UNIVERSIDADE FEDERAL DE LAVRAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
SETOR DE FISIOLOGIA VEGETAL

CURVAS PADRES PARA DETERMINAO DE ACARES REDUTORES, ACARES SOLVEIS TOTAIS, PROTENAS e AMINOCIDOS

GRUPO: Solange Sagio Carolina Lima Meline Santos Sara Dousseau

LAVRAS MG AGOSTO DE 2007

CURVAS PADRES PARA DETERMINAO DE ACARES REDUTORES, ACARES SOLVEIS TOTAIS, PROTENAS e AMINOCIDOS

1 Relatrio de aulas prticas como parte das exigncias da disciplina Laboratrio de Bioqumica e Metabolismo de Plantas ministrada pelo Professor Dr. Luiz Edson Mota de Oliveira rof

GRUPO 2 Solange Sagio Carolina Lima Meline Santos Sara Dousseau

LAVRAS MG AGOSTO DE 2007

SUMRIO

1 INTRODUO......................................................................................................................................................3 2 REFERENCIAL TERICO................................................................................................................................4 2.1 LUZ..............................................................................................................................................................4 2.2 ESPECTROFOTOMETRIA....................................................................................................................................4 2.2.1 Limitaes da Lei de Lambert-Beer....................................................................................................5 2.2.2 Espectrofotmetro..............................................................................................................................6 2.4 CARBOIDRATOS..............................................................................................................................................9 2.4.1 Mtodos para a Quantificao de Acares Solveis totais.............................................................10 2.4.2 Mtodos para a Quantificao de Acares Redutores....................................................................12 2.5 AMINOCIDOS..............................................................................................................................................13 2.5.3 Mtodos de quantificao.................................................................................................................16 2.6 PROTENAS..................................................................................................................................................21 2.6.1 Mtodos para quantificao de protenas totais...............................................................................24 3 MATERIAL E MTODOS................................................................................................................................29 3.1 QUANTIFICAO DE ACARES SOLVEIS TOTAIS PELO MTODO DA ANTRONA........................................................29 3.1.1 Reagentes.........................................................................................................................................29 3.1.2 Obteno da curva padro...............................................................................................................30 3.2 DETERMINAO DE ACARES REDUTORES PELO MTODO DO CIDO DINITROSALICLICO DNS...............................30 3.2.1 Reagentes.........................................................................................................................................30 3.2.2 Obteno da curva padro ..............................................................................................................31 3.3 QUANTIFICAO DE AMINOCIDOS PELO ENSAIO DA NINHIDRINA (YEMM & COCCKING, 1955)................................32 3.3.1 Reagentes.........................................................................................................................................32 3.3.2 Obteno da curva padro...............................................................................................................32 3.4 QUANTIFICAO DE PROTENAS TOTAIS PELO MTODO DE BRADFORD (1976)........................................................33 3.4.1 Reagentes.........................................................................................................................................33 3.4.2 Obteno da curva padro...............................................................................................................34 4 RESULTADOS E DISCUSSO.........................................................................................................................35 4.1 CURVA PADRO DE ACARES SOLVEIS TOTAIS................................................................................................35 4.2 CURVA PADRO DE ACARES REDUTORES .......................................................................................................37 4.3 CURVA PADRO PARA AMINOCIDOS ...............................................................................................................38 4.4 CURVA PADRO PARA PROTENAS TOTAIS..........................................................................................................39 5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS..............................................................................................................42 ANEXOS...................................................................................................................................................................44

1 INTRODUO
As macro e micro molculas so substncias encontradas nos tecidos vegetais e so classificadas em aminocidos, protenas, acares, lipdios, cidos orgnicos, cidos nuclicos e pigmentos. Para se quantificar ou identificar estes grupos de substncias, normalmente feito o fracionamento das amostras dos tecidos vegetais e, com base em reaes qumicas especficas entre o reagente e a estrutura do componente, consegue-se fazer a sua quantificao. Os produtos dessas reaes podem ser quantificados por vrios mtodos, sendo o da colorimetria o mais utilizado. A colorimetria visa determinar a concentrao de uma substncia, em condies bem definidas, pela medida da absoro de luz, tomando como referncia a absoro da substncia numa concentrao conhecida. A principal vantagem desse mtodo de proporcionar um meio simples para determinar pequenas quantidades de substncias. Entre os mtodos colorimtricos destaca-se a espectrofotometria, um processo analtico sensvel, rpido, e cujos resultados so mais precisos, comumente utilizado na determinao da concentrao de constituintes biolgicos. A partir da leitura dos valores de absorbncia, de solues padres de concentraes conhecidas, obtm-se a curva padro ou curva de calibrao. Com esta curva, pode-se determinar a concentrao de uma determinada substncia presente em uma dada amostra. O objetivo desta aula foi a obteno de curvas padres para acares redutores (AR), acares solveis totais (AST), protenas e aminocidos, por meio dos mtodos de DNS, Antrona, Bradford e Ninhidrina, respectivamente.

2 REFERENCIAL TERICO
2.1 Luz
Todas as ondas eletromagnticas se propagam no vcuo com a velocidade da luz (c), com o valor de 3x108 m/s. Em decorrncia deste fato, e sabendo-se a freqncia de uma onda eletromagntica (f), no vcuo, pode-se determinar o comprimento de onda () desta radiao, atravs da seguinte equao: = c/f.. (Bertulani, 2006). Desta forma, pode-se exemplificar as ondas eletromagnticas de maior importncia nas pesquisas e nas aplicaes prticas, em funo do comprimento de onda (propriedade que fornece uma das principais caractersticas da onda): Raios-X (faixa de 10-1 at 10 A), ondas ultravioletas (faixa de 1 at 400 mm), o espectro de luz visvel (faixa de 400 at 700 mm), ondas infravermelhas (faixa de 700 mm at 1 mm) e faixas de radiofreqncia que variam de 20 cm at 105 m (Bertulani, 2006). O espectro de luz visvel pode assumir diversas cores (desde violeta at vermelho), em funo do comprimento de onda (Tabela 1). Sendo o comprimento de onda, a distncia correspondente entre dois pontos sucessivos. Tabela 1 Cores do espectro de luz visvel em funo do comprimento de onda. Cor Violeta 380-440 m Azul 440-490 m Verde 490-565 m Amarelo 565-590 m Laranja 590-630 m Vermelho 630-780 m

2.2 Espectrofotometria
A espectrofotometria fundamental para a pesquisa bioqumica, destacando-se as seguintes situaes: (a) se o ndice de absorbncia a um comprimento de onda especfico for conhecido, a concentrao de um composto pode ser estimada por meio da determinao de sua densidade tica naquele comprimento de onda. (b) medindo-se a taxa de formao ou degradao de um composto que absorva a radiao, o curso de uma reao pode ser determinado e (c) compostos podem ser identificados atravs da determinao de seus

espectros de absoro nas regies visvel e ultravioleta de espectro de energia radiante (Passos, 1996). A espectrofotometria de baseia em duas leis bsicas: a de Lambert e a de Beer. A primeira enuncia: A radiao absorvida diretamente proporcional espessura da soluo analisada. Portanto, temos a equao (Passos, 1996): A = log10 I0/I = as . b em que: I0 = intensidade da radiao incidente I = intensidade da radiao as = ndice de absorbncia caracterstico para a soluo b = comprimento do meio A = absorbncia A segunda lei enuncia: A radiao absorvida diretamente proporcional concentrao do soluto na soluo. Portanto temos a equao: A = log10 I0/I = as . c em que: I0, I, as e A so como na equao anterior e c = concentrao Combinando-se as duas leis, obtm-se a expresso: A = asb.c. O ndice de absorbncia pode ser determinado a partir desta equao, fazendo o seguinte rearranjo, no qual o valor de b pode ser mantido constante atravs do uso de cubetas padronizadas: as = A/cb

2.2.1 Limitaes da Lei de Lambert-Beer

Tomada isoladamente, a relao direta entre absorbncia e concentrao possui poucas excees. Todavia, a adio do componente b (espessura da soluo) em valor

constante (uso de cubetas padronizadas) gera desvios qumicos e interferncia na aparelhagem. Essa lei valida somente para solues diludas. Em altas concentraes (> 10 mM), cada uma das partculas afeta a distribuio de carga de suas vizinhas. Isso pode alterar as caractersticas da soluo em absorver um comprimento de onda especfico. A presena de eletrlitos na soluo modifica o potencial de absoro molar do componente absorvedor de radiao. Esse efeito, contudo, pode ser reduzido por diluies adicionais. Desvios desta lei sero observados quando a substncia analisada se dissociar, associar ou reagir com o solvente, gerando um produto com espectro de absoro diferente da soluo original. Ex: indicadores cido-base. Essa lei observada somente com radiao monocromtica. Quando mais de um comprimento de onda utilizado a relao entre absorbncia e concentrao deixa de ser linear.

2.2.2 Espectrofotmetro
Uma variedade de espectrofotmetro est disponvel comercialmente para medies de absorbncia nas regies ultravioleta, visvel e infravermelha do espectro. Duas variveis na concepo destes aparelhos so fundamentais (Passos, 1996). a) Arranjo das cubetas com relao ao seletor de comprimento de onda As duas cubetas (branco e amostra) podem estar tanto entre a fonte de luz e o seletor de comprimento de onda quanto entre o seletor e o detector. Cada alternativa apresenta desvantagens e vantagens. Na primeira, qualquer fluorescncia na amostra produzir interferncia nas medies. Em compensao, a disperso da radiao causada por componentes da amostra ter pouca importncia, porque ser, posteriormente, rejeitada pelo seletor. J na segunda alternativa, o inverso observado: a fluorescncia ou a fotodecomposio ser minimizada, porque os comprimentos de onda curtos sero removidos antes que possam atingir a amostra. Porm, h a possibilidade de erros por disperso (Passos, 1996).

Na amplitude que nos interessa mais (UV e VIS) a fluorescncia e a fotossensibilidade so problemas mais srios do que a disperso, predominando a concepo em que as cubetas ficam entre o seletor e o detector (Passos, 1996). b) Sincronismo das medies de Io e I e da corrente no escuro Essa caracterstica determina se o aparelho ser de feixe nico ou duplo. Em feixe nico, trs passos so seguidos: (a) zerar o instrumento com o disparador em posio, (b) medir o branco (Io) e (c) medir a amostra (I). Visto que a confiabilidade dos dados vai depender da constncia das caractersticas de operao, as medies tm de ser rpidas (Passos, 1996). Nos instrumentos de feixe duplo, um feixe passa atravs do branco e e o outro atravs da amostra, simultaneamente. Esses aparelhos so de dois tipos (Passos, 1996): O feixe duplo formado pela bifurcao de um nico feixe em espelho em forma de V. Nesse caso, a medio ocorre em dois passos: (a) zerar o aparelho com o disparador em posio e (b) medir a mostra (e o branco). A confiabilidade dos dados depende da constncia da corrente no escuro (quando a radiao no est passando) durante os dois passas. O aparelho no possui disparador. Em vez disso, um espelho giratrio, com movimento de de crculo, direciona a radiao do seletor para o branco e para a amostra, em alternncia. Assim, o feixe duplo na verdade ocorre no tempo e no no espao. Os dois pulsos de radiao so recombinados por um feixe de grade, o qual transmite um e reflete outro para o detector. O espelho de setor comporto por segmentos arredondados, sendo metade abertos, para passagem livre de radiao. Os componentes espelhados possuem moldura metlica, que periodicamente interrompe o feixe direcionado para o detector. Nesse ponto, o microprocessador do detector faz ajustes na corrente no escuro. Por esse processo, o feixe que passa pelo branco atenuado mecanicamente, at que sua intensidade seja igual do feixe que est passando pela amostra. Quando os microprocessadores so capazes de efetuar retroalimentao, o ajuste eletrnico. A medio da amostra, nesse caso, direta e sem necessidade de passos adicionais. Outra vantagem desse modelo a medio contnua, mesmo quando se muda o comprimento de onda. 2.3 Curva padro

Devido existncia de uma proporcionalidade direta entre a concentrao das solues e a quantidade de luz absorvida em comprimentos de onda especficos, a espectrofotometria pode seu usada como um mtodo quantitativo de identificao de substncias. Contudo, faz se necessrio, a obteno de uma relao entre absorbncias registradas em experimentos para diferentes concentraes de solues, elaborando-se retas de calibrao, ou seja, curvas padres (Figura 1). Experimentalmente possvel conhecer os valores de absorbncia de solues conhecidas e assim, utilizando-se as curvas padres, podem-se determinar matematicamente as concentraes destas.

Figura 1 Curva padro para quantificao de acares solveis totais. Procedimento para montagem de uma curva padro (Lehninger, 1984). Quando escolhido um mtodo de dosagem, prepara-se uma soluo padro de concentrao rigorosamente conhecida. Mede-se ento com pipetas de preciso, diferentes volumes desta soluo, completando-se com solvente a um volume final determinado. calculado e anotado a concentrao de cada uma das amostras e ento so feitas duplicatas destas amostras e estas so ento processadas pelo mtodo de dosagem. Um volume igual de solvente processado pelo mesmo mtodo, para servir de branco nesta dosagem (eliminado da leitura o erro causado pela absoro de luz pela cuba, solvente, reagente e impurezas). Orientado pelas indicaes do mtodo empregado, escolhido o comprimento de onda. Se as informaes do mtodo no permitirem a escolha, faz-se o espectro de absoro,
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tomando a precauo de, ao mudar o comprimento de onda, ajustar a absorbncia do branco em zero ou a transmitncia em 100 %. ligado ento, o espectrofotmetro e acertado o zero de transmitncia (corrente de escuro) de acordo com as indicaes especficas do fabricante. Escolhe-se o comprimento de onda, coloca-se o branco na cubeta, e esta introduzida no espectrofotmetro e ento este ajustado para que indique absorbncia zero ou transmitncia 100 %. O branco retirado e substituindo por outra cuba contendo sucessivamente os vrios padres de concentrao. As absorbncias correspondentes a cada concentrao permitiro construir a curva padro para este mtodo.

2.4 Carboidratos
Os carboidratos so as molculas orgnicas mais abundantes na natureza e apresentam funo de reserva energtica e estrutural, para a maioria dos organismos vivos (Raven et al., 2001). Os carboidratos so formados de pequenas molculas chamadas oses. H trs tipos de carboidratos classificados de acordo com o com o nmero de oses (subunidades) que eles contm. Os monossacardeos (acares simples), tais como a ribose, a glicose e a futose, consistem em apenas uma molcula de acar. Os dissacardeos contm duas oses interligadas covalentemente. Exemplos conhecidos so a sacarose, a maltose e a lactose. A celulose e o amido so polissacardeos, os quais contm muitas subunidades ligadas entre si (Raven et al., 2001). Segundo Silva et al. (2003), os monossacardeos, glicose e frutose so acares redutores por possurem grupo carbonlico e cetnico livres, capazes de se oxidarem na presena de agentes oxidantes em solues alcalinas. Os dissacardeos que no possuem essa caracterstica sem sofrerem hidrlise da ligao glicosdica so denominados de acares no redutores. Os aucares redutores e no redutores formam o que chamamos de acares solveis totais. Demiate et al (2002) explica quimicamente como ocorre essa capacidade de reduo dos monossacardeos, atravs de um mecanismo denominado de oxido-reduo que est relacionado com a formao de um enediol, que tem funo redutora em meio alcalino, interconvertendo aldoses e cetoses. A glicose em pH alcalino rapidamente transformada,
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formando um derivado,o enediol, que por sua vez leva a formao de frutose e manose (Penha-Silva et al. 2004), aucares redutores, que ao serem oxidados funo aldnica causa a reduo de ons cpricos. J os dissacardeos como a sacarose, no possuem a capacidade de reduzirem sais de cobre, pois possuem uma ligao glicosdica que compromete a funo anomrica aldedica da glicose e cetnica da frutose. No entanto essa ligao relativamente lbil, podendo ser hidrolisada em meio levemente cido, liberando assim os dois monossacardeos (Demiate et al 2002). Existem diferentes mtodos para a determinao desses aucares e esses mtodos podem se agrupar em titulomtricos (EDTA e Lane-Enyon, Luff-Schoorl), gravimtricos (Musson-Walker) e espectrofotomtricos (ADNS, Antrona, Fenol-Sulfrico, SomogyiNelson) (Silva et al2003). Sendo os espectrofotomtricos os mais conhecidos e dentre eles o Mtodo da Antrona o mais utilizado para a quantificao de aucares solveis totais.

2.4.1 Mtodos para a Quantificao de Acares Solveis totais

a) Mtodo de antrona A reao de antrona se baseia na ao hidroltica e desidratante do cido sulfrico concentrado sobre os carboidratos. Quando a reao levada a efeito com carboidratos com ligaes glicosdicas, estas so hidrolisadas e os acares simples desidratados para furfural ou hidroximetilfurfural. Essas substncias se condensam com a antrona (9,10-dihidro-9oxoantraceno) dando um produto de colorao azul petrleo (Figura 2) (Silva et al., 2003).

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Figura 2 Reao qumica que ocorre no mtodo de antrona. b) Mtodo de Molish Baseia-se corado (Figura 3). na hidrlise cida das ligaes glicosdicas resultando em hidroximetilfurfural e furfural, que se condensam com o -naftol resultando num complexo

Figura 3 Reao de Molish. c) Reao de Seliwanoff Reao para distino entre aldoses e cetoses, que sob ao desidratante de cidos concentrados so transformados em derivados do furfural, que por sua vez se condensam com o resorcinol formando um composto vermelho de composio incerta. A reao com cetoses mais rpida do que com as aldoses permitindo diferenci-los. Este teste especfico para a frutose. Na figura 4 percebe-se a diferena entre uma cetose e uma aldose e direita o exemplo de uma cetose, no caso, a frutose. A B

Figura 4 Diferena estrutural entre uma cetose (A) e uma aldose (B).

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2.4.2 Mtodos para a Quantificao de Acares Redutores

c) Mtodo do cido Dinitrosaliclico (DNS): Em meio alcalino, o AR reduz o DNS a cido 3-amino-5-nitrossaliclico, enquanto que, o grupamento aldedo oxidado a cido aldnico. O cido 3-amino-5-nitrossaliclico um produto de cor laranja (Figura 5), sendo a intensidade da colorao correspondente a concentrao de AR. O hidrxido de sdio promover reao da glicose com o DNS por promover a alcalinizao do meio (Miller, 1959; Silva et al., 2003).

Figura 5 Reao do mtodo do DNS. Alm do DNS, utiliza-se tambm neste mtodo o sal de Rochelle, fenis, bissulfito de sdio e hidrxido de sdio. O fenol otimiza a quantidade de cor produzida e o bissulfito de sdio estabiliza a quantidade de cor obtida na presena de fenol (Miller, 1959). Durante o teste, pode ocorrer a perda de glicose devido oxidao pelo oxignio dissolvido. No trabalho do Miller (1959), quando adicionou sulfito de sdio, observou uma reduo de 70% na destruio da glicose. Eles concluram que esse resultado era devido uma possvel interferncia de outros componentes do reagente na destruio da glicose. Verificaram tambm que o sal de Rochelle parece ser o componente que mais influencia na funo de proteo da glicose pelo sulfito. Na ausncia do sal, a glicose foi mais protegida, o que promoveu um aumento da glicose remanescente. Ento, parece que sulfito atua na proteo da glicose contra a oxidao e o sal de Rochelle importante para controlar essa proteo, evitando uma proteo excessivo do sulfito. Mesmo sem a presena do sulfito ainda possvel obter leitura no ensaio, pois nem toda a glicose sofre oxidao pelo oxignio.

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a) Reao de Benedict Este mtodo consiste na reduo de ons cobre presentes no reagente, o qual reduzido na presena de acares redutores, formando um precipitado de colorao amarela ou vermelha (Cu2O) (Figura 6). O acar, por sua vez, oxidado e polimerizado na soluo alcalina.

Figura 6 Reao do mtodo de Benedict. b) Mtodo de Somogy e Nelson Os glicdeos redutores aquecidos em meio alcalino, transformam-se em enodiis que reduzem o on cprico presente a cuproso. O xido cuproso assim formado reduz a reao arsnio-molibdico a xido de molibdnio de colorao azul cuja intensidade de cor proporcional a quantidade de acares redutores existentes na amostra (Somogy, 1945; Nelson, 1944), sendo a reao quantificada por espectrofotometria a 510 nm (Silva et al., 2003).

2.5 Aminocidos
Os aminocidos so compostos de baixo peso molecular, que contm pelo menos um grupamento amina e uma carboxila (Figura 7). Constituem as unidades estruturais bsicas das protenas, sendo que a diversidade de funes e propriedades desses compostos, surge dos diferentes nmeros e combinaes estruturais de apenas 20 aminocidos (Hermam, 1998).

Figura 7 Estrutura geral de um aminocido. Fonte: Milio & Loffredo (2007).

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As propriedades dos aminocidos so mais tpicas de sais simples do que das aminas ou cidos carboxlicos comuns. So substncias cristalinas que se fundem ou decompes apenas a altas temperaturas e so quase sempre muito solveis em gua, mas relativamente insolveis em solventes orgnicos. Estas propriedades justificam-se porque os aminocidos so sais internos, geralmente chamados zwitterions (do alemo zwitter, hbrido) ou ons dipolares. Apesar de no possuir uma carga real, o zwitterion tem propriedades salinas (Hermam, 1998) (Figura 8).

Figura 8 Forma zwitterinica de um aminocido. Fonte: Milio & Loffredo (2007). Os aminocidos possuem ento, carter anftero, ou seja, quando em soluo podem funcionar como cidos ou como bases. Sendo assim, em soluo, a forma dominante de um aminocido, varia em funo do pH (Figura 9).

Figura 9 Forma predominante do aminocido em soluo: A- extremamente cidas; Bneutras; C- fortemente bsicas. Fonte: Hermam (1998).

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Nas

solues

aquosas

prximas

neutralidade,

um

aminocido

existe

predominantemente como em equilbrio com uma pequena quantidade das formas sem cargas. Em solues fortemente cidas, o grupo carboxila protonado para fornecer um aminocido positivamente carregado, sendo que em bsicas, o prton removido do grupo amnia, formando um negativamente carregado (Hermam, 1998). Os aminocidos sofrem reaes caractersticas das amidas e dos cidos carboxlicos. Os grupos carboxila podem ser, por exemplo, convertidos a steres e os grupos aminas a amidas. Os grupos funcionais das cadeias laterais podem sofrer tambm reaes tpicas, como por exemplo, o grupo tiol da cistena facilmente oxidado a cistina, em uma reao reversvel (Hermam, 1998). As caractersticas da cadeia lateral dos aminocidos so importantes na determinao das estruturas das protenas, podendo ser hidrofbica, cida, bsica e hidroflica (mas no muito cida ou bsica). a) Aminocidos com cadeia lateral hidrofbica Quando possvel, essas cadeias laterais tendem a se colocar em uma vizinhana apolar orgnica, em vez da regio aquosa. So eles, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptofano e metionina. b) Aminocidos com cadeia lateral cida A maioria dos meios fisiolgicos possuem pH aproximadamente neutros (em torno de pH 7), portanto, nessas condies, os grupos carboxila esto essencialmente ionizados a nions carboxilato. So exemplos os cidos asprtico e glutmico, que tem um grupo carboxila em sua cadeia lateral. c) Aminocidos com cadeia lateral bsica Pertencem a este grupo a lisina, que em solues neutras o seu grupo amina est quase completamente protonado; a arginina, que contem uma funo conhecida como grupo guanidino, que tambm suficientemente bsica para estar principalmente protonada em solues neutras; e a histidida, que possuiu o anel imidazlico com um nitrognio

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relativamente bsico, fazendo com que em solues neutras muitas de suas cadeias laterais estejam protonadas. d) Aminocidos com cadeia lateral hidroflica Esses aminocidos possuem cadeia lateral nem cida ou bsica, mas que participam intensamente em pontes de hidrognio. Quando possvel, essas cadeias laterais tendem a se colocar em contato com as molculas de gua em vez de materiais orgnicos apolares. So eles, serina, treonina, tirosina, cistena, asparagina e glutamina.

2.5.3 Mtodos de quantificao

a) Reao com Fluorescamina ou Flurescamina Fluorescamina um composto no fluorescente que reage com aminas formando um produto altamente fluorescente. Embora o fluorescamina seja instvel na gua, seu produto de hidrolise no fluorescente e no interfere com a quantificao dos aminocidos. A reao de Fluorescamina com as aminas ocorre imediatamente. Deve-se utilizar histidina, treonina ou isoleucina como padres para obter a curva padro, porque eles apresentam fluorescncia em intensidades moderadas, sendo melhores as concentraes de 0,3-30 mmol/L. Esse mtodo rpido, barato e sensvel para a medida da concentrao total de aminocidos no nctar (O'Reilly & Lanza, 1995). b) Mtodo da Ninhidrina Constitui-se no mtodo atualmente mais utilizado para a determinao de aminocidos totais. A reao pode ser observada na figura 10.

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Figura 10 Reao da ninhidrina. Fonte: Milio & Loffredo (2007). Na etapa (1), primeiramente, um equivalente de ninhidrina oxidada reduzida em presena de um agente redutor (KCN), perdendo um tomo de oxignio com a formao de uma molcula de gua. Simultaneamente, ocorre uma reao de desaminao oxidativa que remove o hidrognio dois do -aminocido para render um cido -imino. Na etapa (2), o grupo do NH do cido -imino hidrolizado rapidamente formando o cido -ceto com a produo de uma molcula de amnia. Este cido -ceto sofre uma descarboxilao, na etapa (3), em um meio sob aquecimento, para formar um aldedo que tenha um tomo de carbono a menos do que o aminocido original, devido a liberao de uma molcula de CO2. A reao entre um -aminocido e a ninhidrina, envolvida no desenvolvimento da cor descrita pelas cinco etapas seguintes: -aminoacido + ninhidrina oxidada
KCN

ninhidrina reduzida + -aminoacido + H2O

-aminoacido + H2O -ceto acido + NH3 -ceto acido + NH3 aldedo + CO2 Estas primeiras trs etapas produzem ninhidrina e amnia reduzidos, que so requeridas para a produo da cor nas ltimas duas etapas, (4) e (5). A reao total para as reaes acima expressa simplificadamente na reao (6) (ligeiramente sem esclarecimento) como segue:

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-aminoacido + 2 ninhidrina CO2 + aldedo + complexo prpura + 3H2O Neste mtodo, a ninhidrina reagir com o grupamento -amina livre, NH2-CCOOH. Este grupamento contido em todos os aminocidos, peptdeos, ou protenas, contudo, como a reao de decarboxilao prosseguir com um aminocido livre, no acontecer em peptdeos e protenas. Assim, teoricamente somente os aminocidos levaro ao desenvolvimento da cor. Entretanto, deve sempre verificar-se a presena de possvel interferncia dos peptdeos e das protenas, executando testes com branco, especialmente quando tais solues esto prontamente disponveis. Por exemplo, pode-se simplesmente adicionar o reagente do ninhidrina a uma soluo somente contendo protenas e ver se h algum desenvolvimento da cor (Wang, 2007). Este teste pode ser usado rotineiramente para a deteco de glicina na ausncia da outra espcie interferindo. Embora este seja um teste rpido e sensvel para a presena de aminocidos, por causa da no seletividade, no pode ser usado para analisar os ndices individuais relativos de uma mistura de aminocido diferentes. Alm disso, a intensidade da cor desenvolvida dependente do tipo de aminocido. Finalmente, no reage com as aminas tercirias ou aromticas (Wang, 2007). Deve-se considerar, que pelo fato da ninhidrina ser um agente de oxidao forte, cuidados apropriados devem ser tomados para trabalhar com esse composto. especialmente elevada a temperatura sob a qual a reao realizada. O reagente ninhidrina manchar a pele de azul e no pode ser lavado completamente da pele, imediatamente aps o contato. Entretanto, como em toda a outra mancha na pele, a cor sair gradualmente aps cerca de um dia (Wang, 2007). A colorao prpura especfica para todos os -aminocidos, excetuando-se prolina e hidroxiprolina, que possuem amina secundria. Neste caso, o produto da reao possui colorao amarelada, sendo a visualizao dificultada, pois a cor pode ser encoberta pelo azul produzido pelos outros aminocidos (Milio & Loffredo, 2007). Na figura 11 pode ser observada a reao entre prolina e ninhidrina.

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Figura 11 Reao de ninhidrina com aminocidos com grupamento amina secundrio, como a prolina. Fonte: Milio & Loffredo (2007). Este mtodo rpido e pode ser usado com alcotas pequenas, contudo, fornece apenas uma estimativa da concentrao do aminocido porque a quantificao baseada em uma comparao visual com um padro de srie-diludo (O'Reilly & Lanza, 1995). c) Teste xantoprotico Alguns aminocidos contm grupamentos aromticos que so derivados do benzeno. Esses grupamentos submetem-se a reaes especficas do benzeno e seus derivados. Uma dessas reaes a nitrao do anel benznico pelo o cido ntrico. O aminocido fenilalanina contm um anel benznico, mas ele no ativado e no sofre nitrao. Essa reao de nitrao, quando usada para identificar s presena de um anel benznico ativado, comumente conhecida como teste xantoproteico, porque o produto amarelo. A colorao desenvolvida em meio alcalino. Na figura 12 pode ser observada a reao para a tirosina.

Figura 12 Reao de nitrao da tirosina no teste xantoproteico. Fonte: Milio & Loffredo (2007).

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Esta reao uma das reaes que ocorrem quando a soluo concentrada do cido ntrico entra em contato com a pele. A protena na pele contm tirosina e triptofano, que se sofren nitrao e se coram de amarelo. d) Reao de Millon um mtodo especfico para da tirosina, somente aminocidos que contm um grupamento fenlico, uma hidroxila ligada ao anel benznico. Nesse teste, o grupamento fenlico da tirosina primeiramente sofre nitrao pelo cido ntrico em soluo. Esse produto formado reage com os ons mercrio (I) e (II), na soluo e formam um precipitado vermelho ou uma soluo vermelha, ambos so resultados positivos. Protenas que contm tirosina forneceram um resultado positivo. Entretanto, algumas protenas que contm tirosina formam inicialmente a um precipitado branco, que quando aquecidos tornam-se vermelhos imediatamente. Ambos os resultados so considerados positivos. Deve-se atentar que alguns combinam com um grupamento fenlico dando um teste positivo, assim devem estar certos que a amostra que se est testando no contem nenhum fenol, excepo daqueles presena na tirosina (Milio & Loffredo, 2007). e) Teste Hopkins-Cole especfica para a quantificao do aminocido triptofano, somente aminocidos que contm um grupamento indlico. O anel indlico reage com o cido glioxlico na presena de um cido forte para formar um produto cclico violeta (Figura 13).

Figura 13 Reao do teste de Hopkins-Cole. Fonte: Milio & Loffredo (2007).

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f) Teste nitroprussiato Quantifica especificamente o aminocido cistena, somente aminocidos que contm um grupamento sulfidril (-SH). Esse grupamento reage com o nitroprusside em soluo alcalina, formando um complexo vermelho (Figura 14).

Figura 14 Reao do teste de nitroprussiato. Fonte: Milio & Loffredo (2007).

2.6 Protenas
Protenas so polmeros de aminocidos (item 2.5), encontrados em todas as partes das clulas, representando cerca de 50 a 80 % do peso seco celular. A unio de aminocidos para formar uma molcula protica se d de tal modo que o grupo cido de um aminocido combina com um grupo bsico do aminocido adjacente, com perda simultnea de uma molcula de gua. A unio NH e CO- conhecida como ligao peptdica (Figura 15), dando origem a uma cadeia polipeptdica. As protenas so, portanto, polmeros de aminocidos, ligados entre si por ligaes peptdicas (Alberts et al., 1997).

Figura 15 Ligao peptdica. Fonte: Milio & Loffredo (2007). Um polipeptdio ou uma protena pode apresentar-se em nveis diferentes de estruturao (Figura 16), que so mantidos por diversos tipos de ligaes e/ou interaes entre vrios grupos funcionais dos aminocidos que as compem. As protenas podem ser encontradas na forma primria, secundria, terciria ou quartenria (Lehninger, 1984).

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Figura 16 Diferentes nveis estruturais das protenas. - A estrutura primria a seqncia linear dos aminocidos que formam cadeias unidas por ligaes peptdicas. A seqncia de aminocidos de uma protena constitui o nvel mais importante da molcula, uma vez que as estruturas seguintes esto condicionadas ao ordenamento dos aminocidos neste cordo. - A estrutura secundria a organizao espacial dos aminocidos que encontram-se prximos na cadeia polipeptdica. Este arranjo poder ser feito em forma de uma -hlice, modelo onde a cadeia est enrolada em torno de um cilindro imaginrio e estabilizada por pontes de hidrognio entre o grupo amino situado quatro resduos a frente; ou a conformao denominada folha -pregueada, onde os aminocidos assumem uma configurao de uma folha de papel, uma vez que a molcula dobra-se em um vai-e-vem, estabilizada por pontes de hidrognio entre grupos amino e carboxila de cadeia diferentes. - A estrutura terciria a forma espacial pela quais as estruturas secundrias iro mais uma vez, dobrarem e associarem-se, de forma a constituir um novelo ou uma fibra. Ela se forma devido s interaes entre aminocidos distanciados da cadeia e que se aproximam por causa da estrutura secundaria, interagindo de acordo com os seus grupos R. uma estrutura altamente compactada e enovelada. Esta estrutura vai se consolidando logo aps a biossntese da protena e corresponde a sua forma ativa. As interaes possveis entre os radicais dos aminocidos que determinam a associao terciria so: atrao inica entre os grupos NH3+ e COO-, pontes de hidrognio entre grupos R, Fora de Van der Walls, interaes hidrofbicas dos grupos R que se torcem para dentro e pontes dissulfdricas. Os fatores externos que podem alterar provisoriamente ou de forma definitiva, a estrutura

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terciria das protenas so chamados de agentes desnaturantes. A desnaturao de uma protena portanto, uma perda de sua atividade uma vez que sua forma ativa foi alterada. - A estrutura quartenria prpria de protenas oligomricas, ou seja, aquelas compostas por mais de uma cadeia polipeptdica, que se associam por pontes de hidrognio e pontes dissulfdicas.As protenas podem ser classificadas (De Robertis et al., 1985 e Alberts, et al., 1997): a) Quanto conformao - Fibrosas: so cadeias polipeptdicas arranjadas em forma de longos cordes ou folhas, sendo geralmente insolveis nos solventes aquosos e possuem pesos moleculares muito elevados. Geralmente possuem funo estrutural. Algumas protenas fibrosas, no entanto, possuem uma estrutura diferente, como por exemplo, as tubulinas que so formadas por mltiplas subunidades globulares helicoidalmente dispostas. Ex: Colgeno, Fibrona da seda, Expansina. - Globulares: so cadeias polipeptdicas dobradas sobre si mesmas de maneira compacta, resultando em uma forma esfrica ou globular, sendo geralmente solveis nos solventes aquosos. Em sua maioria possuem funo fisiolgica. Ex: enzimas (Figura 17).

Figura 17 Esquemas de protenas globulares e fibrosas. b) Quanto funo - Catalizadoras: enzimas; - Reconhecedoras: presentes nas membranas biolgicas; - Defesa: anticorpos; - Estrutural: colgeno, elastina; - Reserva: sementes, casena do leite; - Transporte: hemoglobina; - Contrcteis: actina, tubulina e Hormnios. c) Quanto solubilidade

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- Albuminas: so protenas solveis em gua; - Globulinas: so solveis em solues salinas; - Prolaminas: so geralmente solveis em lcool; - Grutelinas:: so protenas solveis em solues cidas e bsicas diludas. d) Quanto composio - Holoproteinas: so aquelas que possuem apenas aminocidos em cadeia funcional; - Heteroproteinas: so aquelas que possuem outros compostos alm da cadeia polipeptdica. Ex: glicoprotenas, ferroprotenas e lipoprotenas.

2.6.1 Mtodos para quantificao de protenas totais

Como visto anteriormente, as protenas desempenham papis extremamente importantes, na maioria dos processos biolgicos, por isso, o desenvolvimento de metodologias para determinar esses compostos tem, cada vez mais, se tornado de fundamental relevncia em vrias reas do conhecimento (Zaia et al., 1998). So encontrados na literatura, diferentes mtodos para a quantificao de protenas. A maioria desses mtodos tem como base: a) na propriedade intrnseca das protenas para absorver luz no UV, b) na formao de derivados qumicos, e c) na capacidade que as protenas tm de se unir a certos corantes. Os mtodos para a determinao da concentrao de protenas totais so muito variados, no entanto, as metodologias mais utilizadas so as espectrofotomtricas no ultravioleta e no visvel. Ao longo dos anos, muitos mtodos espectrofotomtricos, tm sido propostos para a determinao de protenas totais, porm no existe uma metodologia considerada de uso universal para todos os meios. Os mtodos geralmente mais utilizados so o do Biureto, de Lowry, de Bradford, de Smith e de absoro de protenas no ultravioleta (Zaia et al., 1998): a) Mtodo de Bradford Um procedimento simples para a determinao da concentrao da protena nas solues a tcnica de Bradford que foi descrito primeiramente por Bradford em 1976. O mtodo de Bradford uma tcnica para a determinao de protenas totais que utiliza o corante de Coomassie brilliant blue BG-250 (Figura 18). Este mtodo baseado na interao entre o corante BG-250 e macromolculas de protenas que contm aminocidos de

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cadeias laterais bsicas ou aromticas. No pH de reao, a interao entre a protena de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilbrio do corante para a forma aninica, que absorve fortemente em 595 nm.

Figura 18 Coomassie brilliant blue. Na literatura no existem muitas substncias que so citadas como interferentes no mtodo de Bradford. Estes interferentes normalmente reagem com as protenas impedindo a reao com o corante BG-250 ou reagem com o corante causando aumento na absorbncia. Os mtodos de eliminao destes interferentes variam conforme o caso, no entanto, Zaia et al. (1998) recomenda a precipitao das protenas com cido tricloroactico. Substncias que interferem na determinao de protenas totais pelo mtodo de Bradford: Tolbutamida, Uria, Cloreto de sdio e potssio, Detergentes (Triton X- A 100, SDS, Tween-20), Ciclodextrinas, Polifenis e polifenis oxidases, 2-mercaptoetanol + guanadina, Glicerol, Lipdios, Cloropromazina e Fluoreto. b) Mtodo de Biureto Este mtodo foi proposto inicialmente por Autenrieth, em 1915, porm sofreu posteriormente modificaes por diversos autores sendo, atualmente mais utilizada a proposta metodolgica de Gornall. O mtodo se baseia na reao do reativo do Biureto, que constitudo de uma mistura de cobre e hidrxido de sdio com um complexante que estabiliza o cobre em soluo

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(Figura 19), sendo o tartarato de sdio o recomendado por Gornall et. al. O cobre, em meio alcalino, reage com protenas formando um complexo quadrado planar com a ligao peptdica. O mtodo do Biureto, portanto, tem como base o desenvolvimento de uma cor violeta em soluo aquosa resultante da reao da protena com o reagente mencionado. O produto de reao apresenta duas bandas de absoro, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na regio de 270 nm aumentarem em seis vezes a sensibilidade do mtodo do Biureto, a banda na regio de 540 nm a mais utilizada para fins analticos, porque diversas substncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na regio de 270 nm causando muita interferncia no mtodo.

Figura 19 Ligao do Cobre com Hidrxido de sdio. Este mtodo pode sofrer interferncia de substncias que possam reagir com os ons cobre II. Existem na literatura vrios mtodos para se eliminar estas substncias, porm o recomendado por Zaia et al. (1998) a precipitao das protenas com cido tricloroactico e posterior solubilizao para determinao das mesmas. Algumas substncias que interferem na determinao de protenas totais pelo mtodo de Biureto: Bilirrubina, Amnio, Lipdios, Hemoglobina, Dextran-40 e 70, Peptdeos e aminocidos livres (His, Ser, Thr), Melanina, Tampo tris-HCl e glicose, Lactose e Amido. c) Mtodo de Smith ou BCA

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Este mtodo foi proposto por Smith, tambm conhecido por mtodo do cido bicinchoninico (BCA 4,4'-dicarboxi-2,2'-biquinolina). O princpio do mtodo baseia se na reao de cobre I com protenas, em meio alcalino, produzindo cobre II e formando um complexo com o BCA, que absorve fortemente na regio de 560 nm. No entanto, em um estudo sobre o papel catalisador do cobre, em meio alcalino, na reao entre protenas e o reativo de Folin-Ciocauteau, detectou-se a formao de um intermedirio de cobre III com peptdeos, porm no se detectou cobre I, como estabelecido por Smith, devendo, portanto, este mecanismo ser mais bem estudado para se estabelecer qual ou quais intermedirios de cobre so formados. Os interferentes, em potencial, do mtodo de Smith so aquelas substncias que reagem com os ons cobre (reaes de xido-reduo, formao de complexos, precipitao) ou com o reativo de BCA. Os mtodos de eliminao destes interferentes variam conforme o caso e em muitas situaes, Zaia et al. (1998), recomendam a precipitao das protenas com cido tricloroactico. Interferentes do mtodo de Smith: Acares em geral, EDTA, Lipdios, Sulfato de amnio, Mercaptoetanol e dithiothreitol, Perxido de hidrognio, Vitamina C e paracetemol, Cloropromazina e Penicilinas. d) Mtodo de absoro no Ultravioleta Este mtodo baseado no fato de que as protenas mostram absoro na regio de 280 nm e na regio abaixo de 220 nm, sendo a primeira devido a diversos aminocidos (fenilalanina, cistena, cistina, metionina, triptofano, histidina e tirosina), e a segunda devido ligao peptdica. No entanto, em 280 nm, em pH neutro, somente os aminocidos triptofano, tirosina e cistina possuem uma absortividade molar significativamente grande. Este mtodo est sujeito a muitos interferentes, sendo que qualquer substncia que apresente uma banda de absoro na regio de leitura um interferente em potencial. e) Mtodo de Lowry O mtodo de Lowry foi descrito primeiramente por Lowry et al. (1951), sendo esta a metodologia mais utilizada para a determinao de protenas. O princpio do mtodo baseiase numa mistura contendo molibdato, tungstato e cido fosfrico, (reagente Folin-

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Ciocalteau), que sofre uma reduo quando reage com protenas (Fig.7), na presena do catalisador cobre (II), e reduz um composto com absoro mxima em 750 nm. Chou e Goldstein e Legler et al. estudaram extensivamente o mecanismo de reduo do reagente de Folin-Ciocalteau por protenas, peptdeos ou aminocidos. Estes autores sugerem que esta reduo ocorra diretamente atravs das cadeias laterais de alguns aminocidos (tirosina, triptofano, cistena, asparagina e histidina), que contribuem com quatro eltrons, ou atravs da retirada de dois eltrons de cada unidade tetrapeptdica dos peptdeos e protenas, que facilitada pela formao do quelato entre o cobre (II) e peptdeos/protenas. O mtodo de Lowry para a determinao da concentrao da protena usado extensamente, porm pode ser sujeito interferncia por muitas substncias e produtos qumicos como, por exemplo: citrato, cloreto de csio, tampes, EDTA, barbital, TRIS e fenol.

Amarelo Figura 20 Reao do mtodo de Folin-Ciocalteau.

Azul

Apesar do mtodo de Lowry apresentar uma grande sensibilidade para protenas, o mesmo possui algumas desvantagens como estar sujeito a diversos interferentes. Na literatura so encontradas muitas substncias interferentes e estas normalmente causam aumento na absorbncia do branco, diminuio da absortividade especfica ou formao de algum tipo de precipitado. Para a eliminao da maioria dos interferentes deste mtodo, sugere-se a precipitao das protenas utilizando-se: cido tricloroactico e co-precipitantes misturas de metanol-clorofrmio-gua ou hexano-isopropanol. Se o interferente for composto de enxofre, como mercaptanas, por exemplo, aconselha-se o uso de iodo acetato ou a secagem a vcuo da amostra, se for lipdeo ou melanina sugere-se a adio de detergentes.

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Os interferentes mais comuns so: Compostos fenlicos, Lipdios, Detergentes, cido rico, Guanina e xantina, Sulfato de amnio, Melanina, Bilirrubina, 4-metilumbeliferona, Mercaptanas e cistena, Tampo tris-HCl, Acares e RNA.

3 MATERIAL E MTODOS
As atividades foram realizadas no Laboratrio de Nutrio e Metabolismo de Plantas, do Departamento de Biologia/Setor de Fisiologia Vegetal, na Universidade Federal de Lavras, no segundo semestre de 2007. Para determinao de AR, AST e AA, cada integrante do grupo ficou responsvel por um ponto da curva, no havendo repeties dos tratamentos. Apenas para a quantificao de protenas totais pelo mtodo de Bradford (1976), cada um dos 4 alunos, componentes desse grupo, preparou 1 tubo dos 5 tubos contendo concentraes crescentes de BSA, alm do branco. Apenas nesse ensaio realizamos 2 repeties, ditas de laboratrio, para cada concentrao, totalizando 41 tubos. As curvas padres dos dados de absorbncia em funo das diferentes concentraes, foram determinadas no Windows Excel com o uso do grfico de disperso, sobre o qual aplicou-se regresso linear. Como critrio de qualidade de ajuste foi utilizado o coeficiente de determinao (R2). A frmula y = ax servir para determinar a concentrao das substncias extradas de um tecido vegetal, sendo y o valor da absorbncia e x a concentrao da biomolcula a ser determinada.

3.1 Quantificao de acares solveis totais pelo mtodo da antrona

Foi utilizado o protocolo original do mtodo de Antrona (Yemm & Willis,1954), sem nenhuma modificao, como descrito abaixo:

3.1.1 Reagentes
Reagente Antrona; H2SO4 concentrado; Glicose 60 g/mL ou 0,333 mM.

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Preparo do reagente Antrona Adicionou-se 40 mg de antrona a 1 mL de gua destilada e aps, 20mL de H2SO4 concentrado, sendo que esse ultimo passo foi realizado na capela. OBS: Este reagente deve ser preparado na hora do uso e sob resfriamento.

3.1.2 Obteno da curva padro

Conforme descrito abaixo (Tabela 2), foram adicionados aos tubos seqencialmente, a soluo de glicose, a gua e o reagente antrona, sendo que esses passos foram realizados com os tubos parcialmente imersos em uma bacia contendo gua com gelo. Em seguida, esses tubos foram agitados em vrtex e depois levados ao banho-maria 100C, por 3 minutos. Retiramos do banho-maria e levamos para o resfriamento em gelo. A leitura foi feita no espectrofotmetro U.V., com = 620nm. Tabela 2 Procedimento para a obteno da curva padro de AST. Tubos Glicose (60g/mL) 1 0,0 2 0,1 3 0,2 4 0,4 5 0,6 6 0,8 7 1,0 Volume reacional = 3 mL gua 1,0 0,9 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 Antrona 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 g AST 0 6 12 24 36 48 60

OBS: Para a quantificao de AST em tecidos vegetais pode-se usar alquotas de at 1mL.

3.2 Determinao de acares redutores pelo mtodo do cido dinitrosaliclico DNS

3.2.1 Reagentes
cido Dinitrosaliclico (DNS) NaOH 2N;

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Tartarato duplo de Sdio e Potssio (Sal de Rochelle); Glicose ou uma mistura de frutose e glicose (10 mM).

Preparo do reagente DNS Adicionar 50 mL de hidrxido de sdio (NaOH) 2N a 2,5 g de DNS e aproximadamente 125 mL de gua destilada e agitar at dissoluo. Posteriormente, adicionar 75g do sal de Rochelle e completar o volume da soluo para 250 mL. Este reagente instvel na presena de luz e CO2.

3.2.2 Obteno da curva padro

Conforme a tabela 3, nos tubos de ensaio, foram adicionados a soluo de glicose e a gua e em seguida o reagente DNS. Posteriormente, todos os tubos foram agitados em agitador tipo vrtex e levados ao banho-maria a uma temperatura de 100C por um perodo de 5 minutos, para que houvesse o desenvolvimento da colorao. Em seguida, os tubos foram retirados do banho-maria, resfriados temperatura ambiente e todos tiveram seus volumes completados para 5 mL com gua destilada, com uma nova agitao sendo realizada. Tabela 3 Procedimentos para obteno da curva padro de acares redutores. Tubos 1 2 3 4 5 Glicose (10 mM) (mL) 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 gua (mL) 0,75 0,65 0,55 0,45 0,35 Antrona (mL) 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 mol AR 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0

Aps o resfriamento, a leitura foi realizada em espectrofotmetro U.V. com comprimento de onda de 540 nm. Para a quantificao de acares redutores em tecidos vegetais, o procedimento de extrao mais indicado deve ser seguido e posteriormente, alquotas de at 0,75 mL do extrato devem ser utilizadas.

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3.3 Quantificao de aminocidos pelo ensaio da ninhidrina (Yemm & Coccking, 1955)

3.3.1 Reagentes
Tampo citrato de sdio 0,2 M, pH= 5,0; Ninhidrina 5% em Metil Celosolve; KCN 2% em Metil Celosolve (2 mL de KCN 0,01 M em 100 mL de metilcelosolve); Etanol 60% (v/v) Glicina ou qualquer outro aminocido em concentrao 0,1 mmol/mL.

Preparo dos reagentes Reagente A Tampo Citrato de Sdio 0,2 M pH 5,0 Para o preparo deste tampo, procedeu-se da seguinte forma: pesou-se 1,47 g de citrato de sdio, que foi dissolvido em 25 mL de gua destilada com posterior aferio do pH. Reagente B - Ninhidrina 5% em Metil Celosolve Pesou-se 0,5 g de ninhidrina, que foi dissolvida em 10 mL de metil celosolve (etileno glicol monoetil ter). Reagente C KCN 2% em Metil Celosolve Para o preparo deste reagente, pesou-se 0,065 g de Cianeto de Potssio (KCN), o qual foi dissolvido em gua destilada e o volume completado para 100 mL. Posteriormente, um volume de 2 mL dessa soluo foi transferido para um balo volumtrico e o volume foi completado para 100 mL com metil celosolve. OBS: Estes reagentes podem ser armazenados em embalagens separadas, sob refrigerao, por um perodo de at 30 dias.

3.3.2 Obteno da curva padro

Conforme a tabela 4, nos tubos de ensaio, foram adicionados a Glicina, a gua e os reagentes A, B e C. Em seguida, todos os tubos foram agitados em agitador tipo vrtex e levados ao banho-maria a uma temperatura de 100C por um perodo de 20 minutos para que houvesse o desenvolvimento da colorao.

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Tabela 4 Procedimento para obteno da curva padro de aminocidos. Tubos Glicina (0,1 mol/mL) gua (mL) Reagentes A+B+C (mL) 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 1,7 Etanol 60% (mL) 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 1,3 mol de aa 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10

(mL) 1 0,0 1,0 2 0,2 0,8 3 0,4 0,6 4 0,6 0,4 5 0,8 0,2 6 1,0 0,0 A= 0,5 mL; B= 0,2 mL; C= 1,0 mL * Volume reacional = 4 mL

Terminado os 20 minutos, os tubos foram retirados do banho-maria, esfriados a temperatura ambiente e tiveram os seu volume acrescidos por 1,3 mL de etanol 60%, com uma nova agitao sendo realizada. A leitura foi realizada em espectrofotmetro U.V. com comprimento de onda de 570 nm. Para a quantificao de aminocidos em tecidos vegetais, o procedimento de extrao mais indicado deve ser seguido e posteriormente, alquotas de at 1,0 mL do extrato devem ser utilizadas.

3.4 Quantificao de protenas totais pelo mtodo de Bradford (1976)

3.4.1 Reagentes
Comassie Blue G-250 H3PO4 etanol; Soro Albumina Bovina (BSA) (1mg/mL ou 10 g/0,1mL).

Preparo dos reagentes Comassie-blue G-250

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Dissolver 100 mg de Comassie blue em 50 mL de etanol 95%. Adicionar 100 mL de H3PO4 85% e completar para 1 L. O cido fosfrico deve ser adicionado ao Comassie dissolvido em etanol e nunca o contrrio. Deixar overnight com agitao constante e filtrar. Dessa forma, as concentraes finais sero: 0,01% de Comassie, 8,5% de cido fosfrico e 4,7% de etanol. Soluo Padro de Albumina Bovina Dissolveu-se 12 mg de BSA em 12 mL de gua destilada. Essa soluo pode ser armazenada em geladeira.

3.4.2 Obteno da curva padro

Conforme a Tabela 5, foram adicionados os reagentes, seqencialmente, o padro BSA, o reagente Comassie e a gua, atp o volume reacional de 5,1 mL. Posteriormente, estes tubos foram agitados (em agitador do tipo vrtex) e conduzidos ao espectrofotmetro U.V. para a realizao das leituras a um comprimento de onda de 595 nm. Para obter uma leitura mais precisa deve-se proceder a leitura de 5 a 20 minutos aps a adio do corante.

Tabela 5 Procedimento para obteno da curva padro de protenas utilizando-se como padro BSA (1 mg/mL). Tubos BSA (1 mg / mL) gua (mL) 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02 0,00 Comassie Blue G-250 (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 g protena 0 20 40 60 80 100

(mL) 1 0,00 2 0,02 3 0,04 4 0,06 5 0,08 6 0,10 * Volume reacional = 5,1 mL

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Erros de pipetagem podem ser minimizados utilizando-se alquotas de 0,1mL retiradas de solues de 20, 40, 60, 80 e 100 g de BSA/0,1mL. Se assim for, a curva seguir o padro mostrado na Tabela 6. Tabela 6 Procedimento para obteno da curva padro de protenas utilizando-se como padro solues diludas de BSA. Tubos BSA (1 mg / mL) (mL) 1 0,1 de gua 2 0,1 3 0,1 4 0,1 5 0,1 6 0,1 * Volume reacional = 5,1 mL Comassie Blue G-250 (mL) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 0 20 40 60 80 100 g protena

A quantificao de protenas em extratos vegetais pode ser feita usando-se volumes iguais do extrato e de TCA (10%) que posteriormente deve ser centrifugado e o pellet ressuspendido com NaOH 0,1N. Aps, retirar uma alquota de 0,1mL e proceder conforme recomendaes da curva padro.

4 RESULTADOS E DISCUSSO
4.1 Curva padro de acares solveis totais
Na tabela 5 esto expressos os valores de absorbncia em funo de concentraes crescentes de acares solveis totais. O reagente antrona utilizado possui uma colorao amarelada que se tornou esverdeada, medida que a alquota de glicose foi aumentada, permitindo assim a obteno da curva padro para quantificao de aucares solveis totais.

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Tabela 5 Dados de absorbncia obtidos a 620 nm para a dosagem de acares solveis totais pelo mtodo da antrona. Tubos 1 2 3 4 5 6 Absorbncia (620 nm) 0,0873 0,1791 0,2921 0,7309 0,5039 0,7116

Com base na curva padro obtida, nota-se que os pontos no tiverem um ajusto muito bom a reta, expressos pelo baixo valor de R2 (Figura 21).

0,8 Absorbncia (620 nm) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 1

y = 0,1213x R2 = 0,8442

Acares Solveis Totais ( g)

Figura 21 Curva padro de acares solveis totais obtida a partir das leituras de absorbncias em espectrofotmetro a 620 nm pelo mtodo da Antrona. Este erro pode-se justificar pelo fato de que cada aluno representou apenas um ponto da curva, portanto as diferenas na pipetagem no foram diludas em mdias. Este fato no ocorreu nos relatrios anteriores, onde cada participante realizou mais de uma repetio.

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4.2 Curva padro de acares redutores

Na tabela 6 esto expressos os valores de absorbncia em funo de concentraes crescentes de acares solveis totais. O reagente utilizado que possui uma colorao amarela, pouco se alterou no branco, mas tornou-se avermelhado medida que a concentrao de acares redutores aumentava.

Tabela 6 Dados de absorbncia obtidos a 540 nm para a quantificao de acares redutores pelo mtodo do DNS. Tubos 1 2 3 4 5 Absorbncia 0 0,3045 0,5177 0,7638 0,9527

Com base na curva padro obtida (Figura 22), pode-se observar que os valores tiveram um bom ajuste a reta, correspondendo com o esperado, onde um aumento da concentrao de acares redutores acarretaria um aumento na absorbncia, porm no corresponderam com os resultados obtidos pelos grupos nos relatrios anteriores.

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1,2 Absorbncia (620 nm) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 1 2 3 4 5 Accar redutor ( mol) y = 0,2481x R2 = 0,99

Figura 22 Curva padro de acares redutores obtida a partir das leituras de absorbncias em espectrofotmetro a 540 nm pelo mtodo do DNS. No presente estudo foi encontrado um valor mnimo de absorbncia de 0,3045 e um mximo de 0,9527, enquanto que nos relatrios anteriores os valores encontrados foram menores, um valor mnimo de 0,1748 e um mximo de 0,6617. Nos grupos anteriores foram feitas 3 repeties para cada tratamento, o que minimiza o erro. O mesmo no foi feito no presente trabalho, onde cada aluno fez apenas uma repetio de um tratamento.

4.3 Curva padro para aminocidos

Na tabela 7 esto expressos os valores de absorbncia em funo de concentraes crescentes de aminocidos totais. O reagente utilizado possui uma colorao violeta, que pouco se alterou no branco, mas tornou-se mais intensa a medida em que se aumentou as concentraes de glicina. Pode ser observado que medida que se utiliza maiores concentraes de glicina, obtm-se valores crescentes de absorbncia. Tabela 7 Valores de absorbncia obtidos a 570 nm para a quantificao de aminocidos totais pelo mtodo na ninhidrina.

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Tubos 1 2 3 4 5 6

Absorbncia 0 0,1149 0,2081 0,3913 0,5093 0,5771

A curva padro para aminocidos apresentou um bom ajuste a regresso linear, sendo o valor de R2 de aproximadamente 99%. Foi observada ainda, uma relao linear positiva entre concentraes de glicina e valores de absorbncia (Figura 23).
0,7 Absorbncia (620 nm) 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 Aminocido ( mol) y = 6,0252x R2 = 0,987

Figura 23 Curva padro de aminocidos, obtida a partir da mdia de absorbncia das leituras em espectrofotmetro a 570 nm pelo mtodo da ninhidrina.

4.4 Curva padro para protenas totais

Os valores de absorbncia das 6 diferentes concentraes de BSA para as 4 repeties, bem como as repeties de laboratrio, esto expressas na tabela 8. Tabela 8 Valores de absorbncia em funo das diferentes concentraes de BSA.
Protena Sara Solange Meline Carol

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(g) 0 20 40 60 80 100

R1 0,0000 0,2223 0,4171 0,6370 0,7908 0,9675

R2 0,0000 0,2342 0,4407 0,6189 0,8023 0,9569

R1 0,0000 0,1936 0,4118 0,7199 0,9648 1,1325

R2 0,0000 0,2882 0,4812 0,7229 0,8844 1,1120

R1 0,0000 0,1703 0,3581 0,5724 0,7439 0,9915

R2 0,0000 0,1713 0,3272 0,5916 0,7767 1,0050

R1 0,0000 0,1475 0,4335 0,6051 0,8116 0,9630

R2 0,0000 0,0261 0,4156 0,6193 0,7843 0,9604

A tabela 9 foi construda com as mdias das repeties de laboratrio de cada aluno e tambm foram calculadas as mdias de cada uma das 4 repeties. Tabela 9 Valores mdios de absorbncia em funo das diferentes concentraes de BSA.
Protena (g) 0 20 40 60 80 100 Sara 0 0,2283 0,4289 0,6280 0,7966 0,9622 Solange 0 0,2409 0,4465 0,7214 0,9246 1,1223 Meline 0 0,1708 0,3427 0,5820 0,7603 0,9983 Carol 0 0,0868 0,4246 0,6122 0,7980 0,9617 Mdia 0 0,1817 0,4107 0,6359 0,8199 1,0111

A partir dos valores mdios de absorbncia e das concentraes conhecidas, estabeleceu-se a curva padro para quantificao de protenas totais (Figura 24)

1,2 Absorbncia (595 nm) 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0 20 40

y = 0,0102x R2 = 0,9984

60 Protena ( g)

80

100

120

40

Figura 24 Curva padro para a quantificao de protenas funo dos valores mdios de absorbncia da soluo, a comprimento de onda.

(g.mol-1) em 595nm de

Como pode ser observado na curva acima, os valores de absorbncia crescem numa proporo quase que idntica ao crescimento proporcional das concentraes. Isso pode ser comprovado pelo valor de R2 igual a 0, 9984, ou seja, a curva possui 99,84% de segurana para que os valores de absorbncia empregados na equao da reta (y= 0,0102x), forneam valores exatos de concentrao de protenas totais. O valor de R2 encontrado neste trabalho foi superior aos obtidos nos trabalhos realizados pelos Grupos I e II no 1 semestre de 2007 (R2 = 0,8725 e R2 = 0, 9926, respectivamente). A linearidade da curva aqui encontrada, portanto, foi mais perfeita quando comparada s curvas de protenas totais encontradas em trabalhos anteriores. Conclui-se que a confiabilidade da curva padro para quantificao de protena foi prxima de 100%, ressaltando que os valores de absorbncia crescem na mesma proporo que os valores de concentrao das solues proticas, o que esperado numa curva linear.

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5 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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O'REILLY, E.; LANZA, J. Fluorescamine: a rapid and inexpensive method for measuring total amino acids in nectars. Ecology, Dec, 1995. Disponvel em: <http://findarticles.com/p/articles/mi_m2120/is_n8_v76/ai_17848355/pg_1>. Acessado em 18 de Agosto de 2007. PENHA-SILVA, N.; FONSECA, A. M.; BRITO, A. G.; SOUZA-PENHA, M. A.; FERREIRA, T. A. A. Determinao rpida de aucares redutores com acido ctrico para uso biotecnologico. Bioscience Journal, v. 20 , n. 3, p.183-188,2004. Disponvel em <www.biosciencejournal.ufu.br/ >Acesso em 16 de Agosto de 2007. SILVA, R N.;MONTEIRO, N.V.;ALCANFOR, J.X.;ASSIS, E.M.;ASQUIERI.E.R.; Comparision methods for the determination of reducers sugars and total in honey. Cincia e Tecnologia de Alimentos. , Campinas, v. 23, n. 3, 2003. Disponvel em: <http://www.scielo.br >. Acesso em: 18 de. Agosto de 2007. SOMOGY, M. A New Reagent for Determination of Sugars. A new Sugar Reagent, May p. 61 68, 1945. ZAIA, D.A.M,; ZAIA, C.T.B.V.; LICHTIG, J. Determinao de protenas totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos mtodos existentes. Qumica Nova, n.21, v.6. 1998. p.787-793. WANG, N. S. Amino acid assay by ninhydrin colorimetric method. Disponvel em: <http://www.ece.umd.edu/~nsw/ench485/lab3a.htm . Acessado em 18 de Agosto de 2007. Sites: www.universitario.com.br/celo/topicos/subtopicos/citologia/bioquimica/proteinas

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ANEXOS
QUESTIONRIO TUTORIAL PREPARO DE SOLUES E CURVAS PADRO 1 Discorra, com o mximo de detalhamento possvel, sobre os critrios e cuidados a serem utilizados na escolha de uma soluo tampo? Em relao aos cuidados na escolha de uma soluo tampo, primeiramente necessrio saber qual o valor de pH a ser utilizado, assim devemos primeiramente levar em considerao a eficincia ou a capacidade tamponante do tampo, e esta por sua vez, est diretamente relacionada com dois fatores: a concentrao molar dos componentes do sistema, sendo que a concentrao de um tampo refere-se soma das concentraes do cido fraco e da sua base conjugada; o segundo a relao entre a concentrao da base conjugada e do acido fraco, quantitativamente a soluo-tampo mais eficiente a que tem a mesma quantidade de componentes cidos e bsicos, para reagir com acido e bsico respectivamente. Conhecendo os fatores que influenciam na capacidade tamponante podemos ento decidir qual o tampo mais eficiente para o valor de pH desejado. 2 Qual o princpio da ao tamponante de uma soluo-tampo? Utilize-se de sistema cartesiano para a explicao? A capacidade tamponante de uma soluo tampo , qualitativamente, a habilidade desta soluo de resistir a mudanas de pH frente a adies de um cido ou de uma base. Quantitativamente, a capacidade tampo de uma soluo definida como a quantidade de matria de um cido forte ou uma base forte necessria para que 1,00 L de soluo tampo apresente uma mudana de uma unidade no pH Esta habilidade em evitar uma mudana significativa no pH diretamente relacionada concentrao total das espcies do tampo (cidas e bsicas),assim como razo destas. verificado que um tampo mais efetivo a
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mudanas no pH quando seu pH igual ao pKa, ou seja, quando as concentraes das espcies cida e bsica so iguais. A regio de pH til de um tampo usualmente considerada como sendo de pH = pKa 1.A razo fundamental de uma soluo tampo resistir a mudanas de pH resulta do fato de que ons hidroxnio ou hidroxila quando adicionados a este tipo de soluo, reagem quantitativamente com as espcies bsicas e cidas presentes, originando o cido fraco e a base fraca, respectivamente. Intuitivamente, fcil constatar que quanto maior a concentrao das espcies do tampo, maior ser a quantidade de ons hidroxnio ou ons hidroxila necessrios para a converso completa dessas espcies a cidos fracos e bases fracas. Ao final desta converso, a razo entre a espcie predominante e a de menor quantidade do tampo torna-se elevada e a soluo deixa de ser um tampo. Este fato claramente representado por um sistema cartesiano, como pode-se observar pelo grfico abaixo, que at uma determinada adio de OH, a soluo no muda o pH, a partir de uma certa concentrao a soluo tampo no segura mais o pH (Figura 1).

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Figura 1 Modo de ao da soluo tamponante.

3 Transformar para ppm os seguintes valores: Sabemos que (g/mL) (1g/1.000.000mL : 1g/1.000L; 1mg/L) a) 0,0015%;>> 100% = 1000000 partes logo 0,0015% igual a 15 ppm b) 22,3 mg/L; >> 23,3 ppm (mg L-1 = ppm) c) 40 mg/100mL; >> 100mL tem 40 mg, em 1000 mL tem-se 400 ppm d) 125 g/5 L; >> 25 g /L 1 g tem 1000 mg, portanto, 25000 mg/L = 25000 ppm e) 0,025%; >>100% = 1000000 partes logo 0,025% igual a 250ppm f) 1000 ppb; >>1 bilho tem 1000 milhes, portanto 1000 ppb = 1 ppm g) 312 mg/L; >>312 ppm (mg L-1 = ppm) h)312 g/m3 ; >>1 m3 tem 1000 L, logo, 312g/1000 L = 312000 mg/ 1000 L = 312 ppm i) 3 g/T; >> 3g/ 1000.000 g = 3 ppm j) 5 mg/mL; >> 1L tem 1000 mL, ento , 5000 mg/L = 5000 ppm l) 0,07 g/1000 mL; >> 0.07 g/L = 70 mg/L = 70 ppm

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m) Kg/Ha; 10.000m x 10cm 10.000m x 0,01m = 100m 1m - 1000L = 100m - x = 100.000.L 1000.000 mg / 1000.000L = 10 mg/L = 10ppm

4 Explique o princpio do desenvolvimento de cor resultante da reao do(s) reagente(s) especfico(s) utilizados em aula para os mtodos de determinao de aminocidos, protenas, acares redutores e totais. Mostre as reaes. determinao de protenas O mtodo de Bradford uma tcnica para a determinao de protenas totais que utiliza o corante de Coomassie brilliant blue BG-250 (Figura 2). Este mtodo baseado na interao entre o corante BG-250 e macromolculas de protenas que contm aminocidos de cadeias laterais bsicas ou aromticas. No pH de reao, a interao entre a protena de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilbrio do corante para a forma aninica, que absorve fortemente em 595 nm.

Figura 2 Coomassie brilliant blue. determinao de aminocidos

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Constitui-se no mtodo atualmente mais utilizado para a determinao de aminocidos totais. A reao da ninhidrina pode ser observada na figura 3.

Figura 3 Reao da ninhidrina. Fonte: Milio & Loffredo (2007). Na etapa (1), primeiramente, um equivalente de ninhidrina oxidada reduzida em presena de um agente redutor (KCN), perdendo um tomo de oxignio com a formao de uma molcula de gua. Simultaneamente, ocorre uma reao de desaminao oxidativa que remove o hidrognio dois do -aminocido para render um cido -imino. Na etapa (2), o grupo do NH do cido -imino hidrolizado rapidamente formando o cido -ceto com a produo de uma molcula de amnia. Este cido -ceto sofre uma descarboxilao, na etapa (3), em um meio sob aquecimento, para formar um aldedo que tenha um tomo de carbono a menos do que o aminocido original, devido a liberao de uma molcula de CO2. A reao entre um -aminocido e a ninhidrina, envolvida no desenvolvimento da cor descrita pelas cinco etapas seguintes: -aminoacido + ninhidrina oxidada
KCN

ninhidrina reduzida + -aminoacido + H2O

-aminoacido + H2O -ceto acido + NH3 -ceto acido + NH3 aldedo + CO2 Estas primeiras trs etapas produzem ninhidrina e amnia reduzidos, que so requeridas para a produo da cor nas ltimas duas etapas, (4) e (5). A reao total para as reaes acima expressa simplificadamente na reao (6) (ligeiramente sem esclarecimento) como segue:
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-aminoacido + 2 ninhidrina CO2 + aldedo + complexo prpura + 3H2O Neste mtodo, a ninhidrina reagir com o grupamento -amina livre, NH2-CCOOH. Este grupamento contido em todos os aminocidos, peptdeos, ou protenas, contudo, como a reao de decarboxilao prosseguir com um aminocido livre, no acontecer em peptdeos e protenas. Assim, teoricamente somente os aminocidos levaro ao desenvolvimento da cor. A colorao prpura especfica para todos os -aminocidos, excetuando-se prolina e hidroxiprolina, que possuem amina secundria. Na figura 4 pode ser observada a reao entre prolina e ninhidrina.

Figura 4 Reao de ninhidrina com aminocidos com grupamento amina secundrio, como a prolina. Fonte: Milio & Loffredo (2007). determinao de acares solveis totais. A reao de antrona se baseia na ao hidroltica e desidratante do cido sulfrico concentrado sobre os carboidratos (Figura 5). Quando a reao levada a efeito com carboidratos com ligaes glicosdicas, estas so hidrolisadas e os acares simples desidratados para furfural ou hidroximetilfurfural. Essas substncias se condensam com a antrona (9,10-dihidro-9-oxoantraceno) dando um produto de colorao azul petrleo

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Figura 5 Reao da antrona. determinao de acares redutores No mtodo do DNS utilizado para quantificao de acares redutores. O DNS reduzido para cido 3-amino-5-nitrossaliclico, enquanto que, no caso mais simples o grupamento aldedo parece ser oxidado a cido aldnico (Figura 6). Entretanto a equivalncia entre o cido aminonitrossaliclico produzido e a quantidade do acar no exata e, diferentes acares produzem diferente intensidade na cor desenvolvida.

Figura 6 Reao do DNS. 5. Qual a funo de cada reagente presente nos ensaios colorimtricos adotados na aula prtica? (Consulte os artigos originais). Quantificao de protenas pelo mtodo do Bradford Comassie Blue = corante; Etanol = solvente do corante; H3PO4 = ajuda na solubilidade do etanol com o corante.

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Quantificao de aminocidos pelo mtodo da ninhidrina

Tampo citrato de sdio = mantm a pH em 5. Ninhidrina = vai ser reduzida a hidrindantina. KCN (Cianeto de Potssio) = atua como agente redutor transformando ninhidrina em Hidrindantina Etanol 60% v/v = completar o volume reacional Quantificao de Acares Solveis Totais pelo mtodo da antrona

antrona = se liga ao furfural resultando na colorao verde cido sulfrico = hidrlisa o acar, formando o composto furfural. sal Quantificao de acares redutores pelo mtodo DNS de Rochelle = evita a oxidao do DNS pelo oxignio dissolvido

cido dinitrossalicilico = promove a reao da glicose e DNS e a colorao da reao fenol = otimiza a quantidade de cor produzida bissulfito de sdio = estabiliza a quantidade de cor produzida na presena do fenol 6 Mencione os outros mtodos de determinao de aminocidos, protenas, acares redutores e totais disponveis na literatura, fazendo uma comparao entre eles? Aminocidos Fluorescamina um composto no fluorescente que reage com aminas formando um produto altamente fluorescente. Embora o fluorescamina seja instvel na gua, seu produto de hidrolise no fluorescente e no interfere com a quantificao dos aminocidos. A reao de Fluorescamina com as aminas ocorre imediatamente. Deve-se utilizar histidina, treonina ou isoleucina como padres para obter a curva padro, porque eles apresentam fluorescncia em intensidades moderadas, sendo melhores as concentraes de 0,3-30 mmol/L. Esse mtodo rpido, barato e sensvel para a medida da concentrao total de aminocidos no nctar (O'Reilly & Lanza, 1995).

a) Reao com Fluorescamina ou Flurescamina

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b) Mtodo da Ninhidrina Neste mtodo, a ninhidrina reagir com o grupamento -amina livre, NH2-CCOOH. Este grupamento contido em todos os aminocidos, peptdeos, ou protenas, contudo, como a reao de decarboxilao prosseguir com um aminocido livre, no acontecer em peptdeos e protenas. Este teste pode ser usado rotineiramente para a deteco de glicina na ausncia da outra espcie interferindo. Embora este seja um teste rpido e sensvel para a presena de aminocidos, por causa da no seletividade, no pode ser usado para analisar os ndices individuais relativos de uma mistura de aminocido diferentes. Alm disso, a intensidade da cor desenvolvida dependente do tipo de aminocido. Finalmente, no reage com as aminas tercirias ou aromticas (Wang, 2007). Deve-se considerar, que pelo fato da ninhidrina ser um agente de oxidao forte, cuidados apropriados devem ser tomados para trabalhar com esse composto. especialmente elevada a temperatura sob a qual a reao realizada. O reagente ninhidrina manchar a pele de azul, contudo a cor sair gradualmente aps cerca de um dia. A colorao prpura especfica para todos os -aminocidos, excetuando-se prolina e hidroxiprolina, que possuem amina secundria. Neste caso, o produto da reao possui colorao amarelada, sendo a visualizao dificultada, pois a cor pode ser encoberta pelo azul produzido pelos outros aminocidos. c) Teste xantoprotico Alguns aminocidos contm grupamentos aromticos que so derivados do benzeno. Esses grupamentos submetem-se a reaes especficas do benzeno e seus derivados. Uma dessas reaes a nitrao do anel benznico pelo o cido ntrico. O aminocido fenilalanina contm um anel benznico, mas ele no ativado e no sofre nitrao. Essa reao de nitrao, quando usada para identificar s presena de um anel benznico ativado, comumente conhecida como teste xantoproteico, porque o produto amarelo. A colorao desenvolvida em meio alcalino. Na figura 7 pode ser observada a reao para a tirosina.

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Figura 7 Reao de nitrao da tirosina no teste xantoproteico. Fonte: Milio & Loffredo (2007). Esta reao uma das reaes que ocorrem quando a soluo concentrada do cido ntrico entra em contato com a pele. A protena na pele contm tirosina e triptofano, que se sofren nitrao e se coram de amarelo. d) Reao de Millon um mtodo especfico para da tirosina, somente aminocidos que contm um grupamento fenlico, uma hidroxila ligada ao anel benznico. Nesse teste, o grupamento fenlico da tirosina primeiramente sofre nitrao pelo cido ntrico em soluo. Esse produto formado reage com os ons mercrio (I) e (II), na soluo e formam um precipitado vermelho ou uma soluo vermelha, ambos so resultados positivos. Protenas que contm tirosina forneceram um resultado positivo. Entretanto, algumas protenas que contm tirosina formam inicialmente a um precipitado branco, que quando aquecidos tornam-se vermelhos imediatamente. Ambos os resultados so considerados positivos. Deve-se atentar que alguns combinam com um grupamento fenlico dando um teste positivo, assim devem estar certos que a amostra que se est testando no contem nenhum fenol, excepo daqueles presena na tirosina (Milio & Loffredo, 2007). e) Teste Hopkins-Cole especfica para a quantificao do aminocido triptofano, somente aminocidos que contm um grupamento indlico. O anel indlico reage com o cido glioxlico na presena de um cido forte para formar um produto cclico violeta (Figura 8).

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Figura 8 Reao do teste de Hopkins-Cole. Fonte: Milio & Loffredo (2007). f) Teste nitroprussiato Quantifica especificamente o aminocido cistena, somente aminocidos que contm um grupamento sulfidril (-SH). Esse grupamento reage com o nitroprusside em soluo alcalina, formando um complexo vermelho (Figura 9).

Figura 9 Reao do teste de nitroprussiato. Fonte: Milio & Loffredo (2007). Protenas Um procedimento simples para a determinao da concentrao da protena nas solues a tcnica de Bradford que foi descrito primeiramente por Bradford em 1976. O mtodo de Bradford uma tcnica para a determinao de protenas totais que utiliza o corante de Coomassie brilliant blue BG-250 (Figura 10). Este mtodo baseado na interao entre o corante BG-250 e macromolculas de protenas que contm aminocidos de cadeias laterais bsicas ou aromticas. No pH de reao, a interao entre a protena de alto peso molecular e o corante BG-250 provoca o deslocamento do equilbrio do corante para a forma aninica, que absorve fortemente em 595 nm.

a) Mtodo de Bradford

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Figura 10 Coomassie brilliant blue. Na literatura no existem muitas substncias que so citadas como interferentes no mtodo de Bradford. Estes interferentes normalmente reagem com as protenas impedindo a reao com o corante BG-250 ou reagem com o corante causando aumento na absorbncia. Os mtodos de eliminao destes interferentes variam conforme o caso, no entanto, Zaia et al. (1998), recomendam a precipitao das protenas com cido tricloroactico. Substncias que interferem na determinao de protenas totais pelo mtodo de Bradford: Tolbutamida, Uria, Cloreto de sdio e potssio, Detergentes (Triton X- A 100, SDS, Tween-20), Ciclodextrinas, Polifenis e polifenis oxidases, 2-mercaptoetanol + guanadina, Glicerol, Lipdios, Cloropromazina e Fluoreto. b) Mtodo de Biureto O mtodo se baseia na reao do reativo do Biureto, que constitudo de uma mistura de cobre e hidrxido de sdio com um complexante que estabiliza o cobre em soluo, sendo o tartarato de sdio o recomendado. O cobre, em meio alcalino, reage com protenas formando um complexo quadrado planar com a ligao peptdica. O mtodo do Biureto, portanto, tem como base o desenvolvimento de uma cor violeta em soluo aquosa resultante da reao da protena com o reagente mencionado.

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O produto de reao apresenta duas bandas de absoro, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na regio de 270 nm aumentarem em seis vezes a sensibilidade do mtodo do Biureto, a banda na regio de 540 nm a mais utilizada para fins analticos, porque diversas substncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na regio de 270 nm causando muita interferncia no mtodo. Este mtodo pode sofrer interferncia de substncias que possam reagir com os ons cobre II. Existem na literatura vrios mtodos para se eliminar estas substncias, porm o recomendado por Zaia et al. (1998) a precipitao das protenas com cido tricloroactico e posterior solubilizao para determinao das mesmas. Algumas substncias que interferem na determinao de protenas totais pelo mtodo de Biureto: Bilirrubina, Amnio, Lipdios, Hemoglobina, Dextran-40 e 70, Peptdeos e aminocidos livres (His, Ser, Thr), Melanina, Tampo tris-HCl e glicose, Lactose e Amido. c) Mtodo de Smith ou BCA O princpio do mtodo baseia se na reao de cobre I com protenas, em meio alcalino, produzindo cobre II e formando um complexo com o BCA, que absorve fortemente na regio de 560 nm. No entanto, em um estudo sobre o papel catalisador do cobre, em meio alcalino, na reao entre protenas e o reativo de Folin-Ciocauteau, detectou-se a formao de um intermedirio de cobre III com peptdeos, porm no se detectou cobre I, como estabelecido por Smith, devendo, portanto, este mecanismo ser mais bem estudado para se estabelecer qual ou quais intermedirios de cobre so formados. Os interferentes, em potencial, do mtodo de Smith so aquelas substncias que reagem com os ons cobre (reaes de xido-reduo, formao de complexos, precipitao) ou com o reativo de BCA. Os mtodos de eliminao destes interferentes variam conforme o caso e em muitas situaes, Zaia et al. (1998), recomendam a precipitao das protenas com cido tricloroactico. Interferentes do mtodo de Smith: Acares em geral, EDTA, Lipdios, Sulfato de amnio, Mercaptoetanol e dithiothreitol, Perxido de hidrognio, Vitamina C e paracetemol, Cloropromazina e Penicilinas. d) Mtodo de absoro no Ultravioleta

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Este mtodo baseado no fato de que as protenas mostram absoro na regio de 280 nm e na regio abaixo de 220 nm, sendo a primeira devido a diversos aminocidos (fenilalanina, cistena, cistina, metionina, triptofano, histidina e tirosina), e a segunda devido ligao peptdica. No entanto, em 280 nm, em pH neutro, somente os aminocidos triptofano, tirosina e cistina possuem uma absortividade molar significativamente grande. Este mtodo est sujeito a muitos interferentes, sendo que qualquer substncia que apresente uma banda de absoro na regio de leitura um interferente em potencial. e) Mtodo de Lowry O princpio do mtodo baseia-se numa mistura contendo molibdato, tungstato e cido fosfrico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma reduo quando reage com protenas, na presena do catalisador cobre (II), e reduz um composto com absoro mxima em 750 nm (Figura 11). Essa reduo ocorra diretamente atravs das cadeias laterais de alguns aminocidos (tirosina, triptofano, cistena, asparagina e histidina), que contribuem com quatro eltrons, ou atravs da retirada de dois eltrons de cada unidade tetrapeptdica dos peptdeos e protenas, que facilitada pela formao do quelato entre o cobre (II) e peptdeos/protenas. O mtodo de Lowry para a determinao da concentrao da protena usado extensamente, porm pode ser sujeito interferncia por muitas substncias e produtos qumicos como, por exemplo: citrato, cloreto de csio, tampes, EDTA, barbital, TRIS e fenol.

Amarelo Figura 11 Reao do mtodo de Folin-Ciocalteau.

Azul

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Apesar do mtodo de Lowry apresentar uma grande sensibilidade para protenas, o mesmo possui algumas desvantagens como estar sujeito a diversos interferentes. Na literatura so encontradas muitas substncias interferentes e estas normalmente causam aumento na absorbncia do branco, diminuio da absortividade especfica ou formao de algum tipo de precipitado. Para a eliminao da maioria dos interferentes deste mtodo, sugere-se a precipitao das protenas utilizando-se: cido tricloroactico e co-precipitantes misturas de metanol-clorofrmio-gua ou hexano-isopropanol. Se o interferente for composto de enxofre, como mercaptanas, por exemplo, aconselha-se o uso de iodo acetato ou a secagem a vcuo da amostra, se for lipdeo ou melanina sugere-se a adio de detergentes. Os interferentes mais comuns so: Compostos fenlicos, Lipdios, Detergentes, cido rico, Guanina e xantina, Sulfato de amnio, Melanina, Bilirrubina, 4-metilumbeliferona, Mercaptanas e cistena, Tampo tris-HCl, Acares e RNA. Acares redutores

a) Mtodo do cido Dinitrosaliclico (DNS): Em meio alcalino, o AR reduz o DNS a cido 3-amino-5-nitrossaliclico, enquanto que, o grupamento aldedo oxidado a cido aldnico. Alm do DNS, utiliza-se tambm neste mtodo o sal de Rochelle, fenis, bissulfito de sdio e hidrxido de sdio. O fenol otimiza a quantidade de cor produzida e o bissulfito de sdio estabiliza a quantidade de cor obtida na presena de fenol (Miller, 1959). Durante o teste, pode ocorrer a perda de glicose devido oxidao pelo oxignio dissolvido. No trabalho do Miller (1959), quando adicionou sulfito de sdio, observou uma reduo de 70% na destruio da glicose. Eles concluram que esse resultado era devido uma possvel interferncia de outros componentes do reagente na destruio da glicose. Verificaram tambm que o sal de Rochelle parece ser o componente que mais influencia na funo de proteo da glicose pelo sulfito. Na ausncia do sal, a glicose foi mais protegida, o que promoveu um aumento da glicose remanescente. Ento, parece que sulfito atua na proteo da glicose contra a oxidao e o sal de Rochelle importante para controlar essa proteo, evitando uma proteo excessivo do sulfito. Mesmo sem a presena do sulfito ainda possvel obter leitura no ensaio, pois nem toda a glicose sofre oxidao pelo oxignio.

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b) Reao de Benedict Este mtodo consiste na reduo de ons cobre presentes no reagente, o qual reduzido na presena de acares redutores, formando um precipitado de colorao amarela ou vermelha (Cu2O) (Figura 12). O acar, por sua vez, oxidado e polimerizado na soluo alcalina.

Figura 12 Reao do mtodo de Benedict. c) Mtodo de Somogy e Nelson Os glicdeos redutores aquecidos em meio alcalino, transformam-se em enodiis que reduzem o on cprico presente a cuproso. O xido cuproso assim formado reduz a reao arsnio-molibdico a xido de molibdnio de colorao azul cuja intensidade de cor proporcional a quantidade de acares redutores existentes na amostra (Somogy, 1945; Nelson, 1944), sendo a reao quantificada por espectrofotometria a 510 nm (Silva et al., 2003). Acares solveis totais A reao de antrona se baseia na ao hidroltica e desidratante do cido sulfrico concentrado sobre os carboidratos. Quando a reao levada a efeito com carboidratos com ligaes glicosdicas, estas so hidrolisadas e os acares simples desidratados para furfural ou hidroximetilfurfural. Essas substncias se condensam com a antrona (9,10-dihidro-9oxoantraceno) dando um produto de colorao azul petrleo (Figura 13) (Silva et al., 2003).

a) Mtodo de antrona

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Figura 13 Reao qumica que ocorre no mtodo de antrona. b) Mtodo de Molish Baseia-se corado (Figura 14). na hidrlise cida das ligaes glicosdicas resultando em hidroximetilfurfural e furfural, que se condensam com o -naftol resultando num complexo

Figura 14 Reao de Molish. c) Reao de Seliwanoff Reao para distino entre aldoses e cetoses, que sob ao desidratante de cidos concentrados so transformados em derivados do furfural, que por sua vez se condensam com o resorcinol formando um composto vermelho de composio incerta. A reao com cetoses mais rpida do que com as aldoses permitindo diferenci-los. Este teste especfico para a

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frutose. Na figura 15 percebe-se a diferena entre uma cetose e uma aldose e direita o exemplo de uma cetose, no caso, a frutose.

Figura 15 Diferena estrutural entre uma cetose (A) e uma aldose (B). 7 Discorra com o mximo de detalhamento possvel sobre o princpio da espectrofotometria e sua relao com as determinaes de macro e micromolculas? A absoro de luz por uma substncia em soluo pode ser utilizada para determinar a sua concentrao, uma vez que, para solues diludas, existe uma relao linear entre a concentrao da substncia e a quantidade de luz absorvida. Alm disso, cada substncia absorve mais fortemente uns comprimentos de onda do que outros. A absoro de luz caracterstica de cada substncia, que representa o seu Espectro de Absoro, pode ser utilizada para caracterizar e identificar uma ou mais substncias numa mistura. Quando um feixe de luz passa atravs de uma soluo, parte da luz absorvida pelos componentes da soluo. A relao matemtica entre a concentrao de uma substncia em soluo e a absoro, dada pela lei de Beer-Lambert. A lei de Lambert pode expressar-se por: Log I0 K1 x 1 I em que: Io = intensidade original do feixe de luz I = intensidade do feixe de luz depois de atravessar a soluo l = espessura da soluo, expressa em centmetros K1 = constante de proporcionalidade que depende das caractersticas de absoro da substncia, da temperatura e do comprimento de onda utilizado

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A lei de Beer pode expressar-se por: Log I0 K2 x C I em que: Io e I tm o mesmo significado. C = concentrao da substncia em soluo, expressa em moles por litro (ou molar) K2 = constante de proporcionalidade Combinando as duas expresses obtm-se a equao fundamental da absoro da luz, conhecida como lei de Beer-Lambert: Log I0 = k x 1 C I em que: k = coeficiente de extino molar, normalmente referido por ,

log I0 = Abs ( absorvncia) I Assim, a expresso da lei de Beer-Lambert pode tomar a seguinte forma: Abs = x 1 x C Chama-se coeficiente de extino molar de uma substncia, , ao valor da absorvncia de uma substncia de concentrao 1 M, medida num tubo com uma espessura de 1cm. O coeficiente de extino molar especfico da substncia, para um dado comprimento de onda, e tem normalmente um valor grande quando a luz de um dado comprimento de onda absorvida eficientemente pela substncia.

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A lei de Beer-Lambert pode, portanto, ser utilizada para determinar o coeficiente de extino molar de substncias em soluo e para determinar a concentrao de uma ou mais substncias em soluo. A lei de Beer-Lambert vlida somente para solues relativamente diludas, uma vez que acima de certas concentraes a relao entre a absorvncia e a concentrao deixa de ser linear. 8 Qual o tempo mximo que cada reao dos mtodos utilizados (aminocidos, protenas totais, acares redutores e acares solveis totais) pode ficar armazenada e que no influencie nos resultados. Justifique sua resposta? No mtodo da antrona, para acares solveis totais, o reagente pode ficar armazenado somente por 12 horas, contudo, depois que a reao ocorreu no tubo de ensaio, a leitura deve ser imediata. No mtodo do DNS, para quantificao de acares redutores, o reagente DNS os pode ser armazenado por at 30 dias, desde que seja acondicionado em embalagens apropriadas, protegido de luz e CO2 (p. ex. em vidro mbar, com boa vedao e envolto em papel alumnio), sob condies de refrigerao. No mtodo da Ninhidrina, para quantificao de aminocidos livres, as solues pode ser armazenadas, sob condies de temperatura controlada (p. ex. geladeira), por perodo varivel: Soluo A - O tampo citrato pode ser armazenado, juntamente com um pouco de timol (os autores no mencionam por quanto tempo). A soluo de Cianeto de potssio diludo em gua destilada pode ser armazenado por at 3 meses; Soluo B - a soluo de Cianeto de Potssio diludo em Metil Celossolve pode ser armazenada por at 1 ms; soluo C - a Ninhidrina dissolvida em Metil Celossolve pode ser armazenada por at 6 meses; A soluo que mistura os reagentes A, B e C - pode ser armazenada em embalagem bem vedada por at uma semana. No mtodo de Bradford, para quantificao de protenas totais, o desenvolvimento da cor essencialmente completado em 2 minutos, e permanece estvel mais ou menos 4% por um perodo de 1 hora. Com o tempo, o complexo protena-corante tem a tendncia de se agregar, com isso, h uma diminuio na cor simplesmente pela remoo fsica do complexo da soluo. Sendo assim, se forem requeridas determinaes muito precisas deve-se ler a absorbncia da amostra entre 5 e 20 minutos aps a adio do reagente.

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9 Discorra com o mximo de detalhamento possvel, os cuidados que devem ser tomadas com os equipamentos, vidrarias e todos os utenslios utilizados no laboratrio? Uso obrigatrio de guarda-p (jaleco); No realizar tarefas envolvendo reagentes sem antes conhecer a sua periculosidade; No utilizar qualquer aparelho sem autorizao. Quando autorizado, certificar-se de como us-lo corretamente e verificar a coincidncia entre a voltagem do aparelho e a da rede eltrica; Aps utilizar qualquer aparelho, observar se o mesmo est desligado e desconectado da rede eltrica; No pesar sais e outros reagentes diretamente sobre o prato de qualquer balana; Manter equipamentos, vidrarias e reagentes nos seus devidos lugares e sempre limpos aps sua utilizao; Muito cuidado na lavagem e secagem de vidrarias; Conservar o local de trabalho sempre limpo; O usurio ser responsvel pelos reagentes, vidrarias e equipamentos que estiverem sendo utilizados; Identificar as solues com etiquetas constando s caractersticas da soluo, data e nome do preparador. (Obs.: Solues sem identificao e armazenadas inadequadamente sero descartadas); As solues devem ser armazenadas em frascos prprios e em locais adequados; Saber utilizar corretamente todos os materiais e equipamentos disponveis no laboratrio antes de us-los; Balanas: A escolha da balana depende da finalidade e preciso desejadas. No remov-las de seus locais de instalao. Espectrofotmetro: Escolha do comprimento de onda adequado; no deixar cair produtos qumicos; limpeza aps o uso. Centrfuga: Balancear rigorosamente os tubos na centrfuga; Seguir a seqncia apropriada para operar cada centrfuga; Limpar aps o uso. Saber distinguir RPM de g . Usar vidrarias adequadas para o preparo (pipeta, proveta, balo volumtrico, etc.) e armazenamento (Tipo de frasco e de reagente, local de armazenamento, etc.);

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 Quando se trabalhar com produtos de alta periculosidade usar recursos adequados de proteo (Capelas, pipetadores automticos, etc.); Observar atentamente o custo dos reagentes; Evitar desperdcio preparando a quantidade realmente necessria; Observar se o produto exigido pode ser comercial ao invs de P.A.; Ajustar metodologias de dosagens atravs da substituio de mtodos, reagentes ou reduo de volume da reao; Armazenamento em condies adequadas, atentando para diferenciar os reagentes que podem, daqueles que no podem ser armazenados. No utilizar qualquer aparelho sem autorizao. Quando autorizado, certificar-se de como us-lo corretamente e verificar a coincidncia entre a voltagem do aparelho e a da rede eltrica; Aps utilizar qualquer aparelho, observar se o mesmo est desligado e desconectado da rede eltrica; 10 Quais as diferenas verificadas entre as metodologias originais e aquelas usadas rotineiramente em nosso laboratrio? Para acares redutores, no protocolo atual, foram retirados os reagentes fenol e bissulfito de sdio, sendo que o DNS, fenol e sal de Rochelle foram mantidos, contudo o sal recebeu maior concentrao na soluo. Em relao ao tempo, este passou dos 15 min propostos por Miller, para 5 min. J no mtodo de acares solveis totais, a diferena est na maior concentrao do cido sulfrico. No do Comessie Blue, o mtodo o mesmo, porm a soluo de Comassie tem que ficar overnight sob agitao constante e tem que ser filtrado. O mtodo para quantificao de aminocidos no sofreu modificaes.

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