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PCR 1 : Principe : amplifier les différents fragments d’un gène Protocole : Le total doit être de 50ùL Tout doit

être 1 fois concentré dans ce volume (en ùl) -Eau : 40 -Buffer 10x avec MgSO4 : 5 -dNTP (10nm each) : 1.2 -Template : 1 Si trop concentré : faire dilution Ex : Nous avons 500ng/ùl et on veut 25ng/ùl, il faut donc diluer par 20. On veut aussi prélever 2ùl du template, donc il faut ajouter 38ùl d’eau pour avoir la bonne dilution -Oligo A (sens) and B (antisens) 1 chacun si trop trop concentré, pour connaître le taux de dilution il faut diviser les moles par la densité optique. Exemple OD 16.29 nm 41.4 donc la dilution est de 2.54 : on prend donc 1 ùl d’oligo et 1.54 ùl d’H20 -Puro DNA polymérase 0.7 On peut également mettre une solution riche en GC dans ce cas le volume d’eau et la nature de ll’enzyme (puro superyield) change total : 50 PCR 2 H2O : 30ùl Buffer n2 x10 : 5ùl GC rich n3 : 10 ùl dNTP n4 : 1ùl PCR1 : 2.5 ùl enzyme n1 : 0.5 ùl Réglages des cycles : PCR 1 et 3 1) 94 degré 2 min 2) 94 degré 0.45 sec 3) 50 degré 1 min 4) 72 degré 1 minutes On repète le cycle de 2) à 4) 24 fois PCR 2 1) 94 degré 2 min 2) 94 degré 0.45 sec 3) 50 degré 1 min 4) 72 degré 4 minutes On repète le cycle de 2) à 4) 5 fois PCR3 Oligo A : 1 ùl Oligo B : 1 ùl Enzyme : 0.5 ùl

Marqueur : 1904 1584 1375 947 831 125 Electropherese (2) .