Anlisis morfolgico de clulas sanguneas por medio de tincin nuclear y citoplasmtica

Integrantes: Leonardo Altamirano Paula Campos Ricardo Godoy Sebastin Hernndez Anglica Marianco Carrera: Bioqumica Asignatura: Biologa celular Profesor: Dr. Marco Paredes Honorato

Introduccin
En la mayora de los tejidos celulares su tamao e incoloridad es una limitante para el ojo humano a la hora de la observacin, inclusive a travs de lentes microscpicos, por ello necesitamos teirlos para observar sus caractersticas morfolgicas. En el siglo XIX se llevo a cabo una tcnica desarrollada desde un principio por el mdico y bacterilogo alemn, Paul Ehrlich En 1879-1891 Ehrlich seguido por los mdicos alemanes Ernst Malachowski y Dmitry Leonidovich Romanowsky, elevoraron una tcnica, en la cul se reunan la tincin de Giemsa y MayGrnwald - Giemsa entre otras, las cuales son utilizadas para diferenciar los tipos de clulas en especmenes patolgicos. A esto se le llam , Tincin de Romanowsky

Objetivos
Caracterizar y conocer la morfologa de las clulas sanguneas tales como linfocitos, monocitos, neutrfilos, basfilos, eosinofilos, plaquetas y eritrocitos, mediante procesos de tincin Giemsa y May Grnwald y anlisis microscpicos.

Materiales y procedimientos
Aspersor con etanol 75% Algodn Povidona Yodada Lancetas Portaobjetos Toalla de papel Alcohol al 95 % Frascos de tincin Solucin de Giemsa Solucin de MayGrnwald Recipiente de desechos Estufa de secado ter de petrleo Microscopios Aceite de inmersin

Aspersor con etanol 75 %

Extrado de la caa de azcar y del maz, y sirve como diluyente de compuestos utilizados en laboratorio. Algodn Extrado de Malvaceae, resultado de un estricto proceso de fabricacin. Utilizado para la desinfeccin y limpieza. Povidona Yodada Solucin antisptica. Utilizado para desinfectar tejidos.

Lancetas Estriles. Para anlisis sanguineo es una rutina frecuente en cualquier laboratorio.
Portaobjetos Fina placa de cristal sobre el cual se disponen objetos para su examen microscpico.

Toalla de papel Utilizado para eliminar el exceso de tincin y agua de los portaobjetos.

Alcohol al 95 % Fijacin del frotis

Frascos de tincin: Solucin de Giemsa: colorante eosina, violeta de metilo y el azul de metilo. Utilizado para tincin de frotis Solucin de May-Grnwald: colorante aninico eosina y el colorante catinico azul de metileno . Utilizado para tincin de frotis. Estufa de secado: Utilizada para secar e incubar el frotis.

Recipiente de desechos: Utilizado para depositar los residuos del experimento.

Aceite de inmersin: Se utiliza cuando se pasa del objetivo 40 al de 100x.

ter de petrleo: Se utiliza para limpiar los objetivos cuando quedan con aceite de inmersin.

Microscopio
Es un instrumento que permite aumentar el poder de observacin de clulas y microorganismos con mayor detalle de las estructuras celulares.

Sistema ptico
-Ocular: lente situado cerca del ojo del observador. Amplia la imagen del objetivo. -Objetivo: Lente situado cerca de la preparacin. Amplia la imagen de este. -Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. -Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. -Foco: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.

Sistema mecnico
-Soporte: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: El pie o base y el brazo. -Platina: Lugar donde se deposita la preparacin. -Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular. -Revolver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos. -Tornillos de enfoque: Micromtrico que aproxima el enfoque y micromtrico que consigue el enfoque correcto.

Procedimientos
Actividad 1:Anlisis morfolgico de leucocitos sanguneos por tincin de Giemsa. 1. Pinchar con una lanceta estril el extremo de un dedo previamente desinfectado con yodo. 2. Depositar una gota de sangre sobre la zona media del portaobjeto 3. Esparcir la gota de sangre hacia un extremo del portaobjeto utilizando otro portaobjeto (procure que la capa de sangre o frotis, sea lo mas fina posible) 4. Secar el frotis al aire por 5 minutos 5. Sumergir el frotis en alcohol 95% durante 2 minutos (fijacin de la muestra)

6. Retirar la preparacin del alcohol y sumergir el frotis en solucin de Giemsa durante 5 minutos.

7. Retirar la preparacin de la solucin y eliminar el colorante sumergiendo el portaobjeto varias veces en un recipiente con agua.
8. Secar la preparacin a 35 C en estufa por 10 minutos

9. Retire el preparado de la estufa y consrvelo hasta el momento del anlisis microscpico.

Actividad 2 : Anlisis morfolgico de leucocitos sanguneos por Tincin de May-Grunwald-Giemsa.

1. Preparar un frotis de sangre segn procedimiento descrito en los pasos 1, 2 y 3 de la actividad N 1. 2. Secar el frotis al aire por 5 minutos. 3. Sumergir el fortis en la solucin de May-Grunwald durante 5 minutos. 4. Retirar el frotis de la solucin May-Grnwald y se sumergir en Giemsa durante 10 minutos. Verter el colorante aspirando por un costado del portaobjeto con papel desechable .

5. Retirar la preparacin de la solucin y eliminar el colorante sumergiendo el portaobjeto varias veces en un recipiente con agua. 6. Secar la preparacin a 35 C en estufa por 10 minutos 7. Retire el preparado de la estufa y consrvelo hasta el momento del anlisis microscpico.

Actividad 3: Anlisis microscpico de las preparaciones.

1. Colocar el objetivo 10 X en posicin de uso y bajar la platina completamente. 2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. 3. Comenzar la observacin con el objetivo de 10x 4. Realice el enfoque de acuerdo al siguiente procedimiento: a. Acercar al mximo la lente del objetivo a la preparacin, empleando el tornillo macromtrico sin llegar a tocarla. Esto debe hacerse mirando directamente y no a travs del ocular, ya que se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparacin pudindose daar alguno de ellos o ambos. b. Mirando, ahora si, a travs de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de la preparacin con el micromtrico y, cuando se observe algo ntido en la muestra, girar el micromtrico hasta obtener un enfoque fino y ntido.

c.

Pasar al objetivo 40X girando el revolver. La imagen debera estar ya casi enfocada y suele ser suficiente con mover un poco el micromtrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de objetivo se perdi por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3. d. Una vez obtenido el enfoque con el objetivo 40x, girar el revolver hacia el objetivo 100x dejndolo entre Este y el de 40x por un momento. e. Colocar una a dos gotas de aceite de inmersin sobre el circulo de luz en la preparacin f. Girar suavemente el revolver hasta la posicin del objetivo 100x. g. Enfocar muy cuidadosamente con el micromtrico hasta obtener un enfoque ntido. Nota: Una vez se haya puesto aceite de inmersin sobre la preparacin, ya no se puede volver a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se manchara con aceite. Por tanto, si desea enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operacin desde el paso 3.

5. Fotografiar la preparacin (en 100X) acoplando manualmente una cmara digital al ocular del microscopio. (Utilice zoom digital si es necesario).
6. Una vez finalizada la observacin y obtencin de fotografas, se baja la platina y se ubica el objetivo de menor aumento girando el revolver. En este momento ya se puede retirar la preparacin de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersin en posicin de observacin. 7. Limpiar el objetivo de inmersin con cuidado empleando un algodn embebido en ter de petrleo. Comprobar tambin que el objetivo 40x este perfectamente limpio.

Glbulos rojos, eritrocitos o hemates

Clulas formadas en forma de disco bicncavo, con dimetro aprox. de 7 a 8 micrones, 2 micrones de espesor en la periferia y 1 micra de espesor en el centro.

Los eritrocitos se caracterizan por no poseer ncleo, mitocondrias y el retculo endoplasmatico se encuentra muy disminuido. Durante la Eritropoyesis los hemates han debido pasar por varias etapas, en las cuales, pierden su ncleo y los organelos mas importantes y solo sintetizan la Hemoglobina que les ayuda a cumplir su nica funcin: El transporte de gases atmosfricos por la sangre del organismo.
Los glbulos rojos circulan en un numero enorme de 5.000.000 por milmetro cbico de sangre en el hombre y 4.500.000 en la mujer, aprox.

Glbulos blancos o leucocitos

Son unidades mviles de la sangre, poseen ncleo, no tienen forma definida y son de un tamao ligeramente mayor que los glbulos rojos, Sin embargo el numero de ellos que circula es menor (5000 a 7000 por milmetro cbico de sangre). En general cumplen un importante papel en la defensa del organismo contra las diversas infecciones producidas por microorganismos. Cuando alguna bacteria u otro agente patgeno ingresa al organismo humano, se liberan ciertas sustancias qumicas que tienen la facultad de atraer a los leucocitos, este fenmeno se ha denominado quimiotaxis. Por otro lado para que el leucocito logre llegar al lugar en que se esta multiplicando la bacteria, estos deben atravesar la pared de los vasos sanguneos, por un proceso llamado diapdesis. Morfolgicamente se distinguen en dos grupos: Granulocitos y Agranulocitos.

Granulocitos: En ellos se observa pequeos grnulos citoplasmticos y ncleo con varios lbulos al microscopio ptico. Aqu se encuentran Eosinfilos, Neutrfilos y Basfilos.
Eosinfilos: Son aquellos que presentan afinidad tintorial por los colorantes cidos (Eosina), y sus grnulos se tien de color rojo anaranjado. Su ncleo puede ser bi o trilobulado. Constituyen el 1 al 3% de todos los leucocitos. Son fagocitadores poco intensos y presentan quimiotaxis moderada. Neutrfilos: Son aquellos leucocitos que presentan afinidad con colorantes de pH neutro, y los grnulos tien de color lavanda plido. Son los mas numerosos, pues representan el 65% de los leucocitos y son los mas activos en cuanto a defensa contra infecciones. Basfilos: Presentan afinidad por colorantes bsicos (azul de metileno), les dan color azul intenso a los grnulos del citoplasma. Son de poca movilidad, ya que su funcin principal es liberar alguna sustancia hacia la sangre, tales como la heparina, sustancia que evita la coagulacin sangunea, son importantes en algunos tipos de reacciones alrgicas. Su porcin en la sangre es del 2 al 3%.

Agranulocitos: Son aquellos que no contienen grnulos en sus citoplasma, y sus ncleos no son lobulados, sino que esfricos. Aqu se encuentran Monocitos y Linfocitos.

Monocitos: Tienen un ncleos grande en forma arrionada o herradura, que tie de color prpura, son de gran tamao 12 a 20 micras. Juegan un papel importante en la inflamaciones e infecciones crnicas, ya que son fagocitadores activos (Macrfagos), los cuales presentan gran movilidad. Su concentracin sangunea es de un 5% aprox.

Linfocitos: Son clulas de tamao aproximado a los hemates, de ncleo redondo, grande y citoplasma escaso. Son muy abundantes en la linfa y representan del 25 al 30% de los leucocitos en la sangre normal. Se tien de color prpura.

Plaquetas o trombocitos
Son las clulas mas pequeas, ya que miden slo 2 a 4 micrones. Existen aproximadamente 300.000 a 500.000 por milmetro cbico de sangre.

Su vida media es de 4 das aprox. No se conoce an el lugar del organismo donde son destruidas.
Cumplen un rol de suma importancia en la coagulacin sangunea.

Tincin
Es una tcnica auxiliar en microscopa para mejorar el contraste en la imagen vista al microscopio. En Bioqumica, esto implica agregar un colorante especfico (ADN, protenas, lpidos, carbohidratos, etc.) a un sustrato para cualificar o cuantificar la presencia de un determinado compuesto. Esto es similar al marcado fluorescente. Las tinciones y colorantes se usan con frecuencia en biologa y en medicina para destacar estructuras en tejidos biolgicos para observacin, a menudo con la ayuda de diferentes tipos de microscopios. Las tinciones pueden ser usadas para definir y examinar tejidos en bruto (resaltando, por ejemplo, fibras musculares o tejido conectivo), poblaciones celulares (clasificando diferentes clulas sanguneas, por ejemplo) u orgnulos dentro de clulas individuales.

Colorantes
La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo.

Tincin Giemsa
Estos organismos adquieren una coloracin diferencial y se ven dentro del citoplasma de la clula husped. La tcnica de Giemsa est formada por varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno como tinte bsico y la eosina como tinte cido, lo que da una amplia gama de colores. El azul de metileno es un colorante metacromtico, de ah que muchas estructuras se tian de prpura y no de azul. El pH de la solucin de coloracin es crtico y se debe ajustar idealmente segn diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9.

Resultados : Citoplasma: rosa Grnulos de las clulas cebadas: prpura Ncleos: azul Bacterias:azul Eritrocitos: rosa naranja Parsitos: azul

 Monocito 400x

A,B,C.- Neutrfilos D.- Linfocito

Neutrfilo 400x

Plaquetas 400x

 A.- Neutrfilo B.- Monocito

Superior.- Neutrfilo Inferior .- Linfocito

Plaquetas 1000x

Linfocito 1000x

Tincin May-Grnwald Giemsa

Como el resto de las coloraciones basadas en la tcnica de Romanowsky, la tcnica MGG permite diferenciar cualitativa y cuantitativamente los principales elementos formes de la sangre.

En los laboratorios clnicos de hematologa resulta especialmente til para la demostracin de alteraciones en el nmero, proporcin y morfologa de las clulas sanguneas. Tambin puede ser adaptada para su utilizacin como una tcnica de tincin clsica para cortes histolgicos. Esta tcnica se basa en la accin complementaria de dos colorantes neutros y en la afinidad de los elementos celulares por los colorantes cidos o bsicos. Estos dos colorantes son MayGrnwald y Giemsa. Ambos colorantes son solubles en alcohol metlico y son, por lo tanto, inactivos: es el contacto del agua el que les da un poder colorante. Las sales se disocian entonces coloreando cido (eosina) y bsico (azul de metileno).

El empleo combinado de los colorantes May-Grnwald y Giemsa, se conocen con el nombre de tincin panptica de May-Grnwald Giemsa, esta tincin resalta de manera especial las granulaciones leucocitarias y mejora la coloracin de los eritrocitos. (Vives y Aguilar, 3 edicin 2006)
Tcnica: - Fijacin - Tincin con May-Grnwald - Lavado y rehidratacin - Tincin con Giemsa - Observacin

Resultado:
- Los ncleos aparecen en colores que van del color azul al prpuranegro. - Los citoplasmas de las clulas maduras aparecen de un color violeta muy plido o marrn muy plido. - Los glbulos rojos, ricos en hemoglobina aparecen de colores entre rosados y beige. - Los grnulos de los neutrfilos aparecen de colores entre violeta y marrn. - Los grnulos de los eosinfilos aparecen de color naranja. - Los grnulos de los basfilos de color entre azul y negro. - Los grnulos de los linfocitos grandes aparecen de color prpura. - Las clulas con gran produccin de ARN (como linfocitos productores de inmunoglobulinas y clulas inmaduras) presentan un citoplasma de color azul intenso. (Colaboradores de Wikipedia, 2012)

Clulas sanguneas 100x

Linfocito 1000x

Neutrfilo1000x

Clulas sanguneas 400x

Monocito1000x

Basfilo1000x

 la

Plaquetas 1000x

Neutrfilos 1000x

Eritrocitos 1000x

Eosinfilo1000x

Neutfilo1000x

Neutrfilo1000x

Conclusiones
Durante este trabajo experimental se pudo observar las distintas clulas sanguneas a travs de dos mtodos de tincin de laboratorio, con el fin de obtener una mejor nitidez de imagen al momento de la observacin en el microscopio ptico. Se ha logrado complementar algunos conocimientos sobre las diversas morfologas celulares, proporcionndonos una mayor precisin para distinguir las clulas a base de sus propias estructuras. La experiencia durante este experimento ha servido para aprender sobre el manejo y funcin de los distintos elementos del laboratorio, tales como el microscopio y las tinciones, indispensables para la correcta investigacin en el mbito cientfico.

Bibliografa
J. Vives y J Aguilar. Manual de Tcnicas de laboratorio en hematologa. Tercera edicin: Editorial Masson; 2006. Pg. 18-20 Colaboradores de Wikipedia. Tincin de Giemsa [en lnea]. Wikipedia, la enciclopedia libre. 2012 [fecha de consulta: 07 de abril del 2012]. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_Giemsa Colaboradores de Wikipedia. May-Grnwarld Giemsa [en lnea]. Wikipedia, la enciclopedia libre. 2012 [fecha de consulta: 07 de abril del 2012]. Disponible en: http://es.wikipedia.org/wiki/Tinci%C3%B3n_de_MayGr%C3%BCnwald/Giemsa http://html.rincondelvago.com/tinciones-hematologicas.html Biologa primer ao medio, Camilo Henrquez.