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J.P. Euzby : Abrg de Bactriologie Gnrale et Mdicale l'usage des tudiants de l'Ecole Nationale Vtrinaire de Toulouse (http://www.bacteriologie.

.net) Document destin aux travaux pratiques de bactriologie

Avertissement Ce document est destin aux travaux pratiques de bactriologie des tudiants de l'cole Nationale Vtrinaire de Toulouse. Il vient complter l'enseignement thorique et l'enseignement oral dispenss aux cours des sances de travaux pratiques. L'enseignement pratique destin aux futurs vtrinaires n'a pas pour vocation de les transformer en bactriologistes. Il a pour objectif de donner un aperu sur les modalits du diagnostic bactriologique conventionnel afin de favoriser le dialogue entre les vtrinaires praticiens et les laboratoires de diagnostic. Le diagnostic molculaire et le diagnostic immunologique sont abords aux cours d'autres sances de travaux pratiques. Toutes les manipulations effectues par les tudiants font pralablement l'objet d'une dmonstration. Il serait hors sujet d'envisager tous les dtails du diagnostic conventionnel, si bien que les quelques indications donnes ci-dessous sont limites aux manipulations ralises par les tudiants et elles sont simplifies. Cette simplification peut conduire quelques inexactitudes susceptibles de surprendre un bactriologiste. Toutefois, l'auteur espre que ces quelques approximations ne constituent pas des erreurs fondamentales. Des informations complmentaires peuvent tre trouves dans les ouvrages suivants : J. FRENEY, F. RENAUD, R. LECLERQ et P. RIEGEL : Prcis de bactriologie clinique, 2me d., Editions ESKA, Paris, 2007, 1764 pages. Voir notamment le chapitre 4 (pages 67-108). N. MARCHAL, J.L. BOURDON et C. RICHARD : Les milieux de culture pour l'isolement et l'identification biochimique des bactries. Doin diteurs, Paris, 1982, 482 pages.

Informations importantes Les sances de travaux pratiques dbutent 8h30 et elles ont lieu dans la salle de travaux pratiques de Microbiologie-Immunologie-Biologie molculaire. Les tudiants doivent se munir d'une blouse en coton, d'une pince mords plats (qui peut tre remplace par une pince linge), d'un feutre capable d'crire sur le verre et, si possible, d'un crayon gras.

Droulement des sances Jour 1 Remise d'un bouillon de culture contenant un mlange de deux bactries. 1

Etat frais, coloration de Gram. Isolement sur une glose trypticase-soja, une glose Columbia au sang de mouton, une glose BCP et une glose de Mac Conkey. Jour 2 Observation des isolements, reprage des deux types de colonies. Coloration de Gram sur chaque type de colonies. Ensemencement d'une galerie d'identification pour l'une des deux bactries. Jour 3 Lecture et interprtation de la galerie d'identification. Ralisation d'un antibiogramme. Jour 4 Lecture et interprtation de l'antibiogramme. Coloration de Ziehl sur un dcalque d'organe.

Prcautions prendre lors des manipulations Deux impratifs : Prvenir la contamination du manipulateur et de son entourage Eviter la contamination des milieux Mesures de scurit contre la contamination du manipulateur et de son entourage Le bactriologiste est responsable de ses actes vis--vis de lui-mme et de son entourage. Il doit respecter une discipline gnrale de travail, mme si les bactries tudies au cours des travaux pratiques ne prsentent pas un danger majeur. Avant de pntrer dans la salle de travaux pratiques, le bactriologiste doit (i) dposer au vestiaire ses vtements de ville tels que manteau, impermable, veste ... ainsi que tous les objets personnels non indispensables son travail et (ii) revtir une blouse propre ferme sur le devant (les blouses en fibres synthtiques sont prohibes car elles sont inflammables et supportent mal l'bullition et la javellisation). Il est interdit de manger, de boire ou de fumer dans un laboratoire de bactriologie ou dans la salle de travaux pratiques. En cours de travail, les mains peuvent tre souilles. Aussi, on vitera de porter les mains au visage, de toucher des objets personnels (mouchoirs, sac, ...), de serrer la main d'un visiteur, etc. 2

Le lavage des mains doit tre effectu au moindre soupon de contamination. Aprs les manipulations il convient de nettoyer soigneusement les paillasses et de les dsinfecter avec de l'eau de Javel. Une dsinfection immdiate doit tre effectue en cas de projection de matire virulente ou lors de la casse accidentelle d'un rcipient contenant un produit pathologique ou une culture bactrienne. Tout matriel en verre ayant t au contact avec une matire virulente doit tre plac dans les bocaux contenant de l'eau de Javel. Mesures destines viter la contamination des milieux Il est impratif de travailler dans le cne de strilit d'un bec bunsen, sans parler et en vitant les courants d'air.

Etat frais Dposer une goutte d'une culture en milieu liquide sur une lame de verre. Recouvrir la goutte d'une lamelle couvre objet (la culture ne doit pas dborder les contours de la lamelle). Luter la lame avec de la paraffine fondue. Observer immdiatement au microscope (objectif x40, condenseur non relev au maximum, diaphragme non compltement ouvert). Aprs observation jeter immdiatement la lame dans un bocal contenant de l'eau de Javel

Coloration de Gram (Kit Gram-Nicolle RAL) Voir aussi le fichier Principe de la coloration de Gram partir d'une culture en milieu liquide Dposer une goutte de bouillon au centre d'une lame de verre, taler la goutte et laisser scher. Fixer par flambage l'alcool 95. Recouvrir la lame de violet de gentiane phniqu et laisser agir une minute. Rincer rapidement l'eau du robinet et liminer l'excs d'eau. Recouvrir la lame de lugol ("Liquide de lugol stabilis PVP") et laisser agir une minute. Rincer l'eau du robinet et liminer l'excs d'eau. Diffrencier (dcolorer) avec un mlange alcool -actone ("Diffrenciateur rapide"). Ce temps est le plus dlicat de la coloration de Gram (cf. dmonstration ralise au cours des travaux pratiques). Rincer abondamment l'eau du robinet. Recouvrir la lame de fuchsine de Ziehl 1/10 et laisser agir une minute. 3

Rincer l'eau du robinet. Scher puis observer au microscope (objectif x100 immersion). partir d'une colonie Dposer une goutte d'eau sur une lame de verre. Prlever un fragment de colonie l'aide d'une pipette Pasteur boutonne. Dissocier soigneusement l'inoculum dans la goutte d'eau et laisser scher. Fixer par flambage l'alcool 95. Poursuivre la coloration comme indique ci-dessus.

Coloration de Ziehl (Ziehl-Neelsen) Les lames remises aux tudiants (dcalque d'organe) sont dj fixes. Recouvrir la lame de Fuchsine de Ziehl. Chauffer jusqu' mission de vapeurs blanches (voir dmonstration effectue lors des travaux pratiques). Laisser refroidir environ trois minutes. Rpter deux fois le chauffage si bien que dans un temps de l'ordre de 10 minutes la lame aura t chauffe trois fois. Rincer l'eau du robinet. Recouvrir la lame d'acide sulfurique au 1/4 et laisser agir une minute. Rincer l'eau du robinet. Recouvrir la lame d'alcool 95 et laisser agir une minute. Rincer l'eau du robinet. Recouvrir la lame avec une solution dilue de bleu de mthylne et laisser agir deux minutes. Rincer l'eau du robinet. Scher puis observer au microscope (objectif x100 immersion).

Milieux de culture utiliss au cours des travaux pratiques Pour une information gnrale concernant les milieux de culture, voir le fichier "Nutrition et croissance des bactries (procaryotes)". Bouillon Trypticase- soja bioMrieux (composition en grammes par litre) : bio-Trypcase : 17 g/L bio-Soyase : 3 g/L Chlorure de sodium : 5 g/L Phosphate bipotassique : 2,5 g/L 4

Glucose : 2,5 g/L pH : 7,3 Le bouillon trypticase soja est un milieu largement utilis et permettant la croissance de bactries exigeantes. Glose Trypticase-soja bioMrieux (composition en grammes par litre) : bio-Trypcase : 15 g/L bio-Soyase : 5 g/L Chlorure de sodium : 5 g/L Agar : 15 g/L pH : 7,3 La glose trypticase-soja prsente les mmes avantages que le bouillon, mais elle permet de raliser un isolement. Glose Columbia + 5% sang de mouton bioMrieux bio-Polytone : 10 g/L Hydrolysat de protines animales et vgtales : 10 g/L bio-Myotone : 3 g/L Amidon de mas : 1 g/L Chlorure de sodium : 5 g/L Agar : 13,5 Sang dfibrin de mouton : 5% pH : 7,3 La glose Columbia contient de l'amidon qui joue un rle protecteur en neutralisant des substances toxiques contenues dans les milieux ou labores au cours de la culture. Outre son rle nutritif, la prsence de sang permet de visualiser des zones d'hmolyse qui sont particulirement nettes sur ce milieu. Glose de Mueller Hinton bioMrieux Infusion de viande buf : 300 g/L bio-Case : 17,5 g/L Amidon : 1,5 g/L Agar : 17 g/L pH : 7,3 La glose de Mueller-Hinton est le milieu de rfrence pour l'tude de la sensibilit aux antibiotiques. Glose BCP bioMrieux : Extrait de viande de buf : 3 g/L bio-Polytone : 5 g/L Lactose : 10 g/L 5

Agar : 10 g/L Bromocrsol pourpre : 25 mg/L Ce milieu permet la croissance des bactries sans exigences particulires. La prsence de lactose et d'un indicateur de pH permet de diffrencier les bactries qui fermentent le lactose de celles qui ne le fermentent pas. Toutefois, ce milieu donne des rsultats difficiles interprter lors de l'isolement de prlvements polymicrobiens renfermant la fois des bactries lactose-positives et lactose-ngatives. En effet, le virage de l'indicateur diffuse dans le milieu. De plus, une ralcalinisation rapide est observe lors d'une incubation suprieure 18-24 heures. Les bactries lactose-positives donnent des colonies jaunes et les bactries lactose-ngative donnent des colonies bleues. La glose BCP prsente l'avantage d'abolir ou de limiter l'essaimage des Proteus spp. Glose de Mac Conkey bioMrieux bio-Gelytone : 17 g/L bio-Polytone : 3 g/L Lactose : 10 g/L Sels biliaires : 1,5 g/L Chlorure de sodium : 5 g/L Agar : 13,5 g/L Rouge neutre : 0,03 g/L Cristal violet : 0,001 g/L pH : 7,1 La glose de MacConkey contient deux inhibiteurs : le cristal violet (qui inhibe la croissance des bactries Gram positif) et les sels biliaires (slection des entrobactries). Ce milieu contient galement du lactose et un indicateur de pH. Les bactries lactose-positives donnent des colonies d'une couleur rouge brique ou rose, entoures d'un halo opaque d la prcipitation des sels biliaires. Les bactries lactose-ngatives donnent des colonies incolores. Glose viande-foie (VF) Peptone pepsique de viande et de foie : 30 g/L Glucose : 2 g/L Agar : 6 g/L Ce milieu sera utilis pour l'tude du type respiratoire (Cf. infra).

Eau peptone Milieu prsent dans certains microtubes de la galerie d'identification (voir galeries API 20 E) Eau distille : 1 L Peptone trypsique : 15 g NaCl : 5 g L'eau peptone doit tre exempte d'indole et de sucres fermentescibles et elle doit contenir du tryptophane en quantit suffisante. 6

Galerie d'identification l'exception de la recherche du type respiratoire, du test catalase et du test oxydase, l'identification sera conduite l'aide d'un dispositif commercialis et prt l'emploi, la galerie API 20 E (bioMrieux). Une prsentation de cette galerie est donne ci-dessous (voir page 16).

Etude du type respiratoire Principe Les milieux utiliss contiennent du glucose (mtabolisme nergtique), mais ils sont dpourvus de nitrates qui pourraient tre rduits et permettre le dveloppement en anarobiose de certaines bactries arobies (par exemple, Pseudomonas aeruginosa). On utilise des gloses profondes telle que la glose VF (viande foie), coules dans des tubes longs et troits (180 mm x 9 mm). Technique Au moment de l'emploi, placer les tubes dont la capsule a t partiellement dvisse dans un bain-marie bouillant pendant 20 minutes (rgnration du milieu). Maintenir les milieux en surfusion dans un bainmarie 45-50 C. Plonger l'effilure d'une pipette pasteur boutonne et strilise par flambage dans une suspension de la bactrie tudier. Transporter l'inoculum dans le fond du tube puis remonter la pipette en dcrivant des tours de spires trs serrs en prenant soin de ne pas arer le milieu. Incuber 37 C durant 18 24 heures Lecture Aprs incubation, on peut reconnatre quatre types respiratoires : bactrie arobie (arobie strict) : croissance uniquement dans la zone superficielle de la glose ; bactrie anarobie (anarobie strict) : croissance uniquement dans la zone profonde de la glose ; bactrie aro-anarobie (aro-anarobie facultatif) : croissance sur toute la hauteur de la glose ; bactrie micro-arophile : croissance dans un cylindre de glose d'environ 0,5 cm de hauteur et situ environ 1 2 cm de la surface.

Recherche de la catalase Principe En prsence d'oxygne molculaire, certaines ractions mtaboliques conduisent la formation d'eau oxygne. La catalase est une enzyme qui dgrade l'eau oxygne en eau et oxygne. 7

Technique Dposer sur une lame de verre une ou deux gouttes d'eau oxygne 10 volumes. Prlever l'aide de l'effilure d'une pipette pasteur un fragment de colonie et dissocier la culture dans l'eau oxygne. Lecture La prsence d'une catalase se traduit, en quelques secondes, par la formation de bulles d'oxygne. Remarques Au cours des travaux pratiques, l'eau oxygne 10 volumes sera remplace par un ractif commercialis, ID color Catalase (bioMrieux). Ce ractif est constitu d'eau oxygne 10 volumes, d'un agent paississant et de bleu d'Evans. La raction est cense tre plus lisible et plus stable grce la prsence de l'agent paississant qui emprisonne les bulles d'oxygne. Il est conseill de ne pas prlever la culture sur une glose au sang car le sang possde une activit catalasique. Aussi, la prsence de sang pourrait provoquer une raction faussement positive.

Recherche de l'oxydase Principe Le test de l'oxydase met en vidence la prsence d'une cytochrome-oxydase qui oxyde le cytochrome c rduit. Ce test met en vidence la prsence de cytochrome c dans les chanes respiratoires grce des ractifs ayant le mme potentiel d'oxydo-rduction que le cytochrome c. La raction est schmatiquement la suivante : cyt c oxyd + ractif rduit ---> ractif color. Technique Plusieurs ractifs sont commercialiss et plusieurs mthodes peuvent tre utilises. Au cours des travaux pratiques, la recherche de l'oxydase sera effectue l'aide de bandelettes "Bactident Oxydase" (Merck) dont la zone ractionnelle est compose d'un papier filtre imprgn de N,N-dimthyl-1,4phnylnediaminedichlorure. Prlever l'aide de l'effilure d'une pipette pasteur un fragment de colonie et dissocier la culture sur le papier filtre. Lecture La prsence d'une cytochrome-oxydase se traduit, en 20 60 secondes, par l'apparition d'une coloration rouge virant rapidement au violet trs fonc.

Recherche d'une nitrate-rductase 8

Principe Certaines bactries peuvent utiliser comme accepteur final d'lectrons des composs minraux riches en oxygne (respiration anarobie). C'est le cas en particulier des nitrates qui sont alors rduits en nitrites. La rduction peut aller au-del du stade nitrites et conduire la formation d'azote gazeux (N2). La recherche d'une nitrate-rductase se fait par la mise en vidence des nitrites forms. Les nitrites en milieu actique ou sulfurique donnent une coloration rose ou rouge en prsence d'acide parasulfanilique et d'alpha-naphtylamine. Toutefois, comme certaines bactries rduisent les nitrates au-del du stade nitrites, toute raction apparaissant ngative (absence de coloration rose ou rouge) doit tre contrle pour constater la prsence ou la disparition des nitrates contenus l'origine dans le milieu. Dans ce but, on ajoute au milieu de la poudre de zinc (preuve de Zo Bell). Le zinc est un agent rducteur capable de rduire en quelques minutes les nitrates en nitrites. Si la raction est vritablement ngative, les nitrates toujours prsents dans le milieu sont rduits en nitrites sous l'action du zinc et une coloration rose ou rouge apparat. Si la raction est faussement ngative, les nitrates ont t rduits par les bactries en azote gazeux. Le milieu ne contient plus de nitrates et lorsque la poudre de zinc est ajoute, la teinte du milieu n'est pas modifie. Technique Cultiver la bactrie dans un bouillon nitrat (1 p. mille de nitrate de potassium). Incuber 37 C jusqu' l'obtention d'une culture abondante. Ajouter une ou deux gouttes d'acide parasulfanilique en milieu actique (ractif NIT 1) puis une deux gouttes d'alpha-naphtylamine en milieu actique (ractif NIT 2). Lecture Apparition en quelques secondes d'une coloration rose ou rouge : raction positive, la bactrie rduit les nitrates en nitrites. Absence de coloration : ajouter de la poudre de zinc : Apparition en cinq minutes d'une coloration rose ou rouge : raction ngative. Absence de coloration : raction positive (bactrie rduisant les nitrites jusqu'au stade azote gazeux). Remarque Dans une galerie API 20 E, la recherche de la nitrate rductase se fait dans le tube marqu GLU (glucose). Cette recherche doit s'effectuer aprs avoir not une ventuelle acidification du glucose (cf. infra).

Etude de l'acidification des glucides et drivs Principe

Ces tests recherchent la capacit d'un germe utiliser par voie oxydative ou fermentative un substrat carbon avec production de mtabolites acides (production faible pour les bactries mtabolisme oxydatif, production importante pour les bactries mtabolisme fermentatif). Les substrats utiliss au cours des travaux pratiques sont lists ci-dessous : Oses : arabinose (pentose), glucose (hexose). Drivs des oses : amygdaline, mannitol, rhamnose, sorbitol. Diholosides : mlibiose, saccharose. Molcule organique cyclique : inositol. Le substrat carbon, dont on veut tudier l'acidification, doit tre plac dans un milieu ne contenant aucun autre substrat fermentescible (par exemple une eau peptone). L'utilisation du substrat carbon conduit une acidification du milieu rvle par un indicateur de pH. Technique Ensemencer le milieu contenant le substrat carbon et l'indicateur de pH (bleu de bromothymol). Incuber 18 24 heures 37 C. Lecture Le virage au jaune du bleu de bromothymol indique l'utilisation du substrat carbon (la fermentation commence dans la partie infrieure du tube, l'oxydation dbute dans la partie suprieure du tube). La prsence d'une coloration bleue ou bleue-verte est le signe d'une raction ngative.

Test ONPG (orthonitrophnyl-bta-D-galactopyranoside) Principe Pour que le lactose soit utilis par les bactries, il doit tre scind par des enzymes intracellulaires, les bta-galactosidases. Ces enzymes sont spcifiques de la liaison bta-1,4-osidique et elles hydrolysent le lactose en glucose et galactose. Pour qu'une bactrie utilise le lactose, il faut que le lactose puisse pntrer dans la cellule. Cette pntration ncessite une autre enzyme, la bta-galactoside permase. Si cette enzyme est dficiente ou absente, une bactrie potentiellement capable d'utiliser le lactose (possdant une bta-galactosidase) ne pourra exprimer ce caractre et paratra lactose ngative. L'objet du test ONPG est d'tudier l'existence d'une bta-galactosidase (et donc la possibilit d'acidifier le lactose), indpendamment de la prsence ou de l'absence d'une bta-galactoside permase. La lecture est alors trs rapide et on dispose ainsi d'une raction complmentaire pour l'tude des germes apparaissant lactose ngative aprs 24 48 heures d'incubation. La bta-galactosidase libre de la cellule bactrienne (lyse thoriquement provoque par le tolune) va agir sur un galactose substitu, l'orthonitrophnyl-bta-D-galactopyranoside ou ONPG. L'hydrolyse de l'ONPG libre de l'orthonitrophnol qui prsente une coloration jaune trs stable. Technique Raliser une suspension du germe tudier dans de l'eau physiologique contenant une solution tamponne d'ONPG. 10

Incuber 37 C aprs avoir ventuellement ajout une goutte de tolune. Lecture Apparition d'une coloration jaune : bactrie ONPG positive. Absence de coloration, bactrie ONPG ngative. Remarques En cas de raction positive, une coloration jaune apparat souvent en moins de 30 minutes. Toutefois, dans le cadre des travaux pratiques la raction ne sera lue qu'aprs 18 24 heures d'incubation. Toutes les bactrie possdant une bta-galactosidase prsentent un test ONPG positif. Toutefois, certaines bactries dpourvues de bta-galactosidase peuvent hydrolyser l'ONPG grce une autre enzyme appele ONPGase. La dnomination de "test ONPG" est donc plus correcte que la dnomination de "recherche de la bta-galactosidase".

Utilisation du citrate Principe Certaines bactries sont capables d'assimiler le citrate, c'est dire capables d'utiliser le citrate comme unique source de carbone et d'nergie. Ces bactries possdent une citrate permase et les enzymes du catabolisme du citrate. De telles bactries sont capables de crotre sur un milieu synthtique, le milieu au citrate de Simmons, dont l'unique source de carbone est le citrate de sodium. Ce milieu contient galement des sels d'ammonium comme unique source d'azote et du bleu de bromothymol comme indicateur de pH. Initialement, le pH du milieu est de 7,0 et, un tel pH, le bleu de bromothymol a une teinte verte. La croissance sur le milieu au citrate de Simmons s'accompagne gnralement d'une alcalinisation provoquant le virage au bleu (bleu outre-mer) du bleu de bromothymol. Technique Ensemencer le milieu au citrate de Simmons partir d'une culture prleve sur un milieu glos. En aucun cas on ne se servira d'une culture en bouillon ou en eau peptone qui apporterait avec les germes des lments nutritifs susceptibles de fausser les rsultats. Incuber 37 C. Observer le milieu tous les jours durant cinq jours. Lecture La majorit des auteurs considre qu'une bactrie est citrate de Simmons positive lorsqu'elle utilise le citrate en provoquant une alcalinisation du milieu. Cette interprtation est celle retenue par bioMrieux pour la lecture d'une galerie API 20 E. Prsence d'une coloration bleue (mme localise uniquement en surface) : raction positive. Prsence d'une coloration verte dans tout le milieu : raction ngative (mme en prsence d'une culture). 11

Raction de Voges-Proskauer (VP) Principe Les ractions de Voges-Proskauer (VP) permet l'tude des drivs de l'acide pyruvique. Le glucose, utilis par les bactries, est dgrad en acide pyruvique qui est un intermdiaire clef du mtabolisme des glucides. Selon les bactries, l'acide pyruvique peut tre compltement oxyd ou tre le point de dpart de diverses voies fermentaires conduisant une trs grande varit de composants finaux dont la nature est caractristique du type fermentaire : La fermentation acide mixte conduit la production d'acide formique, d'acide actique, d'acide lactique, d'acide propionique, d'acide succinique, de dioxyde de carbone, d'hydrogne, d'thanol, etc. La fermentation acide mixte provoque une acidification importante d'un milieu glucos. La fermentation acide mixte est tudie par le test au rouge de mthyle non effectu dans le cadre des travaux pratiques. La fermentation butylne glycolique (butanediolique) conduit la production de 2-3-butanediol. La suite des ractions conduisant au 2-3-butanediol est la suivante : (i) condensation de deux molcules de pyruvate avec dcarboxylation et formation d'acide alpha-actolactique, (ii) dcarboxylation de l'alphaactolactate et formation d'actone (hydroxy-3-butanone) et (iii) rduction de l'actone en 2-3 butanediol. Le test VP permet de caractriser l'actone. En prsence d'oxygne et d'une base forte (soude 4M ou potasse 4M), l'actone est oxyde en diactyle qui forme un complexe color en rose en ragissant avec une fonction amine d'un groupement guanidyle des protines. La raction est plus sensible et plus rapide en prsence d'alpha-naphtol. Technique Ensemencer un milieu de Clark et Lubs (peptone, phosphate bipotassique, glucose, pH 7,5). Incuber 48 heures 37 C. Prlever 1 mL de milieu et ajouter 0,5 mL de KOH ou de NaOH (ractif VP 1) et 0,5 mL d'alpha-naphtol (ractif VP 2). Lecture Attendre un temps maximum de 10 minutes. La prsence d'actone (bactrie VP positive) se traduit par une coloration rose en surface mais pouvant diffuser dans tout le milieu. Remarques Le milieu utilis dans une galerie API 20E est un milieu de Clark et Lubs modifi dans lequel le glucose est remplac par de l'acide pyruvique ce qui permet de lire le test aprs 24 heures d'incubation. Dans une galerie API 20E, les ractifs VP 1 (hydroxyde de potassium) et VP 2 sont directement ajouts au milieu (sans qu'il soit ncessaire de prlever un aliquot du milieu).

Glatinase (mthode de Kohn-Lautrop) Principe 12

La technique rapide de Kohn-Lautrop consiste faire attaquer par la bactrie tudier un fragment de glatine dans lequel on a pralablement inclus du charbon de bois finement pulvris (glatine dnature au charbon). La glatinase, ventuellement produite par le germe, dsagrge la glatine et libre le charbon de bois qui diffuse dans tout le milieu. Technique Ensemencer un tube d'eau peptone dans lequel est introduit de la glatine dnature au charbon. Incuber 37 C. Observer quotidiennement pendant au moins 8 jours. Lecture L'hydrolyse de la glatine se traduit par la libration de particules de charbon de bois qui colorent le milieu en noir. Remarque Au cours des travaux pratiques, la lecture sera effectue aprs 18 24 heures d'incubation.

Test LDC (lysine dcarboxylase), ODC (ornithine dcarboxylase) et ADH (arginine dihydrolase) Principe Ces enzymes, dont l'action est favorise en milieu acide, forment des substances alcalines partir des acides amins. La dcarboxylation de la lysine produit de la cadavrine, la L-ornithine est dcarboxyle en putrescine et l'arginine est dcarboxyle en agmatine puis hydrolyse en putrescine. Les milieux utiliss ne contiennent qu'un seul acide amin (lysine, ornithine ou arginine), du glucose, des extraits de levure, du chlorure de sodium et un indicateur de pH (rouge de phnol). La recherche de ces enzymes n'est effectue que pour des bactries mtabolisme fermentatif. Dans un premier temps, les bactries fermentent le glucose et les milieux s'acidifient (virage au jaune du rouge de phnol). pH acide, la synthse des dcarboxylases est favorise et ces enzymes prsentent une activit maximale. Dans un second temps, la production ventuelle d'une dcarboxylase conduit la formation de composs alcalins et l'alcalinisation du milieu ce qui provoque le virage au rouge du rouge de phnol. Technique Ensemencer chacun des trois tubes avec une suspension bactrienne. Raliser une anarobiose en recouvrant la surface du milieu d'huile de paraffine. Incuber 37 C. Lecture Apparition d'une coloration jaune (acidification du milieu) : raction ngative. Apparition d'une coloration orange fonce ou rouge (alcalinisation du milieu) : raction positive. 13

Remarque Dans une galerie API 20 E, un tampon acide remplace l'acidification due la fermentation du glucose, d'o une sensibilit plus grande.

Hydrolyse de l'ure (urase). Principe L'urase est une enzyme qui hydrolyse l'ure et conduit la formation d'ammoniac et de dioxyde de carbone. En solution, le produit final de la raction est le carbonate d'ammonium qui alcalinise le milieu. Technique Ensemencer un milieu synthtique contenant de l'ure, du tryptophane et du rouge de phnol (milieu ureindole). Recouvrir la surface du milieu d'huile de paraffine pour viter la libration d'ammoniac. Incuber 18 24 heures 37 C. Lecture Urase positive : le milieu prsente une coloration rouge violace ou orange fonce. Urase ngative : le milieu a une teinte jaune.

Tryptophane dsaminase Principe La tryptophane dsaminase dsamine le tryptophane pour donner de l'acide indole-pyruvique. En prsence de perchlorure de fer et en milieu acide, l'acide indole-pyruvique donne un compos de couleur brune fonce (presque noire). Technique Ensemencer un milieu ure-indole. Incuber 18 24 heures 37 C. Lecture Ajouter une goutte d'une solution acide de perchlorure de fer (ractif TDA). Apparition d'une coloration brune fonce : bactrie TDA positive. Apparition d'une coloration jaune : bactrie ne produisant pas de tryptophane dsaminase.

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Remarque Dans une galerie API 20 E, le milieu ure-indole est remplac par de l'eau peptone enrichie en tryptophane.

Production d'indole Principe Certaines bactries dsaminent puis hydrolysent le tryptophane pour donner une molcule d'indole. L'indole ragit avec la fonction aldhyde du paradimthylaminobenzaldhyde pour donner un compos color en rouge. Technique Ensemencer un milieu ure-indole. Incuber 18 24 heures 37 C. Lecture Ajouter une goutte du ractif de James dont la composition n'est pas rvle par la socit bioMrieux. Raction positive : apparition d'une coloration rouge qui diffuse dans tout le milieu. Raction ngative : milieu incolore ou prsentant une lgre coloration jaune. Remarque Dans une galerie API 20 E, le milieu ure-indole est remplac par de l'eau peptone enrichie en tryptophane.

Production d'hydrogne sulfur : recherche d'une thiosulfate rductase Principe L'hydrogne sulfur peut tre form par le mtabolisme des acides amins soufrs (mthionine, cystine, cystine) ou par la rduction de composs oxyds du soufre comme le thiosulfate. Seule la rduction du thiosulfate est envisage ci-dessous. La rduction du thiosulfate par une thiosulfate rductase conduit la formation de sulfate et d'hydrogne sulfur. En prsence de sulfate de fer, l'hydrogne sulfur donne un prcipit noir de sulfure de fer. Technique Ensemencer un milieu contenant du thiosulfate et du sulfate de fer. Recouvrir la surface du milieu d'huile de paraffine pour piger l'ventuel dgagement gazeux d'hydrogne sulfur. Incuber 18 24 heures 37 C. 15

Lecture La synthse d'une thiosulfate rductase conduit l'apparition d'une coloration noire.

Prsentation des galeries API 20 E (d'aprs la documentation bioMrieux). Principe La galerie API 20 E, commercialise par la socit bioMrieux, est un systme miniaturis, prt l'emploi et standardis. La galerie comporte 20 microtubes contenant des substrats dshydrats. Au-dessous de chaque tube, un sigle indique la nature du test. Les tubes sont ensemencs avec une suspension bactrienne effectue en eau physiologique (milieu "Suspension Medium"). Les ractions produites au cours de la priode d'incubation se traduisent par des virages colors spontans ou rvls par l'addition de ractifs (voir cidessous le tableau de lecture). Un fond et un couvercle compltent la galerie sensu stricto et permettent de constituer une bote d'incubation. La galerie API 20 E permet d'effectuer les tests suivants : ONPG, ADH, LDC, ODC, citrate de Simmons (CIT), production d'hydrogne sulfur par rduction du thiosulfate (H2S), synthse d'une urase (URE), recherche d'une tryptophane dsaminase (TDA), recherche du pouvoir indologne (IND), production d'actone (VP), synthse d'une glatinase (GEL), recherche de l'acidification de neuf "glucides" : glucose (GLU), mannitol (MAN), inositol (INO), sorbitol (SOR), rhamnose (RHA), saccharose (SAC), mlibiose (MEL), amygdaline (AMY), et arabinose (ARA). La galerie permet galement la recherche de la nitrate rductase qui se fait dans le microtube "GLU". Technique Placer de l'eau dans les alvoles prsents dans le fond de la boite afin de crer une atmosphre humide. Retirer la galerie de son emballage et la placer dans le fond de la bote. Prlever l'aide d'une pipette pasteur boutonne une colonie parfaitement isole. Dissocier soigneusement la colonie dans une ampoule de "suspension Medium". l'aide d'une pipette munie d'une poire remplir les microtubes de la galerie. Au sein des microtubes, le fabriquant distingue deux parties, le tube et la cupule. Selon les tests, la suspension bactrienne doit tre place uniquement dans le tube ou dans le tube et la cupule. Lorsque le sigle du test est encadr, ce qui est le cas des tests CIT, VP et GEL, la suspension doit remplir le tube et la cupule. Lorsque que le sigle du test est soulign (ADH, LDC, ODC, URE, H2S), la suspension doit remplir uniquement le tube. Aprs ensemencement complet de la galerie, la cupule sera secondairement remplie d'huile de paraffine. 16

Lorsque le sigle du test n'est ni encadr ni soulign (ONPG, TDA, IND, GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA), la suspension doit remplir uniquement le tube.

Refermer la bote d'incubation, crire les rfrences du prlvement sur la languette du fond de la bote et placer la bote 37 C durant 18 24 heures. Lecture Sortir la bote de l'tuve et noter sur la fiche de lecture les rsultats obtenus pour les tests lecture spontane (voir ci-dessous le tableau de lecture). Rvler les tests ncessitant l'addition de ractifs (voir ci-dessous le tableau de lecture) : TDA : ajouter une goutte du ractif TDA IND : ajouter une goutte du ractif de James VP : ajouter une goutte du ractif VP 1 et une goutte du ractif VP 2 Nitrate rductase : aprs avoir not le rsultat obtenu pour l'acidification du glucose, ajouter une goutte du ractif NIT 1 et une goutte du ractif NIT 2. Si aucune coloration rouge n'est obtenue (attendre deux trois minutes), ajouter une petite quantit de poudre de zinc. Noter les rsultats sur la fiche de lecture. Calculer le profil numrique. Sur la fiche de rsultats, les tests sont spars par groupe de trois (chaque groupe de trois tests est spar du groupe voisin par un trait vertical). Chaque test donnant une raction ngative prend la valeur 0. 17

Lorqu'un test est positif, il prend la valeur 1, 2 ou 4 selon sa position au sein d'un groupe de trois : si le premier test d'un groupe de trois est positif il est not 1, si le deuxime test est positif il est not 2 et si le dernier test d'un groupe de trois est positif il est not 4. Le 21me test mentionn sur la fiche de rsultat (OX), correspond l'oxydase (test ralis avant l'ensemencement de la galerie). Pour chaque groupe de trois, additionner les chiffres correspondants. On obtient un nombre sept chiffres qui constitue le profil numrique de la souche tudie. La recherche du profil numrique dans le "Catalogue analytique" commercialis par le fabriquant permet d'identifier la bactrie. Si le profil sept chiffres ne permet pas une identification, il convient de noter les rsultats obtenus pour les tests rduction des nitrates en nitrites (NO2), rduction des nitrates en azote (N2), mobilit (MOB), croissance sur glose de Mac Conkey (McC), oxydation du glucose (OF-O), fermentation du glucose (OF-F). On obtient alors un profil numrique neuf chiffres plus discriminant que le prcdent.

Tableau de lecture d'une galerie API 20 E Tests* Ractions Composants actifs Ajout de ractifs Ngatif ONPG Bta-galactosidase ADH LDC ODC CIT H2S URE TDA IND VP GEL GLU Arginine dihydrolase Lysine dcarboxylase 2-nitrophnyl-bta-Dgalactopyranoside L-arginine L-lysine Non Non Non Non Non Non Non TDA James VP1 VP2 Glatinase Glucose Glatine de buf D-glucose 18 Non Non Incolore Jaune Jaune Jaune Rsultats Positif Jaune Orange ou rouge Orange ou rouge Orange ou rouge

Ornithine dcarboxylase L-ornithine Assimilation du citrate Thiosulfate rductase Urase Citrate trisodique Thiosulfate de sodium Ure

Vert ple ou Bleu-vert ou jaune bleu Incolore ou gristre Jaune Jaune Incolore ou jaune Incolore Dpt noir Orange ou rouge violac marron ou brun fonc Rose ou rouge Rose ou rouge

Tryptophane dsaminase L-tryptophane Production d'indole Production d'actone L-tryptophane Pyruvate de sodium

Non diffusion Diffusion du du charbon charbon Bleu ou bleu Jaune

vert MAN INO SOR RHA SAC MEL AMY ARA Mannitol Inositol Sorbitol Rhamnose Saccharose Mlibiose Amygdaline Arabinose D-mannitol Inositol D-sorbitol L-rhamnose D-saccharose D-mlibiose Amygdaline L-arabinose Non Non Non Non Non Non Non Non Bleu ou bleu Jaune vert Bleu ou bleu Jaune vert Bleu ou bleu Jaune vert Bleu ou bleu Jaune vert Bleu ou bleu Jaune vert Bleu ou bleu Jaune vert Bleu ou bleu Jaune vert Bleu ou bleu Jaune vert

* Pour les tests dont les sigles sont crits en lettres noires seul le tube doit tre ensemenc. Pour les tests dont les sigles sont crits en lettres rouges le tube et la cupule doivent tre ensemencs. Pour les tests dont les sigles sont crits en lettres bleues seul le tube doit tre ensemenc. Aprs ensemencement, la cupule doit tre remplie d'huile de paraffine.

Antibiogramme par la mthode de diffusion Principe Voir le fichier "Antibiogramme". Technique L'antibiogramme par la technique de diffusion est l'objet d'une standardisation rigoureuse (voir le fichier "Standardisation de l'antibiogramme". Notamment, la densit de l'inoculum bactrien est un lment primordial et elle doit tre ajuste l'aide d'un photomtre ou par comparaison avec un talon d'opacit. Au cours des travaux pratiques, il est difficile d'ajuster de manire prcise la densit de cet inoculum et la technique indique ci-dessous conduit des rsultats certainement errons. Toutefois, le but des travaux pratiques est de faire comprendre un principe et non de rendre des rsultats corrects un vtrinaire praticien. Aussi, pour des raisons pratiques, une technique peu prcise sera utilise. Prlever une colonie parfaitement isole l'aide d'une pipette Pasteur boutonne. Dissocier la colonie dans un tube contenant 10 mL d'eau physiologique strile. Homogniser soigneusement la suspension. 19

Prlever 1 mL de la suspension obtenue et le transfrer dans un deuxime tube contenant 10 mL d'eau physiologique. Homogniser soigneusement la suspension. l'aide d'une pipette Pasteur, inonder la surface d'une glose de Mueller-Hinton avec deux quatre mL de la suspension. Enlever soigneusement l'excs de liquide. Scher les botes temprature ambiante. Appliquer les disques l'aide du distributeur de disque. Antibiotiques tests : ampicilline, streptomycine, gentamicine, colistine, acide nalidixique, association trimthoprime/sulfamthoxazole. Incuber 18 24 heures 37 C. Lecture Voir le fichier "Antibiogramme". Pour chacun des disques d'antibiotique, mesurer le diamtre de la zone d'inhibition. Comparer ce diamtre aux diamtres critiques indiqus dans le tableau ci-dessous. Concentrations et diamtres critiques pour une espce de la famille des Enterobacteriaceae (d'aprs les "Recommandations du Comit de l'antibiogramme de la SFM") Antibiotique (symbole) Charge du disque Concentrations critiques (mg/L) S Ampicilline (AM) Streptomycine (S) Gentamicine (GM) Acide nalidixique (NA) Colistine (CS) Trimthoprime/Sulfamthoxazole (SXT) 10 g 10 g 10 UI (15 g) 30 g 50 g 1,25/23,75 g 4 8 2 8 2 2 /38 R > 16 > 16 >4 > 16 >2 > 8 /152 Diamtres critiques (mm) S 19 15 16 20 15 16 R < 14 < 13 < 14 < 15 < 15 < 10

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