nmero de granos dentro de este campo mediante un sistema de anlisis de imagen con una ampliacin de 40X. Debido a los altos niveles de marcaje, a la disposicin tpica de las agrupaciones sobre los cuerpos celulares y al alto aumento, la delimitacin fue inequvoca. Slo las clulas bien separadas se seleccionaron para la cuantificacin. Se analizaron las secciones correspondientes al sitio de la lesin de cinco animales por tratamiento. En el caso del BDNF se analizaron las secciones correspondientes al sitio de la lesin de cinco animales por tratamiento, contndose las clulas por seccin en 5 secciones por animal.

10. DESHIDRATACIN Y MONTAJE DE LAS SECCIONES.

Para la deshidratacin de las secciones se utiliz un procedimiento general mediante el cual se sumergieron en soluciones de concentraciones crecientes de etanol (50, 70, 80, 90 y 100%) durante 5 minutos y seguidamente se mantuvieron durante 15 minutos en histolemon. El medio de montaje utilizado una vez completado el proceso fue DPX.

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11. CUANTIFICACIN RELATIVA DE PCR A TIEMPO REAL.

Los hipocampos izquierdos de cada rata fueron diseccionados 6 horas despus del tratamiento, congelados rpidamente en nitrgeno lquido y guardados a 80 C. El ARN total fue extrado usando el kit RNeasy (Quiagen). El ADNc fue sintetizado desde 1 g del ARN total usando el kit de transcripcin inversa QuantiTest (Quiagen) en un volumen de reaccin de 20 l como se describe en el protocolo del fabricante. La PCR a tiempo real fue realizada con iQTMSYBR Green Supermix (Biorad), 0.4 M cebadores y 1 l de ADNc. Paralelamente se realizaron controles sin ADNc. La amplificacin tuvo lugar en un termociclador Mastercycler ep realplex (Eppendorf) a 94 C durante 3 minutos seguidos de 35 ciclos de desnaturalizacin a 94 C durante 30 segundos, de alineamiento a 55 C durante 45 segundos y de extensin a 72 C durante 45 segundos, seguidos de una elongacin final a 72 C durante 7 minutos. Tras la amplificacin, se realiz el anlisis de una curva de desnaturalizacin calentando las reacciones desde 65 a 95 C a intervalos de 1 C mientras se monitoriza la fluorescencia. El anlisis confirm un producto de PCR simple en la temperatura de desnaturalizacin pronosticada. La -actina sirvi como control interno (gen de referencia) y fue usada para normalizar las muestras. Las secuencias de los cebadores para IL-1, TNF- y -actina se muestran en la tabla 3. El ciclo al cual cada muestra alcanza un umbral de fluorescencia, Ct, fue determinado, y se calcul el promedio de los valores triplicados para cada ADNc. Los anlisis de PCR a tiempo real se hicieron usando un mtodo comparativo de Ct.

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Tamao de Cebadores sentido y antisentido producto Referencia esperado (pares de bases) S: 5-CAGGATGAGGACATGAGCACC-3 447 Rostworowski y IL-1 A: 5-CTCTGCAGACTCAAACTCCAC-3 col., 1997 297 Meltzer y col., 1998 TNF- S: 5-TACTGAACTTCGGGGTGATTGGTCC-3 A: 5-CAGCCTTGTCCCTTGAAGAGAACC-3 514 Rostworowski y -actina S:5-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3 A:5-TTTGATGTCACGCACGATTTCC-3 col., 1997 ARNm diana Tabla 3. Cebadores para la RT-PCR a tiempo real.

12. ANLISIS DE PROTEINAS POR WESTERN BLOT.

Una de las tcnicas ms comunes

para detectar y analizar protenas es el

Western blot. Dicha tcnica consiste en dos fases. En la primera se realiza una electroforesis de protenas en geles de poliacrilamidaDodecil Sulfato Sdico (SDSPAGE), donde las protenas desnaturalizadas son separadas en funcin de su peso molecular (Laemmli, 1970). En nuestro caso se han utilizado geles del 10% y del 16% en un sistema de electroforesis Mini-Protean II. En la segunda fase se lleva a cabo una transferencia de las protenas a membranas de nitrocelulosa. Previamente el hipocampo fue homogeneizado en 15 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA y 1 mM PMSF (todos de Sigma). El homogeneizado se centrifug a 12000 g durante 20 minutos a 4 C. Seguidamente, el sobrenadante se fraccion y se congel a 80 C. El contenido de protenas de las

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muestras se estim por el mtodo de microLowry usando un estndar de albmina srica bovina. Las muestras se mezclaron en proporcin 1:1 con el tampn de muestra (0.01 M Tris/HCl pH 6.8, 20% glicerol, 10% - mercaptoetanol, 2.3% SDS, 0.005% azul de Bromofenol), y posteriormente fueron hervidas a 100 C durante 5 min. Se cargaron unos 25-50 g de protenas en cada pocillo. Las muestras de protenas se separaron por SDSPAGE (10%, en el caso de las protenas kinasas activadas por mitgeno (MAPKs); 16% en el caso de la xido ntrico sintasa neuronal (nNOS) y la iNOS). El tampn de corrido que se emple fue una solucin cuya composicin es: 0.025 M Tris/HCl, 0.19 glicina y 0.1% SDS. En cuanto a las condiciones de las electroforesis, stas se llevaron a cabo a 30 mA usando geles de 1,5 mm de grosor. Tras la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS, se procedi a la segunda fase, en la que las protenas se transfirieron a membranas de nitrocelulosa (Hybond-C Extra; Amershan Life Science, RU), utilizando el sistema de electrotransferencia (TransBlot Cell, Bio-Rad). El tampn de transferencia contena 25 mM Bicina, 25 mM Bis-Tris, 1 mM EDTA, pH 7,2 y 20 % de metanol. La transferencia se realiz segn el mtodo descrito por Towbin y col. (1979), durante 2 h a 4C y 120 voltios. Tras la electroforesis y transferencia a membranas de nitrocelulosas se realiz la inmunodeteccin de las protenas de inters mediante los anticuerpos especficos correspondientes (tabla 4). Lo primero que se hizo fue teir las membranas con una solucin reversible de rojo Ponceau (0.2 % rojo Ponceau en 3 % TCA), para indicar que en los diferentes pocillos hay la misma cantidad de protenas. Las membranas se lavaron con tampn Tris salino con Tween (TTBS, 20 mM TrisHCl, 500 mM NaCl y 0,05 % Tween 20) durante 15 min. Para evitar uniones

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inespecficas del anticuerpo a la superficie de la membrana, se trat con leche de bloqueo (5% en TTBS) durante 1 h a temperatura ambiente y agitacin suave. A continuacin las membranas se incubaron con el anticuerpo primario correspondiente. Los anticuerpos no fosforilados se utilizaron como controles de carga.

Anticuerpo SAPK/JNK P-SAPK/JNK (Thr 183/Tyr 185) P38 P-p38 (Tyr 182) ERK1/2 P-ERK1/2 (Tyr 204) Akt P-Akt (Thr 308) GSK-3 P-GSK-3 (Tyr 216) CREB-1 P-CREB-1 (Ser 133) iNOS nNOS

Origen Cell Signaling Tech Cell Signaling Tech Santa Cruz biotech Santa Cruz biotech Santa Cruz biotech Santa Cruz biotech Santa Cruz biotech Santa Cruz biotech Santa Cruz biotech Santa Cruz biotech Santa Cruz biotech Santa Cruz biotech Santa Cruz biotech Santa Cruz biotech

Dilucin 1:1000 1:1000 1:500 1:500 1:1000 1:1000 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500 1:500

Tiempo 1h Toda la noche 1h Toda la noche 1h Toda la noche 1h Toda la noche 1h Toda la noche 1h Toda la noche Toda la noche Toda la noche

Tabla 4. Anticuerpos primarios utilizados para el anlisis de Western blot. Todos los anticuerpos fueron diluidos en TBS 0,05% Tween 20 y 5 % de leche en polvo, y se conservaron en fro para ser reutilizados en varias inmunodetecciones.

Despus de la incubacin con los anticuerpos primarios, las membranas se lavaron en tampn TTBS, y luego fueron incubadas con anticuerpos secundarios contra inmunoglobulinas de conejo, ratn y cabra conjugados con peroxidasa (DAKO, 104

Materiales y Mtodos

Produktionsvej, DK) en una dilucin de 1:3000 durante 1 hora a temperatura ambiente y en tampn TTBS. Las protenas se visualizaron usando un kit de quimioluminiscencia (Pierce, Rockford, IL). Todos los experimentos fueron repetidos por triplicado. Para la cuantificacin de las bandas de protenas las pelculas autoradiografiadas se secaron a temperatura ambiente, las bandas fueron analizadas por densitometra utilizando un programa de ordenador Quantity One 1-D Anlisis Software (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Las bandas de inters fueron delimitadas y la densidad ptica fue obtenida.

13. ANLISIS ESTADSTICO.

Los resultados se expresaron como la media la desviacin estndar. Las medias se compararon mediante una ANOVA de una va y se us el test LSD para comparaciones mltiples. Tambin se realizaron correlaciones intra animales entre las seis MAPKs estudiadas, utilizando el programa de ordenador Statgraphics.

14. REACTIVOS.

El lipopolisacrido obtenido de Escherichia coli serotipo 026: BC fue proporcionado por Sigma Chemical Co, EE.UU. El MonastralBlue se obtuvo de Sigma Chemical Co, EE.UU. El inhibidor para la activacin de los receptores de glucocorticoides, RU486, se obtuvo de Sigma Chemical Co, EE.UU.

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Materiales y Mtodos

El kit para las medidas de corticosterona y progesterona fue proporcionado por Assay Designs Inc., Ann Arbor, Michigan, EE.UU. En las determinaciones inmunohistoqumicas de la poblacin neuronal, astroglial y microglial se utilizaron los siguientes productos: como anticuerpos primarios se usaron anti-OX-6 hecho en ratn (Serotec, RU); anti-protena fibrilar cida de gla hecha en ratn (GFAP, Chemicon, EE.UU.) y anti-NeuN obtenida tambin en ratn (Chemicon International). El anticuerpo secundario utilizado fue en los tres casos un anti-IgG biotinilado de Vector (RU) contra ratn obtenido en caballo, mientras que como sistema de revelado se utiliz el Kit ABC (ExtraAvidin-Peroxidase) de Vector (RU). El suero empleado fue suministrado por Vector (RU). El agua oxigenada para la destruccin de la peroxidasa endgena se obtuvo de Merck, Alemania, mientras que la utilizada para el revelado con diaminobenzidina fue proporcionada por Sigma Chemical Co, USA. Para el revelado de las tcnicas inmunohistoqumicas se utiliz tetracloruro de 3,3diaminobencidina (DAB), de Sigma Chemical Co. El Tritn X-100 fue suministrado por Sigma Chemical Co, EE.UU. Para la deshidratacin y montaje de las secciones se utiliz Histolemon de Carlo Erba y DPX de VWR International Inc. Poole, Inglaterra Para la histofluorescencia con Fluoro Jade B se utiliz una solucin al 0.06% de permanganato potsico de Panreac, una solucin stock al 0.01% de Fluoro Jade B de Histo-Chen Inc, Jefferson AR y cido actico al 0.1 % de Panreac. Como lquido de centelleo se emple Formula-989 LSC Cocktail de New England Nuclear. La perfusin de los animales para las tcnicas de inmunohistoqumica se realiz con paraformaldehdo de Carlo Erba. 106

Materiales y Mtodos

Para la elaboracin de las ribosondas empleadas en la hibridacin in situ, el medio para el desarrollo y mantenimiento de Escherichia coli fue la Base de Caldo de Luria suministrada por Cultimed y el Agar Bacteriolgico adquirido a Biolife Italiana. El antibitico empleado fue ampicilina (Sigma Chemical Co). El ADN plasmdico fue obtenido mediante un kit de purificacin de ADN Wizard Plus Maxipreps de Promega, Madison, Wi, EEUU. Los plsmidos fueron linealizados con las enzimas de restriccin Sal I, HindIII y EcoRI proporcionadas por Amersham Pharmacia Biotech, RU. Tanto el fenol como el cloroformo utilizados en la precipitacin del ADN fueron suministrados por Sigma Chemical Co. Para visualizar el ADN plasmdico tras cada paso se realizaron electroforesis en geles de agarosa (Pronadisa) teidos con bromuro de etidio (Merck). En los estudios de hibridacin in situ se us dietilpirocarbamato de Serva como inhibidor de las ribonucleasas a lo largo de todo el ensayo y uridina 5[-tio] [35S] triofosfato (UTP) de Amersham Pharmacia Biotech como marcador del ARNm. Para la transcripcin de las sondas se emplearon las polimerasas de ARN T3, SP6 y T7 de Promega, Madison, WI, EE.UU., as como microcolumnas ProbeQuant G-50 de Amersham Pharmacia Biotech para la separacin del UTP no incorporado a la sonda. Los reactivos de uso en el ensayo de hibridacin in situ fueron de calidad para biologa molecular. Para el Western blot se utilizaron NaCl, EDTA, EGTA y PMSF para la preparacin del tampn de homogenizacin todos ellos de Sigma. Se usaron anticuerpos secundarios contra inmunoglobulinas de conejo, ratn y cabra conjugados con peroxidasa de DAKO, Produktionsvej, Dinamarca. Para la visualizacin de las bandas de protenas se us quimioluminiscencia de Pierce, Rockford, Ilianois.

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Materiales y Mtodos

En la tcnica de la PCR a tiempo real, para la extraccin del ARN total se utiliz el kit RNeasy de Quiagen y para la sntesis del ADNc se utiliz el kit de transcripcin inversa QuantiTest de Quiagen. La PCR a tiempo real fue realizada con iQTMSYBR Green Supermix de Biorad. La amplificacin tuvo lugar en un termociclador Mastercycler ep realplex de Eppendorf . Los dems solventes y reactivos fueron de alto grado de pureza, obtenindose todos ellos de los proveedores habituales.

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RESULTADOS

Resultados

1. CAMBIOS EN EL PESO CORPORAL.

Con el fin de evaluar que los animales estuvieran realmente estresados se decidi medir su peso corporal como un parmetro de estrs. La ganancia en el peso de los animales durante el experimento se muestra en la figura 6. Mientras que los animales no estresados aumentaron su peso a lo largo de todo el tiempo que dur el experimento (p< 0,05), en el caso de las ratas estresadas no fue as. Las alteraciones del peso corporal son efectos tpicos del estrs y se utilizan frecuentemente como un mtodo para comprobar que el modelo de estrs aplicado es correcto (Gamaro y col., 2003).

Fig. 6. Efecto del estrs en el peso corporal en animales estresados y no estresados. Peso corporal al principio y al final del tratamiento en ratas estresadas y no estresadas. Los resultados, expresados en gramos, muestran las medias DE de 5 experimentos independientes. Significacin estadstica (t de Student) comparado con el peso al principio del tratamiento en ratas no estresadas: *, p<0,05.

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Resultados

2. CAMBIOS EN LOS NIVELES DE CORTICOSTERONA Y PROGESTERONA EN SANGRE.

Los niveles de corticosterona y progesterona en sangre se midieron como un ndice de estrs crnico para asegurar que se ha producido el estado de estrs, ya que son parmetros que se afectan con este proceso. Debido a que los niveles de esteroides cambian a lo largo del da (en el caso de la rata se presentan niveles bajos durante el da, los cuales se incrementan por la tarde, presentado el pico de secrecin justo antes del anochecer), las muestras de sangre se recogieron en dos momentos diferentes del da: por la maana (entre las 9:00h-10:00h) y por la tarde (entre las 19:00h-20:00h), el da 10 del experimento. Como se esperaba, los niveles de corticosterona y progesterona en sangre aumentaron por la tarde y tambin en condiciones de estrs. El estrs aument significativamente los niveles de corticosterona durante la maana (128% de los niveles control correspondientes) y durante la tarde (153% de los niveles control correspondientes) (p<0,01; Fig. 7A). El tratamiento con RU486 redujo los niveles de corticosterona a cerca del valor control correspondiente (110% de los niveles control por la maana y 131% de los niveles control por la tarde, p<0,01; Fig. 7A). Al igual que la corticosterona, los niveles de progesterona tambin aumentaron despus del estrs (150% y 159% de los niveles control correspondientes para las muestras recogidas por la maana y por la tarde respectivamente) (p<0,01; Fig. 7B). En este caso, el tratamiento con RU486 no redujo los niveles de progesterona en sangre, aunque solamente los aument de manera significativa en las muestras recogidas por la tarde (208% de los niveles control, p<0,01; Fig. 7B).

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Resultados

Figura 7. Efecto del estrs en los niveles de corticosterona y progesterona en sangre. (A) Cuantificacin de los niveles de corticosterona en sangre en los distintos tratamientos ensayados (C: animales control, no estresados; E: animales estresados; ERU, animales estresados y tratados con RU486). Significacin estadstica (ANOVA de una va seguido de un test LSD para comparaciones mltiples): *, comparado con la maana dentro del mismo grupo; a, comparado con el control, por la maana; b, comparado con las muestras recogidas por la maana de los animales estresados; c, comparado con el control, por la tarde; d, comparado con las muestras recogidas por la tarde de los animales estresados; p< 0.01. (B) Cuantificacin de los niveles de progesterona en sangre en los distintos tratamientos ensayados (C: animales control, no estresados; E: animales estresados; ERU: animales estresados y tratados con RU486). Significacin estadstica (ANOVA de una va seguido de un test LSD para comparaciones mltiples): *, comparado con la maana dentro del mismo grupo; a, comparado con el control, por la maana.; b, comparado con el control, por la tarde; c, comparado con las muestras recogidas por la tarde de los animales estresados; p<0,01.

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3. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRS EN LA MICROGLA.

Con el fin de estudiar el efecto de los distintos tratamientos sobre la activacin de la microgla inducida por el LPS se realizaron tcnicas de inmunohistoqumica de OX-6. El OX-6 es un anticuerpo contra un determinante monomrfico del complejo mayor de histocompatibilidad de clase II de la rata, expresado por la microgla reactiva pero no por la microgla residente. De esta manera podemos visualizar clulas activadas, caracterizadas por procesos ms gruesos y cuerpos celulares mayores a los de clulas de cerebros controles, as como microgla fagoctica, con una morfologa de pseudopdica a globular, y en su mayora carentes de procesos que recuerdan a clulas cargadas de lpidos. En respuesta a un dao las clulas microgliales proliferan y se activan (cambian de morfologa, desde una microgla residente ramificada con dos o tres finas prolongaciones hasta clulas redondeadas similares a los macrfagos tisulares). En nuestro diseo experimental un incremento en la expresin de OX-6 es un marcador de dao celular causado por neurotoxinas. Por el contrario se considera neuroproteccin cuando aparece una disminucin en la expresin de OX-6. La inyeccin de vehculo en animales no estresados produce una ligera reaccin microglial (Fig. 8A y F) y tiene un dbil efecto en los animales estresados (Fig. 8B y F). A diferencia de lo que sucede en otras estructuras, como por ejemplo la SN, la inyeccin de LPS en animales no estresados no logr una fuerte activacin de las clulas microgliales, llegando incluso a mostrar valores similares a los del grupo control (99%, Fig. 8C y F). Sin embargo, la inyeccin de LPS en animales estresados aument notablemente las clulas microgliales reactivas, demostrndose as un efecto sinrgico de ambos factores (289% comparado con los animales inyectados con vehculo, p< 0,01; Fig. 8D y F). Dicho efecto se vio muy disminuido tras el tratamiento con

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Resultados

mifepristona (126% comparado con los animales inyectados con vehculo, p< 0,01; Fig. 8E y F).

4. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRS EN LA ASTROGLA.

Para

la

tincin

de

las

clulas

astrogliales

se

usaron

tcnicas

de

inmunohistoqumica con un anticuerpo monoclonal contra el GFAP, el cual es capaz de reconocer a la protena fibrilar cida presente en los astrocitos. Nuestros resultados muestran una astrogliosis moderada alrededor del sitio de inyeccin de vehculo en animales no estresados y estresados, sin mostrar prdida de inmunotincin de GFAP, es decir, no se produce prdida de astrocitos (Fig. 9B y C). Resultados similares se encontraron cuando se inyect LPS en el hipocampo de animales no estresados (Fig. 9D), encontrndose slo una pequea hiperactividad alrededor del sitio de inyeccin. Sin embargo, cuando el LPS fue inyectado en animales estresados, se evidenci que el estrs refuerza el efecto del LPS, produciendo una fuerte astrogliosis (mayor hiperactividad) pero no prdida de astrocitos (Fig. 9E). Por otro lado el tratamiento con RU486 redujo este efecto de una manera considerable (Fig. 9F), observndose una menor astrogliosis.

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Resultados

Figura 8. Efecto del estrs y el LPS sobre la microgla. (A) Seccin coronal que muestra una ligera inmunorreactividad del OX-6 en un animal no estresado e inyectado con vehculo. (B) Activacin del OX-6 en un animal estresado e inyectado con vehculo. (C) Inmunorreactividad en un animal no estresado e inyectado con LPS. La flecha seala el sitio de inyeccin de 2 g de LPS. La activacin microglial fue dbil. (D) Inmunorreactividad del OX-6 en un animal estresado e inyectado con LPS. La reaccin microglial es ms fuerte y ms extensamente distribuida alrededor del sitio de inyeccin (flecha). (E) El tratamiento con RU486 reduce la activacin del OX6 en un animal estresado e inyectado con LPS. Barra de escala: 100 m. (F) Cuantificacin de los cambios en las poblaciones microgliales en la regin CA1 al final de los tratamientos. Los resultados se expresan en media DE de 5 experimentos independientes, y representan clulas OX-6 positivas por mm3. Significacin estadstica (ANOVA de una va seguido de un test LSD para comparaciones mltiples): *, comparado con el control, animal inyectado con vehculo; p<0,01. Abreviaturas: S, control, vehculo inyectado en el hipocampo de ratas no estresadas; SE, vehculo inyectado en el hipocampo de ratas estresadas; L, LPS inyectado en el hipocampo de animales no estresados; LE, LPS inyectado en el hipocampo de animales estresados.

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Resultados

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Figura 9. Efecto del LPS y el estrs en la astrogla. (A) Representacin esquemtica del sitio de inyeccin en la regin CA1 del hipocampo. (B) Seccin coronal que muestra la inmunorreactividad de GFAP en un animal no estresado e inyectado con vehculo. (C) Inmunorreactividad de GFAP en un animal estresado e inyectado con vehculo. (D) Seccin coronal que muestra una inmunorreactividad de GFAP en un animal no estresado e inyectado con LPS. La flecha seala el sitio de inyeccin de 2 g de LPS. (E) Inmunorreactividad de GFAP en un animal estresado e inyectado con LPS. La flecha indica el sitio de inyeccin de 2 g de LPS. La expresin de GFAP es ms intensa alrededor del sitio de inyeccin. (F) El tratamiento con RU486 reduce la activacin de astrocitos en un animal estresado e inyectado con LPS. Barra de escala: 100 m.

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Resultados

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Resultados

5. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRS EN LAS POBLACIONES NEURONALES.

Para detectar neuronas en general se llevaron a cabo tcnicas de inmunohistoqumica frente a NeuN, mientras que para marcar especficamente neuronas GABArgicas se realizaron tcnicas de hibridacin in situ frente al ARNm de GAD67. La inmunohistoqumica con NeuN consigue teir el ncleo y el citoplasma de las neuronas (Fig. 10). La prdida de neuronas NeuN positivas fue restringida al tracto de inyeccin cuando se inyect vehculo en el hipocampo de animales no estresados y estresados, obtenindose un nmero de clulas/mm3 de 4.4 x 105 y 4.6 x 105, respectivamente (Fig. 10A, B y F). Resultados similares se encontraron cuando el LPS se inyect en el hipocampo de animales no estresados (4.0 x 105 cl/mm3; Fig. 10C y F). Sin embargo, se detect una prdida significativa de neuronas NeuN positivas en la regin CA1 despus de la inyeccin de LPS en animales estresados, demostrndose otra vez un efecto sinrgico del estrs y el LPS (2.2 x 105 cl/mm3, p< 0,01 comparado con el nmero de neuronas contadas en animales controles; Fig. 10D y F). Este efecto tambin se vio reducido tras el tratamiento con RU486, obtenindose un nmero de neuronas similar al de los animales controles (4.5 x 105 cl/mm3; Fig. 10E y F). El sistema GABArgico presenta una abundante poblacin neuronal en el hipocampo, por lo que va a expresar un elevado nivel del ARNm de GAD67 (Fig. 11). Por ello se evalu el efecto del LPS y el estrs en las poblaciones GABArgicas inyectando bien vehculo o bien LPS en ratas estresadas y no estresadas. La especificidad de las seales generadas por la hebra antisentido de ARN se confirm utilizando tambin la sonda sentido (no mostrado). La prdida neuronal no fue

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Resultados

significativa tras la inyeccin de vehculo o LPS en los distintos grupos ensayados (Fig. 11I). Cuando estudiamos los niveles de expresin del ARNm de GAD67 cerca del sitio de inyeccin (Fig. 11E-H y J), encontramos un modesto aumento de estos niveles en los animales estresados e inyectados con vehculo (119% comparado con los animales controles inyectados con vehculo; Fig. 11F y J). El LPS por s solo no indujo un aumento de la expresin del ARNm de GAD67, siendo los valores medidos muy similares a los de los animales controles (92% comparado con los animales control; Fig. 11G y J). Sin embargo, el LPS produjo un aumento ms pronunciado de estos niveles en los animales estresados (137% comparado con los animales inyectados con vehculo, p< 0,05; Fig. 11H y J). Para confirmar la neurodegeneracin en la regin CA1 del hipocampo de las ratas, las secciones fueron procesadas para una histofluorescencia con Fluoro Jade B (un marcador autofluorescente de alta afinidad para la localizacin de degeneracin neuronal) (Fig. 12). En el hipocampo de animales no estresados e inyectados con vehculo se encontraron tan slo algunas neuronas dispersas marcadas con Fluoro Jade B (Fig. 12A). En la regin CA1 cercana al tracto de inyeccin en animales estresados e inyectados con salino se detectaron neuronas Fluoro Jade B positivas (Fig. 12B), al igual que en animales no estresados e inyectados con LPS (Fig. 12C). Sin embargo, y como era de esperar, cuando el LPS se inyect en animales estresados, se detectaron numerosas neuronas degenerando a la largo de la mayor parte de la regin CA1 (Fig. 12D).

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Figura 10. Efecto del estrs y el LPS en las neuronas de la regin CA1 del hipocampo. (A) Seccin coronal que muestra la inmunorreactividad del NeuN tras la inyeccin de vehculo en animales no estresados. La prdida se reduce al tracto de inyeccin. (B) Inmunorreactividad del NeuN tras la inyeccin de vehculo en animales estresados. (C) Seccin coronal que muestra la inmunorreactividad del NeuN tras la inyeccin de 2g de LPS en el hipocampo de ratas no estresadas. (D) Inmunorreactividad del NeuN tras la inyeccin de 2 g de LPS en el hipocampo de ratas estresadas. La tincin uniformemente distribuida se alter alrededor del sitio de inyeccin (flecha). El rea carente de tincin es extensa. (E) El tratamiento con RU486 disminuye la prdida de neuronas NeuN positivas causada por la accin combinada del LPS y el estrs. (F) Cuantificacin del nmero de neuronas NeuN positivas. Los resultados se expresan en media DE de 5 experimentos independientes, y representan clulas/mm3. Significacin estadstica (ANOVA de una va seguido de un test LSD para comparaciones mltiples): *, comparado con el control, animales inyectados con vehculo, p<0,01. Barra de escala: 100 m.

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Figura 11. Efecto del LPS y el estrs en las neuronas hipocampales que expresan el ARNm de GAD67. (A) Fotografa de una autorradiografa que muestra la expresin del ARNm de GAD67 tras la inyeccin de vehculo en animales no estresados. (B) Expresin del ARNm del GAD67 tras la inyeccin intrahipocampal de vehculo en animales estresados. (C) Seccin coronal que muestra la hibridacin in situ de las clulas que expresan el ARNm de GAD67 tras la inyeccin de 2 g de LPS en el hipocampo de ratas no estresadas. (D) Expresin del ARNm del GAD67 tras la inyeccin de 2 g de LPS en el hipocampo de animales estresados. (E) Fotografa en campo oscuro de la regin CA1 despus de la inyeccin de vehculo en animales no estresados. (F) Fotografa en campo oscuro que muestra la expresin del ARNm de GAD67 tras la inyeccin de vehculo en el hipocampo de animales estresados, mostrando un pequeo aumento de la seal de hibridacin (como granos por clula). (G) Fotografa en campo oscuro de la regin CA1 en un animal inyectado con LPS. (H) Fotografa en campo oscuro que muestra la expresin del ARNm de GAD67 tras la inyeccin de 2 g de LPS en el hipocampo de animales estresados, mostrando un aumento significativo de la seal de hibridacin (como granos por clula). (I) Cuantificacin del nmero de clulas que expresan GAD67. Los resultados se expresan en media DE de 5 experimentos independientes, y representan clulas/mm3. (J) Cuantificacin de la expresin celular del mensajero de GAD67 en la regin CA1 del hipocampo. Los resultados se expresan en media DE de 5 experimentos, expresados como porcentaje del control. Significacin estadstica (ANOVA de una va seguido de un test LSD para comparaciones mltiples): a, comparado con el control, animales inyectados con vehculo; b, comparado con los animales inyectados con LPS, p< 0,05. Barras de escala: A, B, C y D: 1mm; E, F, G y H: 50 m.

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Resultados

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Figura 12. Efecto del LPS y el estrs en la histofluorescencia con Fluoro Jade B. Microfotografas que muestran la cantidad de clulas Fluoro Jade B positivas en la regin CA1 del hipocampo. (A) Animales inyectados con vehculo. No detectamos ninguna clula alrededor del tracto de inyeccin. (B) Animales estresados e inyectados con vehculo. Se observa una pequea banda de clulas positivas en la regin CA1 en el punto de la inyeccin. (C) Animales inyectados con LPS. La tincin con Fluoro Jade B mostr una banda discreta de clulas positivas en la regin CA1 tras la inyeccin de 2 g de LPS, mientras que la regin CA1 de animales estresados e inyectados con LPS estaba casi completamente llena de clulas positivas para Fluoro Jade B (D). Barra de escala: 100 m.

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Resultados

6. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRS EN LA EXPRESIN DEL ARNm DE BDNF.

Para comprobar el efecto que tenan los distintos tratamientos en la expresin de factores de crecimiento se realizaron tcnicas de hibridacin in situ del ARNm de BDNF. Los factores neurotrficos como el BDNF son pptidos de secrecin que actan como factores de crecimiento durante el desarrollo fenotpico y contribuyen al mantenimiento de las poblaciones neuronales especficas en el SNC, tanto en el estado adulto como durante el desarrollo. Estas protenas pueden actuar a travs de una va de sealizacin retrgrada a partir de neuronas diana, o por mecanismos paracrinos o autocrinos, controlando as numerosos aspectos relacionados con la estructura neuronal y glial (Siegel y Chauchan, 2000). Existe un gran nmero de trabajos que estudian cambios en la expresin de BDNF mediante el uso de modelos de enfermedades. De hecho, varios autores han demostrado que las clulas microgliales pueden expresar factores neurotrficos tras diferentes tipos de dao (Elkabes y col., 1996; Miwa y col., 1997). En nuestro estudio, los animales inyectados con vehculo muestran poca cantidad de clulas que expresan el ARNm de BDNF alrededor del tracto de inyeccin. Estas clulas fueron tan escasas que slo pudimos encontrar 1 2 clulas positivas por seccin (Fig. 13A, B y G). Resultados similares se encontraron cuando se inyect vehculo en animales estresados (no mostrado) y LPS en animales no estresados (Fig. 13C, D y G). Sin embargo, la inyeccin de LPS en animales estresados increment el nmero de clulas que expresan BDNF en un factor de aproximadamente 5 (Fig. 13E, F y G; p< 0,01). Esta fuerte induccin pensamos que no es de neuronas sino de microgla,

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ya que puede verse una correlacin topogrfica precisa entre la microgla y la induccin de BDNF (las clulas que expresan ARNm de BDNF aparecen justo cerca del sitio de inyeccin).

Figura 13. Efecto del estrs y el LPS en la expresin del ARNm de BDNF en el hipocampo. Las fotografas en campo oscuro fueron tomadas a partir de secciones emulsionadas. (A) Expresin de ARNm de BDNF tras la inyeccin de 2 L de vehculo en el hipocampo de ratas no estresadas. No se observan clulas alrededor del sitio de inyeccin (flecha). (B) Alta magnificacin en campo claro de la foto A. (C) Expresin del ARNm de BDNF tras la inyeccin de 2 g de LPS en el hipocampo de ratas no estresadas. No se ven clulas alrededor del sitio de inyeccin. (D) Alta magnificacin en campo claro de la foto C. (E) Expresin del ARNm de BDNF tras la inyeccin de 2 g de LPS en el hipocampo de ratas estresadas. El nmero de clulas alrededor del sitio de inyeccin se incrementa (flecha). (F) Alta magnificacin en campo claro de la foto E. (G) Cuantificacin de la expresin del ARNm de BDNF. Los resultados se expresan en media DE de 5 experimentos independientes, y representan clulas/seccin. Significacin estadstica (ANOVA de una va seguido de un test LSD para comparaciones mltiples): a, comparado con el control, animales no estresados inyectados con vehculo; b, comparado con los animales estresados e inyectados con vehculo; c, comparado con los animales no estresados e inyectados con LPS; p< 0,01. Barras de escala: A, C y E, 100 m; B, D y F, 50 m.

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7. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRS EN LOS NIVELES TOTALES Y FOSFORILADOS DE JNK, P38, ERK, AKT, CREB y GSK-3.

En las clulas mamferas se han identificado 3 grupos principales de MAPKs: kinasa de la regin aminoterminal del factor de transcripcin c-jun (JNK), kinasa regulada por seales extracelulares (ERK) y p38 MAPK. Akt, GSK-3 y el factor de transcripcin CREB, se incluyen dentro de otros grupos. La activacin de las MAPKs se determin a travs de Western blot utilizando anticuerpos especficos de las formas fosforiladas y no fosforiladas de JNK, p38, ERK, Akt, GSK-3 y del CREB. Ni el estrs ni el LPS produjeron cambios significativos en las cantidades totales de estas protenas (Fig. 14). Por el contrario, s que se alteraron los niveles fosforilados de todas ellas. El estrs indujo un incremento en el P-JNK (desde 40% en animales controles hasta el 69% en animales estresados inyectados con vehculo, p<0,01; los valores en porcentaje son relativos a la cantidad total de las protenas estudiadas en animales controles). La inyeccin de LPS tambin increment los niveles de P-JNK en animales no estresados (61%, p<0,01) y en animales estresados (95%, p<0,01) en comparacin con los animales control, aunque en un grado diferente. Los niveles de P-p38 MAPK tambin se vieron alterados. As, el estrs indujo un incremento en P-p38 (desde el 22% en controles al 45% en animales estresados inyectados con vehculo, p<0,01), mientras que el LPS inyectado en animales no estresados increment estos niveles hasta el 62% (p<0,01). De nuevo, el estrs reforz este efecto en combinacin con el LPS (81%; p<0,01). Los niveles de P-ERK tambin cambiaron tras la inyeccin de vehculo en animales estresados, incrementndose desde el 32% en los controles hasta el 64% en

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animales estresados e inyectados con vehculo (p<0,01). El efecto fue similar en animales no estresados e inyectados con LPS (67% comparado con los controles, p<0,01), y se reforz cuando se inyect LPS en animales estresados (87% comparado con los controles, p<0,01). El trmino Akt se refiere por lo general al Akt1, uno de los tres miembros conocidos de la familia de genes del Akt (Brazil y Hemmings, 2001). Aunque estas tres protenas Akt no se conocen muy bien, al menos parece que tienen algunas funciones no solapadas. En nuestro trabajo encontramos que los niveles de fosforilacin de Akt cambiaron despus de los diferentes tratamientos, disminuyendo del 71% en animales controles al 50% en animales estresados inyectados con vehculo (p<0,01). Esta disminucin fue similar en animales no estresados e inyectados con LPS (47%, p<0,01) y se reforz cuando se inyect LPS en animales estresados (13% comparado con los animales control, p<0,05). La protena de unin al elemento de respuesta al AMP cclico (CREB) es un miembro de la familia de los factores de transcripcin ATF-1 y est implicado en la regulacin de muchos genes de citoquinas (revisado por Mayr y Montminy, 2001). Su fosforilacin en la serina 133 (la cual puede tener lugar por muchas kinasas incluyndose la Akt) se requiere para la actividad transcripcional de CREB (revisado por Lonze y Ginty, 2002). La fosforilacin de CREB se estudi tambin a travs de Western blot (Fig. 14). El P-CREB se redujo tras la inyeccin de vehculo en animales estresados (desde 67% en animales controles al 24% en animales estresados e inyectados con vehculo, p<0,01) y de LPS en animales no estresados (26%, p<0.01). Este descenso fue mayor tras la inyeccin de LPS en animales estresados (11%, p<0,01) comparado con los valores controles.

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Resultados

Dentro de las dianas de Akt implicadas en el control de la supervivencia celular se incluye a la glucgeno sintasa kinasa GSK-3 (Cross y col., 1995). Se realizaron ensayos de Western blot utilizando anticuerpos contra las formas fosforiladas de GSK3 (tirosina 216). De este anlisis observamos que el estrs indujo un aumento en los niveles fosforilados de GSK-3 (del 28% en los controles al 53% en los animales estresados e inyectados con vehculo, p<0,01); mientras que el LPS inyectado en los animales no estresados aument los niveles al 68% de los controles (p<0,01). De nuevo el estrs reforz este efecto en combinacin con el LPS (89%; p<0,01). En la figura 14 se muestran, adems, los resultados obtenidos de las correlaciones intra animales que se realizaron entre las seis MAPKs, junto con los coeficientes de correlacin correspondientes (todos los resultados fueron los esperados, por lo que slo se muestran las interacciones de mayor inters). Puede observarse como las interacciones entre JNK/ERK, JNK/p38, p38/ERK y Akt/CREB son positivas, mientras que la interaccin entre Akt/GSK-3 es negativa.

8. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRS EN LOS NIVELES DE TNF- E IL-1.

Teniendo en cuenta que el estrs incrementa el efecto del LPS, decidimos corroborarlo a nivel molecular determinando los niveles de las citoquinas proinflamatorias TNF- e IL-1. Los anlisis por RT-PCR a tiempo real mostraron que los ARNm de estas citoquinas proinflamatorias se indujeron a las 6 horas tras el tratamiento con LPS. Los niveles de expresin del ARNm de la IL-1 en el hipocampo (Fig. 15A) no cambiaron en los animales estresados inyectados con vehculo (114%

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Resultados

comparado con los controles), pero aumentaron en los animales no estresados e inyectados con LPS (379% comparado con los animales no estresados e inyectados con vehculo, p< 0,01). Cuando se inyect LPS en animales estresados, los niveles de expresin de IL-1 alcanzaron el 720% de los animales controles no estresados e inyectados con vehculo (p<0,01). Los niveles de expresin del mensajero de TNF- en el hipocampo (Fig. 15B) se afectaron tambin slo por la inyeccin de LPS y por la combinacin de LPS y estrs. De esta manera, el LPS en animales no estresados aument el nivel de expresin al 457% de los valores controles (p<0,01). Cuando el LPS se inyect en animales estresados, los niveles de expresin de TNF- alcanzaron el 1131% de los animales controles (p<0,01).

9. EFECTO DEL LPS Y EL ESTRS EN LOS NIVELES DE iNOS y nNOS.

La expresin de enzimas tales como la nNOS o la iNOS se midi por Western blot utilizando anticuerpos especficos (Fig. 16). Los niveles de nNOS e iNOS aumentaron tras la inyeccin de vehculo en animales estresados (171% y 256% respectivamente, comparado con los controles, p<0,01). Un aumento de la expresin de iNOS se observ tambin en los animales no estresados e inyectados con LPS (287%, p< 0.01); en el caso de nNOS, el LPS solo no aument su expresin comparado con los animales estresados e inyectados con vehculo, pero s comparado con los animales control (166%; p< 0,01). Sin embargo, la adicin de estrs aument tanto los niveles de

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Resultados

expresin de nNOS como de iNOS (266% y 363% respectivamente de los controles, p<0,01) (Fig. 16).

Figura 14. Efecto del estrs y el LPS en los niveles de expresin de varias protenas kinasas y el factor de transcripcin CREB en el hipocampo. Las protenas del hipocampo de ratas sometidas a los distintos tratamientos (S: control, vehculo inyectado en el hipocampo de ratas no estresadas; SE: vehculo inyectado en el hipocampo de ratas estresadas; L: LPS inyectado en el hipocampo de animales no estresados; LE: LPS inyectado en el hipocampo de animales estresados) se separaron por electroforesis y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa, para posteriormente teirlas con anticuerpos anti-JNK, anti P-JNK, anti p38, anti P-p38, anti ERK, anti P-ERK, anti Akt, anti P-Akt, anti CREB, anti P-CREB, anti GSK-3 y anti P-GSK-3. Se calcularon las densidades pticas totales de cada banda. Los resultados se expresan en media DE de 5 experimentos independientes, y representan la intensidad de las bandas relativa al control. Significacin estadstica (ANOVA de una va seguido de un test LSD para comparaciones mltiples): a, comparado con el control, animales no estresados inyectados con vehculo; b, comparado con los animales estresados inyectados con vehculo; c, comparado con los animales no estresados e inyectados con LPS; p<0,01. Tambin se representan las correlaciones intra animales entre las seis MAPKs, mostrndose sus coeficientes de correlacin.

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Resultados

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Resultados

Figura 15. Efecto del estrs y el LPS en los niveles de expresin hipocampales de los ARNm de IL-1 y TNF-. La expresin de los ARNm de IL-1 y TNF- en el hipocampo de ratas sometidas a los distintos tratamientos se midi por RT-PCR a tiempo real. (A) Cuantificacin de la expresin del ARNm de la IL-1. El estrs no tuvo efecto, mientras que el LPS solo aument los niveles de expresin. La induccin del ARNm de la IL-1 fue mayor cuando el LPS y el estrs se combinaron. (B) Cuantificacin de la expresin del ARNm de TNF-. El estrs aumenta ligeramente el nivel de expresin del TNF-. Esta induccin fue mayor y significativa en los animales no estresados e inyectados con LPS. De nuevo la combinacin del LPS y el estrs aument este efecto de forma sinrgica. Significacin estadstica (ANOVA de una va seguido de un test LSD para comparaciones mltiples): a, comparado con el control, animales no estresados inyectados con vehculo; b, comparado con los animales estresados inyectados con vehculo; c, comparado con los animales no estresados e inyectados con LPS; p<0,01.

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Figura 16. Efecto del estrs y el LPS en la expresin hipocampal de nNOS e iNOS. (A) Cuantificacin de la expresin de nNOS. El estrs slo y la inyeccin de LPS solo, aumentaron el nivel de fosforilacin de nNOS de una manera similar. Sin embargo, la combinacin de LPS y estrs produjo una mayor elevacin de estos niveles. (B) Cuantificacin de la expresin de iNOS. De nuevo, el estrs solo y el LPS solo aumentaron el nivel de fosforilacin de iNOS, aunque en este caso de una manera diferente ya que el aumento fue mayor en el caso de los animales no estresados e inyectados con LPS. La combinacin de ambos factores aument este efecto de una manera significativa. Significacin estadstica (ANOVA de una va seguido de un test LSD para comparaciones mltiples): a, comparado con el control, animales no estresados inyectados con vehculo; b, comparado con los animales estresados inyectados con vehculo; c, comparado con los animales no estresados e inyectados con LPS; p<0,01.

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Resultados

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DISCUSIN

Discusin

Nuestro grupo, al igual que otros investigadores, ha demostrado la diferente susceptibilidad de las distintas estructuras del SNC al estmulo proinflamatorio inducido por una nica inyeccin intraparenquimal de LPS (Herrera y col., 2000; Kim y col., 2000). Herrera y col. (2000) inyectaron 2 g de LPS en la SN, el estriado, el haz prosenceflico medial y el rafe dorsal, y observaron que la SN era la estructura ms sensible al estmulo inflamatorio en todos los parmetros estudiados. Adems comprobaron que el dao era selectivo del sistema dopaminrgico, ya que ni el sistema GABArgico ni el serotninrgico se afectaban. De igual manera, Kim y col. (2000) observaron que la inyeccin de LPS en el hipocampo, la corteza o la SN de ratas adultas solamente produca neurodegeneracin en el caso de la SN. El anlisis de la cantidad de microgla en cada regin revel que la SN tena la mayor densidad de microgla. En estudios in vitro se observaron que cuando cultivos mezclados de neuronas y gla derivados del hipocampo, la corteza o el mesencfalo se trataban con LPS, los cultivos mesenceflicos eran sensibles al LPS a concentraciones tan bajas como 10 ng/ml y respondan, de una manera dependiente de la dosis, con la produccin de factores inflamatorios y prdida de neuronas dopaminrgicas. En cambio, los

cultivos hipocampales y corticales permanecieron insensibles al tratamiento con LPS a concentraciones tan altas como 10 g/ml (Kim y col., 2000). De acuerdo con las observaciones in vivo, los cultivos mesenceflicos tenan entre 4 y 8 veces ms microgla que los cultivos de las otras regiones. Esta correlacin positiva entre la cantidad de microgla y la sensibilidad a la neurotoxicidad inducida por el LPS tambin fue confirmada por la observacin de que la suplementacin con microgla enriquecida derivada del mesencfalo o la corteza hizo que los cultivos corticales neurona-gla insensibles al LPS se volvieran sensibles a la neurotoxicidad inducida por ste (Kim y

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Discusin

col., 2000). Este comportamiento diferente en funcin de la estructura se justifica, segn Kim y col., por la elevada densidad de microgla que existe en la SN frente a las otras reas cerebrales (Lawson y col., 1990; Kim y col., 2000), microgla que al activarse produce una serie de citoquinas, disminuye factores neurotrficos, secreta neurotoxinas como el NO y adems libera RLOs. Sin embargo, otros autores no estn de acuerdo con esta explicacin, ya que en la SN coexisten distintos tipos de neuronas y, por lo tanto, la mayor densidad de microgla en la SN no sera suficiente para explicar la especial vulnerabilidad de las neuronas dopaminrgicas. Esta gran vulnerabilidad de las neuronas dopaminrgicas al estrs oxidativo puede ser tambin consecuencia de la reduccin de la capacidad antioxidante, del alto contenido en hierro y/o de la DA de la SN (Jenner y Olanow, 1998). Existe un consenso general en cuanto a la accin txica de la DA, como generadora de metabolitos redox incluyendo la semiquinona, la quinona, los zwiteriones 5,6hidroxiindoles y, posiblemente, RLOs. Esta toxicidad de la DA, en teora, tambin acelera la autooxidacin de la DA liberada, lo que genera RLOs in vivo. El aumento de la autooxidacin de la DA y de los RLOs podra iniciar una cascada de estrs oxidativo que llevaran al dao y a la prdida de neuronas en la SN compacta en la EP. Uno de los ltimos estudios realizados por nuestro grupo profundiza en la implicacin de la DA en la vulnerabilidad del sistema dopaminrgico despus de la inyeccin de LPS (de Pablos y col., 2005). En este estudio nuestro grupo mostr que el proceso inflamatorio degenerativo inducido por el LPS depende de la DA, ya que la inhibicin de la tirosina hidroxilasa (TH) por la -metilparatirosina (-MPT) produca una proteccin considerable. Adems, el tratamiento sistmico con L-

DOPA/benserazida, que conlleva a la produccin de DA a pesar de la inhibicin de la

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Discusin

TH por -MPT, revierte el efecto protector producido por esta droga. Por tanto, la implicacin de la DA en este proceso podra explicar la especial susceptibilidad de las neuronas dopaminrgicas de la SN a la inflamacin. Sin embargo, no justifica la diferencia encontrada entre estructuras, ya que la implicacin de los procesos inflamatorios ha sido descrita como importante en otras enfermedades degenerativas y otras estructuras, como por ejemplo en la CPF y el hipocampo en la EA. Respecto a la diferencia en la densidad microglial como causa de las diferencias regionales a la susceptibilidad al estmulo inflamatorio, cabe decir que la densidad de clulas microgliales en la formacin hipocampal no es muy diferente de la de la SN, por lo que parece evidente que otras caractersticas deben explicar las diferencias encontradas. En un estudio reciente, Ji y col. (2008) han estudiado las diferencias regionales en la inflamacin cerebral inducidas por la inyeccin de LPS en la SN y en la corteza, concluyendo tambin que diferentes factores explican las diferencias regionales. Algunos de estos factores incluyen la infiltracin excesiva de neutrfilos y factores del entorno tales como menor densidad astroctica y mayor permeabilidad de la barrera hematoenceflica. Como ya se ha mencionado, se ha demostrado que reas del cerebro tales como el hipocampo no responden a la inyeccin intrahipocampal de LPS (Kim y col., 2000). En el presente estudio confirmamos estas observaciones y adems demostramos que el estrs crnico hace a las neuronas hipocampales altamente sensibles al estmulo proinflamatorio inducido por una nica inyeccin intrahipocampal de LPS. Este efecto combinado del estrs y la inflamacin tambin se ha demostrado en la degeneracin de las neuronas de la CPF, donde el estrs aumenta de forma sinrgica el dao inducido tras una inyeccin intracortical de LPS (de Pablos y col., 2006). Adems, nuestro

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trabajo tambin proporciona evidencias de que el estrs crnico es un suceso clave para activar la microgla reactiva en el hipocampo cuando se combina con un estmulo proinflamatorio. Segn esto parece evidente que deben existir otro tipo de factores que aumenten el efecto de la inflamacin sobre las estructuras cerebrales que son relativamente resistentes a sta, o que sensibilicen a las estructuras frente a la inflamacin, y uno de estos factores podra ser el estrs. El modelo de estrs crnico variable aplicado en nuestro estudio fue validado demostrndose niveles aumentados de corticosterona y progesterona en sangre, ya que dichos niveles aumentan en situaciones de estrs. Tambin fue validado mediante la medida del peso corporal. Los animales estresados no aumentaron de peso a lo largo del tiempo que dur el experimento, lo que tambin es un efecto tpico del estrs (Gamaro y col., 2003).

1. EFECTOS DEL ESTRS EN LAS CARACTERSTICAS INFLAMATORIAS INDUCIDAS POR LA INYECCIN

INTRAHIPOCAMPAL DE LPS.

En este estudio demostramos una importante respuesta neurodegenerativa en el hipocampo de animales estresados despus de la inyeccin de LPS. Debemos subrayar la presencia de clulas en proceso de degeneracin en la regin CA1 de animales no estresados e inyectados con LPS, observada por histofluorescencia con Fluoro Jade B. Sin embargo, el anlisis de las poblaciones neuronales por inmunohistoqumica de NeuN demostr que la inyeccin intrahipocampal de LPS solo no logra alterar la integridad de las poblaciones neuronales en el rea CA1, confirmndose as que la

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Discusin

inyeccin intrahipocampal de LPS induce un dao mnimo. Sin embargo, la inyeccin de LPS en animales estresados induce una prdida de cerca del 50% de las neuronas NeuN positivas en la regin CA1. Adems, la tincin de Nissl muestra una prdida restrictiva de neuronas piramidales CA1, claramente observable por el tamao y la morfologa tpicos que tienen estas neuronas. Estos resultados sugieren un efecto sinrgico deletreo del estrs crnico y la inflamacin en la regin CA1 piramidal. Las interneuronas inhibitorias, en cambio, no se vieron afectadas por la inyeccin de LPS como se demuestra por la hibridacin in situ del ARNm de GAD67. De hecho, no se vieron diferencias en la respuesta al LPS entre los grupos estresados y no estresados. Sin embargo, s se encontr una sobreexpresin del mensajero de GAD67 en las neuronas alrededor del sitio de inyeccin de LPS en los animales estresados. Esta sobreexpresin ya se demostr en las neuronas GABArgicas del hipocampo de la rata y en otras regiones del cerebro relevantes para el estrs tras la exposicin a un estmulo estresante (Bowers y col., 1998). El anlisis a largo plazo demuestra un aumento discreto en el nmero de microgla reactiva OX-6 positiva en respuesta a una nica inyeccin intrahipocampal de 2 g de LPS en los animales no estresados, que no fue estadsticamente diferente de los grupos inyectados con salino. Esta observacin concuerda con la opinin de que el hipocampo es altamente resistente a los estmulos inflamatorios en condiciones normales. Tanaka y col. (2006) observaron que la inyeccin de LPS en la regin CA1 del hipocampo de la rata durante 5 das consecutivos causaba activacin de la microgla e induca dficits en el aprendizaje y la memoria en los animales, pero el anlisis histoqumico no presentaba muerte neuronal bajo estas condiciones experimentales. Sin embargo, nosotros hemos visto que en animales estresados, la inyeccin con LPS desencadena una fuerte activacin de microgla en la formacin hipocampal, 142

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demostrndose as el papel clave del estrs en este suceso. Nuestro estudio tambin revela una fuerte reaccin astroglial en el grupo estresado e inyectado con LPS, con la proliferacin e hipertrofia de astrocitos activados alrededor de la lesin, pero sin prdida de astrocitos GFAP-positivos. La astrogliosis es una reaccin esperada con el uso de inflamgenos. Los experimentos llevados a cabo por PCR a tiempo real muestran un aumento en los niveles de expresin de los ARNm de las citoquinas proinflamatorias IL-1 y TNF-, 6 horas despus del tratamiento con LPS. As, el LPS por s solo indujo una respuesta inflamatoria mnima, nicamente detectada a nivel molecular y poco despus de la inyeccin. Estos datos concuerdan con estudios previos donde se demuestra que cuando se inyecta LPS en la regin CA1 del hipocampo de la rata se produce el aumento de estas citoquinas microgliales durante la fase inicial del tratamiento (Tanaka y col., 2006). En estos estudios tambin se mostraba que las clulas que expresan IL1, despus del tratamiento con LPS, colocalizaban con las clulas microgliales pero no con las clulas astrogliales. En nuestro estudio encontramos que la inyeccin de LPS en animales estresados produce un aumento mayor en los niveles de expresin de IL-1 y TNF- de una manera sinrgica. Para profundizar algo ms en nuestro estudio, se midieron los mediadores proinflamatorios nNOS e iNOS, 24 horas despus del dao. El estrs en s mismo aumenta significativamente la expresin de la protena nNOS de una manera similar a la observada en los animales inyectados con LPS. La expresin de iNOS aumenta en los animales estresados e inyectados con vehculo, pero este aumento es mayor en el grupo no estresado e inyectado con LPS. La produccin de NO inducida por LPS es uno de los factores ms importantes que afectan a la fisiologa y patologa del cerebro. De nuevo podemos observar como el estrs acta sinrgicamente con el LPS para 143

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producir un aumento mximo de ambas enzimas, proporcionando as una nueva evidencia de que el estrs crnico juega un papel clave en la activacin microglial en la formacin hipocampal. Otro resultado interesante es el aumento inducido por el LPS en el nmero de clulas que expresan altos niveles del ARNm de BDNF alrededor del sitio de inyeccin, en animales estresados pero no en ratas control. El BDNF es un factor neurotrfico que pertenece a la familia de las neurotrofinas, un grupo de sustancias relacionadas con los fenmenos de supervivencia neuronal y de diferenciacin en reas especficas del SNC, as como en la regulacin de la conectividad neuronal y la plasticidad sinptica. Se ha propuesto que los axones compiten durante el desarrollo por cantidades limitadas de factores neurotrficos; las neuronas que no fuesen capaces de obtener una cantidad suficiente de estos factores para cubrir sus necesidades, moriran mediante apoptosis (Thoenen y col., 1987; Connor y col., 1998). La expresin de BDNF cambia en respuesta a diferentes estmulos estresantes y depende de la estructura del cerebro estudiada (Pizarro y col., 2004; Tapia-Arancibia y col., 2004; Xu y col., 2004; Rosenbrock y col., 2005). En nuestro experimento, el aumento en el nmero de clulas que expresan el ARNm de BDNF podra ser un efecto sinrgico producido por la toxicidad del LPS y por el estrs, ms que ser producido por el estrs directamente. Puesto que la expresin neuronal de BDNF en la formacin hipocampal est restringida a las capas de clulas piramidales y granulares dentadas, es plausible sugerir el origen microglial de las clulas que expresan el ARNm de BDNF. Confirmando esto, se puede ver una correlacin topogrfica precisa entre la activacin microglial y la induccin de BDNF (las clulas que expresan altos niveles del ARNm de BDNF aparecen justo cerca del sitio de inyeccin). La expresin del ARNm de BDNF en las clulas microgliales despus del dao estriatal ya ha sido demostrado 144

Discusin

(Venero y col., 2002). Estudios previos han demostrado que la expresin de BDNF aumenta en respuesta a un dao (Plunkett y col., 1997; Wong y col., 1997; Liberatore y col., 1997) como resultado de la activacin microglial y de los macrfagos (Batchelor y col., 1999). Esta expresin de BDNF microglial se ha asociado a mecanismos de reinervacin (Wong y col., 1997; Batchelor y col., 1999). Consecuentemente, nuestro estudio sugiere que la expresin del ARNm de BDNF que se ve aumentada en respuesta al tratamiento combinado de estrs y LPS, podra ser una respuesta glial adaptativa para evitar la degeneracin de las neuronas hipocampales. Para profundizar en los mecanismos de accin, nuestro grupo estudi los cambios en la fosforilacin de diferentes MAPKs, considerando su papel en la neurodegeneracin y en la activacin microglial (Borsello y Forloni, 2007; Kumar y col., 2003; Subramaniam y Unsicker, 2006; Zhang y Dong, 2005). Las cascadas de estas protenas son responsables de la transduccin de las seales neurotrficas y se ven activadas tanto por los procesos inflamatorios como por el estrs y el BDNF (a travs de su receptor TrkB). Pero algunas de estas MAPKs, como JNK, p38 y ERK, se sabe que estn asociadas con la aparicin de apoptosis y que juegan un papel importante en la patognesis de la respuesta inflamatoria (Walton y col., 1998). En nuestro experimento, la respuesta de estas tres diferentes MAPKs fue bastante similar en las diferentes condiciones experimentales ensayadas. As, el estrs y el tratamiento con LPS por s solos, aumentan de una manera similar los niveles de fosforilacin de cada una de ellas. Sin embargo, la combinacin de LPS y estrs produce un aumento mayor que cuando acta cada uno por s solo. JNK y p38 juegan papeles importantes en la induccin de la apoptsis y, lo que es ms importante, en la produccin de las citoquinas inflamatorias (Kummer y col., 1997; Kyriakis y Avruch, 2001). Se ha demostrado que la activacin sostenida de las 145

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MAPKs JNK y p38 est asociada con la activacin secuencial de la caspasa 8 y la caspasa 3 y la muerte neuronal y/o la apoptosis en muchos tipos celulares (Borsello y Forloni, 2007; Subramaniam y Unsicker, 2006). Adems, la fosforilacin de JNK y su sustrato, c-jun, se ha relacionado con cambios neurodegenerativos, incluyendo la formacin hipocampal (Herdegen y col., 1997; Minogue y col., 2003). El aumento en la actividad de p38 tambin se ha mostrado como una seal de apoptosis en varios tejidos, incluyendo el hipocampo (Ozawa y col., 1999; Takagi y col., 2000). Estos efectos sirven de fundamento para los procesos degenerativos encontrados en la formacin hipocampal en animales estresados, en respuesta al LPS. Sin embargo, debemos hacer resaltar la relacin ntima entre la activacin de JNK y p38 y la inflamacin. As, la activacin de JNK induce la expresin de proteasas y citoquinas especficas (Karin y Gallargher, 2005). Alternativamente, los inhibidores de p38 inhiben la produccin de TNF- e IL-1 (Kumar y col., 1997) adems de la expresin de otros mediadores/protenas inflamatorias, entre los que se incluyen la iNOS (Ajizian y col., 1999), la COX-2 (Subbaramaiah y col., 1998), la IL-6 (Krause y col., 1998) y la IL-8 (Krause y col., 1998). En el cerebro, ERK est tambin implicado en las respuestas celulares a los estmulos estresantes, incluyendo el estrs oxidativo y la estimulacin del receptor de glutamato (Aikawa y col., 1997) y se sabe que igualmente est implicado en la produccin de NO, la expresin de iNOS y en la secrecin de TNF- estimuladas por LPS. Consecuentemente, la activacin de JNK, p38 y ERK por el estrs, combinado con el tratamiento con LPS, apoya la opinin de que ambas condiciones actan recprocamente para desencadenar un ambiente inflamatorio, principalmente relacionado con la activacin microglial. Esta opinin tambin se corrobora por el anlisis de las correlaciones intra animales que demuestra la existencia de correlaciones significativas entre JNK/ERK, JNK/p38 y p38/ERK. 146

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Para demostrar que la supervivencia celular est comprometida cuando se combina el estrs crnico con el LPS, se analiz la activacin de Akt y CREB. La va de sealizacin de Akt se conoce como una de las vas ms crticas en la regulacin de la supervivencia celular. La activacin de la va de Akt facilita a las clulas una seal de supervivencia para resistir a los estmulos apoptticos (Yao y Cooper, 1995). El factor de transcripcin CREB es capaz de ser fosforilado por Akt, mediando as la expresin de algunos genes antiapoptticos inducida por Akt (Wang y col., 1999). En los animales estresados e inyectados con LPS se ve una fuerte disminucin en los niveles fosforilados de Akt y CREB, lo que confirma el consecuente estado deletreo en el sistema hipocampal bajo estas condiciones. El anlisis de la correlacin intra animal entre Akt y CREB demuestra una interaccin positiva entre ellos. La misma interaccin, pero negativa, se observ entre Akt y su diana GSK-3 (Akt favorece la fosforilacin de GSK-3 en la Ser-9, lo que lleva a su inactivacin), una kinasa que es abundante en el cerebro y que est ampliamente distribuida en las neuronas in vivo (Cross y col., 1995). El inters en esta kinasa es mximo ya que GSK-3 tambin se ha implicado directamente en la regulacin de apoptosis. Adems, GSK-3 activado lleva a una hiperfosforilacin de tau (Johnson y Bailey, 2002), lo que le otorga a esta kinasa un papel en la patologa del Alzheimer (Balaraman y col., 2006). En nuestras condiciones experimentales, el LPS induce de forma significativa la forma activa de GSK-3 en animales no estresados, siendo este aumento significativamente mayor en las ratas estresadas. La forma fosforilada de GSK-3 que hemos determinado en este estudio es la forma activa, la cual tiene la fosforilacin en la tirosina 216. Segn esto, en este caso su fosforilacin no parece ser inducida por Akt, ya que, segn Cross y col. (1995), Akt induce la fosforilacin de GSK-3 en la serina 9, dando lugar a su forma

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inactiva. Esto est de acuerdo con el resultado del anlisis de correlacin intra animal entre Akt/GSK-3, el cual di una interaccin negativa entre ambos. En resumen, la combinacin del estrs crnico y el LPS desencadenan mecanismos que llevan a la activacin de las MAPKs y a la activacin microglial, factores que contribuyen significativamente al deterioro de los sistemas neuronales (Hirsch y col., 2003; Miloso y col., 2008).

2.

EFECTOS

DEL

ESTRS

ACCIN

DE

LOS

GLUCOCORTICOIDES SOBRE EL CEREBRO.

El estrs es capaz de incrementar los daos neuronales en determinadas condiciones; una exposicin previa al estrs social incrementa el volumen infartado y exacerba los dficits cognitivos asociados a la isquemia cerebral transitoria (Sugo y col., 2002; Craft y col., 2005). El mecanismo responsable de los efectos del estrs en los accidentes cerebro-vasculares parece estar relacionado con la corticosterona a travs de sus receptores de GCs para incrementar la subsiguiente muerte neuronal inducida por isquemia (Sugo y col., 2002; Craft y col., 2005). Las consecuencias dainas de la exposicin prolongada a un exceso de GCs se han descrito extensamente en el hipocampo, de manera que despus de un tratamiento con corticosterona se ha demostrado atrofia de las dendritas y prdida neuronal (Sapolsky, 1985; Wolley y col., 1990). Tambin se ha demostrado que en presencia de GCs las neuronas hipocampales llegan a ser ms vulnerables a diferentes daos entre los que se incluyen la isquemia (Sapolsky y Pulsinelly, 1985) y la hipoglucemia (Tombaugh y Sapolsky, 1992; Tombaugh y col., 1992), as como a la exposicin a

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Discusin

antimetabolitos (Packan y Sapolsky, 1990) y a varias neurotoxinas (Hortnagl y col., 1993; Stein y Sapolsky, 1988). De acuerdo con esto tambin se ha visto que la liberacin inducida por estrs de compuestos que incluyen catecolaminas, pptidos y corticosteroides, ejerce una influencia excitatoria en sus clulas diana, particularmente en la formacin hipocampal, la amgdala, la CPF y el septum lateral (Morilak y col., 2005; Joels y col., 2008). Los receptores NMDA estn altamente concentrados en el hipocampo y, de manera fisiolgica, intervienen en los mecanismos de concentracin y memoria. Dentro del hipocampo, la corticosterona induce la liberacin de vesculas que contienen glutamato en proyeccin aferente al rea CA1 (Karst y col., 2005). Sin embargo, los altos niveles de glutamato (por exceso de GCs originado por el estrs) podran causar una sobreestimulacin de entrada de calcio a travs de los receptores NMDA y la prdida de neuronas NMDA-receptivas debido a la excitotoxicidad (Choi y Rothman, 1990; Bal-Price y Brown, 2001). Sobre las propias neuronas y clulas de microgla, el cortisol acta inhibiendo moderadamente el transporte de glucosa, de tal manera que ese ligero descenso compromete la supervivencia celular durante los episodios isqumicos y podra incrementar la vulnerabilidad neuronal al dao a travs de la disminucin de la capacidad energtica (Sapolsky, 1986). Adems, el exceso de GCs origina un descenso en la actividad de los antioxidantes, bloquea la actividad de las protenas neuroprotectoras y limita la disponibilidad de NADPH para responder en los fenmenos de isquemia. Todos estos efectos son ocasionados por el estrs a travs de los GCs. La cuestin es cmo los cambios inducidos por el estrs en el hipocampo hacen a esta rea del cerebro ms susceptible al dao en respuesta a la inflamacin. Una observacin clave en nuestro estudio es la fuerte respuesta de las clulas microgliales al estmulo 149

Discusin

del estrs. En este sentido, los receptores de corticosteroides no son exclusivos de las neuronas, sino que tambin se expresan en las clulas microgliales (Tanaka y col., 1997). Inicialmente se crey que el estrs suprime las respuestas inmunes incluyendo la inhibicin de la microglia debido, en parte, a los efectos de los GCs circulantes (examinado en Biondi y Zannino, 1997). Sin embargo, hay evidencias que sugieren que el estrs y los GCs en realidad aumentan la activacin microglial (Minami y col., 1991; Nguyen y col., 1998; Niino y col., 2000). Nuestros datos apoyan claramente este hecho, al menos en la formacin hipocampal, que es particularmente resistente al estmulo proinflamatorio. Como se ha comentado anteriormente, se consideran diversos factores para explicar estas diferencias regionales. Nuestro estudio sugiere que la presencia de altas densidades de RM y RG debe ser un factor adicional para explicar las diferencias regionales asociadas a la degeneracin relacionada con la inflamacin.

3. PREVENCIN DEL DAO PRODUCIDO POR EL ESTRS.

Todos estos resultados nos permiten sugerir que el estrs crnico induce una situacin especial que conduce al incremento del dao y a la prdida de neuronas. Sin embargo, el dao producido por el estrs se puede prevenir con antagonistas especficos de los GCs. De acuerdo con esto se ha visto que la inhibicin del aumento de los niveles de GCs durante la isquemia preserva la supervivencia celular despus de la isquemia (Krugers y col., 1995, 1998, 1999; Smith-Swintoski y col., 1996). Para demostrar de forma indudable que los GCs circulantes son responsables de los efectos deletreos vistos en nuestro estudio, introdujimos un nuevo grupo de animales estresados que adems fueron tratados con RU486 (mifepristona), un potente

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esteroide sinttico inhibidor de la activacin de los RG y antagonista tambin del receptor de la progesterona, por lo que presenta efectos antiglucocorticoides y antiprogestgenos (Herrmann y col., 1982; Gaillard y col., 1984). El bloqueo de los RG con RU486 tambin previene la prdida de las neuronas de la regin CA1 en las 24 horas despus de un dao por constriccin crnica de nervios (McCullers y col., 2002). Se sabe tambin que RU486 revierte la vulnerabilidad frente al glutamato mediada por GCs en cultivos de lneas celulares de hipocampo de rata (Behl y col., 1997a). En nuestro estudio el tratamiento con RU486 protege significativamente a los animales contra los efectos deletreos observados en los animales estresados e inyectados con LPS, reduciendo la activacin de la microgla, la astrogliosis y la prdida de neuronas NeuN positivas. Esto demuestra que los GCs juegan un papel crtico en la activacin de la microgla en respuesta al LPS, llegando a inducir muerte celular de las neuronas piramidales de CA1. Estos efectos antiglucocorticoides adems podran prevenir la excesiva acumulacin intracelular de calcio en las neuronas (Elliot y Sapolsky, 1993; McCullers y col., 2002), puesto que la activacin concreta de los RG aumenta el influjo de calcio. El efecto protector de RU486 podra ser debido tambin a sus efectos antiglucocorticoides combinado con sus propiedades antioxidantes, ya que segn Behl y col. (1997b) previene de la acumulacin intracelular de perxido y de la muerte celular inducidos por la protena amiloide, el perxido de hidrgeno, el glutamato y neurotoxinas que se han implicado en ciertas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la EA. Estudios previos han mostrado que RU486 previene la oxidacin de la lipoprotena de baja densidad (Parthasarathy y col., 1994) e inhibe la modificacin oxidativa de protenas por perxidos lipdicos preexistentes en sistemas libres de

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clulas (Carpenter y col., 1996). Adems, Behl y col. (1997b) demostraron los efectos antioxidantes neuroprotectores de RU486 en cultivos celulares y cortes organotpicos.

4. POSIBLES EXPLICACIONES AL EFECTO SINRGICO DEL ESTRS Y LA INFLAMACIN EN LOS DAOS PRODUCIDOS EN EL HIPOCAMPO.

Los resultados obtenidos en nuestro experimento sugieren que el dao neuronal en el hipocampo podra ser debido al efecto sinrgico entre el estrs crnico y la inflamacin. Este dao podra deberse al incremento de la activacin de la microgla (con el consecuente aumento en la produccin de citoquinas proinflamatorias y neurotoxinas como el NO, y en la liberacin de RLOs, por parte de la microglia), a la activacin de las MAPKs y al aumento de los niveles de glutamato extracelular, producidos cuando se combinan neuroinflamacin y estrs. Todos estos datos sugieren que la inflamacin, junto con el estrs crnico, induce una situacin especial que lleva a un dao aumentado y a la prdida de neuronas. Estudios recientes han descrito la implicacin de los RLOs en los efectos degenerativos inducidos por la inyeccin intranigral de LPS (Toms-Camardiel y col., 2004). Adems, se sabe que el estrs induce la formacin de RLOs (McIntosh y Sapolsky, 1996). McIntosh y Sapolsky observaron como los niveles fisiolgicos de GCs en cultivos neuronales exacerbaron la toxicidad de compuestos generadores de RLOs y, por tanto, la generacin de RLOs. La hiptesis que propusieron es que los GCs deben exacerbar la toxicidad de neurotoxinas cuyos mecanismos de accin solapan con las vas de los GCs. Esta formacin de RLOs acaba generando un dao oxidativo en varios

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tejidos, incluyendo la sangre (Oishi y col., 1999) y el cerebro, concretamente en los lpidos, protenas y ADN (Liu y col., 1996). La activacin de las cascadas de las MAPKs puede dar lugar a la induccin de apoptosis y la produccin de citoquinas inflamatorias, como ya se ha mencionado anteriormente. En nuestro estudio, el descenso en los niveles fosforilados de Akt y CREB y el aumento en los niveles fosforilados de JNK, p38, ERK y GSK-3, confirman completamente el estado deletreo producido por el LPS y el estrs en el hipocampo. La sobreexcitacin de los receptores de glutamato debido a la inflamacin producida tras la inyeccin de LPS, parece contribuir a la neurodegeneracin en estadios tempranos (Glezer y col., 2003) por excitotoxicidad tras el aumento de la entrada de calcio al interior de la clula. Adems, esta excitacin se ve aumentada con el estrs. En resumen, todos estos resultados sugieren una relacin sinrgica entre el proceso inflamatorio y el incremento de la actividad basal del eje HPA.

5.

POSIBLE

RELACIN

ENTRE

EL

ESTRS

LA

ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.

Estas observaciones podran tener importantes consecuencias clnicas para los pacientes que sufren de EA, ya que la CPF y el hipocampo son las reas del cerebro ms afectadas en esta enfermedad. De acuerdo con esto, en los estadios tempranos en la EA se encuentra microgla activada en el hipocampo (Cagnin y col., 2001), estructura que muestra el mayor grado de cambios neuropatolgicos y de neurodegeneracin

153

Discusin

(Griffin y col., 1998). Cagnin y col. (2001) encontraron una distribucin de microgla activada en el cerebro de pacientes con EA en estados tempranos que no se ve en cerebros de individuos ancianos sanos, por lo que ambos cerebros tienen un patrn distinto a pesar de que comparten algunas de las caractersticas patolgicas. Por otro lado, estudios de imgenes PET de activacin microglial en la EA encuentran una mayor activacin en regiones del cerebro que ms tarde desarrollan atrofia (Cagnin y col., 2001). Estos datos confirman el hecho de que, al igual que en otras enfermedades neurodegenerativas como la EP, el proceso patolgico puede permanecer subclnico y sin reconocerse durante varios aos antes de que se alcance el umbral para la manifestacin clnica (Cagnin y col., 2001). La evidencia convincente que apoya la hiptesis neuroinflamatoria en la EA deriva de la extensa investigacin sobre la relacin entre los AINEs y el desarrollo de la enfermedad. Esta hiptesis sugiere que el empeoramiento funcional y el dao del SNC en la EA es causado por una mayor inflamacin del SNC debido a una activacin de la microgla en el cerebro (Rosenberg, 2005). Hay numerosos estudios epidemiolgicos que indican que las personas que toma agentes atiinflamatorios o que sufren de condiciones tales como la artritis, para las cuales el uso de estos agentes es rutinario, tienen un riesgo considerablemente reducido de desarrollar EA. Sin embargo, estudios epidemiolgicos en personas que sufren de EA, no dan tan buenos resultados. Por esto Rosenberg destaca la importancia de profundizar en los procesos antiinflamatorios y en su deteccin precoz para desarrollar nuevas terapias antiinflamatorias eficaces desde estados tempranos de la enfermedad. Pacientes con EA tambin muestran una actividad basal aumentada del eje HPA, incluyendo un aumento en las concentraciones basales de cortisol en plasma (Belanoff y col., 2001) junto con un mayor ndice de fracaso de adaptacin al estrs 154

Discusin

crnico (Pascualy y col., 2000). Debido a que el estrs crnico est asociado con un aumento en la funcin de los corticosteroides, es plausible la hiptesis de que el estrs crnico debe conferir mayor susceptibilidad al dao neuronal en pacientes que sufren EA. De acuerdo con esto, nuestro estudio proporciona pruebas que refuerzan el hecho de que el estrs crnico debe constituir un factor de riesgo para exacerbar el curso natural de la enfermedad. El hipocampo podra ser menos sensible a la inflamacin que al estrs; sin embargo, un efecto cooperativo entre estos dos procesos podra explicar la relacin sugerida entre estrs y EA. As, Wilson y col. (2005) observaron que una alta susceptibilidad al sufrimiento, a la angustia, lleva a un riesgo aumentado de desarrollar esta enfermedad, de manera que las personas propensas al sufrimiento tenan 2.4 veces ms probabilidad de desarrollar EA que las personas no propensas. Nuestros resultados tambin apuntan la posibilidad de usar RU486 como un tratamiento coadyuvante en la EA ya que esta droga tiene propiedades neuroprotectoras y antioxidantes intrnsecas que tambin podran ofrecer beneficios adicionales. Considerando esto, diferentes autores han propuesto el uso de RU486 como un tratamiento que atrasa la progresin del deterioro cognitivo en esta enfermedad (Belanoff y col., 2002; DeBattista y Belanoff, 2005).

155

CONCLUSIONES

Conclusiones

1. Hemos comprobado que nuestras condiciones experimentales de estrs crnico variable son efectivas, habiendo producido la alteracin del peso corporal de los animales tratados y el aumento de los niveles de corticosterona y progesterona en sangre. 2. El estrs induce la activacin de la microgla en respuesta al LPS, siendo esencial para que se produzca respuesta inflamatoria en el hipocampo. 3. El estrs aumenta de forma considerable el efecto del LPS sobre la poblacin astroglial, produciendo una fuerte astrogliosis pero no prdida de astrocitos. 4. El estrs y la inyeccin de LPS producen de manera sinrgica la degeneracin y la prdida significativa de clulas piramidales hipocampales, mientras que no producen prdida de neuronas GABArgicas. 5. La expresin del ARNm de BDNF en el sitio de inyeccin solo se produce cuando se combinan estrs y LPS. 6. El estrs, el LPS y la combinacin de ambos producen un aumento de los niveles de fosforilacin de las MAPKs JNK, p38, ERK y GSK-3. En cambio, los niveles de fosforilacin de Akt y del factor de transcripcin CREB disminuyen. Todos estos cambios son promotores de la apoptosis. 7. El estrs aumenta los niveles de TNF- e IL-1 inducidos por la inyeccin de LPS en el hipocampo. 8. La adicin de estrs a la inyeccin de LPS aument de forma significativa los niveles de mediadores de la inflamacin tales como iNOS y nNOS. 9. Nuestros resultados parecen indicar que el estrs puede ser un factor de riesgo importante para el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas que tengan como base la prdida de neuronas del hipocampo, como es el caso de la enfermedad de Alzheimer. Los efectos dainos del estrs deben ser tomados en 156

Conclusiones

cuenta en aquellos individuos en los que se puedan dar efectos inflamatorios debidos a la acumulacin de protenas modificadas durante el envejecimiento o por otras causas. 10. El tratamiento con RU486, un potente inhibidor del receptor de glucocorticoides, disminuye los efectos producidos por la combinacin de estrs crnico variable y LPS en el hipocampo en todos los parmetros estudiados. Esto nos permite sugerir la posible utilidad de la inclusin de tratamientos contra el estrs basados en el bloqueo de los receptores de glucocorticoides dentro de las terapias que se aplican en la actualidad en la enfermedad de Alzheimer.

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