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Introduccin
Significa "Escribir en Colores.
Los componentes de una mezcla pueden presentar una tendencia diferente a permanecer en cualquiera de las fases involucradas.

Cromatografa

Es la separacin de dos o ms compuestos qumicos en un medio.

Aspectos histricos de la cromatografa

La tcnica de cromatografa aparece en 1850.
El qumico F.F.Runge, que trabajaba con tintas, descubre que los cationes orgnicos se podan separar por migracin cuando se colocaba una solucin que los contena sobre un material poroso, como papel.

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Aspectos histricos de la cromatografa

En 1906 el botnico ruso Tswett utiliz la cromatografa de columna para separar extractos vegetales coloreados.
Por primera vez se utiliza el nombre de cromatografa.

Aspectos histricos de la cromatografa

A partir de 1940 los mtodos cromatogrficos adquieren extensin mundial.
En 1940 Tiselius divide los mtodos cromatogrficos en cromatografa por anlisis frontal, desarrollo por elusin y desarrollo por desplazamiento, obtuvo el premio Nbel por sus trabajos en 1948.

En 1930 Lederer consigue separar los colorantes de la yema de huevo. Los qumicos Khun, Kamer y Ruzucca desarrollan la cromatografa en el campo de la qumica orgnica e inorgnica.
Obtienen el premio Nbel por sus trabajos en 1937, 1938, 1939 respectivamente.

Para el mismo tiempo la cromatografa comienza a aplicarse en el campo de la bioqumica.

Martin consigue separar algunos aminocidos acetilados.

Conceptos generales
La cromatografa se basa en un conjunto de tcnicas asociadas al principio de retencin selectiva.
Permite separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

Tipos de cromatografa
Cromatografa plana: La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un papel.
Las principales tcnicas son:
Cromatografa en papel Cromatografa en capa fina

Posee:
Fase mvil: consiste en un fluido (gas, lquido o fluido supercrtico). Fase estacionaria: se trata de un slido o un lquido fijado en un slido.

Cromatografa en columna: La fase estacionaria se sita dentro de una columna.

Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen: Cromatografa de lquidos Cromatografa de gases Cromatografa de fluidos supercrticos`

Los componentes de la mezcla interaccionan en forma diferente con la fase estacionaria y con la fase mvil.
Los componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando.

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Aspectos histricos de los distintos tipos de cromatografa

Cromatografa en papel
Fue desarrolla por Martin. Tiene como soporte un papel de celulosa. Es una tcnica sencilla y presenta la ventaja de poder utilizar cantidades pequeas de muestra (miligramos y microgramos).

Aspectos histricos de los distintos tipos de cromatografa

Cromatografa en capa fina
Fue originada en 1938 por los trabajos de los investigadores rusos Izmailov y Schraiberen.
Lograron separar mezclas de tinturas farmacuticas.

En este tipo de cromatografa la fase estacionaria se extiende sobre un soporte inerte (silica). Stahl estandariz el mtodo para elaborar capas finas por mtodos mecnicos.

Cromatografa de columna
Consiste en la aplicacin de una muestra compleja a una columna de cristal.
Contiene una matriz slida porosa que est inmersa en el solvente. Se bombea una gran cantidad de solvente a travs de la columna.
Las diferentes mezclas se van retrasando de manera distinta segn sus interacciones con la matriz. Se pueden separar de acuerdo a su carga, su hidrofobicidad, su tamao o su capacidad de unirse a grupos qumicos particulares. La pureza de las fracciones obtenidas se suele comprobar mediante la electroforesis en geles de poliacrilamida.

Trminos relacionados con el proceso

Matriz de la columna Longitud de la columna Volumen de la columna: volumen total de gel. Run Throught: volumen de muestra mas solvente.

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Aspectos histricos de los distintos tipos de cromatografa

Cromatografa de intercambio inico
Esta tcnica apareci durante la II Guerra Mundial.
Tena la finalidad de separar los elementos alcalinotrreos y los elementos de transicin.

En 1938 Taylor y Urey utilizan este mtodo para separar istopos de Litio y Potasio utilizando resinas de zeolita. En 1939 Samuel logra sintetizar resinas de intercambio inico.

Cromatografa de intercambio inico

Se realiza sobre matrices que tienen una carga neta.
Carga negativa: intercambio de cationes Carga positiva: intercambio de aniones

Cromatografa de intercambio inico

Funcionamiento
En unas condiciones determinadas sern retenidas en la columna las muestras que tengan una carga complementaria a la de la matriz de la gel, siendo eluidas las restantes. Para eluir las muestras retenidas se puede variar la carga inica del solvente o su pH de forma que se alcance el punto isoelctrico de la muestra de inters o el de la matriz, neutralizando de este modo la fuerza que retiene a la muestra en la columna.

La carga de la matriz de la columna as como la carga de la muestra depender del pH del solvente y de su fuerza inica (proporcional a la concentracin de iones). Se usa en la separacin de molculas grandes (protenas y cidos nucleicos).
Cuando las separaciones exigen condiciones qumicas fuertes se emplean intercambiadores inicos inorgnicos.

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Aspectos histricos de los distintos tipos de cromatografa

Cromatografa de gel-filtracin
Fodin y Porath en 1958 descubren que usando como fase estacionaria geles se puede separar polmeros sintticos de alto peso molecular.

Cromatografa de exclusin
La cromatografa de exclusin molecular o de filtracin en gel, separa las muestras en base a su tamao. La matriz de la columna esta formada por un polmero entrecruzado con poros de tamaos determinados. Las muestras de mayor tamao migran a lo largo de la columna con mayor velocidad que las de tamao pequeo. Las muestras de menor tamao, entran en los poros y se mueven a lo largo de la columna lentamente porque tienen que atravesar los laberintos que se encuentran en el interior de las bolas de polmero en su marcha a lo largo de la columna.

Cromatografa de afinidad.
Porath en 1967 utiliza un pptido o protena unida covalentemente a un ligando y la utiliza para la separacin de molculas proteicas.

Cromatografa de gas.
Es una de las tcnicas ms utilizadas e importantes.
Ha revolucionado el campo de la qumica analtica.

Cromatografa de exclusin
Hay diferentes tamaos de partcula para un gel:
a menor tamao mayor resolucin y menor gasto en la columna.

Caractersticas de las matrices

Deben ser estables. Tener bajo contenido en grupos inicos. Uniformidad de poro y tamao. Los compuestos utilizados pueden ser derivados de:
Dextranos (Sephadex) Agarosa (Sepharosa) Acrilamidas (Biogel P) Esferas de vidrio

Este tcnica se emplea en la separacin de protenas de alimentos, determinacin de glucosa y fructosa en zumos de fruta, etc.

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Cromatografa de afinidad
Permite la separacin de mezclas por su afinidad o capacidad de unin a un determinado ligando. Las muestras que se retienen en la columna son aquellas que se unen especficamente a un ligando que previamente se ha unido covalentemente a la matriz de la columna. Despus de que las muestra que no se unen al ligando son lavadas o eludas a travs de la columna, la muestra de inters que ha quedado retenida en la columna se eluye (se libera) mediante el empleo de una solucin que contiene bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interaccin entre el ligando y la protena

Ligandos de afinidad
Son las molculas bioqumicas que se encuentran ancladas qumicamente sobre el soporte slido inerte, y son las responsables de la adsorcin especfica de los solutos-analitos. Se clasifican segn su:
Naturaleza - pueden ser macromolculas biolgicas o bien molculas de bajo peso molecular. Actuacin - se fundamenta en la selectividad de la retencin que condiciona las caractersticas de la cromatografa de afinidad. Se distinguen dos grandes grupos:
Ligandos especficos , como los anticuerpos , que se enlazan reversiblemente a un solo soluto. Ligandos generales enlazados con un determinado grupo de compuestos bioqumicos, como las lectinas y nucletidos.

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Electroforesis

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Introduccin
La electroforesis fue desarrollada por primera vez por el qumico sueco Arne Tiselius.
Gana el Premio Nbel en 1948 por los trabajos realizados.

Conceptos generales
La electroforesis es un proceso que se utiliza para separar macromolculas en una solucin.
Cuando una mezcla de molculas ionizadas y con carga neta son colocadas en un campo elctrico, estas experimentan una fuerza de atraccin hacia el polo que posee carga opuesta.
Las molculas cargadas positivamente se desplazarn hacia el ctodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazarn hacia el nodo (el polo positivo).

La electroforesis es una tcnica analtica de separacin de fundamento cintico basada en el movimiento o migracin de las macromolculas disueltas en un determinado medio a travs de una matriz o soporte reticulado como resultado de la aplicacin de un campo elctrico. El comportamiento de la molcula viene dado por su movilidad electrofortica:
La movilidad depende de la carga, tamao y forma. Cuanto mayor es la relacin carga/tamao ms rpido migra un in.

Conceptos generales

Conceptos generales
Los iones comenzarn a moverse formando un frente cuya anchura aumentar con el tiempo.
Para reducir la anchura de este frente podemos reducir el movimiento de las molculas empleando un medio que oponga mas resistencia a dicho movimiento. Una forma comn de hacer esto es formar un gel.

La friccin con el solvente dificultaran este movimiento originando una fuerza que se opone , por otro lado, las molculas tienen que moverse en forma aleatoria o movimiento browniano debido a que poseen energa cintica propia denominado difusin.

El gel consiste de un polmero soluble de muy alto peso molecular que atrapa molculas de agua y forma un tamiz que dificulta el movimiento de los solutos.

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Conceptos generales
La velocidad de migracin (v) de la partcula es directamente proporcional al producto de su carga efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de friccin (f) relativo a la talla y forma de la molcula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio.
V = q E / f

Mtodos electroforticos zonales

Son los ms comunes, dada su alta aplicabilidad en diferentes campos. Son tiles para lograr la separacin de mezclas complejas. Se aplican pequeas cantidades de la muestra a un soporte slido. Los soportes son en general polmeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las molculas a travs del medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de conveccin del solvente.

Tipos de soportes
papel (celulosa) almidn poliacrilamida agarosa acetato de celulosa

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Electroforesis de gel
La electroforesis en gel se utiliza en la deteccin, control de pureza, caracterizacin, cuantificacin (por comparacin con controles), preparacin y purificacin (por extraccin de bandas desde el gel) de diferentes molculas. Esta tcnica tiene como ventaja su capacidad de separar macromolculas de inters en la industria biotecnolgica y qumica.
Ha sido un mtodo muy til para la separacin de protenas (enzimas, hormonas) y cidos nucleicos (DNA y RNA) con gran resolucin.

Electroforesis de gel
Los geles ms comunes son agarosa y poliacrilamida. La electroforesis en gel tiene dos mecanismos de separacin:
por la relacin carga/tamao por tamao

Electroforesis de agarosa
Permite separar molculas de DNA, cuando stas son sometidas a un campo elctrico y atradas hacia el polo opuesto a su carga neta. La agarosa es un polisacrido (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composicin homognea), cuyas disoluciones (tpicamente de 0.5 a 2 %) poseen la propiedad de permanecer liquidas por encima de 50 grados C y formar un gel, semislido al enfriarse.

Electroforesis de poliacrilamida
Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin de la acrilamida por accin de:
Agente entrecruzador ('cross-linking'): bisacrilamida Catalizador: TEMED (N,N,N,N'tetrametilnediamina) Iniciador: in persulfato que se aade en forma de persulfato amnico

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Clasificacin
Electroforesis desnaturalizante
La ms comn: somete a las protenas a migracin asegurando la completa desnaturalizacin (prdida de la estructura tridimensional). La migracin es proporcional a la carga y al tamao de la molcula pero no a su forma. El agente desnaturalizante ms empleado es el sodiododecilsulfato o SDS, un detergente.

Electroforesis nativa
Es la que somete a las protenas a migracin sin desnaturalizacin. Las protenas migran en funcin de su carga, de su tamao y de su forma.

SDS-PAGE

Electroforesis capilar
Es una tcnica alterna a la electroforesis convencional. Surge debido a que la velocidad de separacin y resolucin de los compuestos mejora a medida que aumenta el campo elctrico aplicado. Se realiza la electroforesis en un tubo capilar con un dimetro interno inferior a 0.1 mm y una longitud de 50 cm a 1 m. El mecanismo de separacin est basado en las relaciones carga/masa de los analitos. Su utilidad est en la separacin de protenas y pptidos entre otras sustancias.

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